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1
Cintica Enzimtica
CONCEPTOS BSICOS
DEFINICIONES.
1.CONVERSION.
Nmero de molculas convertidas por nmero de
molculas iniciales.
X
s
: conversin del sustrato S
n
s0
: cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccin.
n
s
: cantidad (moles) de sustrato S al final de la reaccin
CONVERSION.
Este parametro debe maximizarse para
evitar el reciclado del sustrato no convertido.
minimizar el volumen del reactor.
evitar reacciones no deseadas con el sustrato no
tid
CONCEPTOS BSICOS
convertido.
No obstante
grandes conversiones requieren largos tiempos de
reaccin.
grandes conversiones requieren grandes cantidades de
catalizador.
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2
2.RENDIMIENTO
Nmero de molculas de producto sintetizadas
por nmero de molculas iniciales.
CONCEPTOS BSICOS

p
: conversin del producto P
n
p0
: cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccin.
n
p
: cantidad (moles) de producto P al final de la reaccin.

s
: factor estequiomtrico para el sustrato S

p
: factor estequiomtrico para el producto P
RENDIMIENTO.
Junto con la conversin y la selectividad define cuantas
molculas de producto son sintetizadas por molcula de
sustrato.
Esta definicin se refiere al rendimiento analtico, y es el
que debe utilizarse para el entendimiento de los pasos
CONCEPTOS BSICOS
que debe utilizarse para el entendimiento de los pasos
individuales de reaccin y el planteamiento de modelos
cinticos.
Es ms aplicado hablar de rendimiento aislado, que
cuantifica el rendimiento despus de los procesos del
downstream.
Si consideramos el proceso completo, el rendimiento global
es el producto matemtico de todos los pasos individuales.
3.SELECTIVIDAD
Nmero de molculas de producto sintetizadas
por nmero de molculas convertidas.
CONCEPTOS BSICOS

p
: selectividad para el producto p
n
s0
: cantidad (moles) de sustrato S al comienzo de la reaccin
n
s
: cantidad (moles) de sustrato S final de la reaccin
n
p0
: cantidad (moles) de producto P al comienzo de la reaccin.
n
p
: cantidad (moles) de producto P al final de la reaccin.

s
: factor estequiomtrico para el sustrato S

p
: factor estequiomtrico para el producto P
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3
LAS ENZIMAS son protenas que se comportan
como catalizadores muy potentes y eficaces de las
reacciones qumicas de los sistemas biolgicos.
La CATLISIS ENZIMTICA es esencial para los
sistemas vivos.
CONCEPTOS BSICOS
La mayora de las Reacciones Qumicas
ocurriran muy lento en condiciones
biolgicamente significativas.
Hace posible que en condiciones fisiolgicas
tengan lugar reacciones que sin catalizador
requeriran condiciones extremas de presin,
temperatura o pH.
Las biomolculas son muy estables a pH neutro,
temperatura suave y ambiente acuoso
Caractersticas
Como catalizadores, los enzimas actan en pequea
cantidad y se recuperan indefinidamente, in vivo.
No llevan a cabo reacciones que sean
CONCEPTOS BSICOS
No llevan a cabo reacciones que sean
energticamente desfavorables, sino que solamente
aceleran las que espontneamente podran
producirse. G
o
<0
Los enzimas son catalizadores especficos: cada
enzima cataliza un solo tipo de reaccin, y casi
siempre acta sobre un nico sustrato o sobre un
grupo muy reducido de ellos. Esto es cierto in vivo,
peor no in vitro, lo cual es el origen de las
Biotransformaciones
Estructura-actividad cataltica
La actividad cataltica
depende del
mantenimiento de la
conformacin proteica
nativa
Si se desnaturaliza la
protena o se disocia en
subunidades pierde su
actividad.
Estructuras 1, 2, 3 y 4
son esenciales
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4
El sustrato es reconocido por la enzima
(centro de reconocimiento) y Biotransformado en
el centro activo
Lisozima y su
substrato
Cofactor (Coenzima):
tomo, ion o molcula que participa en el proceso
cataltico sin ser enzima ni substrato.
Los cofactores participan de dos maneras distintas:
1. A travs de una fijacin muy fuerte a la protena y no son
modificados en el ciclo cataltico.- cofactor
2. Como un segundo substrato; se ven modificados en
el ciclo cataltico y por lo general requieren otra enzima
para volver al estado original.- coenzima
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5
Reacciones metablicas
y su regulacin
Catalizadores
en sntesis
Diagnsticos enfermedades
Distribucin
intracelular de las
enzimas
Localizacin por
Histoenzimologa
Ensayos Elisa
Biotransformaciones
Se pueden extraer sin
perder actividad
biolgica
Extractos se usa para
Estudios de :
y g
Estructuras y
mecanismos de accin
en sntesis
industrial
enzimas
La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por
enzimas. Estos estudios proporcionan informacin directa acerca del
mecanismo de la reaccin cataltica y de la especifidad del enzima.
CINTICA ENZIMTICA
y
La velocidad de una reaccin catalizada por un enzima puede medirse con
relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar
el enzima. La medida se realiza siempre en las condiciones ptimas de pH,
temperatura, presencia de cofactores, etc, y se utilizan concentraciones
saturantes de sustrato.
En estas condiciones, la velocidad de reaccin observada es la velocidad
mxima (V
max
). La velocidad puede determinarse bien midiendo la aparicin
de los productos o la desaparicin de los reactivos.
Al seguir la velocidad de aparicin de producto (o de desaparicin del sustrato) en
funcin del tiempo se obtiene la llamada curva de progreso de la reaccin, o
simplemente, la cintica de la reaccin. A medida que la reaccin transcurre, la
Cintica de aparicin de
producto
velocidad de acumulacin del producto va disminuyendo porque se va consumiendo el
sustrato de la reaccin. Para evitar esta complicacin se procede a medir la velocidad
inicial de la reaccin (v
0
).
La velocidad inicial de la reaccin es igual a la pendiente de la curva de avance a
tiempo cero. De esta forma, la medida de v
0
se realiza antes de que se consuma el 10%
del total del sustrato, de forma que pueda considerarse la [S] como esencialmente
constante a lo largo del experimento. Adems, en estas condiciones no es necesario
considerar la reaccin inversa, ya que la cantidad de producto formada es tan
pequea que la reaccin inversa apenas ocurre. De esta forma se simplifican
enormemente las ecuaciones de velocidad.
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6
Para estudiar la cintica enzimtica se mide el efecto de la concentracin
inicial de sustrato sobre la velocidad inicial de la reaccin, manteniendo la
cantidad de enzima constante.
Si representamos v
0
frente a [S]
0
obtenemos una grfica como la de la Figura.
Cuando [S]
0
es pequea, la velocidad inicial es directamente proporcional a
la concentracin de sustrato, y por tanto, la reaccin es de primer orden.
A elevadas [S]
0
, el enzima se encuentra saturada por el sustrato, y la
velocidad ya no depende de [S]
0
. En este punto, la reaccin es de orden
cero y la velocidad es mxima (V
max
).
Activador: Agente que aumenta la actividad enzimtica
Inhibidor: Agente que disminuye la actividad enzimtica
Inhibidor reversible: establece un equilibrio reversible con la
Enzima. Un aumento en la ocncentracin de sustrato elimina la inhibicin
E + I EI E I EI
Inhibidor irreversible: modifica qumicamente a la enzima.
Un aumento de la concentracin de sustrato no reactiva la enzima
E + I E
4.1 PARMETROS BSICOS
SELECTIVIDAD.
Describe las molculas de producto sintetizadas en relacin
con todas las molculas convertidas.
Debe ser lo ms cercana posible a 1 para evitar gastos
innecesarios de sustrato, por lo que es uno de los factores
econmicos ms importantes econmicos ms importantes.
Es un parmetro decisivo para estimar el tiempo de
reaccin, pues su evaluacin continua nos indicar si dedemos
detener la reaccin en un momento determinado.
La combinacin de estos tres parmetros bsicos nos lleva
a la siguiente ecuacin:.
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7
Velocidades de las reacciones qumicas
efecto de los catalizadores
Velocidades de reaccin y orden de reaccin
Reacciones de 1 Orden
Para la reaccin irreversible:
A B
[A]/[A]
0
= e
-(k-1t)
k
1
[s
-1
]
donde [A]
0
= concentracin inicial de A cuando t = 0.
Integrando la ecuacin anterior
Representacin grfica
Los procesos bioqumicos son reversibles
[A]
k
1
k-
-1
[B]
Donde k
1
y k
-1
son constantes de velocidad de 1
er
orden, directa e inversa.
En el equilibrio
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8
Reacciones de 2 Orden
2A
k
2
B
Velocidades de las reacciones qumicas
efecto de los catalizadores
Donde k
2
es cte de v de 2 orden [(mol/L)
-1
s
-1
]
Los esquemas de reacciones complejas se simplifican con un paso limitante
de la velocidad
Estados de transicin y Barreras de
reaccin
Qu determina la velocidad de una
reaccin?
Barrera energtica
Estado de transicin
Estados de transicin y Barreras de reaccin
K = e
- G /RT
K = e
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Qu hace un catalizador?
Disminuye la energia libre de activacin G

sin afectar a la energa libre del proceso G
o
Reaccin Energa de activacin
(Kcal*mol
-1
)
Cmo funcionan las enzimas
Los enzimas disminuyen la energa de
activacin de las reacciones
( )
H
2
O + O
2
18
b) el hierro cataltico (Fe) realiza la reaccin
H
2
O
2
H
2
O + O
2
13
H
2
O
2
H
2
O + O
2
12
H
2
O
2
H
2
O + O
2
5
el perxido de hidrgeno se descompone en:
H
2
O
2
c) el platino cataltico (Pt) realiza la reaccin :
d) la catalasa una enzima heptica la realiza
Qu hace un catalizador?
Cmo reduce el
catalizador la barrera
energtica?
Reduccin de entropa
Desolvatacin
Se compensa tensin o
distorsin del sustrato
Consigue alineamiento
entre grupos funcionales
catalticos de la E y el S
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10
Cmo actan las enzimas como
catalizadores?
Sitio Activo Sitio Activo
1.- El enzima y su
sustrato
2.- Unin al centro
activo
3.- Formacin de
productos
Cmo actan las enzimas como
catalizadores?
Hiptesis de la Cerradura y la llave (E. Fischer, 1894)
Sustrato y enzima se acoplan de forma estereospecfica,
de la misma manera que una llave se ajusta a su cerradura.
Modelo aceptado durante mucho tiempo; hoy se considera
insuficiente al no explicar algunos fenmenos de la inhibi-
cin enzimtica, por ejemplo
Cmo actan las enzimas como
catalizadores?
Hiptesis del Ajuste Inducido (Daniel Koshland, 1958)
E Induce al S a configuracin aproximada al Estado de
Transicin
1. UNE S
2. REDUCE EE
aa
2. REDUCE EE
aa
3. IMPULSA Catlisis
4. LIBERA P
5. SE REGENERA
Tanto la enzima como el substrato sufren una alteracin
en su estructura por el hecho fsico de la unin.
Est mucho ms de acuerdo con todos los datos experimen-
tales conocidos hasta el momento.
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11
La teora del Ajuste Inducido se ampla en la actualidad
definiendo la accin enzimtica como
Estabilizacin del Estado de Transicin
Segn lo cual, el Centro Activo enzimtico es en realidad
complementario no al substrato o al producto, sino al
estado de transicin entre ambos.
Cintica de Michaelis-Menten
Para explicar la relacin observada entre la velocidad inicial (v
0
) y la
concentracin inicial de sustrato ([S]
0
) Michaelis y Menten propusieron
que las reacciones catalizadas enzimticamente ocurren en dos
etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y
en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacin
del producto, liberando el enzima libre:
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Cintica de la Catlisis
Enzimtica
Cintica de Michaelis-Menten
1 etapa se forma el complejo enzima-
sustrato.
2 etapa, el complejo enzima-sustrato da lugar a
l f i d l d lib d l i
k
1
K
-1
k
2
la formacin del producto, liberando la enzima
libre:
Paso lento
V
1
= k
1
[E] [S]
V
2
= k
2
[ES]
V
3
= k
3
[ES]
k
1
k
3
E + S ES E+ P
k
2
Cintica de la Catlisis Enzimtica
En este esquema, k
1
, k
-1
y k
2
son las constantes cinticas
individuales de cada proceso y tambin reciben el
nombre de constantes microscpicas de
velocidad. Segn esto, podemos afirmar que:
v
1
= k
1
[E] [S]
V
2
= k
2
[ES]
v
3
= k
3
[ES]
Podra Expresarse V como funcin de [E]
t
y [S]
Asumiendo que E y S estn en equilibrio cuando k
2
<< k
-1
K
s
cte de disociacin
Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unida al
sustrato (ES), de forma que la concentracin total de enzima, [E
T
],
(que es constante a lo largo de la reaccin) es:
[E
T
] = [E] + [ES]
Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v
1
= k
1
[S] [E
T
] - k
1
[S] [ES]
Este modelo cintico adopta la hiptesis del estado
estacionario, segn la cual la concentracin del
complejo enzima-sustrato es pequea y constante a lo
largo de la reaccin Por tanto la velocidad de formacin
Pero E, S y ES no estn en equilibrio pues ES se conviente en P
Continuamente
Modelo de Briggs Haldane: Estado Estacionario
largo de la reaccin. Por tanto, la velocidad de formacin
del complejo enzima-sustrato (v
1
) es igual a la de su
disociacin (v
2
+ v
3
):
v
1
= v
2
+ v
3
Adems, como [ES] es constante, la velocidad de
formacin de los productos es constante:
v = v
2
= k
2
[ES] = constante.
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13
Como v
1
=v
2
+v
-1
, podemos decir que:
k
1
[S] [E
T
] - k
1
[S] [ES] = k
2
[ES] + k
3
[ES]
Despejando [ES], queda que:
siendo
donde la expresin (k
2
+k
3
)/k
1
se ha sustituido por K
M
, o
constante de Michaelis-Menten.
Esta relacin nos explica las razones que hacen de la K un Esta relacin nos explica las razones que hacen de la K
M
un
parmetro cintico importante.
Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formacin
del producto es:
v = v
3
= k
3
[ES] =
Para cualquier reaccin enzimtica, [E
T
], k
3
y K
M
son constantes.
Vamos a considerar dos casos extremos:
A concentraciones de sustrato pequeas ([S] << K
M
) v = (k
3
[E
T
]/K
M
) [S].
Como los trminos entre parntesis son constantes, pueden englobarse en
una nueva constante, k
obs
, de forma que la expresin queda reducida a: v =
k
obs
[S], con lo cual la reaccin es un proceso cintico de primer orden.
A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), v = k
3
[E
T
]. La
velocidad de reaccin es independiente de la concentracin del sustrato, y
por tanto, la reaccin es un proceso cintico de orden cero. Adems,
t t k [E ] t t it d fi i tanto k
3
como [E
T
] son constantes, y nos permite definir un nuevo
parmetro, la velocidad mxima de la reaccin (V
max
): V
max
= k
3
[E
T
], que
es la velocidad que se alcanzara cuando todo el enzima disponible se
encuentra unido al sustrato.
Si introducimos el parmetro V
max
en la ecuacin general de la velocidad,
(la frmula recuadrada anteriormente), obtenemos la expresin ms
conocida de la ecuacin de Michaelis-Menten:
Cintica de la Catlisis Enzimtica
Pero E, S y ES no estn en equilibrio pues ES se convierte en P Continuamente
Modelo de Briggs Haldane: Estado Estacionario
Entonces
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Cintica de la Catlisis
Enzimtica
K
M
es caracterstica de
cada reaccin
Tiene unidades de
concentracin
Ecuacin de Michaelis Ecuacin de Michaelis - - Menten Menten
concentracin
Cuando K
M
>> [S] se
alcanza V
max
Cintica de la Catlisis Enzimtica
Para reacciones de pasos mltiples:
K
2
es un caso particular la K
cat
Se hace un anlisis similar pero teniendo presente el paso lento
de la reaccin como determinante de la misma
Cintica de la Catlisis
Enzimtica
Significado de K
M
, K
cat
, K
cat
/K
M
K
M
Cuando k
2
<< k
-1
Entonces K
M
k
-1
/k
1
= K
Afinidad de la enzima por el sustrato
K
M
= [S] cuando V = V
max
Es una medida de la [S] necesaria para alcanzar
una catlisis eficaz
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Cintica de la Catlisis
Enzimtica
Significado de K
M
, k
cat
, k
cat
/K
M
k [segundos
-1
] k
cat
[segundos
-1
]
Medida directa de la produccin cataltica en
condiciones ptimas (enzima saturada)
Tiempo necesario para cambiar S en P
Nmero de recambio (N molculas de S
transformadas por segundo)
Cintica de la Catlisis Enzimtica
Significado de K
M
, k
cat
, k
cat
/K
M
k
cat
/ K
M
Cuando [S] << K
M
Entonces [E]
t
<< [E]
Medida directa de eficiencia y especifidad
de la enzima
Permite comparar eficiencia de una
enzima con diferentes sustratos
Valor mximo entre 10
8
y 10
9
(mol/L)
-1
s
-1
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Cintica de la Catlisis Enzimtica
Algunos valores representativos
Cintica de la Catlisis Enzimtica
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Cintica de la Catlisis
Enzimtica
Representacin doble inversa o de Lineweaver-
Burk
Cintica de la Catlisis
Enzimtica
Representacin de Eadie- Hofstee
Factores que afectan la velocidad de reaccin
En condiciones de
concentracin de [E],
Efecto de la variacin de la concentracin del
sustrato
[ ]
pH y temperatura
constante se observa
que la accisa
correspondiente a
Vmax/2 es Km
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Factores que afectan la velocidad de reaccin
En condiciones de
concentracin de S
Efecto de la variacin de la concentracin de
la enzima
concentracin de S
crecientes hasta la
saturacin, pH y
temperatura constante se
observa que la velocidad
inicial crece con [s]
Factores que afectan la velocidad de reaccin
Efecto de la temperatura sobre la actividad
enzimtica
En general, los aumentos de temperatura aceleran las
reacciones qumicas: por cada 10C de incremento, la
velocidad de reaccin se duplica, Q
10.
Factores que afectan la velocidad de
reaccin
Efecto del pH sobre la actividad enzimtica
Los enzimas poseen grupos qumicos ionizables
(carboxilos -COOH; amino -NH
2
; tiol -SH;
imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus
aminocidos
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Cintica Enzimtica
Reacciones en que intervienen dos o
ms sustratos. Puede haber dos casos
extremos:
Unin aleatoria de los sustratos
La fosforilacin de la glucosa con ATP, catalizada con hexokinasa, con tendencia a
unirse a la glucosa en primer lugar.
Unin ligeramente priorizada de uno de los sustratos
Cintica Enzimtica
Reacciones en que intervienen dos o ms
sustratos
Unin ordenada de los sustratos
Se observa en oxidaciones de sustratos con la coenzima
nicotinamida adenindinucleotido (NAD+).
Cintica Enzimtica
Reacciones en que intervienen dos o ms
sustratos
Mecanismo ping-pong
La ruptura de una cadena polipetdica con una serin-
proteasa, tal como la tripsina o la -chymotripsina.
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Cintica Enzimtica
Anlisis cintico en el estado estacionario de las reacciones bi-
sustrato
Cintica Enzimtica
Mecanismos de Inhibicin
Inhibidor competitivo Inhibidor no competitivo
Cintica Enzimtica
Mecanismo de Inhibicin Reversible
Inhibicin competitiva
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Mtodos grficos de determinacin del proceso de inhibicin
Cintica Enzimtica
Mecanismos de Inhibicin Reversibles
Inhibicin no competitiva
Mtodos grficos de determinacin del proceso de inhibicin
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22
Cintica Enzimtica
Mecanismos de Inhibicin Reversibles
Inhibicin no-competitiva
Cintica Enzimtica
Mecanismos de
Inhibicin Irreversibles
Anlogos del estado de
transicin
Marcadores de afinidad
Inhibidores suicidas
Activador alostrico: favorece
la unin del sustrato
Inhibidor alostrico: impide la
unin del sustrato
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Elementos de la
reaccin
El enzima no fosforilado es
inactivo
El enzima fosforilado es
activo
Activacin enzimtica por fosforilacin de la enzima
Resolucin de mezclas racmicas
Hay tres metodologas para preparar compuestos pticamente puros
1) Partir de compuestos quirales enantiomricamente puros
(se obtiene de la Naturaleza)
2) Resolucin cintica de mezclas racmicas
3) Sntesis asimtrica a partir de sustratos proquirales y un catalizador 3) Sntesis asimtrica a partir de sustratos proquirales y un catalizador
quiral
El primer mtodo tiene el problema de la dificultad de hallar el producto adecuado
en la Naturaleza
La biocatlisis se emplea a nivel industrial en los otros dos mtodos dadas las
Caractersticas de las enzimas como catalizadores.
Resolucin cintica
Se basa en la distinta velocidad de reaccin de cada uno de los dos
Enantimeros de un racmico frente a un catalizador quiral
En el caso ideal, el mximo rendimiento que se puede obtener es de un 50%.
No obstante siempre el valor es menor pues la velocidad de reaccin depende
de la concentracin de sustrato y a medida que avanza la resolucin el proceso
se ralentiza para el enantimero mas gastado.
RR
Racemico
(R+S)
S
%R-%S
e.e =------------
%R + %S
*para lograr buenos e.e. se detiene la reaccin antes de llegar al 50% de
rendimiento
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HO OH H H
Resolucin de alcoholes secundarios empleando hidrolasas
R1 R2
OH
O
O
R
4
R1 R2
O
R4
O
+
R3
R1 R2
O
R
4
O
o
Lipasas
Proteasas
R
O
O R
O
O R
O
O CCl3 R
O
O
AGENTES ACILANTES QUE FAVORECEN LA IRREVERSIBILIDAD DE LA RESOLUCION
DE MEZCLAS RACMICAS
4.1 PARMETROS BSICOS
4.EXCESO ENANTIOMRICO
En una mezcla de dos enantimeros, es el
porcentaje de uno de los enantimeros menos el
del otro.
ee
R
: exceso enantiomrico del enantimero R.
n
R
: cantidad (moles) del enantimero R
n
S
: cantidad (moles) del enantimero R
PARMETROS BSICOS en biocatlisis
EXCESO ENANTIOMRICO.
Describe la pureza ptica de una molcula pticamente
activa.
Debido a que los dos enantimeros pueden tener
propiedades muy diferentes, deben buscarse procesos que
transcurran de manera lo ms enantioselectiva posible.
M h b d l i d i d d i Muchos procesos, sobre todo en la industria de produccin
de frmacos y agroqumicos (pesticidas, fungicidas, ), que
originalmente se producan en forma racmica, comienzan a
ser producidos de forma enantiomricamente pura.(RACEMIC
SWITCH).
Ventajas obvias: se produce menos del enantimero no
deseado, aumenta la capacidad de la fbrica, hay menos
contaminacin, ..
17/02/2010
25
Enantiomeric ratio = E
E = ___Va___= _(kcat/Km)a___
Vb (kcat /Km)b
Substrate E = _ln [(1-c) (1-ees)]_
G

= -RT ln E
PARMETROS BSICOS en biocatlisis
ln [(1-c)(1+ees) ]
Product E= __ln [1-c(1+eep)]
ln [1-c(1-eep)]
R1 R2
OH
O
O
R4
R1 R2
O
R4
O
+
R3
R1 R2
O
R4
O
o
Condiciones para realizar una resolucin cintica dinmica (DKR)
PARMETROS BSICOS en biocatlisis
1.- La resolucin cintica debe ser eficiente (E >20)
2.- La racemizacin debe ser rpida . Al menos 10 veces mas rpida que la reaccin de la
enzima con el enantimero menos activo
k
rac
> 10 k
ent-s
3.- La reaccin de racemizacin no debe dar lugar a la formacin de subproductos
4.-El metal de transicin usado no debe racemizar el producto de reaccin
5.- Lla resolucin cintica y la racemizacin deben ser compatibles y eficaces en
las mismas condiciones de reaccin. One pot synthesis.
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Resolucin cintica dinmica de alcoholes secundarios
y de aminas primarias
PARMETROS BSICOS en biocatlisis
Matute An.Quim. 2006, 102, 46-52
Resolucin cintica dinmica
PARMETROS BSICOS en biocatlisis
Hoyos y col J.Org.Chem 2006, 71,7632-7
100% e.e.
98% yield
TIPOS DE PRECISIN ENZIMTICA
LA PRECISIN SE TRADUCE EN:
SELECTIVIDAD HACIA SUSTRATO
QUIMIOSELECTIVIDAD (grupo)
REGIOSELECTIVIDAD (zona)
ESTEROSELECTIVIDAD (esteroqumica)
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5.NMERO DE RECAMBIO
(TURNOVER NUMBER).
Nmero de molculas sintetizadas por nmero
de molculas de catalizador usadas.
PARMETROS BSICOS en biocatlisis
tn : nmero de recambio
n
P
: cantidad (moles) de producto P al final de la reaccin
n
cat
: cantidad (moles) de catalizador

p
: factor estequiomtrico para el producto P
NMERO DE RECAMBIO Turnover number.
Es una medida de la eficiencia del catalizador.
tn debe ser lo mayor posible con vistas a la reduccin del
precio final del producto, sobre todo en los casos en los que
el catalizador sea muy caro.
PARMETROS BSICOS en biocatlisis
Suele combinarse con otros parmetros (velocidad de
desactivacin, tiempo de vida medio) para dar una idea ms
correcta de la eficacia del catalizador.
En el caso de reacciones en las que existan cofactores o
coenzimas necesarias para la actividad cataltica se pueden
definir valores de tn para estas molculas.
6.FRECUENCIA DE RECAMBIO
Nmero de molculas convertidas por unidad de
tiempo.
PARMETROS BSICOS en biocatlisis
tof : frecuencia de recambio (s
-1
)
n
s
: diferencial de cantidad (moles, moles ) de sustrato
convertido
n
cat
: cantidad (moles, moles ) de catalizador
t : diferencial de tiempo para la conversin (s)
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FRECUENCIA DE RECAMBIO.
Es una medida de la actividad enzimtica.
Es mucho mayor para biocatalizadores que para
catalizadores qumicos.
Ej l
PARMETROS BSICOS en biocatlisis
Ejemplo:
catalizador qumico para la epoxidacin (Mn-Saleno):
tof 3 h
-1
.
Catalizador enzimtico: cloroperoxidasa (CPO): tof
4500 h
-1
Pero tambin deben considerarse los pesos moleculares:
635 frente a 42000 g mol
-1.
7. ACTIVIDAD ENZIMTICA
Velocidad de reaccin por unidad de peso de
catalizador (protena).
PARMETROS BSICOS en biocatlisis
V : mxima actividad de la enzima en unas condiciones
determinadas (katal kg
-1
, U mg
-1
)
n
s
: diferencial de cantidad (moles, moles) de sustrato
convertido
m
cat
: peso (kg, mg ) de catalizador
t : diferencial de tiempo para la conversin (s, min)
ACTIVIDAD ENZIMTICA.
La unidad en el Sistema Internacional: KATAL (kat = mol
s
-1
= 6 10
7
U)
.
Como suelen ser valores muy pequeos, se
habla generalmente de microkat, nanokat o picokat.
Es ms prctico el uso de UNIDADES (1U = 1 molmin
-1
).
Los valores de actividad deben expresarse siempre para un
sustrato determinado y en unas determinadas condiciones de
PARMETROS BSICOS en biocatlisis
sustrato determinado y en unas determinadas condiciones de
reaccin (temperatura, tipo y conc. de buffer, pH, )
Para determinar la concentracin de una disolucin de
protena ser suelen emplear mtodos indirectos, bien
fotomtricos (Bradford, Biuret, Lowry) o analticos
(electroforesis)
La actividad tambin puede expresarse por unidad de
volumen (UmL
-1
) cuando la concentracin enzimtica no
puede determinarse.
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8. VELOCIDAD DE DESACTIVACIN
Es la prdida de actividad cataltica por unidad
de tiempo.
PARMETROS BSICOS en biocatlisis
k
deact
: velocidad de desactivacin.
V
0
: actividad de la enzima al comienzo de la medicin (U mg
-1
)
V
1
: actividad de la enzima al final de la medicin (U mg-1)
t
0
: tiempo inicial de medicin (min, h, d)
t
1
: tiempo final de medicin (min, h, d)
Expresa la estabilidad del catalizador.
9. VIDA MEDIA
Tiempo al que la actividad enzimtica se reduca
a la mitad.
t
1/2
: vida media (min, h, d)
k
deact
: velocidad de
desactivacin.
V
x
: actividad de la enzima un
tiempo x (U mg
-1
)
t ti di i ( i h d)
PARMETROS BSICOS en biocatlisis
t
x
: tiempo medicin (min, h, d)
Expresa estabilidad.
Suele seguir un
decaimiento exponencial
TIPOS DE PRECISIN ENZIMTICA
SELECTIVIDAD DE SUSTRATO
Incluso conociendo la estructura 3D de una enzima, a veces es difcil entender
por qu una enzima reconoce un tipo de sustratos, mientras que otros similares no
son transformados.
Por ejemplo, la transaminasa de Escherichia coli puede producir una gran variedad
de 2-oxocidos usando cido L-glutmico o L-Asprtico como donador del grupo
amino.
Proceso irreversible
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TIPOS DE PRECISIN ENZIMTICA
SELECTIVIDAD DE GRUPO FUNCIONAL
Es la capacidad de las enzimas para actuar sobre un grupo
funcional determinado en una molcula en la cual existe otro grupo
funcional ms reactivo en condiciones qumicas.
TIPOS DE PRECISIN ENZIMTICA
REGIOSELECTIVIDAD
Es la capacidad de las enzimas para actuar sobre un grupo funcional
determinado en una molcula en la cual existe otro grupo funcional similar o
idntico en reactividad.
O
R2 O O
OCH3 R1
lipasa de
Geotrichum candidum
medio acuoso
OH O
OCH3 R1
+
O
R2 O O
OCH R
(S)
(R,S)
esteres de cidos grasos con
sustituyentes aciloxi en beta
OCH3 R1
(R)
inalterado
R1 R2 selectividad (E)
heptilo propilo 11
undecilo propilo 20
pentadecilo propilo 20
5,5-dibutilpentilo propilo 62
undecilo clorometilo 3
undecilo heptilo 5
TIPOS DE PRECISIN ENZIMTICA
HO N N
Tyr O H Gly O H R
N
S
CH3
CH3
H H
O
N
O
H O
N
H H
O
N
O
H O
S
CH3
CO2H
Acilasa
Acilasa
N
S
CH3
CH3
H H
O
H2N
N
H H
O
H2N S
CH3
CO2H
HO
N
N
N
N
NH2
O H Gly O H Phe O
R= Leu Leu-encefalina
R= Met Met-encefalina
-quimotripsina
papaina
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TIPOS DE PRECISIN ENZIMTICA
OCH3
Cl
H3CO O
O
OCH3
O
H3C
OCH3
Cl
H3CO O
O
O
H3C
HO
Batrylis alii Cercospora melonis
OCH3
Cl
HO O
O
OCH3
O
H3C
GRISEOFULVINA
-quimotripsina
CH3
HO
O
O
H3C
O
O
CH3
N
Microsporum
canis
OH
Cl
H3CO O
O OCH3
O
H3C
Ref.- BOOTHROYD, B. y cols. (1961) Biochem. J. , vol. 80, p. 34
GRISEOFULVINA
(antibitico)
N
CH3
O
O
H3C
OH
N
O
O
HO
hidrlisis qumica del
acetato en 6-alfa -
hidrlisis enzimtica del
ester dihidrocinmico en
3-beta
Chapmann, P. J. y cols.-
(1965)
. Biochem. Biophys.
Res. Commun. vol. 20, p. 104
Lin, Y.Y. y Jones, J. B. (1973)
J. Org. Chem. vol.38, p. 3575
TIPOS DE PRECISIN ENZIMTICA
N
OH
OH
OH
H
HO
subtilisina
butirato de tricloroetilo
piridina
N
OH
OH
H
HO
O
O
82 %
CASTANOSPERMINA
inhibidor de glucosidasa
agente antineoplsico
tratamiento del SIDA
lipasa de
Chromobacterium viscosum
butirato de tricloroetilo
N
OH
H
HO
O
O
O
O
72 %
MARGOLIN, A.L. y cols. 1990 J.Am.Chem.Soc ., 112, 2849
TIPOS DE PRECISIN ENZIMTICA
ESTEREOSELECTIVIDAD
Es la capacidad de las enzimas para reconocer quiralidad o
proquiralidad en un sustrato.
Es sin duda la propiedad enzimtica ms empleada en
Biotransformaciones.
C m la quiralidad es una cuestin de espaci un sustrat debe Como la quiralidad es una cuestin de espacio, un sustrato debe
ubicarse de una manera determinada en tres dimensiones para permitir
un alto grado de enantioselectividad.
Existe una teora basada en este hecho, como es la llamada REGLA DE
LOS TRES PUNTOS, que permite explicar los tres tipos de
esteroselectividad enzimtica.
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TIPOS DE PRECISIN ENZIMTICA
DISCRIMINACIN ENANTIOTPICA
A
C
B
A
accin
enzimtica
pro-R
pro-S
C
B
A
A
B
C
A
C
B
A
C
B
A
C
B
A
A
C
A
B
A
A
B
C
pro-R
pro-S pro-S pro-S
pro-R
pro-R
A. OGSTON, Nature, 1948, 162, 963
REGLA DE LA UNIN POR
TRES PUNTOS
C
B
A
cara Re
cara Si
C
B
A
A
B C
C
A
B
A
B C
ataque Si
ataque Re
REGLA DE LA SECUENCIA
A>B>C
DISCRIMINACIN
ENANTIOFACIAL
TIPOS DE PRECISIN ENZIMTICA
DISCRIMINACIN ENANTIOMRICA
D
C
B
A
D
A
B
C
(S) (R)
D
C
B
A
D
A
B
C
D
A B
C
D
A
B C
C
B
A
accin
enzimtica
C A C A
C A
B
A C
B
A
B
E
+ A
[EA]
[EB]
E + P
E + Q +B
ASPECTOS CINETICOS de la resolucin de racmicos
[EB] E + Q +B
G
#
= H
#
- TS
#
= -RTln (V
A
/V
B
)
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33
G
#
(kcal/mol) V
A
/ V
B
ee (%)
0.118 1.2 10
0.651 3 50
1 74 19 90
PARMETROS BSICOS en biocatlisis
1.74 19 90
2.17 39 95
3.14 199 99
4.50 1999 99.9