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CTEDRA : BIOTECNOLOGA

CATEDRTICA : Mg Sc. Ing. Norma Gamarra Mendoza


INTEGRANTES : BAQUERIZO CHUQUILLANQUI, Guilliana
CHOQUE MENDOZA, Sheyla Laura
CORILLA HUAMN, Gaby
HUANQUIS ALBINAGORTA, Lourdes
LLACUA CHVEZ, Fabiola
PALOMINO CESAR, William Ezer

2014
EXTRACCIN Y ACCIN
CATALTICA DE LAS
AMILASAS
Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias
UNI VERSI DAD NACI ONAL DEL CENTRO DEL
PER
BIOTECNOLOGA
EXTRACCIN Y ACCIN CATALTICA DE LAS AMILASAS





La produccin de enzimas tienen una gran importancia para los procesos industriales
o biotecnolgicos, ya que pueden ser de enorme ayuda para obtener: productos
lcteos, edulcorantes, frmacos, alimentos, licores, detergentes, o con propiedades de
degradacin de lignina o de compuestos txicos.
Las nuevas industrias, juntamente con las nuevas tendencias y las nuevas altas
exigencias ambientales han impulsado el desarrollo de nuevas tcnicas
agroindustriales. Las nuevas plantas de alcohol para uso como combustible, a partir
del almidn, requieren la transformacin de la materia prima por procesos de
hidrlisis mediante la accin de un complejo de amilasas capaces de degradarlo en
azucares. La implementacin de hidrlisis enzimtica conlleva generar altos costos de
produccin, factor que genera una problemtica en las empresas de este gnero y a
su vez en buscar soluciones para dicha temtica.
Estas alfa amilasas son muy importantes para muchos procesos, tanto fisiolgicos,
como las amilasas salivales, como industriales, las que son utilizadas en la fabricacin
de etanol combustible (ya mencionado anteriormente). Debido a la importancia de
conocer las enzimas, en especial la alfa amilasa, y sus aplicaciones en la industria, en
el presente trabajo se plantearon los siguientes objetivos:
Extraer amilasa de origen vegetal
Evaluar y comparar su accin biocataltica.



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2.1. ALMIDN
Probablemente no existe otro compuesto orgnico tan ampliamente distribuido
en los vegetales como el almidn. Es el producto de asimilacin ms importante
de la fotosntesis y constituye la principal sustancia de reserva delos vegetales.
Qumicamente el almidn o fcula es un polisacrido homogneo que est
formado por una mezcla de dos polisacridos estructuralmente diferentes:
amilosa y amilopectina.
Amilosa
Es una molcula lineal compuesta por 250 a 300 unidades de -
D-glucopiranosa enlazadas por uniones 1-4.- La
Amilopectina
Es ramificada, constituida por 1.000 a 3.000 unidades de glucosa
conectadas por uniones 1-4 y 1-6 en los puntos de ramificacin.
El almidn se encuentra en abundancia en:- Gramneas
(cereales): trigo (Triticum sativum); arroz (Oryza sativa); maz
(Zea mays;); avena (Avena sativa); centeno (Secale cereale);
cebada (Hordeumvulgare).- Leguminosas (legumbres): porotos
(Phaseolusvulgaris); arvejas (Pisumsativum); lentejas (Lens
sculenta), etc.- Solanceas: papas (Solanum
tuberosum).Industrialmente se le obtiene por va hmeda a
partir de ellos.
2.1.1. Caracterstica y propiedades
Se presenta como polvo blanco fino, inspido,constituido por granos
caractersticos microscpicamente para cada especie.Para su
caracterizacin se toma en cuenta: tamao (aprox. 2-150 u),
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forma,hilio o ncleo, estratificaciones; granos simples o compuestos y
aspectos a laluz polarizada.El almidn es insoluble en agua fra; en agua
caliente se hincha formandoengrudo; se tie de azul a azul violeta con
sol. R lugol; da glucosa como producto final de la hidrlisis total.
(Smith L. y Cristol S.; 1990).

Grafico 1. Representacin esquemtica del Almidn.
Fuente: Smith L. y Cristol S. (1990).

Grafico 2. Representacin esquemtica de una molcula de amilopectina.
.., lmite de la degradacin inicial por la -amilasa y confn de la dextrina-I;
- - - -, lmite de la segunda degradacin por la -amilasa, y confn de la dextrina-III;
(representa el lmite de la degradacin de la -glucosidasa para dar dextrina-II). R, es
un grupo reductor terminal.
Fuente: Smith L. y Cristol S. (1990).

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2.2. ALFA y BETA-AMILASA.
El nombre de diastasas corresponde a un sinnimo de las amilasas, aunque se
usa principalmente para designar la alfa-amilasa, que se extrae de cereales.
Origen de alfa-amilasa: Fngico (Aspergillus oryzae), bacteriano (B.
stearothermophilus, B. subtilis), de cereales y del pncreas.
Origen de beta-amilasa: cereales, soya y camote.
La enzima alfa-amilasa se encuentra en poca cantidad en el trigo y abunda ms
en aquel que ha sido parcialmente germinado. La beta-amilasa, por el
contrario, se encuentra en gran cantidad en este cereal.
Acciones:
Como es sabido, el almidn est formado por la fraccin amilosa de cadena
recta de molculas de glucosa unidas por enlaces glucosdicos alfa-1,4; en tanto
que la fraccin amilopectina, adems de la cadena recta, presenta
ramificaciones con enlaces glucosdicos 1,6.
La alfa-amilasa cataliza la hidrlisis de la cadena lineal (amilosa) y la
ramificada (amilopectina) del almidn, rompiendo enlaces 1,4 interiores
(endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce
como enzima dextrinognica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina,
acrodextrina y maltodextrina) con poca produccin de maltosa.
Por su accin, la alfa-amilasa provee de fragmentos menores que pueden ser
utilizados por la enzima beta-amilasa. La enzima alfa-amilasa requiere de un
activador como, por ej., cloruro de sodio. Es sensible a una acidez elevada y
se vuelve inactiva a pH 3,3 o a pH menor a 0C por 15 min. El pH ptimo
de accin est dentro del rango 5-7, siendo de 6,5 para la alfa-amilasa
bacteriana y pancretica. La enzima es resistente al calor, pues a 70C
conserva un 70% de su actividad. Acta sobre almidones crudos y
gelatinizados.
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La beta-amilasa se la conoce con el nombre de enzima sacarognica, pues
acta sobre la amilosa, rompiendo unidades 1,4, dando maltosa. Sobre la
amilopectina acta en las uniones alfa-1,4 de la cadena recta, y detiene su
accin a distancia de 2 unidades de glucosa antes de atacar las uniones alfa-
1,6. Se trata de una exo-amilasa, ya que acta sobre el terminal de la
molcula; mientras la amilosa es transformada totalmente en maltosa, la
cadena ramificada de la amilopectina se conserva en un 40-45% sin hidrolizar
(38).
La beta-amilasa no necesita de activador para actuar, pero es menos estable al
calor, inactivndose a 70C por 15 min. El pH ptimo de la beta-amilasa es
de 4,5.
Aplicaciones:
El uso de la alfa-amilasa para mejorar el valor panificador de harinas se basa
en el hecho de que un adecuado y mantenido desprendimiento de anhdrido
carbnico depende de la cantidad de maltosa y glucosa fermentescibles que
estn presentes en la masa, y cuya formacin depende, a su vez, de la accin
sincronizada de la alfa- y la beta-amilasa; en mejor forma que por adicin de
extracto de malta usado tambin para este objeto. Mientras los cereales
germinados contienen ambas enzimas, muchas harinas de trigo son deficientes
en alfa-amilasa, siendo entonces conveniente su adicin.
La alfa-amilasa de origen fngico (como es la que se obtiene por crecimiento
del micelio del Aspergillus oryzae en fermentadores de cultivo sumergido que
permiten una agitacin y una aireacin intensa), aunque puede ser menos
potente que la de bacterias o de cereales, se puede obtener con baja actividad
de proteasa (desdobladora del gluten) y de maltasa, conservndose as la
maltosa, esencial para la fermentacin. La presencia de una cantidad suficiente
de alfa-amilasa durante el esponjamiento y fermentacin de la masa, tiene las
siguientes ventajas:
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mayor contenido de azcares fermentescibles en la masa;
aceleracin de la fermentacin
desprendimiento gaseoso, mayor y uniformemente mantenido
aumento del volumen y textura del pan con una miga de porosidad
ms fina y de costra ms uniforme y ms coloreada.
La alfa-amilasa de origen bacteriano es ms estable al calor que la de hongos y
de cereales, de manera que no se inactiva totalmente en el horno panificador.
Por este motivo, su adicin debe ser bastante cuidadosa para evitar una
sobreproduccin de dextrina residual y con ello una miga gomosa y pegajosa
(38, 40). Por otra parte, una actividad residual de la alfa-amilasa bacteriana en
el pan tiene la ventaja de suministrarle una mejor conservacin, al restringir
durante el almacenamiento del pan la retrogradacin de su almidn, causante
del envejecimiento. Al sustituir la adicin, de la amilasa por extracto, jarabe o
harina malteados, debe tenerse presente la relativa termo-resistencia de su
alfa-amilana y su considerable actividad proteoltica, cuyas desventajas se han
sealado anteriormente.
Maldonado y Guerrero (2000); realizaron un ensayo experimental sobre
hidrlisis cida y enzimtica del almidn, y para confirmar azcares reductores
realizaron la reaccin de Benedict, lo realizaron en un bao de agua hirviendo
por 5 minutos, retiraron los tubos y observaron; en el cuadro 1 reportaron sus
resultados.
Cuadro 1. Resultados hidrlisis cida y enzimtica del almidn.

Fuente: Maldonado y Guerrero (2000).
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En la hidrlisis cida se produce un rompimiento total de los enlaces que
mantienen unido a los monmeros del almidn y se forma glucosa, maltosa,
isomaltosa.
En la hidrlisis enzimtica se produce un rompimiento parcial de los enlaces
que mantienes unido a las unidades del almidn y se formar maltosa, glucosa
y dextrina lmite que es una cadena ramificada.
2.3. RECONOCIMIENTO QUIMICO DE LA GLUCOSA.
El reconocimiento qumico de los principios inmediatos es una prctica de la
que no debera abusarse en el medio escolar, dado que sus resultados no son
fcilmente explicables en dicho mbito pedaggico. De todos modos, resulta
interesante realizar algn ensayo de los de tipologa ms conocida.
Presentamos aqu el clsico reconocimiento de la glucosa por medio de la
solucin de Fehling.
La solucin de Fehling se prepara como sigue:
Sol. A: 17.3 gr. De sulfato de cobre en 250 cc. De agua destilada.
Sol. B: 86.5gr. de tartrato sdico-potsico en 125 cc. De agua
destilada.
25 gr. De hidrxido potsico en 125 cc. De agua
destilada.
Las soluciones A y B se guardan por separado. Para constituir la solucin de
Fehling se mezclan ambas soluciones inmediatamente antes de su utilizacin.
La mezcla se realizar a partes iguales.
Para comprobar la reaccin con licor de Fehling, se prepara una solucin de
glucosa a la que se le aade la solucin de Fehling, se prepara una solucin de
glucosa a la que se le aade la solucin de Fehling y se calienta la mezcla al
bao Mara. Se producir un precipitado rojizo de xido de cobre, reaccin
tpica de la glucosa. Como complemento, podemos verificar que la citada
reaccin no se produce con la sacarosa. (Nogus, 1988).
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3.1. MATERIALES:
100 g de Trigo

Almidn de papa

Reactivo de Fehling A y B

Tubos de ensayo


Vasos de precipitacin

Gradilla

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Fiola


Probeta





Pipetas

Varilla de vidrio


Matraces Centrifuga
Papel filtro

pH - metro


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3.2.- MTODO
a) Extraccin de B-Amilasa de trigo
Remojado del trigo
Una vez seleccionado (separacin de pajas y semillas extraas) se pes la
semilla (250-500g), se lav con agua potable, seguidamente se remojo en
un recipiente hasta alcanzar el 45% de humedad, por un tiempo de 6-8h,
a temperatura ambiente, se cambi el agua al menos 3 veces para
oxigenar el material, luego se retir el agua y se coloc las semillas en
papel absorbente por 30 minutos.


Germinacin
Las semillas con 45 % de humedad en peso se colocaron en bandejas para
la germinacin y se sometieron en el germinador en donde se mantuvo a
una temperatura de 16 C, con una humedad relativa de 100%. Una vez
que el acrospiro alcanzo de a o 9 mm de longitud del grano se
detuvo la germinacin.













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Molienda
Las semillas se molieron en un moulinex, hasta obtener una partcula de
0,5 a 0,7 mm de tamao, se asegur que la corteza pajosa este molida.


Dilucin
Las semillas molidas de diluyeron en una proporcin de 1:2, se agita, se
filtra y centrifuga a 5000 rpm. El sobrenadante tuvo que ser transparente,
seguidamente se guard en tubo falcon esterilizado en congelacin hasta
el momento del anlisis.





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b) Ensayos hidrolticos
Preparacin del sustrato
Se prepar una suspensin de almidn al 15 % (P/V) Y pH =5, se mezcl
bien y se llev a coccin por 30 minutos a temperatura de ebullicin o
tambin se pudo haber auto clavado a 120C por 15 minutos. Se enfri y
se tom alcuota para los ensayos de hidrolisis enzimtica y acida.


Hidrolisis enzimtica y acida
Se realiz en tubos de prueba con tapa rosca, se utiliz un equipo de
bao mara, durante la hidrolisis y se agito en intervalos de tiempo de 15
minutos.


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Brix inicial (antes de la hidrlisis)



Brix final(Despus de la hidrlisis)
Acida amilasa salival amilasa amilasa y
amilasa
Blanco
Brix 8,2 2,4 3,2 3,0 1.0

Resultados de la accin biocataltica de las amilasas
Los resultados de son cualitativa, esencialmente en la coloracin, para la cual
se muestra la siguiente tabla
Acida amilasa
salival
amilasa amilasa y
amilasa
Blanco
Hidrlisis No hubo Si Si Si No
Color

Celeste Rojo ladrillo Rojo
ladrillo
Rojo ladrillo

Azul







Brix
Muestra antes de la hidrlisis 3
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Al agregar el Fehling A y B se observ el cambio de color de azul a un rojo
ladrillo por lo que se puede decir que hay presencia de azcares reductores.
Discusiones:
Segn Nogus (1988) refiere que la solucin de Benedict (y la solucin del
mismo gnero de Fehling que contiene el ion complejo de tartrato cprico),
dan un precipitado rojo ladrillo de

cuando oxidan a una aldosa. Los


azcares que dan pruebas positivas con las soluciones de Tollens o Benedict
se conocen como azucares reductores.

Segn Smith L. y Cristol S. (1990)., en la cebada predomina la beta amilasa,
suficiente para producir los azucares necesarios para el desarrollo de los
microorganismos; durante el malteado, que es una germinacin controlada
del grano, se producen las enzimas de alfa amilasa y beta amilasa, cuya
actividad conjunta sobre el almidn se conoce como actividad diastsica.

Smith L. y Cristol S. (1990) nos dice que los cereales como la enzima alfa-
amilasa en su accionar degrada la amilosa en maltosa y pequeos
compuestos de glucosa. Sin embargo, esta enzima solo es capaz de degradar
parcialmente la amilopectina y el glucgeno debido a que no es capaz de
desdoblar los enlaces glicosidicos 1-6 encontrados en los puntos de
ramificacin de la cadena del polisacrido.

La accin de la alfa amilasa sobre los almidones presentes en los granos de
cebada depende de la estructura granular porosa que puedan tener y que los
haga accesibles a la enzima.

La hidrlisis de la amilosa produce oligosacridos de bajo peso molecular
abarcando desde maltosa a maltohexosa dependiendo del origen y
naturaleza de la amilosa. Siendo una amilasa sacarognica, el almidn se
hidrolizara inicialmente a dextrinas y posteriormente a maltosa y glucosa,
que son azcares libres diferencindola as de las amilasas liquificantes que no
los producen.

Los grnulos de almidn en la cebada estn compuestos casi enteramente de
amilopectina, recubiertos por una capa delgada de protena y exteriormente
por una capa delgada de celulosa, por lo que requiere un proceso de ruptura
para facilitar el ataque enzimtico. La hidrolisis de la amilopectina produce
glucosa, maltosa y una variedad de dextrinas alfa limitantes ramificadas que
contienen enlaces alga 1,6 del polmero original; al estar presente la alfa
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amilasa experimental, los almidones presentes se hidrolizan parcialmente
produciendo dextrinas que originan un color pardo al reaccionar con iodo.

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De lo realizado en la prctica, se llega a las siguientes conclusiones:
Se consigui la extraccin de amilasas, mediante la germinacin de cereales.
La amilasa, tiene mayor actividad hidroltica que la amilasa.
Una combinacin de y amilasas, muestran una alta actividad enzimtica, a
comparacin de las mismas por separado.
La hidrolisis acida, no reacciono con el reactivo de Felhing, debido a que el
acido utilizado, no tena la pureza requerida.




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Smith L. y Cristol S. 1990. Qumica Orgnica. Primera edicin. Editorial
Revert.
Maldonado N. y Guerrero L. 2000. Facultad de Ciencias Qumicas.
Universidad de Guayaquil.
Nogus R. 1988. La observacin de los seres vivos. Primera edicin. Editorial
Universidad Autnoma de Barcelona.
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas
/schmidth02/parte07/08.html
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a) Desarrollar y explicar el mecanismo bioqumico de hidrolisis enzimtica de la
alfa, beta y acida del almidn.
Hidrlisis del almidn. Como actan las enzimas
La hidrlisis implica la ruptura de un enlace mediante la adicin en medio del
mismo de los elementos del agua. Los polisacridos de la dieta se metabolizan
mediante hidrlisis a monosacridos. La mayora de los pasos de la degradacin
de almidn a glucosa pueden ser catalizados por tres enzimas distintas, si bien hay
otras ms que se necesitan para completar el proceso. Las tres primeras enzimas
son una -amilasa, -amilasa y almidn fosforilasa. Al parecer solo la -amilasa
puede atacar grnulos de almidn intactos, por lo que cuando participan la -
amilasa y la almidn fosforilasa, es probable que acten sobre los primeros
productos liberados por la -amilasa. La -amilasa ataca de manera aleatoria
enlaces 1,4 en las molculas de amilosa y amilopectina, al principio creando
huecos al azar en los granos de almidn y liberando productos que aun son
grandes. En cadenas de amilosa no ramificadas, el ataque repetido por la -
amilasa produce maltosa, un disacrido que contiene dos unidades de glucosa. Sin
embargo, la -amilasa no puede atacar los enlaces 1,6 localizados en los puntos
de ramificacin de la amilopectina, por lo que la digestin de amilopectina cesa
cuando an quedan dextrinas ramificadas con cadenas de longitud corta. Muchas
-amilasas son activadas por Ca+, lo cual es una de las razones por las que el
calcio es un elemento esencial.
La -amilasa hidroliza al almidn en -maltosa; la enzima acta primero solo
sobre los extremos no reductores. La -maltosa cambia con rapidez, por
mutarrotacin, para formar las mezclas naturales de isomeros y . La hidrlisis
de amilosa por la -amilasa es casi completa, pero la degradacin de
amilopectina es incompleta porque no son atacados los enlaces de los puntos de
ramificacin. La actividad de ambas amilasas implica la incorporacin de una
molcula de H2O por cada enlace roto, por lo que son enzimas hidrolasas.
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Figura 1: hidrolisis enzimtica de la alfa

b) Cuales son las ventajas y desventajas de la hidrolisis qumica e enzimtica
desde el punto de vista tecnolgico, ambiental, econmico y alimentario.
HIDRLISIS ENZIMTICA
Ventajas Y desventajas
La hidrlisis enzimtica en los ltimos 30 aos ha desplazado la hidrlisis cida,
debido a que se dispone de nuevas enzimas. Hoy en da la mayor parte de la
hidrlisis de almidn se realiza usando enzimas, ya que esta tcnica presenta ventajas
como: Control de la formacin de productos no deseables y mayor flexibilidad del
producto.
La hidrolisis enzimtica, dichos azucares pueden ser aprovechados en la
produccin de alcohol etlico para diferentes propsitos como la produccin
de bebidas alcohlicas
Mejores expectativas de futuro:
Proceso especifico
Altos rendimientos






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HIDRLISIS CIDA
Ventajas Y Desventajas
La hidrlisis cida del almidn a glucosa es una tcnica que tiene muchas desventajas:
Formacin de productos no deseables y flexibilidad muy pobre (el producto final
slo se puede modificar cambiando el grado de hidrlisis), por ltimo es necesaria
que el equipo resista el cido y las temperaturas requeridas durante el este proceso.

c) Cul es la importancia de la hidrolisis del almidn desde el punto de vista
alimentario, farmacutico y qumico.
La importancia de la hidrolisis del almidn desde el punto de vista alimentario,
farmacutico y qumico se encuentra en gran variedad de aplicaciones industriales,
algunas de ellas se indican en la Figura 2:

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