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45044 Orléans courriel : pierre.dieumegard@free.fr

critiques (constructives svp) à adresser à :

Lycée

Pierre Pothier

Dieumegard

Enzymes et coenzymes

Enzymes et coenzymes

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Enzymes et coenzymes

L'étude des enzymes a commencé au XIXe siècle. Les grains d'orge sont constitués surtout d'amidon, polymère de glucose. La germination de ces grains aboutit à la disparition de cet amidon et à la libération de maltose, dimère de glucose. Donc l'amidon a été transformé en maltose.

Enzymes : observations historiques et définitions fondamentales

Un extrait de grain d'orge germé peut aussi provoquer cette transformation (hydrolyse d'une solution d'amidon). En séparant les constituants biochimiques de l'extrait d'orge germé, on peut purifier la fraction active, dont une quantité minuscule peut catalyser l'hydrolyse d'une grande quantité d'amidon. Cette fraction active est de nature protéique. Elle a été nommée amylase, qui fait partie des enzymes. Le terme enzyme signifie en grec « (matière active) dans le levain » ; amylase est plus précisément l'enzyme qui agit sur l'amidon.

amidon + eau substrats
amidon + eau
substrats
--------------> maltose produit
--------------> maltose
produit

Les enzymes n'apparaissent pas dans le bilan de la réaction.

Les enzymes sont des catalyseurs, donc abaissent l'énergie d'activation de la réaction

substrat

énergie des

molécules

de la réaction substrat énergie des molécules En présence d'enzyme, l'énergie d'activation
En présence d'enzyme, l'énergie d'activation est diminuée sans enzyme avec enzyme
En présence
d'enzyme,
l'énergie d'activation
est diminuée
sans enzyme
avec enzyme

amylase (la flèche signifie : « catalysé par »)

Ce n'est pas la seule façon de couper la molécule d'amidon en sucres solubles. Une solution d'amidon, à chaud (100°C) et en présence d'HCl est hydrolysée en quelques heures en glucose. Mais de telles conditions seraient incompatibles avec la vie. Les enzymes permettent la réalisation de la réaction aussi rapidement, mais à froid, donc dans des conditions compatibles avec la vie.

Substrat : molécule sur laquelle porte la réaction enzymatique ; elle est définitivement modifiée. Sa quantité diminue au cours du temps. C'est un réactif (il figure dans le bilan de la réaction). Produit : molécule résultant de la réaction enzymatique. Sa quantité diminue au cours du temps (figure dans le bilan de la réaction). Pour une réaction réversible, si les conditions changent, le produit peut devenir substrat et inversement. Enzyme : biocatalyseur protéique qui accélère la réaction. Sa quantité ne change pas au cours du temps (ne figure pas dans le bilan de la réaction). Ligand : toute molécule se liant transitoirement à l'enzyme. Le substrat et le produit sont des ligands, mais il existe aussi des ligands inhibiteurs ou activateurs.

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produit

coordonnées de réaction

Une enzyme ne fait que faciliter, accélérer des réactions thermodynamiquement spontanées, donc exoénergétiques (ΔG<0). Une enzyme diminue l'énergie d'activation nécessaire pour le déclenchement de la réaction.

Enzymes et coenzymes

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Par définition, la vitesse d'une réaction chimique est la quantité de substrat disparu, ou de produit apparu,

par unité de temps. Par exemple, pour l'amylase, on peut mesurer la quantité de maltose apparu. Par contre, on ne peut pas se baser sur « la quantité d'amidon disparu », puisque l'amidon est une macromolécule, et que la coupure d'une liaison osidique laisse encore une grosse molécule que l'on peut encore qualifier d'amidon. Le calcul de la vitesse est fait dans la « phase stationnaire »

v = d [ P ]

dt

Mesures classiques de la vitesse d'une réaction catalysée par une enzyme

v = d [ S ] dt

ou

Unités :

- le katal en système international (1 mole de substrat transformée par seconde)

- « unité internationale » : une micromole de substrat transformée par minute (1 UI = 15 nanokatal).

Les vitesses mesurées sont les « vitesses initiales »

phase stationnaire : la quantité d'enzyme en train de transformer le substrat en produit est constante.

vitesse initiale : l'enzyme vient d'être mise en contact avec le substrat. La concentration en substrat est la concentration initiale, la concentration en produit est nulle.

[produit apparu] [produit apparu] La vitesse d'apparition du produit diminue : - il y a
[produit
apparu]
[produit
apparu]
La vitesse d'apparition du produit diminue :
-
il y a moins de substrat (car il est
consommé par la réaction)
il y a plus de produit , qui encombre le
site actif de l'enzyme.
-
temps (quelques ms)
temps (quelques s ou min)

phase préstationnaire : l'enzyme vient juste d'entrer en contact avec le substrat. Avant que le produit apparaisse, il faut que le substrat se fixe sur l'enzyme, soit transformé en produit, et que le produit soit relâché par l'enzyme (quelques µs ou ms).

Finalement, la vitesse devient nulle : équilibre entre substrat et produit

Il n'y a pas d'incompatibilité entre le fait de mesurer la vitesse dans la phase stationnaire (donc après un certain temps) et de mesurer la vitesse initiale : l'échelle de temps des deux graphiques est différente. Il ne faut que quelques fractions de secondes pour que la phase stationnaire s'établisse, et la vitesse initiale peut souvent être mesurée pendant plusieurs minutes.

Enzymes et coenzymes

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Mesure de la vitesse des réactions catalysées par les enzymes

Les conditions naturelles ne facilitent pas l'étude expérimentale des réactions enzymatiques :

Normalement, on étudie la variation de la concentration en substrat ou en produit, or dans les systèmes vivants, ces concentrations restent plus ou moins constantes. Le produit formé ressemble au moins un peu au substrat, et a donc une assez forte affinité pour le site actif de l'enzyme. Si le produit se fixe sur le site actif, celui-ci ne peut pas recevoir de substrat, et la réaction enzymatique est perturbée.

Dans un système vivant, les molécules d'enzyme sont beaucoup moins nombreuses que les molécules de substrat et l'eau est encore plus abondante (en général)

E S P S S S P S E S S S P P S
E S
P
S
S S
P
S
E S
S
S
P
P
S
P
S
S
E

C'est pourquoi les études de cinétique enzymatique

sont faites dans les « conditions initiales » :

- on vient juste de mettre en contact l'enzyme et le substrat, et la concentration en produit est supposée nulle.

(mais on suppose aussi que la réaction est dans sa phase stationnaire)

Dans un

système

vivant, le

produit

coexiste

avec le

substrat

Représentation schématique d'un système vivant : beaucoup d'eau, un peu de substrat et de produit, et très peu d'enzyme

- bien que l'eau soit souvent parmi les réactifs (substrats) ou parmi les produits, on ne s'intéresse guère à elle, car ce n'est pas le facteur limitant de la réaction. En général, on suppose sa concentration constante.

- Comme l'enzyme est en petite quantité, la vitesse est proportionnelle à la quantité d'enzyme : plus il y a d'enzyme, plus la réaction est rapide.

- Les concentrations restent à peu près constantes : le substrat est régénéré et le produit est consommé par d'autres réactions. (exemple :le glucose est en permanence produit par la digestion, la glycogénolyse, etc., et en permanence consommé par la glycolyse.

Les enzymes sont des protéines sensibles à leur environnement

Double effet de la température : activation de réaction et dénaturation de la protéine

La vitesse s'effondre au delà de la température de dénaturation : le catalyseur n'est plus capable de remplir son rôle.

vitesse de la réaction (unités arbitraires)

La vitesse augmente exponentiellement avec la température (cas habituel en chimie : l'agitation moléculaire
La vitesse augmente
exponentiellement avec
la température (cas
habituel en chimie :
l'agitation moléculaire
augmente avec la
température)

température (°C)

température de dénaturation de la protéine enzymatique (souvent vers

40°-50°)

vitesse de réaction

Enzymes et coenzymes - 6 - pH optimal pH
Enzymes et coenzymes
- 6 -
pH optimal
pH

Cette sensibilité au pH (et à d'autres caractères physiques ou

) est variable :

- certaines enzymes sont très sensibles au pH, alors que d'autres le sont beaucoup moins (le pic de la sensibilité au pH est très étalé, et le pH optimal s'étend sur plusieurs unités de pH). - certaines enzymes ont un pH optimal acide (peptidases sécrétées par l'estomac) alors que d'autres ont un pH optimal neutre ou basique (peptidases sécrétées par le pancréas).

chimiques (salinité

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Cofacteurs et coenzymes

Pour de nombreuses réactions, la présence de l'enzyme ne suffit pas à déclencher la transformation du substrat. Il faut en plus d'autres molécules, qui interviennent dans le déroulement de la réaction. On pourrait les considérer comme des « cosubstrats », mais comme ces molécules supplémentaires sont rapidement régénérées après la réactions, elles n'entrent pas dans le bilan final de la réaction.

D'une façon générale, ces intervenants supplémentaires sont nommés cofacteurs ; lorsque ce sont des molécules organiques, on les nomme coenzymes. Attention : les coenzymes ne sont pas des enzymes ni même des protéines.

Certains coenzymes peuvent être synthétisés par l'organisme humain, mais d'autres doivent être apportés par l'alimentation. C'est le cas de nombreuses vitamines, qui sont soit des coenzymes, soit des précurseurs de coenzymes.

Coenzymes à connaitre :

- Coenzyme A : utilisé par des transférases, comme vecteur de groupement acétyl (-> acétyl-coenzyme A) ou d'acides gras.

- ATP et autres nucléotides phosphates :

premier substrat, transformé en premier produit

groupement à

transférer

transformé en premier produit groupement à transférer G cofacteur G (enzyme E1, de type transférase) cofacteur
transformé en premier produit groupement à transférer G cofacteur G (enzyme E1, de type transférase) cofacteur
G
G

cofacteur

G (enzyme E1, de type transférase)
G
(enzyme E1, de
type
transférase)

cofacteur

Le cofacteur est régénéré, et peut être réutilisé

(2e enzyme E2) G
(2e
enzyme
E2)
G
régénéré, et peut être réutilisé (2e enzyme E2) G transporteurs de phosphate, mais aussi intermédiaires
régénéré, et peut être réutilisé (2e enzyme E2) G transporteurs de phosphate, mais aussi intermédiaires

transporteurs de phosphate, mais aussi intermédiaires énergétiques

- NAD, NADP, FAD : transporteurs d'hydrogène

- ions métalliques divalents : Zn 2+ , Mg 2+ , etc

On peut considérer aussi comme cofacteurs certaines parties non protéiques des enzymes, et qui participent à la réaction catalytique (ions ou groupements prosthétiques)

cofacteur

deuxième substrat, transformé en deuxième produit

réaction catalytique (ions ou groupements prosthétiques) cofacteur deuxième substrat, transformé en deuxième produit

Enzymes et coenzymes

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Il y a six classes d'enzymes : les oxydoréductases, les transférases, les hydrolases, les lyases, les isomérases et les ligases.

Exemple :

EC 2.7.3.2 est la créatine-kinase EC = enzyme commission

2

= classe des transférases

7

= sous-classe des phosphotransférases

3

= sous-sous-classe des phosphotransférases qui ont un accepteur avec de l'azote

2

= numéro d'ordre de l'enzyme en question.

oxydoréductases :: catalysent des réactions d'oxydo-réduction (souvent un coenzyme) déshydrogénases (coenzymes de type NAD, FAD, etc) Les oxydases travaillent avec du dioxygène

transférases : catalysent le transfert d'un groupe fonctionnel d'une molécule donneuse à une molécule réceptrice. méthyl-transférase transaminases kinases (qui transfèrent un phosphate vers ou à partir d'ATP)

hydrolases lipases, phosphatases, peptidases, DNases, acétylcholinestérase

lyases catalysent la coupure d'une liaison par un autre moyen que l'hydrolyse, souvent avec formation d'une double liaison. décarboxylases

isomérases

ligases catalysent la formation de liaison, grâce à l'énergie d'hydrolyse d'ATP.

Enzymes et coenzymes

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C'est le type de cinétique le plus simple. Les premières études ont été réalisées par Leonor Michaelis (Allemagne, début du XXe siècle) et Maud Menten (Canada, début du XXe siècle). On étudie la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat.

Cinétique michaelienne

V = Vmax.

[ S ]

Km  [ S ]

Vi = vitesse initiale

Équation de Michaelis-Menten

Vmax

] Vi = vitesse initiale Équation de Michaelis-Menten Vmax Vitesse maximale : vitesse initiale théorique d'une

Vitesse maximale : vitesse initiale théorique d'une réaction enzymatique, pour une concentration infinie en substrat. Aux fortes concentrations en substrat, la vitesse se rapproche d'un maximum : réaction d'ordre 0 Cela montre que la vitesse de catalyse n'est pas infinie, et qu'il existe un site actif pouvant être saturé par le substrat.

points expérimentaux Vmax /2 courbe par modélisation Aux faibles concentrations en substrat, la vitesse est
points
expérimentaux
Vmax /2
courbe par
modélisation
Aux faibles concentrations
en substrat, la vitesse
est proportionnelle à
[S] : réacton d'ordre 1

Km

S = [substrat]

Constante de Michaelis :

Concentration du substrat pour laquelle la vitesse initiale d'une réaction enzymatique atteint la moitié de la vitesse maximale.

Surtout ne pas confondre cette courbe (« courbe cinétique »), v = f([S], provenant du calcul de plusieurs vitesses initiales) avec la courbe de même forme [P] = f(t), permettant de calculer une seule vitesse initiale !!!

Il suffit de deux paramètres, Km et Vmax, appelés paramètres cinétiques, pour décrire la totalité de la courbe cinétique V = f([S]) On peut obtenir Km en mesurant la concentration de substrat qui aboutit à une vitesse égale à Vmax / 2 Démonstration : à cette concentration, l'équation de Michaelis- Menten donne Vmax/2 = Vmax [S] /(Km + [S]), d'où ½ = [S] /(Km + [S], d'où Km + [S] = 2 [S], d'où Km = [S]

On pourrait donc penser qu'il suffit de faire quelques mesures, pour avoir quelques points de cette courbe cinétique, puis de tracer l'hyperbole pour avoir Vmax, donc Km en calculant l'abscisse de la courbe au point d'ordonnée Vmax /2. Malheureusement, il est souvent difficile d'estimer Vmax, ce qui aboutit aussi à la difficulté de calculer Km. De plus il est difficile de voir à l'oeil si la courbe a bien une forme de vraie hyperbole et obéit bien à la loi de Michaelis-Menten. Or certaines enzymes, et non des moindres, n'y obéissent pas

Enzymes et coenzymes

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Substrat E S P S
Substrat
E
S
P
S

Substrat lié à l'enzyme au niveau du site actif

P S Substrat lié à l'enzyme au niveau du site actif produit libéré après la réaction

produit libéré après la réaction

Enzyme

Site actif de l'enzyme : c'est le lieu où vient se fixer le substrat par des liaisons faibles, et où il subit la réaction chimique. Le site actif doit

- avoir une liaison faible avec le substrat (au niveau d'une sous-partie nommée site de fixation)

- déclencher la réaction catalytique (au niveau d'une sous-partie nommée site catalytique

Modèle moléculaire d'enzyme michaelienne

Le site actif est une région dont les caractéristiques physiques favorisent la réaction chimique. Ce site actif est souvent une fente dans la forme globuleuse de l'enzyme, où des AA particuliers donnent ces caractéristiques.

Fixation du substrat sur le site actif :

- il y a une complémentarité stérique (de forme) et électrique (charges (+) et charges (-)). Par exemple, la ribonucléase pancréatique a son site actif contenant des AA basiques, chargés positivement, qui fixent l'ARN (acide, avec des charges négatives sur les phosphates) - il y a des électrons mobiles capables de déclencher la réaction chimique dans le substrat.

Modèle simple de complémentarité : modèle clé-serrure Pour qu'une clé puisse ouvrir une serrure, il faut une bonne complémentarité de forme entre les deux. Normalement, seule la bonne clé peut provoquer l'ouverture de la serrure, même si parfois des clés de forme voisine peuvent être efficaces. De même, seul le bon substrat peut être catalysé par une enzyme donnée, même si certains substrats chimiquement voisins peuvent venir se fixer sur le site actif, et même parfois être transformés.

Modèle plus complexe (et plus réel) : adaptation induite de l'enzyme et du substrat Par diffraction des rayons X, on a constaté que la conformation des enzymes liées au substrat est différente de celle des enzymes isolées. C'est donc que le substrat modifie la forme de l'enzyme ; d'autre part, l'enzyme modifie la forme du substrat, puisqu'elle y déclenche une réaction chimique, donc un changement de forme. Ce n'est pas étonnant, puisque les protéines sont très sensibles à leur environnement, et donc en particulier aux ligands qu'elles fixent.

Enzymes et coenzymes

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Cette enzyme intervient dans la dégradation du glucose par glycolyse. Le glucose a été cassé en deux trioses-phosphates, (phosphoglycéraldéhydes) qui sont alors déshydrogénés en

Un exemple d'enzyme : la triose- phosphate déshydrogénase

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La chymotrypsine est une protéase sécrétée par le pancréas ; elle coupe le polypeptide après un résidu arômatique (PHE, TRP ou TYR). La trypsine est une protéase voisine, qui coupe après les résidus basiques (LYS et ARG). Elles font partie du groupe des « protéases à sérine », qui ont le même mécanisme d'action. Ce groupe comprend aussi la thrombine, protéase sanguine permettant la coagulation du sang par hydrolyse sélective du fibrinogène. Le site catalytique contient en particulier une sérine (195) et une histidine (57). Le N-H de l'histidine est lié de plus à un ASP (102) par une liaison H, ce qui augmente la réactivité envers la sérine. Même si le mécanisme (donc le site catalytique) est semblable, les substrats de ces différentes enzymes sont différents : les sites de reconnaissance des enzymes sont différents.

Origine de la spécificité de substrat des diverses enzymes : des résidus différents au fond de la poche constituant le site actif :

La chymotrypsine contient des résidus hydrophobes, pouvant se lier aux cycles de PHE, TRP ou TYR de la protéine à cliver. La trypsine contient de l'aspartate (189) qui peut se lier aux résidus basiques LYS et ARG de la protéine à cliver

Mécanisme d'action de la trypsine, une protéase à sérine CH 2 Sérine Liaison H entre
Mécanisme d'action de la trypsine, une
protéase à sérine
CH 2
Sérine
Liaison H entre SER et HIS :
R
Substrat
1
H
est partagé entre O et N,
(liaison
O
CH 2
C
O
donc O devient réactif
peptidique)
O
-
Enzyme
H
nucléophile δ-
NH
et
H est δ+
R
N
H
2
N
N
(arrivée du substrat =
polypeptide)
H
N
Histidine
H
(L'enzyme revient à la situation initiale) CH 2 O H N N H
(L'enzyme
revient à
la
situation
initiale)
CH 2
O
H
N
N
H
R 1 CH 2 O C (O de la sérine et H de l'histidine réagissent
R
1
CH 2
O C
(O de la sérine
et H de
l'histidine
réagissent
avec le
substrat)
R
1
O C
H
O
O
NH 2
ester (liaison
covalente
N
R
H
H
2
transitoire entre
enzyme et
O
N
substrat)
H
(H 2 O hydrolyse l'ester,
l'autre partie du produit
est libérée)
Une partie du produit
est libérée

Enzymes et coenzymes

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Les constantes k i sont les constantes de vitesse des réactions :

- v 1 = k 1 [E]*[S] est la formation de ES à partir de E et S

- v -1 = k -1 [ES] est la décomposition de ES pour redonner E et S, sans réaction

- v 2 = k 2 [ES] est la décomposition de ES en E et P, avec réaction chimique (v -2 = k -2 [E]*[P] serait la réaction inverse, formation de complexe à partir de l'enzyme et du produit P ; négligeable, car on travaille dans les conditions initiales, lorsqu'on vient juste de mettre en contact E et S, et que le produit P n'a pas encore eu le temps de se former)

La vitesse totale de la réaction est V = d[P]/dt = k 2 [ES]

Lors de l'état stationnaire, le complexe ES est en quantité constante

- formation : d[ES]/dt = k 1 [E]*[S]

- destruction -d[ES]/dt = (k -1 + k2)*[ES]

donc si la formation compense la destruction on peut écrire k 1 [E]*[S] = (k -1 + k 2 )*[ES] De là, on obtient Km = [E]*[S]/[ES] = (k -1 + k 2 )/k 1

On peut aussi écrire, en exprimant [Et] la concentration en enzyme totale = [ES] + [E] :

Km = ([Et] – [ES])*[S]/[ES] = ([Et]/[ES] – 1)*[S]

donc Km / [S] = [Et]/[ES] – 1

d'où [ES] = [Et]/(Km/[S] + 1= [Et]*[S]/(Km + [S] Or V (vitesse totale) = k 2 [ES] donc V = k 2 [Et]*[S]/(Km + [S] Lorsque V = Vmax, l'enzyme est saturée en substrat, et [ES] = [Et] Puisque V = k 2 [ES], on peut dire que Vmax = k 2 [Et], ce qui permet de retrouver la formule de Michaelis :

V = Vmax * [S] / (Km + [S])

==> Km/[S] + 1 = [Et]/[ES]

Signification des paramètres cinétiques Km et Vmax ou kcat

Soit la réaction où E est l'enzyme, S le substrat, ES le complexe enzyme- substrat et P le produit :

E + S

k 1 k 2 ES
k 1
k 2
ES

k -1

(k -2 )

E +

P

1/Km correspond à l'affinité de l'enzyme pour le substrat, car Km est la constante de dissociation du complexe enzyme-substrat :

plus la dissociation est importante, moins l'enzyme se lie au substrat.

En toute rigueur, ceci n'est vrai que si k 2 est petit devant k -1 , ce qui est le cas général.

Km s'exprime en unités de concentration, c'est à dire en moles par litre.

Vmax

Vi = vitesse initiale

points expérimentaux Vmax /2 courbe par modélisation
points
expérimentaux
Vmax /2
courbe par
modélisation

Km

S = [substrat]

La vitesse maximale Vmax dépend de la concentration en enzyme, et n'est donc pas très utile pour faire des comparaisons. Plus utile est la constante catalytique k 2 , aussi appelée k cat , valant Vmax/[Et] (puisque à très forte concentration en substrat, V vaut Vmax, et [ES] vaut [Et]), qui est indépendante de la concentration en enzyme. kcat est une mesure de l'activité catalytique maximale atteignable par l'enzyme. kcat a une dimension de temps -1 , et 1/kcat est la durée d'un cycle catalytique lorsque l'enzyme est saturée en substrat. kcat/Km peut être une mesure de la spécificité de l'enzyme

Enzymes et coenzymes

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La représentation inverse de Lineweaver-Burk

Vi = vitesse initiale

inverse de Lineweaver-Burk Vi = vitesse initiale S = [substrat] [ S ] Km  [
inverse de Lineweaver-Burk Vi = vitesse initiale S = [substrat] [ S ] Km  [

S = [substrat]

[ S ]

Km  [ S ]

V = Vmax.

Km ١
Km
١

L'équation de Michaelis-Menten donne V en fonction de S. On peut la transformer pour obtenir l'équation de 1/V en fonction de 1/S

١

Km [ S ]

١

Vmax

V

= Vmax. [ S ] = Vmax Vmax . S

Vmax V = Vmax. [ S ] = Vmax  Vmax . S Avantages : la

Avantages : la courbe est transformée en une droite !

- ordonnée à l'origine

transformée en une droite ! - ordonnée à l'origine 1/Vmax - pente Km/Vmax - abscisse d'ordonnée

1/Vmax

- pente Km/Vmax

- abscisse d'ordonnée 0 : -1/Km

Il est plus facile de calculer les paramètres d'une droite que d'une courbe. Donc pour une enzyme michaelienne, on peut calculer facilement et précisément Km et Vmax.

Il est plus facile de voir si des points sont alignés que de voir s'ils suivent une hyperbole ou non. Donc si les points expérimentaux sont alignés, on peut supposer que l'enzyme est michaelienne. Si les points expérimentaux ne sont pas alignés, c'est que l'enzyme ne suit pas la loi de Michaelis (ou bien qu'il y a eu une erreur dans les mesures ou dans les calculs !)

1/V

1/Vmax pente = Km/Vmax
1/Vmax
pente = Km/Vmax

1/[S]

-1/Km

Enzymes et coenzymes

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Les effecteurs sont des ligands qui se fixent sur l'enzyme et modifient son activité. Les activateurs sont des effecteurs qui se fixent sur l'enzyme et qui augmentent son action (augmentation de Vmax, diminution de Km) Les inhibiteurs sont des effecteurs qui se fixent sur l'enzyme et diminuent son action (diminution de Vmax, augmentation de Km) Ici, il ne sera pas question que des modifications d'activité catalytique par des ligands se fixant sur l'enzyme par des liaisons faibles (et réversibles).

Effecteurs enzymatiques

Substrat

produit Enzyme - +énergie +ions
produit
Enzyme
-
+énergie
+ions

+coenzymes

+
+

activateurs

inhibiteurs

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Inhibition compétitive : augmentation de Km, pas de changement pour Vmax Les inhibiteurs compétitifs ont de l'affinité pour le site actif, et viennent se fixer sur celui-ci à la place du substrat. Pour une même valeur de [S], l'enzyme fixe moins de substrat puisqu'une partie des sites actifs est occupée par l'inhibiteur : la vitesse est donc plus faible. Mais s'il y a une très grande quantité de substrat normal, la grosse majorité des sites actifs est occupée par du substrat, et finalement la vitesse est presque la même qu'en absence d'inhibiteurs : la vitesse maximale est donc inchangée.

On appelle constante d'inhibition la constante de dissociation du complexe enzyme-inhibiteur :

Ki = ([I].[E])/[E-I] (plus Ki est basse, plus l'inhibition est forte)

La constante de Michaelis est augmentée et devient K'm = Km (1 + [I]/Ki)

Pour une enzyme monomérique, on imagine mal l'existence d'activateur compétitif : si une molécule est fixée sur le site actif, elle ne peut que gêner la fixation du substrat sur ce site actif. Par contre, pour les enzymes oligomériques (« allostériques »), il existe des molécules qui se fixent sur un site actif et favorisent la fixation de substrat sur les autres sites actifs.

Vmax

Vmax/2

Inhibiteurs compétitifs

Enzymes et coenzymes Vi = vitesse initiale avec inhibiteur sans inhibiteur compétitif K'm
Enzymes et coenzymes
Vi = vitesse
initiale
avec inhibiteur
sans inhibiteur
compétitif
K'm

Km

S = [substrat]

E I S
E
I S

Modèle d'inhibition compétitive La fixation de l'inhibiteur I sur le site actif de l'enzyme E empêche de substrat S d'accéder à ce site actif.

Enzymes et coenzymes

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Effecteurs non compétitifs

sans inhibiteur

D'autres effecteurs (l'exemple ici sera un inhibiteur) modifient la vitesse maximale de l'enzyme, mais sans faire changer Km. Donc ces inhibiteurs diminuent la vitesse de l'enzyme, sans changer fortement l'affinité de l'enzyme pour le substrat. Même avec de très fortes concentrations en substrat, la vitesse de réaction reste faible.

Vi = vitesse initiale

avec inhibiteur non compétitif

Vi = vitesse initiale avec inhibiteur non compétitif Vmax Km S = [substrat] Vmax/2 V'max I
Vi = vitesse initiale avec inhibiteur non compétitif Vmax Km S = [substrat] Vmax/2 V'max I

Vmax

Vi = vitesse initiale avec inhibiteur non compétitif Vmax Km S = [substrat] Vmax/2 V'max I
Vi = vitesse initiale avec inhibiteur non compétitif Vmax Km S = [substrat] Vmax/2 V'max I
Vi = vitesse initiale avec inhibiteur non compétitif Vmax Km S = [substrat] Vmax/2 V'max I
Vi = vitesse initiale avec inhibiteur non compétitif Vmax Km S = [substrat] Vmax/2 V'max I

Km

S = [substrat]

Vmax/2

V'max

I E S
I
E
S

Les effecteurs non compétititfs peuvent aussi bien être des activateurs que des inhibiteurs. Il est tout à fait concevable que la fixation d'un ligand sur un site d'une protéine change la conformation de cette protéine en augmentant son activité enzymatique.

Il existe aussi des cas plus complexes, où l'inhibition provoque à la fois une variation de Km et une variation de Vmax On les appelle parfois « inhibitions incompétitives »

Modèle d'action d'un inhibiteur non compétitif :

La fixation de l'inhibiteur I sur un site effecteur de l'enzyme E n'empêche pas le substrat S d'accéder au site actif, mais l'empêche de subir la réaction normalement catalysée par l'enzyme

Enzymes et coenzymes

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Ambigüité du terme « allostérie » ou « allostérique » Etymologiquement, allostérie vient de « ster » qui signifie forme, volume, et « allo » qui signifie différent ; donc l'allostérie correspond à un changement de forme. Au sens large, l'allostérie est donc l'ensemble des phénomènes montrant des changements de forme de l'enzyme. Cela correspond à des phénomènes où deux ligands se fixent simultanément sur l'enzyme, d'une part le substrat, d'autre part un effecteur. Dans ce sens, les inhibiteurs non compétitifs provoquent des effets allostériques : ils changent la forme de l'enzyme, donc sa capacité à agir sur le substrat qui y est fixé. Mais dans le langage des biochimistes, « allostérie » est souvent employé avec un sens beaucoup plus restreint : il désigne les phénomènes observables sur des protéines constituées de plusieurs sous-unités (= plusieurs protomères), dont la forme et l'activité varient en fonction de divers ligands qui y sont fixés.

==> les termes suivants sont à peu près synonymes :

enzyme allostérique

= enzyme oligomérique

= enzyme à structure quaternaire = enzyme constituée de plusieurs sous-unités

= enzyme constituée de plusieurs protomères.

Enzymes oligomériques et effets allostériques

différents protomères

et effets allostériques différents protomères différents sites actifs des liaisons entre les protomères

différents sites

actifs

des liaisons entre les protomères provoquent des effets allostériques :

entre les protomères provoquent des effets allostériques : sites actifs sites effecteurs (liaisons avec des activateurs

sites actifs

provoquent des effets allostériques : sites actifs sites effecteurs (liaisons avec des activateurs ou des

sites effecteurs (liaisons avec des activateurs ou des inhibiteurs)

Enzyme oligomérique (=allostérique)

le changement de conformation d'un des protomères provoque le changement de conformation d'un ou plusieurs autres

Le cas le plus simple est celui où la protéine est constituée de sous-unités identiques, disposées de façon symétrique. Il existe aussi des cas plus complexes :

- sous-unités presque identiques, mais pas tout à fait - existence de plusieurs types de sous-unités ; par exemple chaque type réalise une étape différente de la réaction catalytique.

Enzymes et coenzymes

- 19 -

Enzymes et coenzymes - 19 - sites actifs sites effecteurs (liaisons avec des activateurs ou des

sites actifs

sites effecteurs (liaisons avec des activateurs ou des inhibiteurs)

Les effecteurs allostériques sont des ligands dont le site de fixation est différent du site actif.

Effet allostérique homotrope : l'effecteur est une molécule de substrat, mais qui se fixe en un lieu différent du site actif. Effet allostérique hétérotrope : l'effecteur est une molécule qui n'est pas le substrat (et qui, bien sûr, se fixe ailleurs qu'au site actif).

Modélisation des protéines allostériques : symétrie des états des protomères

- les différents protomères sont symétriques et équivalents.

- chaque ligand (substrat, effecteur

)

a un site de liaison sur chaque protomère (au

moins).

- la conformation de chaque protomère est contrainte par la conformation des autres, puisqu'ils ont des liaisons faibles entre eux.

- il y a au moins deux états possibles pour chaque protomère, l'état tendu et l'état relâché. Normalement, l'état tendu correspond à un état non catalytique de la protéine, et l'état relâché à l'état catalytique. On nomme transition allostérique le passage d'un état à l'autre (tendu à relâché ou inversement). Cette transition est aléatoire, et favorisée par les ligands fixés sur la protéine. Le substrat fixé sur le site actif favorise l'état relâché (catalytique).

- les affinités des sites de fixation de l'enzyme pour le ligand, ainsi que la vitesse de la réaction catalysée, dépendent de l'état des protomères.

- lorsqu'un protomère change d'état, la symétrie de l'ensemble est conservée (c'est à dire que les autres protomères vont aussi changer d'état).

Normalement, il y a coopération entre les sous-unités :

- Le substrat se fixe sur un protomère, et le bloque dans l'état relâché (catalytique)

- Cet état contraint la conformation du ou des autres protomères à l'état relâché (catalytique). Donc une autre molécule de substrat pourra venir se fixé sur l'autre (les autres) site(s) actif(s).

Ainsi, la fixation d'un substrat sur un protomère favorise la fixation d'autres substrats sur les autres protomères ; inversement, si aucun protomère n'a de substrat fixé, l'ensemble a tendance à prendre l'état tendu (non catalytique).

Enzymes et coenzymes

- 20 -

vitesse de réaction

Enzymes et coenzymes - 20 - vitesse de réaction Les enzymes allostériques (oligomériques) ont une cinétique

Les enzymes allostériques (oligomériques) ont une cinétique sigmoïde, et non michaelienne

S
S
ont une cinétique sigmoïde, et non michaelienne S S Vmax [S] A faible concentration en substrat,
S
S
ont une cinétique sigmoïde, et non michaelienne S S Vmax [S] A faible concentration en substrat,

Vmax

ont une cinétique sigmoïde, et non michaelienne S S Vmax [S] A faible concentration en substrat,
ont une cinétique sigmoïde, et non michaelienne S S Vmax [S] A faible concentration en substrat,

[S]

A faible concentration en substrat, peu de protomères ont fixé ce substrat ==> ils sont majoritairement à l'état tendu, et n'ont que peu d'action catalytique. L'affinité pour les substrat est faible.

catalytique. L'affinité pour les substrat est faible. A plus forte concentration en substrat, l'enzyme peut

A plus forte concentration en substrat, l'enzyme peut mieux catalyser la réaction. Certains protomères ont fixé le substrat, et sont en train de le catalyser. Ils contraignent les autres protomères à prendre la forme relâchée, donc à capter plus facilement le substrat.

protomère ayant déjà fixé le substrat, et

en train de le catalyser ; il bloque l'ensemble à l'état relâché (catalytique)

protomère contraint à l'état relâché ; il va fixer un substrat, ce qui le bloquera dans cet état, et ainsi contraindra les autres protomères à l'état relâché, etc.

enzyme oligomérique à forte concentration de substrat

S
S

enzyme oligomérique à faible concentration de substrat

Enzymes et

21 - -Enzymes

et coenzymes

coenzymes

- - 21

Voie métabolique:

Ensemble de réactions biochimiques successives, permettant la production ou la destruction d'une molécule importante. Exemple : la glycolyse, qui détruit le glucose en formant du pyruvate.

Les diverses réactions d'une voie métabolique sont catalysées par des enzymes différentes, dont certaines sont de type allostérique (enzymes oligomériques). Ces enzymes dont l'activité varie en fonction des ligands qui y sont fixés sont des enzymes-clés de la régulation de la voie métabolique. L'enzyme-clé d'une voie métabolique est celle qui contrôle la vitesse de l'ensemble de la voie. C'est l'enzyme dont la vitesse normale est la plus faible (mais variable).

Normalement, dans un système vivant, la concentration des diverses molécules est à peu près constante :

par exemple notre glycémie doit rester au voisinage de 1 g/L. Si la concentration de ces molécules s'écarte de la normale, des voies métaboliques sont activées, et aboutissent au retour à la normale. Par exemple, en cas d'hyperglycémie, notre organisme active la glycolyse, la formation de glycogène par le foie, et la transformation des glucides en lipides. Inversement en cas d'hypoglycémie, la glycolyse est ralentie, la glycogénolyse accélérée, ainsi que la formation de glucose à partir des acides aminés. Ces variations de vitesse des voies métaboliques proviennent de variations d'activité des enzymes.

Une enzyme purement michaelienne est peu sensible à son environnement. Certes une variation de [substrat] provoque une petite variation de la vitesse de réaction, mais assez faible. Si cette enzyme est purement michaelienne, elle n'est pas censée avoir de site de fixation pour des effecteurs éventuels (activateurs ou inhibiteurs non compétitifs).

Les enzymes allostériques permettent un meilleur controle des voies métaboliques

Enzyme purement michaelienne

vitesse de la réaction Enzyme théorique extrêmement allostérique (seuil) [substrat]
vitesse de la réaction
Enzyme théorique
extrêmement
allostérique
(seuil)
[substrat]

Une enzyme « totalement allostérique » ne fonctionnerait qu'au delà d'une valeur-seuil de la concentration en substrat. Le résultat serait que [S] devrait rester en permanence à cette valeur-seuil : en-deçà de cette valeur, l'enzyme est inactive et ne transforme pas le substrat, au-delà de cette valeur, l'enzyme est totalement active, et détruit le substrat à grande vitesse.

Enzyme allostérique pour deux concentrations différentes d'un effecteur

Une enzyme qui ne serait sensible qu'à la concentration en substrat ne permettrait pas la coordination des réactions métaboliques avec l'ensemble de

l'organisme. Les enzymes allostériques sont sensibles à divers effecteurs, qui permettent de moduler leur activité en fonction d'autres constituants biochimiques de l'organisme

(hormones, messagers divers

)

Enzymes et coenzymes

- 22 -

glycogène-

phosphorylase

Exemples d'enzymes allostériques

phosphofructokinase :

fructose 6P + ATP --> fructose 1-6 bisphosphate

cinétique coopérative pour le fructose 6 P, mais pas pour l'ATP (la phosphofructokinase a une affinité 2000 fois plus forte pour le fructose 6P en conformation R qu'en T.

A partir de 0,5 mM, l'ATP est un inhibiteur allostérique (il se fixe sur un autre site que le site catalytique)

inhibiteurs allostériques :

phosphoénolpyruvate, citrat

activateurs allostériques : adp, amp, gdp, ampc : ils se fixent sur le même site allostérique que l'atp, et l'empêchent d'avoir son effet inhibiteur.

Enzymes et coenzymes

- 23 -

Un carrefour métabolique est une substance chimique pouvant être le substrat de plusieurs enzymes appartenant à des voies métaboliques différentes. Toute voie métabolique

- commence par une molécule qui est soit un carrefour métabolique, soit un

nutriment ou un aliment,

- s'achève par une molécule qui est soit un carrefour métabolique, soit une substance sécrétée ou excrétée.

Les carrefours métaboliques sont les molécules de passage entre diverses voies métaboliques

Lorsqu'une enzyme a deux substrats pour la réaction, l'aspect cinétique est plus complexe : quelle que soit la concentration du substrat A, la réaction ne sera possible que s'il y a du substrat B.

« bi-bi » signifie « bi-substrat, bi-produit »

Modèle bi-bi ordonné : le substrat B ne se fixe que si le substrat A est déjà fixé

Exemple : l'alcool-déshydrogénase de la fermentation alcoolique CH 3 -CH 2 OH + NAD + <=> CH 3 -CHO + NADH, H +

éthanol

(= acétaldéhyde) La fixation de l'éthanol sur l'enzyme n'est possible que si le NAD + est déjà fixé. Le complexe éthanol-enzyme-NAD + se transforme en complexe éthanal- enzyme-NADH. Finalement, l'éthanal est libéré, puis le NADH.

éthanal

Dans nos cellules, cette enzyme fonctionne en sens inverse. Elle permet la fermentation éthylique, en consommant l'éthanal provenant de la décarboxylation du pyruvate, et en formant de l'alcool et la régénération du NAD + nécessaire à la glycolyse.

Autre exemple : malate-déshydrogénase du cycle de Krebs - OOC-CH 2 -CHOH-COO - + NAD + <=> - OOC-CH 2 -CO-COO - + NADH, H +

malate

oxaloacétate

L'enzyme n'a d'affinité pour le malate que si elle est préalablement associée au NAD + . Lorsque le complexe enzyme-NAD + est réalisé, le malate se fixe en réalisant le complexe ternaire malate-enzyme-NAD + , puis la réaction enzymatique aboutit au complexe oxaloacétate-enzyme- NADH. Finalement, l'oxaloacétate est libéré, puis le NAD réduit.

Et de nombreuses autres enzymes d'oxydo-réduction utilisant le NAD

Cinétiques enzymatiques à deux substrats (et/ou à deux produits), avec réalisation d'un complexe ternaire : modèle bi-bi

Enzymes et coenzymes - 24 - A A A E E E B B B
Enzymes et coenzymes
- 24 -
A
A
A
E
E
E
B
B
B
E
= enzyme
P
A
= substrat 1
B = substrat 2
P
= produit 1
Q = produit 2
E + A + B
--> (A-E) + B
--->(A-E-B)
--->(P-E-Q)
--->(P-E) + Q
--->P + E + Q
Q
P
Q
Q
P

Mécanisme bi-bi aléatoire : l'un ou l'autre des substrats se fixe en premier

Exemple : citrate-synthase du cycle de Krebs acétyl-CoA + oxaloacétate + H 2 O <=> CoA-SH + citrate

La liaison de l'enzyme avec chacun des deux substrats se fait dans un ordre qui dépend uniquement de leurs concentrations. Lorsque les deux substrats sont fixés, la réaction enzymatique a lieu, puis les produits sont libérés.

Enzymes et coenzymes

- 25 -

Dans le modèle « ping-pong », il n'y a pas réalisation d'un complexe ternaire, mais la réaction se fait en deux temps, avec la réalisation de plusieurs complexes binaires successifs.

Le complexe (enzyme-substrat A) réagit pour former le complexe (enzyme modifiée – produit P), puis le produit P est libéré. L'enzyme modifiée se fixe au substrat B, et le modifie en produit Q, qui est finalement libéré, avec retour de l'enzyme à son état initial.

Cinétiques enzymatiques à deux substrats (et/ou à deux produits), sans complexe ternaire, mais en deux temps : modèle ping-pong

Exemple de mécanisme ping-pong : l'alanine-amino- transférase (ALAT)

Cette enzyme catalyse le transfert d'un groupe amine (- NH 2 ) de l'alanine vers l'α-cétoglutarate, qu'elle transforme en glutamate, en formant du pyruvate

alanine + α-cétoglutarate <=> glutamate + pyruvate

- L'ALAT se lie à l'alanine

- L'ALAT prend le groupement -NH 2 de l'alanine (qui est ainsi transformée en pyruvate) et le fixe sur son coenzyme (le phosphate de pyridoxal) qui devient ainsi du phosphate de pyridoxamine.

- Le pyruvate se détache de l'enzyme.

- L'enzyme se fixe à l'α-cétoglutarate, et lui transfère le groupe -NH 2 : le coenzyme redevient du phosphate de pyridoxal.

- Le glutamate ainsi formé à partir de l'α-cétoglutarate est libéré;

A + E + B -->(A-E) + B -->(P-E') + B --> P + E' + B --> P + (E'-B) --> P + (E-Q) --> P + E + Q

B B A A P P E E E' Q B E' E E P
B
B
A
A
P P
E
E
E'
Q
B
E'
E
E
P

Modèle ping-pong : pas de complexe ternaire

Enzymes et coenzymes

- 26 -

Normalement, les isozymes, qui sont des protéines de séquence légèrement différente, sont codées par des gènes différents (provenant de la duplication d'un même gène ancestral).

Isozymes : enzymes catalysant la même réaction enzymatique, mais légèrement différentes

Isoformes de la lactate-déshydrogénase La lactate-déshydrogénase est l'enzyme qui permet la fermentation lactique par transformation du pyruvate en lactate :

pyruvate + NADH,H + ---> lactate + NAD + C'est une enzyme tétramère. La forme M a un Km bas (donc une grande efficacité de conversion). La forme H a un Km élevé (donc une faible efficacité de conversion). Les muscles striés ont beaucoup de forme M (de type M4, ou M3H), donc peuvent facilement faire la fermentation lactique. Le muscle cardiaque a surtout de la forme H (de type H4 ou MH3), donc ne peut pas faire de fermentation lactique.

Enzymes et coenzymes

- 27 -

Hexokinase et glucokinase catalysent toutes deux la réaction glucose + ATP ---> glucose 6 phosphate + ADP mais avec des caractéristiques différentes

Hexokinase et glucokinase sont deux enzymes différentes de phosphorylation du glucose

sont deux enzymes différentes de phosphorylation du glucose L'hexokinase (cerveau, muscle ) Km hexokinase = 5.10
L'hexokinase (cerveau, muscle ) Km hexokinase = 5.10 -5 Km glucokinase = 2.10 -2 -
L'hexokinase (cerveau, muscle
)
Km
hexokinase
= 5.10 -5
Km
glucokinase
= 2.10 -2
-

peut agir sur divers hexoses (dont le glucose). C'est une

enzyme inhibée par son produit. Son Km est très faible, ce qui signifie qu'elle a une forte affinité pour son substrat, et est saturée par des quantités assez faibles d'hexose. A la glycémie normale, l'hexokinase travaille près de Vmax : une petite variation de

glycémie aura peu d'effet sur la vitesse de réaction, et le métabolisme cellulaire du glucose (glycolyse) variera peu.

La glucokinase (foie) est spécialisée pour le métabolisme du glucose. Son Km est plus fort, ce qui signifie qu'elle n'a pas une très grande affinité pour son substrat, et n'est saturée que pour de très fortes quantités de glucose. A la glycémie normale, la glucokinase travaille loin de Vmax : une petite variation de glycémie fera varier fortement son activité. Une augmentation de la glycémie augmente l'activité glucokinase du foie : le glucose est transformé en glycogène et en lipides.

: le glucose est transformé en glycogène et en lipides. Il y a un lien entre

Il y a un lien entre les caractéristiques cinétiques de ces enzymes et la fonction physiologique de l'organe :

dans les organes normaux, l'hexokinase assure l'alimentation constante des cellules en glucose phosphate (quelle que soit la glycémie)

glycémie

normale

- dans le foie, qui est l'organe de régulation de la glycémie, la glucokinase a son activité qui varie fortement en fonction de la glycémie, ce qui permet la régulation de celle-ci.

Enzymes et coenzymes

- 28 -

Les inhibiteurs compétitifs et les effecteurs allostériques agissent en modifiant la conformation de l'enzyme par des liaisons faibles. Ces modifications dépendent essentiellement de la concentration des effecteurs en question; Ici, il sera question de liaisons covalentes, qui sont réalisées ou brisées par des enzymes spécifiques. La modification de la conformation de l'enzyme, donc de son activité, dépend non seulement de la présence de ligands, mais aussi de la présence d'enzymes capables de catalyser la réaction entre le ligand (l'effecteur) et l'enzyme.

Le plus important : Phosphorylation (par des kinases) et déphosphorylation (par des phosphatases enzyme + ATP ---> enzyme-phosphate + ADP Cette réaction est catalysée par une protéine-kinase, qui fixe un phosphate par une liaison ester sur un résidu alcool (sérine, thréonine, tyrosine) ou bien sur une histidine.

Souvent, les kinases elles-mêmes doivent être phosphorylées pour être actives, par d'autres kinases. Il existe donc des « cascades de kinases » qui se phosphorylent progressivement.

Modifications covalentes réversibles des enzymes

Autres modifications covalentes moins importantes

- Fixation d'ubiquitine (protéine)

- réduction ou oxydation de ponts disulfures

Enzymes et coenzymes

- 29 -

Les proenzymes sont des protéines n'acquérant leurs propriétés catalytiques qu'après coupure d'une liaison peptidique

Exemple : les hydrolases sécrétées par le pancréas Le pancréas sécrète des enzymes digestives, qui hydrolysent les aliments contenus dans l'intestin. Si ces enzymes étaient directement fonctionnelles dès leur synthèse par le REG, elles hydrolyseraient les protéines de la cellule, qui serait donc détruite. En fait, ces hydrolases sont synthétisées sous une forme inactive, nommée proenzyme. La proenzyme est activée dans l'intestin par une protéase spécifique, qui en coupe un petit peptide. Après cette ablation, il y a changement de conformation de la protéine. La nouvelle conformation possède alors le site actif bien conformé : l'enzyme est devenue active.

Autre exemple : les facteurs de coagulation du sang Le sang coagule grâce à l'enzyme nommée thrombine, qui catalyse la transformation (hydrolyse) du fibrinogène dissous dans le plasma en fibrine, qui coagule. La thrombine n'existe pas dans le sang sous forme active avant le moment de la coagulation : elle existe sous forme de prothrombine, qui en est la proenzyme. Une autre enzyme (un autre facteur de coagulation du sang) catalyse la coupure de la prothrombine en thrombine et un autre peptide.

Modifications covalentes irréversibles d'enzymes

A la fin de vie d'une enzyme, lorsque celle- ci est hydrolysée par une protéase, elle perd son activité catalytique

Il y a une hiérachie dans le contrôle de l'action des enzymes :

- immédiat : contrôle par la concentration de substrat et de produit

- très rapide : contrôle par la concentration des effecteurs (activateurs et inhibiteurs)

- rapide : modifications covalentes par phosphorylation et déphosphorylation (en fonction de l'activité des enzymes kinase et phosphatase, ou des protéases d'activation)

- lent : transcription et traduction de gènes.

Enzymes et coenzymes

- 30 -

Structure générale du métabolisme et rôle des coenzymes

Enzymes et coenzymes

- 31 -

Molécules complexes :

- polyholosides : amidon, cellulose

- protéines

- acides nucléiques

H 2 O hydrolyse condensation
H
2 O
hydrolyse
condensation

Molécules simples organiques :

- oses

- acides aminés

- nucléotides

oxydation O 2 Molécules minérales : réduction
oxydation
O
2
Molécules minérales :
réduction

-CO 2 , H 2 O

- N 2 , NO 3 -< , NH 4

- SO 4 2- , HPO 4 2-

+

Métabolisme = anabolisme + catabolisme

Enzymes et coenzymes

- 32 -

L'énergie est nécessaire à la vie, et la vie est une transformation d'énergie tout autant qu'une transformation de matière. En biologie, l'énergie est principalement sous forme d'énergie chimique. Par exemple :

- photosynthèse :

- respiration :

E. lumineuse ---------> E. chimique + chaleur

E. chimique ---------> E. mécanique + chaleur + E. chimique

Les systèmes biologiques sont des systèmes ouverts

Le système biologique est la partie de l'univers que l'on étudie. Cela peut être un organisme, ou une cellule, ou une mitochondrie. Le reste, c'est le milieu extérieur. Entre les deux existe une frontière, réelle ou fictive, plus ou moins hermétique. Il existe une convention de signe :

- si le système reçoit de l'énergie, l'échange est noté + (le système a plus d'énergie à la fin de l'opération)

- si le système perd de l'énergie, l'échange est noté - (le système a moins d'énergie à la fin de l'opération).

La même convention est utilisée pour les échanges de matière.

Un système est dit isolé si la frontière est étanche aux échanges de matières, et isolante pour les échanges d'énergie. Un système est dit fermé si la frontière est étanche aux échanges de matières, mais conductrice pour les échanges d'énergie. C'est le cas pour les systèmes étudiés classiquement en physique.

Les systèmes biologiques sont dits ouverts : la frontière est perméable à certains constituants chimiques, et n'est pas isolante sur le plan thermique. Exemple : l'organisme humain échange de la chaleur avec son environnement, absorbe de l'eau, des aliments, du dioxygène, et rejette du CO 2 , de l'eau, des déchets azotés et le résidu de la digestion.

Système thermodynamique extérieur frontière
Système
thermodynamique
extérieur
frontière

B

A système biologique = système ouvert
A
système
biologique =
système
ouvert

Les problèmes de thermodynamique physique P sont avec des systèmes ayant peu de constituants chimiques, et avec des caractères physiques Q (pression, température,

volume

)

variables.

Par contre, les systèmes biologiques ont beaucoup de constituants chimiques pouvant réagir, mais les caractères physiques sont assez constants (pression constante, température constante, volume souvent constant).

Enzymes et coenzymes

- 33 -

Rappel du premier principe de la thermodynamique : l'énergie ne se crée pas, ne se détruit pas, elle se transforme.

Les unités du système international sont le Joule et le kilojoule.

En biologie, on utilise souvent des unités interdites

en physique : la calorie (énergie nécessaire pour élever un gramme d'eau de 1°C), qui vaut 4,18 J et la kilocalorie ou "grande calorie" (kcal ou Cal).

Les ouvrages anglo-américains utilisent parfois la BTU (British Thermal Unit) qui vaut à peu près 1 kJ.

Grandeurs énergétiques fondamentales

En biologie :

- les réactions de dégradation (formation de molécules plus petites) sont exergoniques (= exoénergétiques) : ΔG<0, donc la réaction est thermodynamiquement spontanée

- les réactions de synthèse (formation de molécules plus grosses) sont en général endergoniques (= endoénergétiques) : ΔG> 0 donc non spontanées thermodynamiquement. Il faut un couplage avec une réaction exergonique

(ΔG<0), grâce à des protéines spécialisées, de façon que l'ensemble ait une variation d'énergie libre négative ou nulle. Il y a deux grands groupes de réactions dans le métabolisme :

- réactions d'oxydation/réduction

C 6 H 12 O 6 + 6 O 2 ---> 6 CO 2 + 6 H 2 O

ΔG° ≈ - 2800 kJ/mole

glucose + dioxygène --> dioxyde de carbone + eau

- réaction d'hydrolyse/condensation

En physique, on utilise des grandeurs variées, en particulier pour faire la différence entre les transformations à volume constant ou à pression constante.

- énergie interne U

- enthalpie H

- énergie libre A

- enthalpie libre G

mais en biologie, pour une même réaction, ces grandeurs sont pratiquement égales, puisque les êtres vivants ont un volume constant, une pression constante, et une température constante (ou presque). On ne parle que de variation d'énergie libre au cours d'une réaction ΔG :

l'énergie libre est l'énergie disponible dans la réaction pour faire autre chose que de la chaleur.

L'enthalpie libre molaire (pour une mole du constituant i qui réagit) est aussi appelée potentiel chimique du constituant i (donc en joules par mole).

Les chimistes calculent cette variation d'énergie libre dans les conditions standards ΔG 0 ; cette valeur sert de référence, et ensuite on peut calculer ΔG dans des conditions différentes :

- pression = 1 atmosphère (10 5 pascals)

- température = 25°C (298 K)

- concentrations en divers réactifs et produits égales à 1

En biochimie, on peut trouver la notation ΔG 0 ’ ; l’origine de l’apostrophe vient du

fait que les conditions standards sont différentes : pH = 7

Enzymes et coenzymes

- 34 -

Les systèmes biologiques ne correspondent pas aux conditions standards.

Soit la réaction aA + bB <=> pP + qQ. Si ΔG 0 est la variation d'énergie libre dans les conditions standards. on démontre et nous admettrons que :

G =  G ° RT ln [ P ] p . [ Q ]

A ] a . [ B ]

q

b

[

Donc selon la composition du système, une réaction pourra être exergonique ou non, c'est à dire spontanée ou non.

A l'équilibre, ΔG = 0, donc on en déduit que ΔG 0 = - RT ln(Ke)

où Ke est la constante d'équilibre

Ke = [ A ] a. [ B ] b [ P ] p. [ Q ] q

La variation d'énergie libre d'une réaction dépend de la composition du système

Énergie du système

réaction équilibre [A]+[B] = 100% [P]+[Q]=100% réaction
réaction
équilibre
[A]+[B] = 100%
[P]+[Q]=100%
réaction

Les processus physiques et chimiques qui ont lieu dans les êtres vivants obéissent aux mêmes lois que ceux qui ont lieu à l'extérieur des êtres vivants, mais les êtres vivants les utilisent à leur profit, pour pouvoir grandir, se multiplier et avoir leurs activités.

Enzymes et coenzymes

- 35 -

Les systèmes vivants sont en état stationnaire de non-équilibre

En chimie, on étudie classiquement les situations d'équilibre, où les concentrations ne varient pas, car les constituants se transforment les uns en les autres. Ainsi, lorsque l'équilibre est atteint, l'entropie du système ne varie pas. En biologie, c'est différent : il entre dans le système un flux de matière, en permanence, et il en sort aussi un flux d'autres constituants. Par exemple, l'organisme humain consomme en permanence des molécules organiques et de l'oxygène, et rejette en permanence de l'eau et du dioxyde de carbone.

Là encore, les concentrations restent constantes, car les êtres vivants maintiennent constante leur composition chimique. On donne à cette situation le nom d'état «stationnaire de non équilibre», ou d'«équilibre dynamique». L'entropie du système reste aussi constante, mais de façon différente : le système vivant utilise l'énergie du milieu extérieur. On démontre en physique que c'est dans ce cas que l'énergie est la moins dégradée, c'est à dire que la production d'entropie est la plus faible. On peut aussi montrer que les relations entre ΔG et les concentrations vues au paragraphe précédent sont encore valables.

aA + bB ↔ pP + qQ
aA + bB ↔ pP + qQ

état d'équilibre

A aA + bB ------> pP + qQ B état stationnaire de non-équilibre
A
aA + bB ------> pP + qQ
B
état stationnaire de non-équilibre

P

Q

On démontre en physique que c'est dans ce cas que l'énergie est la moins dégradée,
On démontre en physique que c'est dans ce cas
que l'énergie est la moins dégradée, c'est à dire
que la production d'entropie est la plus faible.
On peut aussi montrer que les relations entre
ΔG et les concentrations vues au paragraphe
précédent sont encore valables.
q
 G =  G °  RT ln  [ P ] p . [ Q ]
b 
[
A ] a . [ B ]
ΔG 0 = - RT ln(Ke)
Ke = [ A ] a. [ B ] b
[ P ] p. [ Q ] q

Enzymes et coenzymes

- 36 -

Pour rester en vie, il faut que l'organisme dégrade l'énergie du milieu extérieur, de façon à maintenir intacte son énergie libre interne. Autrement dit, il faut qu'il fasse augmenter l'entropie du milieu extérieur, pour garder la sienne constante. Cela se fait essentiellement par des réactions d'oxydation. Exemple : l'oxydation du glucose

C6H12O6 + 6 O2 ---> 6 CO2 + 6 H2O

ΔG° ≈ - 2800 kJ/mole

Au niveau atomique, une oxydation est une perte d'électrons, et une réduction est un gain d'électrons. Un corps oxydant sera celui qui provoquera la perte d'électrons dans une autre substance, en acquérant lui-même les électrons. Un corps réducteur est celui qui donne facilement des électrons, de façon à réduire une autre substance.

le potentiel d'oxydation (potentiel d'oxydo-réductionmesure la capacité à oxyder d'autres substances, donc mesure la capacité de la substance à recevoir des électrons.

En d'autres termes, les électrons vont vers les couples d'oxydoréduction qui ont le potentiel le plus positif.

Les électrons vont vers les potentiels d'oxydo-réduction positifs, et c'est la même chose pour l'hydrogène (proton + électron). On peut donc avoir des chaînes de transporteurs, où chaque transporteur peut exister sous deux formes : oxydée et réduite. Ce potentiel E dépend de la concentration des différentes formes selon la formule de Nernst.

٠

E A = E A

R.T

z.F

ln [ A ox ]

[ A red ]

E

= potentiel d'oxydation de A

z

= nombre d'électrons mis en jeu

F

= constante de Faraday

(96500 coulombs)

R

= constante des gaz parfaits (8,314 J/mole)

T

= température absolue

[A ox ] = concentration de la forme oxydée de A [A red ] = concentration de la forme réduite de A

Réactions d'oxydo/réduction

énergie potentielle des électrons

d'oxydo/réduction énergie potentielle des électrons E B : B + /B (B → B + +
d'oxydo/réduction énergie potentielle des électrons E B : B + /B (B → B + +

E B : B + /B

(B

→ B + + e - )

→ B + + e - )

E A : A + /A

(A + + e - → A)

potentiel d'oxydation des couples redox

réaction spontanée : B + A + → B + + A

Dire que l'oxygène est un oxydant puissant peut être indiqué sous forme de potentiel d'oxydation :

le couple H2O/ ½ O2 a un potentiel d'oxydation de 0,81 V (fortement positif, donc attirant les électrons)

Une oxydation spontanée doit correspondre avec une variation négative d'énergie libre. Si un électron passe d'une molécule B à une molécule A, sa variation de potentiel d'oxydo-réduction est de ΔE = E A - E B . Plus la différence de potentiel est grande, plus la variation d'énergie correspondante est élevée. On peut montrer que :

ΔG = - zFΔE (en joules) Cette différence de potentiel varie avec la concentration des réactifs, tout comme l'énergie libre.

Enzymes et coenzymes

- 37 -

Progressivité de l'oxydation des molécules biologiques

L'oxydation directe des molécules biologiques pose des problèmes :

- elle dégage beaucoup d'énergie, et une énergie dégagée aussi brutalement peut être difficile à récupérer pour d'autres réactions. Exemple pour une mole de glucose :

C 6 H 12 O 6 + 6 O 2 ----------> 6 CO 2 + 6 H 2 O ΔG 0 = -2870 kJ = - 687 kcal

- elle demande une forte énergie d'activation, donc en principe une température élevée ; or les êtres vivants fonctionnent à basse température.

Dans la cellule, l'oxydation est toujours indirecte et progressive :

- fixation d'oxygène : X + 1/2 O 2 ----> X-O

- perte d'électrons (classique en chimie)

- fixation d'eau et déshydrogénation

R-CHO + H 2 O

----> R-COOH + H 2 activé

- perte d'hydrogène

R-CH 2 -OH ----> R-CHO + H 2 activé

Les variations d'énergie libre sont additives :

Quelles que soient les diverses réactions chimiques effectuées entre un même état initial et un même état final, la variation d'énergie libre ΔG est identique. On peut montrer en physique que le rendement thermodynamique est meilleur avec un grand nombre de petites réactions qu'avec une seule, mais en biologie, il existe un avantage supplémentaire aux ensembles de réactions : ils permettent une bonne possibilité de régulation sur les enzymes.

Enzymes et coenzymes

- 38 -

Les molécules constituant les êtres vivants sont des macromolécules formées par la condensation de monomères, les nutriments. La polymérisation de ces monomères se fait par condensation = élimination d'une molécule d'eau. Normalement, c'est une réaction endergonique (= endoénergétique), qui nécessite de l'énergie extérieure. Les réactions de synthèse de matière organique constituent l'anabolisme.

La réaction inverse, qui donne des monomères à partir des molécules organiques, est une hydrolyse : cassure de la molécule organique par la molécule d'eau, et aussi cassure de la molécule d'eau. Exemples : hydrolyse du lactose en galactose et glucose, hydrolyse des protéines en acides aminés, hydrolyse des lipides en acides gras et glycérol, hydrolyse des acides nucléiques en nucléotides Normalement, l'hydrolyse est une réaction exergonique (= exoénergétique), qui ne nécessite pas d'énergie extérieure, et qui est donc thermodynamiquement spontanée. Les réactions de destruction des grosses molécules pour en faire de plus petites constituent le catabolisme. On dit que les grosses molécules sont dégradées : « dégradation » signifie « hydrolyse et oxydation ».

Certaines molécules peuvent être hydrolysées en libérant plus d'énergie que la normale. On dit que ce sont des « composés à haut potentiel d'hydrolyse », ou « molécules riches en énergie ». Classiquement, il faut que ΔG <--30 kJ/mole. En d'autres termes, pour qu'une liaison soit qualifiée de « à haut potentiel d'hydrolyse », il faut que son hydrolyse dégage plus de 30 kJ/mole. C'est en particulier le cas de l'ATP, qui possède deux de ces liaisons :

ATP ---> ADP + Pi : ΔG°' = -34,5 kJ/mole ATP ---> AMP +PPi : ΔG°' = -37,4 kJ/mole

Dans la cellule, ΔG est plutôt de l'ordre de 50 kJ/mole.

Enzymes et coenzymes

- 39 -

ATP = Adénosine Tri Phosphate

« phosphate » =

atome de phosphore (pentavalent), lié à des oxygènes :

- double liaison avec un O

- simples liaisons avec 3 O, normalement formant 3 acides, mais dont un ou deux sont liés (ester ou anhydride d'acide)

- O

O O O P O P O- P O O - O - O -
O
O O
P
O
P
O-
P O
O -
O -
O -

La molécule d'ATP et ses propriétés

la fonction alcool (OH) du carbone 5' est estérifiée par le phosphate

P P ˜ ˜
P
P ˜
˜
P
P

Les phosphates sont liés entre eux par des liaisons « anhydride d'acide », riches en énergie

NH 2 N N N N CH 2 O OH OH
NH 2
N
N N
N
CH 2
O
OH
OH

Adénine

(nucléobase

purique)

liaison N-

glycosidique entre la nucléobase et le carbone 1' du pentose ribose

Enzymes et coenzymes

- 40 -

-0,6 potentiel d'oxydation standard 2H+/H2 -0,42 -0,4 NADP+/NADPH -0,32 NAD+/NADH -0,31 -0,2 FAD/FADH2 -0,22
-0,6
potentiel d'oxydation
standard
2H+/H2 -0,42
-0,4
NADP+/NADPH -0,32
NAD+/NADH -0,31
-0,2
FAD/FADH2 -0,22
pyruvate/lactate -0,18
0
0,2
0,4
fumarate/succinate 0,03
Les électrons
montent les
potentiels
d'oxydation : ils
vont vers les
couples les plus
oxydants.
NO3-/NO2- 0,43
0,6
0,8
O2/2 H2O 0,82
1
10
0

NAD : la forme oxydée est chargée NAD + ; elle peut recevoir 2 électrons et un H + , ce qui donne NADH. Ce coenzyme intervient dans le catabolisme (glycolyse, cycle de Krebs==> phosphorylation oxydative). Le NADP porte un phosphate sur le ribose. Il fournit du pouvoir réducteur aux enzymes de l'anabolisme. Le nicotinamide nous est fourni par la vitamine PP dans l'alimentation.

FAD provient de la vitamine

B2.

NAD, FAD et les coenzymes transporteurs d'hydrogène

fixation possible d'H sur nicotinamide ou flavine

fixation possible d'H sur nicotinamide ou flavine (illustration tirée de G2E biologie 2 2004 "les
fixation possible d'H sur nicotinamide ou flavine (illustration tirée de G2E biologie 2 2004 "les

(illustration tirée de G2E biologie 2 2004 "les vitamines")

Enzymes et coenzymes

- 41 -

En biologie, l'énergie se transmet en général sous forme chimique : les réactions chimiques dégagent ou consomment de l'énergie. Il ne sera donc question ici que des couplages entre une réaction chimique et une autre forme d'énergie : autre réaction chimique, énergie lumineuse, énergie mécanique, énergie électrique ou électrochimique

Réaction chimique / déformation mécanique moléculaire réaction exergonique ==> déformation moléculaire :

contraction musculaire

oxydo-réduction ==> DDP électrochimique Fonctionnement de la chaîne d'oxydo-réduction de la membrane interne de la mitochondrie, qui expulse les H + .

DDP électrochimique ==> réaction endergonique :

synthèse d'ATP par ATP-synthase (couplage chimio-osmotique dans mitochondrie, chloroplaste ou bactérie)

Divers types de couplages énergétiques en biologie

Réaction chimique exergonique / réaction chimique endergonique :

synthèse d'ATP pendant la glycolyse

Réaction chimique exergonique ==> émission de lumière "Vers luisants" et autres animaux ou microorganismes lumineux.

Absorption de lumière ==> réaction d'oxydo-réduction :

fonctionnement du photosystème II

Absorption de lumière ==> DDP électro-chimique :

fonctionnement du photosystème I

Enzymes et coenzymes

- 42 -

HS

adénine
adénine

mercapto-éthylamine + acide pantothénique (vit B5)

ribose
ribose

Le coenzyme A est constitué d'une adénosine liée à un groupement terminé par une fonction thiol (-SH), qui est la partie réactive.

Le coenzyme A (CoA) permet le fonctionnement des transférases, en particulier pour le transfert de groupes acétyl CH 3 -C=O, et des divers groupes acyl (avec une plus longue chaîne carbonée.

CoA-S~CO-CH 3 = acétyl-coenzyme A

chaîne carbonée. CoA-S~CO-CH 3 = acétyl-coenzyme A La liaison thioester est à haut potentiel d'hydrolyse

La liaison thioester est à haut potentiel d'hydrolyse ("riche en énergie") : sa rupture libère une grande quantité d'énergie.

Le coenzyme A, transporteur de groupes acyl

Enzymes et coenzymes

- 43 -

Activateurs

15

Dénaturation

 

6

Katal 4

 

Représentation inverse de Lineweaver-

Activateurs allostériques

 

21

Déshydrogénase

11

Kcat 13

Burk

14

Adénosine

Tri Phosphate

38

Effecteurs

 

15,

17

Kinases27

Site actif

16

Affinité de l'enzyme pour le substrat. 13

Effecteurs

allostériques

27

Km 9

Structure quaternaire

17

Alcool-déshydrogénase

 

23

Effecteurs

non compétititfs

17

Krebs 23

Substrat

3

Allostérie

17

Effet

allostérique

hétérotrope

18

Ligand 15

Système biologique

31

Amylase

3

sv

Effet

allostérique

homotrope

18

Ligases 8

Température

6

Anabolisme

30

Endergoniques

32

Lineweaver-Burk

 

14

Thrombine

12,

28

Anhydride

38

Énergie

d'activation

 

36

Lyases 8

 

Transférases

7

sv

ATP 38

 

Énergie

interne

 

32

Malate-déshydrogénase

 

23

Transition allostérique

18

Biocatalyseur

 

3

Énergie

libre

32

Maltose4

 

Transporteurs d'hydrogène

7

Calorie 32

 

Enthalpie

32

Menten 9

Trypsine

12

Carrefour métabolique

 

22

Enthalpie

libre

32

Métabolisme

 

30

Ubiquitine

27

Catabolisme

30

Enthalpie

libre

molaire

 

32

Michaelis

9,

13 sv, 16

Variation d'énergie libre

32

Chymotrypsine

12

Entropie

 

34

Michaelis-Menten

 

14

Vitesse maximale

9,

13

Cinétique

coopérative

21

Enzymes

21

Modèle « ping-pong »

24

Vitesses initiales

4

Cinétique

michaelienne

9

Enzymes

allostériques

 

20

Modèle

bi-bi

23

Vmax 9

Cinétique

sigmoïde

19

Enzymes

allostériques

19

NAD

23, 39

Vmax 13

Cinétiques enzymatiques à deux

7,

Enzymes oligomériques

17,

20

Nernst 35

 

Voie métabolique

20,

22

substrats

23

Équilibre dynamique

34

Nutriments

 

37

Coagulation

12

État

18

Oxydation

 

35

sv

Coenzyme A

42

État

d'équilibre

34

Oxydation/réduction

 

32

Coenzymes

7

État

tendu

18

Oxydoréductases

8

Coenzymes transporteurs

39

Exergonique

 

32

Paramètres

9

Cofacteurs

7

Fermentation lactique

25

Peptidases

6

Complexe

enzyme-substrat

13

Fibrinogène

28

PH optimal

6

Complexe

ES

13

Glucokinase

26

Phase

préstationnaire

4

Composés à haut potentiel d'hydrolyse

Glycogènephosphorylase

21

Phase

stationnaire

4

 

37

Glycogénolyse

20

Phosphatases

 

27

Condensation

 

37

Glycolyse

20

Phosphofructokinase

21

Conditions

32

Hexokinase

26

Ponts disulfures

27

Conditions initiales

 

5

Hydrolases

8, 28

Potentiel

chimique

32

Constante

catalytique

13

Hydrolyse

 

37

Potentiel

d'oxydation

35

Constante

d'équilibre

33

Hydrolyse/condensation

32

Produit 3

 

Constante

d'inhibition

16

Inhibiteurs

15

Proenzymes

 

28

Constante

de Faraday

35

Inhibiteurs allostériques

21

Protéase

12

Constantes de vitesse

13

Inhibition compétitive

16

Protéases à sérine

12

Coopération entre les sous-unités

18

Inhibitions incompétitives

17

Prothrombine

28

Couplages

40

Isoformes

25

Protomères

 

17,

18

Courbe cinétique

9

Isomérases

8

Protomères)

 

17

Cycle de Krebs

 

23

Isozymes

25

Régulation

 

36,

20