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INTRODUO
A famlia Bromeliaceae compreende aproximadamente 46
gneros e cerca de 1.900 espcies de plantas herbceas,
quase todas originrias das Amricas Tropical e Subtropical. O
abacaxizeiro (Ananas comosus L. Merril) a espcie que se
destaca, por sua importncia econmica e em razo de
abranger todos os cultivares atualmente plantados (MEDINA,
1987).
O Brasil grande produtor de abacaxi, ocupando a
primeira posio na Amrica do Sul e a segunda em produo
mundial, apresentando crescimento constante, com taxa
mdia anual de 2,93% (FAO, 2000).
A salinidade no solo ou em meios de cultivo in vitro
provoca respostas metablicas nas plantas, por proporcionar
uma condio estressante. Entre elas, esto as alteraes nos
nveis de protenas e na atividade de enzimas, como a
peroxidase. As peroxidases esto relacionadas com os
processos de crescimento e diferenciao celular, e mudanas
morfogenticas em resposta aos estresses fsico, qumico e
biolgico. O aumento da atividade desta enzima em plantas
submetidas a estas condies pode ser fator determinante da
capacidade de adaptao dessas plantas, podendo essa
atividade ser identificada como um marcador bioqumico de
estresse. Em relao aos nveis de protenas, o estresse
1
2
31
MATERIAL E MTODOS
Gemas axilares de abacaxizeiro foram cultivadas in vitro
em meio constitudo pelos sais minerais do MS (MURASHIGE &
-1
-1
SKOOG, 1962), acrescido de 1 mg L de tiamina, 100 mg L
-1
de mio-inositol, 30 g L de sacarose, 8,881 M de BAP (6benzilaminopurina);
e
5,37
M
de
ANA
(cido
-1
naftalenoactico), e solidificado com a adio de 5 g L de
gar. As plantas obtidas foram enraizadas em meio MS lquido
com a metade de sua concentrao de sais, acrescido de 5,37
M de ANA.
Os nveis de salinidade testados na fase de obteno de
-1
plantas e enraizamento foram: 0 (controle); 0,57 g L ; 1,15 g L
1
-1
; e 2,30 g L de NaCl. O pH do meio foi ajustado para 5,8
0,1. Alquotas de 20 mL de meio de cultura foram distribudas
em frascos de cultivo de 268 mL de capacidade. Em seguida,
os frascos foram fechados com tampas transparentes de
-2
polipropileno e autoclavados a 121 C e 1,5 kg cm , durante
20 minutos.
Em cmara de fluxo laminar, os explantes foram
distribudos a razo de quatro por frasco de cultivo, que foi
fechado em seguida com filme transparente de PVC e
incubados temperatura de 25 1 C, fotoperodo de 16
horas.
As anlises de peroxidases e protenas totais solveis
foram realizadas em todas as fases do cultivo in vitro, ou seja,
gemas em desenvolvimento (0, 15 e 30 dias), plantas (0, 15,
30, 60 e 90 dias) e razes (30 e 60 dias).
Biloga Dra., Departamento de Qumica e Bioqumica, I.B., UNESP, CP 545, 18618-000, Botucatu - SP - Brasil - E-mail: isabelapiza@terra.com.br
Eng. Agr., Dra., Profa. Livre Docente, Departamento de Qumica e Bioqumica, I.B., UNESP, CP 545, 18618-000, Botucatu - SP - Brasil E-mail:
gpplima@ibb.unesp.br
Eng. Agr., Dr., Prof. Titular Departamento de Qumica e Bioqumica, I.B., UNESP, CP 545, 18618-000, Botucatu - SP - Brasil
(Recebido para Publicao em 12/12/2002, Aprovado em 04/09/2003)
R. bras. Agrocincia, v. 9, n. 4, p. 361-366, out-dez, 2003
361
PIZA et al. Atividade de peroxidase e nveis de protenas em plantas de abacaxizeiro micropropagadas em meio salino
Atividade de Peroxidase
O material vegetal coletado foi pesado e macerado em 5
mL de tampo fosfato 0,2 M, pH 6,7, e o resduo filtrado duas
vezes em gaze, obtendo-se o denominado extrato bruto. O
procedimento foi realizado em banho de gelo.
A determinao da atividade da enzima peroxidase foi
realizada de acordo com o mtodo de LIMA (1994), utilizandose o extrato bruto obtido. A atividade especfica da peroxidase
-1
foi expressa em moles de H2O2 decomposto.min. mg de
-1
protena .
Teor de Protenas Totais Solveis
Empregou-se o mtodo proposto por BRADFORD (1976).
As leituras foram efetuadas em espectrofotmetro a 595 nm e
comparadas com a curva-padro de casena a 1%, sendo o
-1
teor protico da amostra expresso em mg de protena . g de
matria fresca.
Delineamento Experimental
Em todo o trabalho foi utilizado o programa Estat-Graph
(UNESP - Jaboticabal) para a anlise estatstica, sendo o
delineamento
experimental
adotado
o
inteiramente
casualizado, pelo teste de Tukey, ao nvel de 5% de
significncia, comparando-se as mdias dos diferentes nveis
de salinidade em cada coleta. As coletas referem-se a
diferentes medidas tomadas em uma mesma unidade
experimental.
Na primeira fase (desenvolvimento de gemas) realizaramse trs coletas: 0 = gemas recm extradas da coroa, 15 dias =
gemas com incio de desenvolvimento e 30 dias = gemas com
emisso de parte area, nos quatro nveis de salinidade
propostos, avaliando-se a atividade de peroxidase e os teores
de protenas totais solveis em quatro repeties. Na segunda
fase (desenvolvimento de plantas) realizaram-se cinco coletas
(0; 15; 30; 60; 90 dias) analisando-se a parte area e, aps 30
dias, parte area e razes, nos quatro nveis de salinidade
propostos, para os mesmos parmetros bioqumicos, em
quatro repeties. Foi determinada a curva de regresso nas
anlises, das coletas (no tempo) e anlise de varincia para as
comparaes entre nveis de salinidade testados.
RESULTADOS E DISCUSSO
Atividade de Peroxidase
As variaes na atividade da enzima peroxidase em
gemas de abacaxizeiro cultivadas in vitro, em diferentes nveis
de salinidade, esto representadas na Tabela 1.
Tabela 1 - Atividade de peroxidase (moles H2O2 decomposto
-1
-1
mg
de protena), em gemas de
minuto
abacaxizeiro propagadas in vitro em diferentes
-1
nveis de salinidade (0; 0,57; 1,15 e 2,30 g L de
NaCl), em trs tempos de coletas.
-1
Dias de
NaCl (g L )
Coletas
1,15
2,30
0
0,57
0
0,0135A* 0,0135A 0,0135A
0,0135A
15
0,0308B 0,0368B 0,1668A
0,1613A
30
0,0055C 0,0270A 0,0123B
0,0118B
*Mdias seguidas da mesma letra nas linhas no diferem
significativamente pelo teste de Tukey, a 5%.
Ocorreu aumento na atividade da enzima peroxidase em
todos nveis de salinidade nos primeiros 15 dias, sendo maior
a atividade nas maiores concentraes de NaCl, que diferiram
significativamente das demais. Aos 30 dias, houve decrscimo
362
PIZA et al. Atividade de peroxidase e nveis de protenas em plantas de abacaxizeiro micropropagadas em meio salino
-1
-1
resultado do estresse salino, e
Tabela 2 - Atividade de peroxidase (moles H2O2 decomposto minuto mg de
interpretaram estes resultados com a
protena) em plantas de abacaxizeiro propagadas in vitro, em diferentes
-1
suposio de que ocorre correlao
nveis de salinidade (0; 0,57; 1,15 e 2,30 g L de NaCl), durante 90 dias.
-1
recproca
entre
crescimento
e
Dias de Coletas
NaCl (g L )
atividade da peroxidase.
0
0,57
1,15
2,30
O aumento de peroxidase aos 60
0
0,1283 A*
0,1283 A
0,1283 A
0,1283 A
dias pode estar relacionado
15
0,2535 A
0,2553 A
0,2333 A
0,2073 A
mudana de fase do processo
30
0,1863 AB
0,2615 A
0,1605 B
0,1443 B
organognico, visto que os brotos
60
0,2125 A
0,3003 A
0,2853 A
0,3453 A
foram transferidos para um meio de
90
0,1315 A
0,2103 A
0,2013 A
0,1643 A
enraizamento, o qual apresentava
*Mdias seguidas da mesma letra nas linhas no diferem significativamente pelo
apenas a metade dos minerais
teste de Tukey, a 5%.
nutrientes do meio de proliferao de
se nota alta atividade da enzima. A salinidade tambm
brotos, causando, provavelmente, estresse adicional s
interferiu na atividade da peroxidase, ocorrendo aumento de
plantas.
atividade em razes em meios salinos.
ANDERSEN (1986) afirmou que a enzima peroxidase
Os resultados relativos peroxidase em gemas, plantas e
poderia ser usada como marcador de organognese e
razes de abacaxizeiro cultivadas in vitro, em meio salino,
estdios de desenvolvimento, por participar da regulao
podem refletir a capacidade adaptativa das diversas estruturas
endgena de AIA, agindo como AIA oxidase, sistema
aos fatores estressantes. Em gemas no se observou
enzimtico capaz de oxidar o AIA, principalmente nas fases de
visualmente
injria causada pelo sal, mas notou-se aumento
intenso crescimento ou formao de rgos nas plantas. O
da atividade da peroxidase aos 15 dias nos maiores nveis de
autor, estudando o desenvolvimento in vitro de clulas de
NaCl, talvez devido a um efeito protetor da enzima em relao
Rhododendron, concluiu que baixa atividade da enzima
salinidade, permitindo crescimento satisfatrio. No caso de
poderia estar relacionada com perda do potencial
plantas, observou-se comportamento varivel da enzima, mas
morfogentico.
tambm teores mais altos foram identificados em meios
A atividade da peroxidase tambm foi quantificada nas
salinos aos 15 e 60 dias, pocas crticas que requeriam
razes formadas in vitro com dois tempos de coletas, aos 30 e
adaptao das plantas para garantir o crescimento. J em
60 dias. Os resultados podem ser observados na Tabela 3.
razes, os resultados mostraram aumento de peroxidase em
meio salino, confirmando a condio estressante do NaCl. A
Tabela 3 - Atividade de peroxidase (moles H2O2 decomposto
-1
-1
alta atividade da enzima no controle (sem sal) pode ser o
minuto mg protena) em razes de plantas de
mecanismo de defesa da planta contra o estresse causado
abacaxizeiro propagadas in vitro, em diferentes
-1
pela mudana de concentrao de nutrientes no meio e,
nveis de salinidade (0; 0,57; 1,15 e 2,30 g. L de
conseqentemente, o que garantiu o enraizamento de 100%
NaCl), aos 30 e 60 dias.
-1
das plantas. Altas concentraes de sal comprometeram o
NaCl (g L )
Dias de Coletas
enraizamento
0
0,57
1,15
2,30
30
0,1028A* 0,0308B
------Protenas Totais Solveis
60
0,0910A 0,0973A 0,0978A
---Na Tabela 4 esto os resultados dos teores de protenas
*Mdias seguidas da mesma letra nas linhas no diferem
totais solveis em gemas de abacaxizeiro propagadas in vitro,
significativamente pelo teste de Tukey, a 5%.
em diferentes tratamentos salinos.
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PIZA et al. Atividade de peroxidase e nveis de protenas em plantas de abacaxizeiro micropropagadas em meio salino
0 g/L
0,57 g/L
0,40
1,15 g/L
0,35
2,30 g/L
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
0
15
30
45
60
75
90
DIAS DE COLETAS
R2 = 0,5539
-1
R2 = 0,9195
-1
R2 = 0,5027
-1
R2 = 0,4553
-1
Figura 1 - Atividade de peroxidase (mol H2O2 decomposto minuto mg de protena ) em plantas de abacaxizeiro propagadas in
-1
vitro, em diferentes nveis de salinidade (0; 0,57; 1,15 e 2,30 g. L de NaCl), durante 90 dias.
Os resultados provavelmente relacionam-se tanto com o
estdio de desenvolvimento das gemas quanto com o efeito
do estresse salino durante o processo de crescimento.
Segundo LEVITT (1980), o NaCl provoca diminuio da
sntese de protena e aumenta a hidrlise protica em grande
grupo de plantas, sendo a hidrlise considerada o efeito
primrio do sal. Observou-se neste trabalho que, nos primeiros
15 dias de exposio ao sal, ocorreu reduo dos teores de
protenas com maior intensidade em alta salinidade, com
diferena significativa entre os nveis salinos e o controle. O
decrscimo no contedo de protena pode refletir
retardamento na sntese protica ou acelerao na sua
degradao, levando ao aumento na quantidade de
aminocidos livres ou inibio da incorporao destes
aminocidos nas protenas.
-1
No nvel de salinidade de 2,30 g.L observou-se maior
concentrao de protenas aos 30 dias, tendo resultados
semelhantes sido relatados por KRISHNAMURTHY
& BHAGWAT (1989), que comprovaram acmulo de protenas
solveis em brotos de arroz cultivados em meio salino quando
comparado com o controle, sem sal. Este acmulo foi
considerado uma adaptao para a sobrevivncia em estresse
salino. Esta pode ser uma hiptese para o acmulo de
protenas no tratamento salino aos 30 dias; isto , uma
adaptao ao estresse, garantindo o desenvolvimento da
gema em alta salinidade, j que, visualmente, injrias
causadas pelo estresse salino no foram observadas.
Os resultados da salinidade em plantas propagadas in
vitro de abacaxizeiro em relao aos teores de protenas totais
solveis esto demonstrados na Tabela 5, enquanto que os
resultados grficos esto apresentados na Figura 2.
No controle, ocorreu diminuio dos teores de protenas
aos 15 dias, com diferena significativa em relao aos nveis
salinos. Aos 30 dias estas protenas mostraram pequeno
aumento, tambm com diferena significativa dos meios
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PIZA et al. Atividade de peroxidase e nveis de protenas em plantas de abacaxizeiro micropropagadas em meio salino
0 g/L
3,5
0,57 g/L
1,15 g/L
2,30 g/L
2,5
1,5
0,5
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Dias de Coletas
-1
R = 0,6136
2
R = 0,6588
2
R = 0,9684
2
R = 0,8646
-1
Figura 2 - Teores de protenas totais solveis (mg de protena grama de matria fresca ) em plantas de abacaxizeiro
-1
propagadas in vitro, em diferentes nveis de salinidade (0; 0,57; 1,15 e 2,30 g L de NaCl), durante 90 dias.
CONCLUSES
ABSTRACT
The objectives of this work were to analyze the peroxidase
activity in pineapple plants (Ananas comosus L. Merril) cv. Smooth
Cayenne, cultured in vitro on saline medium, as a stress and
organogenesis marker. It also aimed to study the influence of saline
stress on enzyme activity, and analyze the changes in total soluble
proteins. Axillary buds of pineapple were cultured in vitro in MS
medium, supplemented with 8.881 mol L-1 de BAP and 5.37 mol L1
de NAA. The levels of salinity tested were: 0.57 g L-1; 1.15 g L-1 and
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PIZA et al. Atividade de peroxidase e nveis de protenas em plantas de abacaxizeiro micropropagadas em meio salino
2.30 g L-1 of NaCl. Peroxidase activity and total soluble proteins were
evaluated in the development of buds, shoots and roots. The results
showed that peroxidase activity was higher in buds at the highest salt
concentration at 15 days and proteins showed a decrease in all
treatments. Shoots cultured showed that peroxidase activity and total
proteins change with treatments and time. The obtained roots
showed peroxidase activity and total proteins to be higher in saline
medium.
Key words: Ananas comosus, in vitro culture.
REFERNCIAS
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