Licenciatura em Bioqumica 2 Ano

Laboratrios de Biofsica/Bioqumica





I - Isolamento de transtirretina recombinante produzida em E. coli por
cromatografia de troca inica
II Anlise de protenas por eletroforese e immunoblotting
III ELISA





RELATRIO








Data de entrega: 29-05-2014

Realizado por: Alexandra Teixeira, Catarina Cunha, M Ins Silva

Grupo 4, PL3
2

0.000
0.500
1.000
1.500
2.000
2.500
3.000
3.500
4.000
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A
b
s

2
8
0

n
m
Tubo ou fraco adicionada
Resultados


1. Cromatografia de troca inica - apresente os resultados sob a forma de tabela e trace o
grfico com os valores obtidos para a cromatografia de troca inica (cromatograma).


Tabela 1 Registo dos valores de absorvncia em cada tubo (obtidos por cromatografia de troca inica) e do volume
total transferido aps cada adio de 2 mL.

Tubo Volume total / ml Absorvncia
280 nm

1 2 0.307
2 4 3.259
3 6 3.037
4 8 2.457
5 10 1.075
6 12 0.593
7 14 0.374
8 16 0.230
9 18 0.180




















Figura 1 Representao grfica dos valores de absorvncia a 280 nm das fraes obtidas por cromatografia de
troca inica.



3

2. Descreva sucintamente o protocolo para a eletroforese e para o immunoblotting tal como
foram executados na aula.

Numa primeira fase, foram preparados quatro tubos das amostras (como descrito no ponto 2.2 do
protocolo fornecido): antes do IPTG, depois do IPTG (amostras previamente fornecidas), lisado e pico
(previamente obtidas por cromatografia de troca inica). Posteriormente, as amostras foram fervidas
durante dois minutos para se dar a desnaturao da protena. Em seguida, aps montagem do suporte de
eletroforese, foram aplicados 20 L das amostras nos poos do gel, assim como 4 L dos marcadores de
massa molecular (de acordo com a seguinte ordem: marcador; antes IPTG; depois IPTG; lisado; pico). Por
fim, ps-se a correr o gel, aplicando uma corrente de 200 mV (72 mA, 14 W) durante 30 minutos.
Correram-se dois gis, em simultneo, de poliacrilamida em meio desnaturante. Foi utilizado um gel
contnuo a 12% de acrilamida, da Mini Protean TGX Stain Free, Precast Gels 12%, BIO-RAD (j
preparado, no foi polimerizado na aula).
No final da eletroforese, um dos gis foi utilizado para ser corado por Coomassie Blue (de modo a
verificar-se a distncia migrada e calcular-se o peso molecular de cada protena) e o outro foi utilizado para
Immunoblotting.
O ltimo gel foi transferido para uma membrana de nitrocelulose em tampo de transferncia.
Preparou-se a cassete de transferncia, colocando-se esse gel de poliacrilamida sobre cerca de 6 folhas de
papel molhadas no mesmo tampo e tapado com mais 6 folhas de papel nas mesmas condies. A
transferncia ocorreu durante 10 minutos a 1.3A e 9V.
Posteriormente, bloqueou-se a membrana com uma soluo de leite em p a 5%, de modo a que
ficasse coberta de protenas contidas no leite (como a albumina), impedindo que os anticorpos se liguem
por toda a membrana, mas sim apenas protena que reconhece como antignio (TTR). Lavou-se a
membrana com PBS T e, de seguida, incubou-se durante uma hora a 37 C com um anticorpo anti
transtirretina humana produzido em coelho (1:500). Passado esse tempo, lavou-se novamente a
membrana com PBS T (3 vezes), sendo ulteriormente incubada com anticorpo secundrio (anticorpo
produzido em carneiro contra imunoglobulinas de coelho acoplado peroxidase).
A membrana incubou durante 45 minutos temperatura ambiente. Aps isso, lavou-se 2 vezes com
PBS T e uma vez com PBS. Por fim, colocou-se a membrana em soluo de revelao (contendo DAB, que
reage com a peroxidase, cujo produto confere cor soluo).


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3. Apresente o resultado obtido para a eletroforese de SDS-PAGE e Immunoblotting que
executou. As figuras devem ser devidamente legendadas.

SDS-PAGE
















Figura 2 Resultado da eletroforese em gel de SDS-PAG: 1 marcador de pesos moleculares; 2 Antes do IPTG; 3
Depois do IPTG; 4 Lisado; 5 Pico (os poos no identificados pertencem ao grupo 3).

IMMUNOBLOTTING














Figura 3 Resultado referente membrana de nitrocelulose do Immunoblotting: 1 marcador de pesos
moleculares; 2 Antes do IPTG; 3 Depois do IPTG; 4 Lisado; 5 Pico (os poos no identificados pertencem ao
grupo 3).
1 2 3 4 5
1 2 3 4 5
5

4. Apresente os resultados obtidos para o ensaio de ELISA na seguinte tabela indicando para cada
poo qual a amostra e a absorvncia obtida.


Tabela 3 Valores de absorvncias obtidos nos diferentes poos, para o ensaio de ELISA (resultados em
duplicado).

1 2 3 4
A Controlo;
0.097
Controlo;
0.112
Controlo (sem TTR);
0.108
Controlo (sem TTR);
0.093
B Antes IPTG;
0.442
Antes IPTG;
0.603
TTR diluda 3000x;
0.260
TTR diluda 3000x;
0.248
C Depois IPTG;
0.662
Depois IPTG;
0.638
TTR diluda 1000x;
0.327
TTR diluda 1000x;
0.385
D Lisado;
0.659
Lisado;
0.625
TTR diluda 300x;
0.544
TTR diluda 300x;
0.520
E Lavagem 1;
0.192
Lavagem 1;
0.135
TTR diluda 100x;
0.645
TTR diluda 100x;
0.582
F Pico (50 L);
0.615
Pico (50 L);
0.545
TTR diluda 30x;
0.532
TTR diluda 30x;
0.530
G Pico (80 L);
0.508
Pico (80 L);
0.486
TTR diluda 10x;
0.648
TTR diluda 10x;
0.554
H Lavagem 2;
0.480
Lavagem 2;
0.513
TTR diluda 5x;
0.561
TTR diluda 5x;
0.478


Procederam-se a alteraes no protocolo experimental relativamente aos volumes pipetados: nos tubos 1 e
2, 50 L de PBS-T e 50 L da amostra a analisar; nos tubos 3 e 4, 90 L de PBS-T e 10 L de TTR padro nas
diferentes diluies.


6

Anlise dos Resultados


1. Com base nas propriedades fsico-qumicas da Transtirretina justifique a escolha do sistema
cromatogrfico utilizado (suporte cromatogrfico e solues de equilbrio e eluio).

O ponto isoeltrico da TTR 5.5, logo, a um pH superior encontrar-se- carregada negativamente. Assim, um
trocador aninico como a DEAE celulose (carregado positivamente) favorece a ligao da protena nestas
condies.
Utilizaram-se duas solues de tampo: inicial e final. Ambos apresentam pH 7.0, pelo que em todo o processo o
pH se manteve sempre acima do pI da protena a purificar (o que promove a sua fixao e impede que precipite). O
tampo inicial foi utilizado para remover da mistura todas as protenas em soluo que no a TTR, sendo que esta se
encontrava fixada coluna cromatogrfica; o tampo final (utilizado s aps a densidade tica ser muito prxima de
zero, o que significa que quase todas as partculas que no eram de interesse foram eludas) faz com que a TTR seja
removida da coluna. Isto deve-se ao facto de o tampo final conter NaCl (que confere maior fora inica), ao
contrrio do inicial, o que garante a eluio da protena por competio aos locais de ligao da TTR e dos ies do
eluente (os ies Cl
-
, em grande quantidade, aderem DEAE celulose mais eficazmente que a TTR e, por isso, ela
deixa de estar adsorvida na fase estacionria, saindo). Este mtodo foi utilizado, portanto, numa tentativa de
purificar a protena.


2. Sugira alteraes ao processo de cromatografia de troca inica executado para melhorar os
resultados obtidos.

De modo a melhorar os resultados obtidos poder-se-ia ter utilizado um trocador aninico mais forte/eficaz
que a DEAE celulose, de forma protena se ligar melhor coluna cromatogrfica. Contudo, os custos que da
poderiam advir deveriam ser contrabalanados com a eficincia dos trocadores.
Alm disto, poderia utilizar-se um gradiente de concentrao salina. O uso de uma concentrao fixa elevada
ou intermdia faz com que as protenas sejam eludas todas ao mesmo tempo, junto com o tampo final; ao usar um
gradiente salino, garante-se que as protenas eluam por tamanho e, portanto, possam ser separadas de acordo com
este parmetro.
Ainda, em alternativa, poder-se-ia usar um gradiente de pH, provocando-se a variao da carga global da
protena (a um pH mais alto, ficaria mais fortemente adsorvida na coluna, na primeira fase de extrao de outras
protenas; aquando a eluio, se o pH do tampo final fosse mais baixo, prximo do ponto isoeltrico da TTR ou
abaixo, a eluio seria mais fcil, diminuindo a competio, j que a sua carga seria neutra ou positiva,
respetivamente, o que enfraquecia a ligao DEAE celulose).

7

DM = -5.4433 log (MM) + 27.657
R = 0.903
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20
D
i
s
t

n
c
i
a

m
i
g
r
a
d
a

/

c
m
Log (MM)
3. Represente graficamente a distncia migrada pelas diferentes bandas dos padres em funo do
logaritmo das respetivas massas moleculares. Calcule a massa molecular da transtirretina com
base nos resultados obtidos.


Tabela 3 Valores relativos distncia migrada pelas bandas dos padres usados, bem como a respetiva massa
molecular e seu logaritmo.

Bandas
Massa Molecular /
Da
Log (Massa Molecular) Distncia Migrada / cm
1 120000 5.08 0.4
2 85000 4.93 1.0
3 50000 4.70 1.4
4 35000 4.54 2.3
5 25000 4.40 3.8
6 20000 4.30 4.9























Figura 4 Representao grfica da reta de calibrao obtida a partir da distncia migrada pelas diferentes
bandas dos padres em funo do logaritmo das respetivas massas moleculares.



Para o clculo da massa molecular da transtirretina, foi medida a distncia migrada pela banda mais evidente,
correspondente ao monmero de TTR (detetada apenas atravs do Immunoblotting). A visualizao foi feita na
amostra do pico, situao em que h maior quantidade de protena, bem como maior pureza relativamente s
outras amostras. O valor de distncia migrada foi, ento, substitudo na equao da reta de calibrao, tendo-se
obtido 12171 Da de peso molecular.

8


4. De acordo com os resultados da alnea anterior e com o valor terico de massa molecular da
transtirretina o que que pode concluir acerca da estrutura desta protena?

Por tetrmero, a transtirretina apresenta um peso molecular de 55000 Da; por monmero, o peso molecular
de cerca de 14000 Da.
Esta protena foi sujeita a condies desnaturantes, atravs da eletroforese em SDS-PAGE, pelo que h a
separao das diferentes subunidades. Assim, a massa molecular calculada em 3. corresponde massa de uma nica
subunidade (monmero). A partir do valor obtido pode, ainda, inferir-se que a TTR da amostra do pico no estaria na
forma de dmeros (subunidades primariamente resultantes da desnaturao dos tetrmeros), j que isso promoveria
um aumento de massa molecular, superior a 14000 Da, o que no se verificou. Contudo, prxima dos 25000 Da
verifica-se a existncia de uma banda um pouco evidente, que corresponder ao dmero, o que significa que a
revelao no foi totalmente especfica.
A diferena entre o valor obtido (12171 Da) e o da literatura (14000 Da) pode ser originria da migrao
diferencial dos padres de peso molecular (a distribuio das bandas dos padres no era a melhor, visto que se
verificou uma sobreposio das correspondentes a 85000 e 50000 Da).


5. Justifique a realizao do Immunoblotting aps ter obtido os resultados da eletroforese que
executou. Quais as vantagens deste mtodo?

Normalmente, a partir da eletroforese em SDS PAGE possvel observar-se uma banda que permite
determinar a massa molecular da TTR. No entanto, no nos permite concluir se estamos, efetivamente, perante uma
banda correspondente TTR ou, equivocamente, perante outra protena de peso molecular semelhante. De modo a
comprovar a presena da protena pretendida, procede-se realizao de Immunoblotting, mtodo mais sensvel
dado basear-se numa interao especfica anticorpo-antignio. Este anticorpo (anti TTR), estando associado a um
processo de colorao (ligado peroxidase, que em presena do substrato origina um produto corado), aps ligar-se
protena, permite identific-la como sendo realmente a TTR.
Contudo, de acordo com os resultados apresentados, na eletroforese em SDS PAGE, a TTR no foi sequer
detetada, evidenciado a elevada sensibilidade do Imunnoblotting (consegue detetar a protena em quantidades tais
que a eletroforese no capaz). Assim, as vantagens que este mtodo apresenta so, essencialmente, a elevada
seletividade e sensibilidade. Para alm disso, no difere muito da eletroforese em termos prticos, j que tambm
relativamente rpido e de fcil manuseamento e visualizao de resultados. Contudo, mais dispendioso, devido ao
uso de anticorpos.


6. Comente os resultados obtidos no ELISA e compare-os com os obtidos no Immunoblotting.

Em relao aos resultados obtidos no ELISA, explcitos na tabela 3, de notar que os valores de absorvncia
obtidos so consequncia da colorao conferida pelo produto da peroxidase, acoplada ao anticorpo adicionado ao
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processo, anti TTR. Assim, uma maior absorvncia significa maior quantidade de produto, que revela uma grande
quantidade de anticorpo e, por sua vez, mais TTR no poo, qual ele se ligou. Com isto, podem realar-se alguns
aspectos importantes:
Foi confirmado o efeito do IPTG (isopropiltiogalactgosido), no que toca ao aumento da expresso da
protena, uma vez que se verifica um aumento dos valores de absorvncia dos poos contendo as amostras depois do
IPTG relativamente queles que contm as antes do IPTG (contudo, os dois ensaios, feitos em duplicado, no se
revelaram coincidentes, em termos numricos, no caso dos poos contendo a amostra de antes do IPTG, porm,
verificado igualmente um aumento de absorvncia aps a adio de IPTG);
O lisado apresenta valores de absorvncia superiores aos das lavagens, o que intuitivo, visto que o
primeiro contm a totalidade da protena, enquanto nas lavagens se vai perdendo pores da mesma, logo, sendo a
absorvncia proporcional concentrao de TTR, a absorvncia menor nas amostras das lavagens;
Relativamente s lavagens, relevante a sua comparao. A lavagem 1 corresponde a uma amostra
retirada durante a lavagem da coluna cromatogrfica com tampo inicial, onde se espera que no se encontre TTR
(apenas pequenas quantidades de protena que no ficou bem adsorvida, eventualmente). A lavagem 2 corresponde a
uma amostra recolhida aquando a eluio com tampo final, na qual a TTR predomina. Tal comprovado pelos valores
de absorvncia medidos, sendo que para a lavagem 1 se obtiveram valores bastante inferiores lavagem 2, o que
indica a maior quantidade de TTR na segunda, qual o anticorpo se ligou;
Quanto amostra correspondente ao pico na cromatografia realizada, esperar-se-ia observar-se o valor
mximo de absorvncia, relativamente a todos os outros poos, j que nessa amostra que se julga encontrar a maior
concentrao da protena em causa. Todavia, embora se tenha obtido valores razoavelmente elevados de absorvncia,
esta no foi a mais alta das amostras estudadas e, para alm disso, os poos com maior quantidade destas amostras (80
L) apresentaram valores mais baixos de absorvncia;
Em relao aos padres de transtirretina, pode verificar-se que a absorvncia diminui quando as diluies
so muito elevadas (ou seja, menor concentrao de TTR), mantendo-se sem grandes oscilaes para diluies abaixo
das 1000x. Para a diluio mais baixa (5x), verifica-se uma pequena diminuio de absorvncia, que se pode dever ao
facto de o anticorpo no conseguir ligar toda a TTR em soluo e a sua relativamente elevada concentrao poder
tornar a leitura do aparelho menos sensvel.
As incongruncias verificadas podem dever-se a pequenos erros experimentais, uma vez que estes so
amplificados quando se trabalha com quantidades muito pequenas como as usadas neste trabalho (pequena
incorreco na pipetagem, em pequenos volumes, por exemplo, leva a resultados inconclusivos, visto serem
amplamente afectados). Por outro lado, para elevadas concentraes de protena, como no caso do pico,
perdida alguma sensibilidade do espectrofotmetro, conduzindo a resultados pouco conclusivos.

Comparando com os resultados do Immunoblotting, pode fazer-se uma avaliao qualitativa relativamente
ao do IPTG: nota-se maior concentrao de TTR na amostra depois do IPTG, evidenciada pela cor mais intensa
que a da amostra antes do IPTG. Porm, as bandas do pico, no Immunobloting, correspondem s mais intensas,
revelando a concentrao mxima de TTR (embora o lisado tambm apresente uma concentrao alta, no to
10

elevada pois existe muitas outras susbtncias em soluo nessa amostra). De realar o facto de que a comparao
directa do enriquecimento com IPTG s possvel para concentraes iguais de protena total.
O mtodo de ELISA, contudo, apresenta algumas vantagens: permite a quantificao das protenas nas amostras
obtidas; possibilita a anlise de amostras mais complexas, como o plasma; fcil de automatizar, uma vez que
recorre a mtodos simples, com base em diluies; bastante sensvel, dado ser capaz de detetar quantidades
muito baixas de protena em soluo (solues muito diludas, como os padres de TTR utilizados). Uma das suas
limitaes o facto de ser necessrio saber bem a quantidade de anticorpo a usar, de modo a que no fique em
excesso relativamente TTR e, por conseguinte, no ligue outras substncias para alm da protena de interesse.
Quanto ao Immunoblotting, notou-se, ainda, alguns problemas na marcao dos padres de peso molecular,
uma vez que a sua distribuio revelou-se um pouco irregular, havendo, tambm, uma sobreposio das bandas dos
85 e 50 kDa. Para alm disso, h o risco de o corante no estar a funcionar como deveria, prejudicando os
resultados.


7. Com base nos resultados obtidos faa um comentrio global ao processo de produo e
purificao de transtirretina realizado.

A TTR foi produzida na E.coli, usando um vetor de expresso. A produo da protena induzida pela adio de
IPTG na cultura, efeito confirmado pelos resultados obtidos em todos os mtodos (embora as bandas do gel de
electroforese de SDS PAGE sejam pouco evidentes). Este um processo de produo eficaz e permite produzir
quantidades relativamente grandes de protena.
Pode avaliar-se o processo de purificao de TTR atravs das bandas de lisado e de pico na eletroforese (mais
evidente nos resultados do grupo 3 nos dois ltimos poos, respetivamente, da figura 2). Verifica-se que a
purificao muito pouco eficaz, porque a alquota do pico apresenta as mesmas bandas que o lisado. O
Immunoblotting d uma melhor perspetiva da purificao, uma vez que as bandas do pico so as mais intensas
(figura 3), indicando uma maior concentrao de TTR. Contudo, a revelao no foi muito especfica, dado que a
membrana contm vrias bandas para alm da corrrespondente TTR (sendo que uma mais evidente,
possivelmente referente ao dmero, evidenciando que no houve uma completa desnaturao, causada pelo SDS
PAGE). Estas bandas, correspondentes a outras protenas que se mantiveram em soluo, mostram que no foi
conseguida uma boa purificao.
Uma vez que h a possibilidade de o corante (Coomassie Blue) no estar a funcionar corretamente, este poderia
ser substitudo por nitrato de prata, por exemplo.
Tanto no Immunoblotting como no ELISA foram usados anticorpos, cujo uso requer alguns cuidados:
primeiramente, necessrio conhecer a especificidade do anticorpo (em que organismos funciona e com o que
interage); por outro lado, a rentabilidade do sistema optimizada com o uso de anticorpos secundrios, que tm
uma actuao mais geral (podem ligar-se mais que uma vez ao anticorpo primrio), o que contrapesa com o seu
custo, mas deve ter-se em ateno que no podem ser usados indefinidamente, j que as interaes tornam-se
inespecficas, e, por isso, deve-se contrabalanar a amplificao com a especificidade das ligaes.
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Um mtodo mais fivel de purificao poderia ser, por exemplo, a cromatografia de afinidade (normalmente
com melhores resultados, embora mais dispendioso).
Embora a purificao no tenha sido muito eficiente, com os procedimentos usados conseguiu-se concentrar um
pouco mais a TTR, facilitando a sua utilizao em estudos posteriores.