INTRODUCCIN

Durante las dcadas pasadas ha ocurrido una significativa evolucin desde los
saborizantes artificiales hacia los naturales. Este movimiento, producido tanto en los
saborizantes de alimentos como en los gustos de los consumidores, se debe
parcialmente a la reglamentacin nacional, que est tratando de limitar el uso de
saborizantes artificiales en alimentos y bebidas procesadas, y tambin a la creciente
predisposicin del pblico contra todo alimento producido de una manera qumica o
por sntesis. Como , adems, la sntesis qumica se acompaa de la formacin de
mezclas de ismeros, los saborizantes naturales ven crecer su uso en una gran
variedad de productos alimentarios y bebidas. Estos sabores naturales suelen ser
sillares de construccin bsicos que pueden servir como materias primas para producir
o componer sabores ms sofisticados o complejos. Muchos saborizantes derivan de
vegetales, pero los componentes organolpticamente activos a menudo estn
presentes solo en pequeas cantidades o en una forma unida, lo que frecuentemente
dificulta su aislamiento. Dos posibles alternativas a la produccin de compuestos
saborizantes naturales son el uso de los procesos de fermentacin microbiana y el de
enzimas.












SABORIZANTES MICROBIANOS

La produccin y liberacin de compuestos del sabor es un fenmeno bien conocido por
los microbilogos, y de hecho, la produccin de estos compuestos por
microorganismos presenta numerosas ventajas. Se multiplican durante un perodo de
tiempo corto, producen sabores de origen natural, y existe una inagotable reserva de
cepas. Pueden manipularse fcilmente tanto fenotpicamente, y producen sabores
complejos que no pueden emularse econmicamente por medio de sustancias
qumicas puras. Principalmente existen dos rutas para la produccin de sabores
microbianos: la biosntesis (tambin denominada sntesis de novo) y la
biotransformacin. Un proceso biosinttico produce compuestos qumicos a partir de
clulas que se estn multiplicando, metablicamente activas (productos de la
fermentacin o del metabolismo secundario), mientras que la biotransformacin se
define como el uso de clulas microbianas para llevar a cabo modificaciones o
interconversiones especficas de estructuras qumicas. Aunque existen numerosos
ejemplos de sntesis bacteriana de novo de molculas del sabor, el rendimiento
relativamente bajo obtenido mediante sta ruta a menudo lo invalida por causas
econmicas. Por el contrario, la bioconversion, que se basa en precursores
relativamente abundantes y baratos, ofrece mayores rendimientos de producto, y por
lo tanto posibilita un proceso industrial ms atractivo desde un punto de vista
econmico. Se pueden emplear microorganismos o enzimas para producir sabores
complejos multicomponentes o compuestos del sabor individuales. Ejemplos de
sistemas saborizantes complejos producidos por enzimas o fermentacin microbiana
son los quesos modificados enzimticamente, las grasas de la leche lipolizadas o el
saborizante a queso azul. Recientemente ( Christen y Lopez Mungufa, 1994) se han
descrito con detalle algunas molculas microbianas responsables del sabor.

METILCETONAS
Cuando el queso madura con el moho Penicilium roqueforti, se produce el tpico sabor
a queso azul. Las enzimas proteolticas y lipolticas del moho juegan el principal papel
en el desarrollo del sabor final. Las enzimas son excretadas en la leche, donde la
proteasa hidroliza la casena, produciendo tanto precursores del sabor como sustratos
necesarios para el crecimiento del hongo. La lipasa produce cidos grasos libres, que
dan los sabores caractersticos de los productos lcteos. Sin embargo, los cidos grasos
tambin son txicos para el hongo, y el grado de toxicidad depende de la
concentracin de estos cidos, de la longitud de su cadena, y del pH del medio. La
figura 6.6 muestra la formacin de metilcetonas mediante oxidacin y
descarboxilacin. Las metilcetonas son el resultado de dos reacciones, a saber, la B-
oxidacin de los cidos grasos a B-cetocidos, seguida de descarboxilacin, que
produce C5-C11 2-alcanonas, las molculas responsables en mayor medida del sabor
de los quesos de tipo azul. En la fabricacin de sabor de queso azul, el calcio de
fermentacin se inactiva trmicamente, y despus se deshidrata por atomizacin. Se
han utilizado tanto las conidiosporas como el micelio de Penicilium roqueforti para
producir metilcetonas a partir de cidos grasos. Tambin se ha estudiado un sistema
de reactor contnuo utilizando esporas inmovilizadas. En reino unido la compaa
Stafford Speciality Ingredients produce metilcetonas de manera comercial utilizando
una cepa de Aspergillus niger ( Janssens et al., 1992)










DIACETILO Y ACETALDEHIDO
El diacetilo imparte el sabor a mantequilla a productos lcteos fermentados como la
crema agria y la mantequilla fermentada. Otro compuesto carbonilo de bajo peso
molecular importante es el acetaldehdo, que es el principal sabor del yogur y de
algunas frutas, como la naranja. El etanol se convierte en acetaldehdo utilizando una
alcohol deshidrogenasa con regeneracin del cofactor NAD o por medio de clulas
inmovilizadas de candida utilis o Pichia pastoris.
La formacin de diacetilo en Lactococcus lactis diacetylactis se asocia con la utilizacin
del citrato y se ha descubierto que est asociada a la presencia de un plsmido. La
tcnica de DNA recombinante proporciona una solucin a la escasa produccin de
diacetilo resultante de la prdida de la actividad citrato permeasa codificada en un
plsmido en los cultivos iniciadores. Se ha sugerido la incorporacin de los
determinantes genticos de la citrato permeasa al cromosoma, un proceso que se
denomina integracin, como medio de estabilizar ste rasgo. La clonacin del gen que
TRIGLICERIDOS
ACIDOS GRASOS
B-CETO CIDOS
METILCETONAS
LIPASA
OXIDASAS
DESCARBOXILASA
FORMACIN OXIDASA DE METIL
CETONAS POR Penicillium roqueforti
codifica para la citrato permeasa de Lactococcus y el desarrollo de vectores
integrativos para sta especie, hace tcnicamente posible la integracin cromosmica
del gen de la citrato permeasa. La figura , muestra las etapas de la produccin de
diacetilo a partir del citrato. El cido &-acetolctico es el precursor del diacetilo, y por
tanto un componente clave en su biosntesis. Se ha sugerido que una posibilidad de
aumentar la produccin de diacetilo podra consistir en aumentar el nivel de su
precursor por manipulacin gentica para reducir la cantidad de la &-acetolactato
descarboxilasa.

Citrato
Citrato
Oxalacetato
PRODUCCION DE DIACETILO A PARTIR DEL CITRATO
Piruvato
Acetaldehido-TPP
Diacetilo
Acetoina
2,3-Butilenglicol
Membrana celular ( Citrato permeasa)
Acetato Citrato liasa
CO2
Diacetilo reductasa


LACTONAS

Las lactonas estn asociadas a impresiones olorosas placenteras, tales como el olor
afrutado, el olor a coco, a mantequilla, afresco, o anuez. Estos compuestos se han
aislado en los principales alimentos, como frutas, verduras, nueces, carnes, productos
lcteos y productos horneados. Trichoderma viridae, un hongo del suelo, produce un
potente olor a coco al crecer en un medio simple. Qumicamente, se necesitan siete
pasos para sintetizar este aroma. Sporobolomyces odoras es una levadura que
produce hasta 1,6 mg/l de decalactona, que es el aroma afrutado tpico del melocotn.
Se ha descrito la produccin fermentativa con la levadura Candida lipolytica utilizando
cido ricinoleico ( cido 12-hidroxioctadecil-9-enoico), que es uno de los compuestos
principales del aceite de ricino. El cido ricinoleico liberado despus es metabolizado
mediante la B-oxidacin y es convertido finalmente en cido 4-fidroxidecanoico, que
es excretado en cantidades de hasta 6g/l (Janssens et al. 1992). La conversin final a y-
decalactona se consigue por ebullicin del caldo de fermentacin acidificado.

cido 12-hidroxi-
octadecil-9-enoico
cido 10-hidroxi-
hexadecil-7-enoico
cido 4-hidroxi-
decanoico
Y-decalactona
CONVERSIN OXIDATIVA DEL CIDO RICINOLEINO
EN Y-DECALACTONA POR CANDIDA LIPOLYTICA



TERPENOS
Los terpenos a menudo, son los componentes ms importantes en el olor de aceites
esenciales. Estn constituidos por unidades de isopreno repetidas. La mayora de los
organismos productores de terpenos son hongos. El gnero Ceratocystis ha sufrido una
intensa investigacin en cuanto a la produccin de los terpenos ms importantes y a
sus caractersticas sensoriales. Actualmente, se considera que la sntesis de novo no es
rentable comparada con los mtodos normales de extraccin. El potencial ms
significativo de los cultivos bacterianos en la produccin de terpenos est en su
capacidad para realizar biotransformacin, convirtiendo precursores de terpenos
baratos y abundantes en derivados de alto valor aadido. Destaca particularmente
Pseudomonas por su capacidad para metabolizar terpenos. Los terpenos son
excelentes sustratos de bioconversiones estereoespecficas. El L-mentol, uno de los
alcoholes terpenos ms importantes, se usa ampliamente en las industrias de
perfumera y de compuestos saborizantes. El L-mentol natural se produce por
cristalizacin a partir de aceites de menta extrados de las plantas del gnero Mentha;
pero existe cierta escasez de aceite de menta de alta calidad. Muchas esterasas
microbianas hifdrolizan preferentemente L-mentil steres asimtricos, dejando los D-
mentil steres intactos.

STERES

Los steres son responsables del aroma y sabor afrutado que, aunque se considera
defectos en muchos alimentos como es el caso del queso Chedar, son deseables en la
cerveza y en el vino. Los steres afrutados naturales se utilizan en mezclas
saborizantes para potenciar el sabor y el aroma de alimentos tales como el yogur,
helados, bebidas con sabor a fruta, goma de mascar y dulces. El acetato de etilo, el
butirato de etilo, el isovalerato de atilo y el hexenoato de etilo son producidos por
varias especies de Pseudomonas, Lactococcus, y Lactobacillus, y por las levaduras
Hansenula anmala y Candida utilis. ste ltimo organismo es el ms prometedor en
la produccin industrial de acetato de etilo a partir del etanol. En condiciones ptimas,
a pH 7,0 en tampn fosfato y con una concentracin de etanol inicial de 10 g/l, se
alcanza una produccin de acetato de etilo alrededor de 4,5 g/l tras 5 horas de
incubacin. La American Company Hercules Inc. (Janssens et al., 1992 ) produce
microbiolgicamente cido butrico y butirato de etilo. El costo de produccin del
butilato de etilo por medios microbiolgicos es de unos $ 180 dlares/kg, mientras que
su anlogo de sntesis es de solo $. 4 dlares/hg. Tambin se han investigado las
capacidades sintetizadoras de steres de ciertas esterasas lipasas procedentes de
Aspergillus niger y Mucos miehei. Se han examinado sistemas no acuosos ( solventes
orgnicos como el n-exano ) para mejorar el rendimiento de ster y para sijmplificar las
etapas de aislamiento y purificacin.

PIRAZINAS

Las pirazinas con compuestos heterocclicos nitrogenados, asociados a menudo con
sabores a sado o a nuez de lso alimentos tratados por calor. Este atributo sugera el
uso de pirazinas en alimentos destinados a microondas que no producen estos
compuestos durante el proceso de calentamiento. Los dos ejemplos ms importantes
de pirazinas producidas por bacterias son la tetrametilpirazina (TMP) Y LA 2 METOXI-
ISOPROPILPIRAZINA (MIPP). La tetrametilpirazina fue descrita por vez primera como
producida por Bacillus subtilis y mas tarde por Corynebacterium glutamicum (Demain
et al., 1967). Este ltimo caso es un ejemplo del uso de las tcnicas mutagnicas
tradicionales con el mutageno qumico N-metil-N-nitroso-N-nitrosoguanidina (MNNG),
se aisl un mutante que acumulaba hasta 3g/l de TMP en un perodo de 5 das. Se
postul que una diferencia en la actividad reductoisomerasa produca un bloqueo en la
ruta biosinttica de isoleucina-valina en el mutante (Romero, 1992). Ello permita la
acumulacin de acetona, el precursor propuesto para el TMP. Un tipo de pirazina, la
metoxialquilpirazina, se encuentra en gran nmero de alimentos entre los que se
incluyen patatas, judas verdes, y guisantes. Se ha observado que dos especies de
Pseudomonas, P taetalentis y P, perolens, producen 2-metoxi-3-isopropilpirazina (
Gatfield, 1998). De especial inters es el aislamiento de un mutante tras un
tratamiento con MNNG que produca 375 veces ms MIPP que la cepa parental
(Romero, 1992 ).

COMPUESTOS AROMTICOS
El benzaldehdo y la vainilla son dos aldehdos aromticos de importancia comercial. El
benzaldehdo, destacado por su aroma a almendras amargas y a cerezas, ha sido
identificado como un producto del metabolismo secundario microbiano. El
benzaldehdo puede proceder de la degradacin de los precursores glucsidos
mandelonitrilo y amigdalina a partir de las cerezas y almendras, respectivamente. Se
estudi una ruta similar en microorganismos, donde el benzaldehdo se forma como
un intermediario metablico durante la degradacin del mndelato. Se han clonado los
determinantes genticos para las cinso enzimas en pseudomonas putida, y se han
establecido las secuencias de DNA de la mandelato racemasa, la (s)-mandelato
deshidrogenasa, y la benzilformato descarboxilasa. Un posible mtodo de produccin
de benzaldehdo podra tomar ventaja de la capacidad de varias pseudomonas de
utilizar el mandelato como nica fuente de carbono. Un examen de la ruta sugiere que
la inactivacin de los dos benzaldehdo deshidrogenasas por medio de tcnicas de
mutacion provocara la acumulacin de benzaldehdo.
La vainillina es el principal componente saborizante de la vainilla y tiene una gran
importancia en la industria debido al gran nmero de formulaciones saborizantes que
la contienen. La creciente demanda de vainillina se satisface con la vainillina extrada
de la madera. Otras fuentes alternativas de vainillina, que tienen la ventaja de ser
consideradas naturales, pueden obtenerse por biotransformacin microbiana. Como
en el caso de la degradacin del mandelato, se han identificado cultivos bacterianos
que degradan el eugenol, formando vainillina en el proceso. La degradacin bacteriana
del eugenol fue descrita por vez primera en especies de Corynebacterium,
proponiendo una ruta metablica en la que la vainillina era un intermediario.
Recientemente se ha depositado una patente sobre la produccin bacteriana de
vainillina a partir del eugenol y del isoeugenol por cepas de Serratia,Klebsiella, o
Enterobacter. Se han descrito rendimientos de hasta 3,8 g/l. el sabor a vainilla tambin
puede producirse por cultivo de clulascallo derivadas de vainilla fragrans o V.
phaeantha. Esta produccin de vainilla puede mejorarse mediante un sistema de
cultivo inmovilizado en el que se elimina de manera contnua los componentes del
sabor del medio de cultivo.(carbn activado ) utilizando una solucin de etanol al 50%.

OCH3
CH2CH=CH2
OH
OCH3
CH=CHCOO-
OH
CH=O
OH
OH
COO-
OH
OCH3
COO-
OH
OH
cido B-cetoadpico
ruptura de anillo
cido protocatocuico
vainillina cido vainillinico
Euglenol cido ferlico
PRODUCCIN DE VAINILLINA A PARTIR DE LA DEGRADACIN
DEL EUGLENOL POR ESPECIES DE CORYNEBACTERIUM


POTENCIADORES DEL SABOR

Tambien puede utilizarse cultivos microbianos para producir potenciadores del sabor,
que son compuestos que no poseen un aroma o sabor propios pero que son capaces
de potenciar otros sabores ya presentes. Entre estos compuestos estn el inosin 5-
monofosfato, (5-IMP) y el guanosn 5-monofosfato (5-GMP) as como el glutamato
monosdico (MSG). Entre los ribonucleicos 5, solo los nucletidos de purina tienen
esta propiedad denominada umami. El componente bsico es una purina con un grupo
hidroxilo en la posicin 6 y un radical fosfrico unido en la posicin 5 de la D-ribosa.
Los nucletidos 5 se pueden producir por hidrlisis enzimtica del RNA de las
levaduras, por hidrlisis qumica del RNA, y por fermentacin directa hasta 5-IMP o
mediante la produccin microbiana de inosina y su posterior fosforilacin qumica para
dar 5-IMP. Desde 1975, en Japn cerca de un 50% de los nucletidos 5 se producen
por el mtodo de hidrlisis enzimtica. En ste mtodo, se cosechan clulas de
levadura con un elevado contenido en RNA al final de la fase logartmica y se extrae el
RNA con una solucin alcalina en caliente. Tras separar el residuo celular, el RNA se
precipita aadiendo HCL O etanol y despus se deshidrata. En la hidrlisis qumica del
RNA por calentamiento a 130C durante 3-4 horas en hidrxido clcico, se producen
nuclesidos. La fosforilacin qumica de estos nuclesidos a 5-IMP Y 5-GMP se realiza
de manera similar, por desaminacin de estos nuclesidos a adenosina e inosina. Si se
usa la fermentacin directa, se puede producir 5-IMP por diversos mtodos
(principalmente por produccin fermentativa de inosina y posterior fosforilacin
qumica hasta 5-imp, o por fermentacin produciendo directamente 5-IMP). En la
produccin fermentativa de la inosina, los auxotrofos de adenina (Ade-) de varios
gneros, como Bacillus y Brevibacterium ammoniagenes o auxtrofos de biotina (Bio-)
de microbacterium pueden acumular hasta 30-35 g/l de inosina. Los mutantes tienen
bloqueada la biosntesis de nucletidos, lo que elimina el control negativo por
producto final. La inosina producida se precipita a partir de un cultivo filtrado a pH 11 y
se cristaliza. La fosforilacin qumica de la inosina se realiza empleando un trialquil
fosfato con PLC3, obtenindose un rendimiento cercano al 90% de 5-monoster. Los
mutantes de Brevibacterium ammoniagenes capces de crecer sobre adenina que
carecen de la nucleotidasa (que degrada el 5-IMP) e insensible al Mn2+ pueden
producir 5-IMP en cantidades de hasta 20-27 g/l. La Ajinomoto Company ha
desarrollado un proceso de produccin de 5-IMP utilizando un mutante de B-
ammoniagenes tratado con nitrosoguanidina. Aadiendo inosina (50-2000 mg/l) o
hipoxantina (25-1000 mg/l) durante la fermentacin en azcar o hidrolizado de
almidn, se obtena aumento significativo en la cantidad de 5-IMP.

Levaduras (C.utilis o
S.cereviciae
RNA (Pureza del 79-90%)
Mezcla 5GMP/5AMP/
5CMP/5UMP
Mezcla 5AMP/5GMP
Mezcla IMP/GMP
5IMP + 5GMP (1,5 3,0 %)
- Extraccin con una solucin salina caliente (5-20% ClNa, 8 h,
100C
- Precipitacin con HCl o etanol
- Secado
- Exonucleasa P1 (Penicillium citrinum ) o
- Mutante Streptomyces aureus (5nucleotidasa y fosfatasa negativo)
- pH 5,4h,65C
- Eliminacin de CMP/UMP por absorcin sobre carbn activado
- Eludir el AMP/GMP absorbido con metanol/amonio
- desaminacin de AMP con la adenil desaminasa ( Aspergillus oryzae)
- Purificacin por columna de intercambio inico
PRODUCCIN DE 5 NUCLETIDOS POR HIDRLISIS
ENZIMATICA DEL RNA


Actualmente se utilizan dos procesos en la produccin industrial de 5-GMP. La
produccin fermentativa de AICAR(5-amino-4-imidazol carboxamida ribosa), que es
convertida qumicamente a 5-GMP; y la produccin de guanosina por fermentacin
directa seguida de fosforilacin qumica. Se ha utilizado a escala industrial un
auxtrofo de purina y sus mutantes, que carecen de actividad AICARP(5-amino-1(5-
fosforibosil)-imidazol-4-carboamida)formil-transferasa- en condiciones ptimas de
fermentacin, sta cepa produce 16g/l de AICAR, a partir de 80g/l de glucosa. Para
maximizar la produccin de AICAR, el medio de cultivo debe contener una fuente de
purina como por ejemplo levadura deshidratada o RNA de levadura. La esporulacin
tiene un efecto negativo sobre la produccin de AICAR pero puede suprimirse
mediante inhibidores tales como el cido butrico o reduciendo el suministro de
oxgeno. EL AICARP formado es excretado al medio de fermentacin en su forma
desfosforilada, AICAR. Primero el AICAR se convierte en guanosina mediante varias
reacciones qumicas y luego se fosforila. Para la produccin de guanosina por ejemplo
algunos mutantes de Bacillus subtilis. Estos mutantes que excretan altas cantidades de
guanosina deben sta capacidad a varios factores: o bin son auxtrofos de adenina, o
carecen de GMP reductasa, o han perdido la retro-regulacin por GMP, o poseen
incrementada la actividad IMP deshidrogenasa y GMP sintetasa. La produccin de
guanosina por B. subtilis de ha mejorado mediante la clonacin gentica. El gen para la
IMP deshidrogenasa (responsable de la catlisis del paso limitante) de B. subtilis se
clon primero en E.coli, y despus de reintrodujo de nuevo en B.subtilis aumentando
as el nmero de copias del gen. El resultado fue un aumento en la produccin de
guanosina.
El aminocido L-glutamato y su sal sdica, el MSG, son conocidos potenciadores del
sabor, y la industria produce ms de 500,000 toneladas anuales. Se ha descubierto que
un gran nmero de bacterias, levaduras y hongos son capaces de producir L-
glutamato. Los mejores productores son algunas cepas de Brevibacterium flavum y
Corynebacterium glutamicum, pero la mayor parte del glutamato se produce mediante
un proceso de fermentacin de la glucosa y sacarosa como fuentes de carbono y
energa con Corynebacterium glutamicum. ste organismo acumula cido &-
cetoglutrico, y es porque es incapaz de completar el ciclo de los cidos tricarboxlicos.
Como consecuencia, el exceso de &-cetoglutrico se dirige hacia la sntesis de cido
glutmico. Adems, el crecimiento en condiciones limitadas de biotina provoca una
mayor capacidad del microorganismo para excretar cido glutmico al medio. Esto
simplifica el proceso de purificacin. Si la biotina est limitada, la sisntesis de
fosfolpidos tambin lo est, y las membranas celulares se hacen ms dbiles. sta es
la razn por la que todos los productores de glutamato necesitan biotina, la prdida de
la actividad L-glutarato deshidrogenasa, y una gran actividad glutamato
deshidrogenasa. En condiciones ptimas de cultivo, las bacterias productoras de
glutamato convierten alrededor de un 50-60% de la fuente de carbono en L-glutamato.
En una fermentacin tpica a partir de glucosa con Brevibacterium divaricatum, se
aade 0,65ml/l de cido oleico. Tras comenzar la fermentacin a un pH de 7,8 y 3,8C,
se utiliza un proceso discontnuo que termina tras 30-35 horas con un rendimiento en
glutamato de 100 g/l.