UNIVERSIDAD DE CHILE

Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas

Depto. de Bioqumica y Biologa Molecular
Laboratorio de Microbiologa





Guas de Trabajos Prcticos
Asignatura Microbiologa









Prof. Sergio Alvarez.



2009

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NORMAS GENERALES Y DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGA

Uno de los principales objetivos del laboratorio de Microbiologa es que los alumnos aprendan
a manipular microorganismos potencialmente patgenos, por lo que las normas debern cumplirse en
todo momento. Los alumnos debern aprender a trabajar de modo de evitar riesgos de infeccin, como
tambin de impedir la contaminacin de las muestras con microorganismos ambientales.


1.- El uso del delantal ser obligatorio.
2.- Est estrictamente prohibido fumar y comer en el laboratorio. Trate de no llevarse los dedos, lpices,
etc., a la boca.
3.- No ponga sus apuntes, cuadernos o mochila sobre los mesones.
4.- En caso de derramar algo, quebrar un tubo, placa o cualquier otro accidente, avise de inmediato al
profesor quien se preocupar de limpiar y desinfectar adecuadamente. Trabaje en el lugar asignado,
evite pasearse por el laboratorio con tubos con cultivos en las manos.
5.- El uso de mecheros es siempre necesario por lo que se ruega tener mucho cuidado para evitar
quemaduras. Debido al tipo de iluminacin del laboratorio es difcil ver los mecheros encendidos, por
lo que recuerde apagarlos cuando no los este usando. Para evitar que se les queme el pelo es
conveniente que las personas de pelo largo se hagan un moo. En lo posible utilice ropa y delantales
de algodn, evitando la ropa de materiales sintticos.
6.- Recuerde que est trabajando con microorganismos patgenos o potencialmente patgenos por lo
tanto, todo el material contaminado y sucio deber ser autoclavado. Se dispondr de ollas para
eliminar este material (placas, tubos, pipetas). Nunca debe vaciar un caldo de cultivo contaminado por
el desage.
7.- Al finalizar su trabajo deje ordenados y limpios los mesones. Antes de salir del Laboratorio no olvide
desinfectar sus manos con alcohol con yodo. Deje secar y espere al menos 5 minutos antes de
enjuagarse o lavarse con jabn.
8.- La asistencia a T.P. es de un 100%. Dado a que los horarios de trabajos prcticos coinciden con los
horarios de otras asignaturas y la gran cantidad de alumnos es muy difcil recuperar un prctico en
caso de inasistencias. Se exigir puntualidad, pues las explicaciones se darn al comienzo de
cada trabajo prctico.
9.- Las pruebas de TP se realizarn los das Lunes y Viernes de la semana correspondiente, al inicio del
TP. La prueba del da lunes controlar el contenido de la gua. La prueba del da viernes
considerar el anlisis de las actividades realizadas durante la semana.
.

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1. OBSERVACIN DE BACTERIAS AL MICROSCOPIO

Debido a su pequeo tamao y a que tienen un ndice de refraccin similar al vidrio (lo que las hace
transparentes), las bacterias son difciles de observar directamente, por lo tanto es necesario teirlas para
poder verlas o para detectar alguna de sus estructuras. El proceso de tincin se debe a reacciones qumicas
entre un colorante y alguna estructura bacteriana.
Las tinciones se clasifican en:
a) Tinciones simples. Se utiliza un slo colorante para revelar la presencia de microorganismos y su
forma en general. Son de poco uso en bacteriologa.
b) Tincin negativa. Se tie el fondo mientras que las clulas permanecen sin teir (transparentes),
observndose como entidades claras sobre un fondo obscuro. Ejemplo de este tipo de tincin es la
tincin de cpsula en la que se usa tinta china.
c) Tinciones especiales. Se utilizan para observar alguna estructura en particular como nucleoide,
flagelo, esporas, etc.
d) Tinciones diferenciales. Las bacteria son diferentes entre s, tanto en su estructura fsica como en su
composicin qumica, de modo que reaccionan en forma diferente frente a los colorantes. Estas
tinciones se utilizan para diferenciar los distintos grupos de bacterias. La Tincin de Gram es la tincin
diferencial ms importante usada en bacteriologa.

1.1.- Tincin de Gram
Es una tincin diferencial que permite diferenciar dos grandes grupos de bacterias: Gram positivas y
Gram negativas. Consiste en teir un frotis de bacterias fijadas sobre un portaobjeto con cristal violeta y luego
tratarlas con una solucin mordiente (fijadora) de Iodo y ioduro. Todas las bacterias se tien en estas
condiciones. Sin embargo, slo algunas son capaces de retener el colorante al tratarlas con un agente
decolorante como etanol o una solucin de etanol-acetona. Las bacterias que retienen el colorante son Gram
(+) y las que se decoloran son las Gram (-). Para observar estas ltimas se tien con un colorante de
contraste (safranina). Por lo tanto, las Gram (+) se vern de color violeta y las Gram (-) de color rojo o rosado.
La diferencia en la reaccin frente a la tincin de Gram se debe a la diferencia en la composicin
qumica de las estructuras externas de las bacterias. Las bacterias Gram (+) tienen una capa gruesa de
peptidoglicn o murena, mientras que las Gram (-) tienen menor cantidad de peptidoglicn y tienen la
membrana externa (adems de la membrana citoplasmtica). La explicacin ms aceptada es que, luego de
la accin de la solucin decolorante, las bacterias Gram (+) son capaces de retener el colorante gracias al
peptidoglicn. En cambio, las Gram negativas, pierden parte de los lpidos de su membrana externa por
accin del decolorante lo que sumado a la menor cantidad de peptidoglicn, hace que se decoloren. Es
importante destacar que la etapa crtica en la tincin es la de decoloracin, por lo que se debe tener especial
cuidado en realizarla en forma adecuada.
En ocasiones las bacterias Gram (+) pueden observarse como Gram (-) debido a que no son capaces
de retener el colorante producto de alteraciones en su envoltura especialmente en cultivos envejecidos. Esto
tambin puede ocurrir en condiciones de decoloracin muy prolongada.

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1.2.- Tincin cido resistente o Tincin de Ziehl Neelsen.
Esta es otra tincin diferencial que se utiliza para un grupo de bacterias llamadas alcohol-cido
resistentes. A este grupo pertenece el gnero Mycobacterium; dos especies de este gnero son M.
tuberculosis (Bacilo de Koch) y M. leprae (Bacilo de Hansen).
Son bacterias que se tien con dificultad (en caliente) y son capaces de retener el colorante an por
accin de decolorantes enrgicos como una solucin de alcohol y cido clorhdrico. Estas propiedades se
deben a la gran cantidad de lpidos que tienen en su cubierta, incluyendo cidos grasos de alto peso
molecular, que constituyen entre el 20 y el 40% del peso seco de la bacteria. Este contenido inusualmente alto
en lpidos le confieren a este grupo una alta hidrofobicidad, de tal forma que se observan frecuentemente
formando grumos en medio lquido.

1.3.- Tincin de Esporas.
Esta tincin es un ejemplo de una tincin especial. Algunos gneros bacterianos como Bacillus y
Clostridium, producen endosporas como una forma de resistencia a condiciones ambientales adversas, por
ejemplo sequedad o falta de nutrientes. Las endosporas o esporas se caracterizan por ser altamente
resistentes al calor, a las radiaciones y a la desecacin. La resistencia de la espora se debe a la estructura
proteica (rica en aminocidos azufrados) de sus capas externas, lo que tambin las hace resistentes a tincin.
Por este motivo las esporas se tien en caliente.

1.4.- Observacin de bacterias al fresco.
Para observar las bacterias vivas, sin teir, se utiliza el microscopio de fase contrastada. Este tipo de
microscopio permite observar clulas pequeas sin teir. Se basa en utilizar y aumentar la pequea
diferencia de ndice de refraccin que existe entre las clulas y el medio que las circunda. Esta diferencia
puede ser usada para crear una imagen con mucho mayor contraste que la que se obtiene en el microscopio
de campo claro. Este microscopio usa un lente objetivo especial y en el condensador se inserta un diafragma
especial; adems para aumentar el contraste se insertan filtros verdes o azules.


2. MEDIOS DE CULTIVO

Todos los organismos vivos requieren agua, una fuente de energa, carbono, nitrgeno, oxgeno,
azufre, fsforo, adems de elementos trazas. Algunos requieren compuestos de mayor complejidad como
aminocidos, lpidos y vitaminas.
Es posible multiplicar bacterias in vitro mediante el uso de medios de cultivo adecuados. Estos se
caracterizan por ser preparados estriles que contienen las sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo
de microorganismos, tener un pH adecuado que depender del tipo de organismo y estar envasados
convenientemente.


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2.1.- Ingredientes comnmente usados en los medio de cultivo:
Existe una gran variedad de medios complejos cuya composicin qumica depende del tipo de bacteria en
estudio. En el mercado hay empresas que fabrican medios de cultivo preparados y deshidratados. Como por
ejemplo:
a) Extracto de Carne: se obtiene a partir del caldo resultante de hervir carne de vacuno; ste luego se
concentra hasta formar una pasta. Contiene aminocidos, vitaminas y minerales.
b) Peptona: se obtiene por hidrlisis de diferentes protenas con enzimas proteolticas como pepsina,
tripsina o papana. Contiene pptidos cortos y aminocidos. Existen peptonas de carne, de casena,
de harina de soya y mezclas de ellas.
c) Casena hidrolizada: se obtiene por hidrlisis de casena con cido clorhdrico.
d) Extracto de levadura: se obtiene por extraccin acuosa de levadura de cerveza autolisada. Se utiliza
como fuente de vitaminas, especialmente complejo B.
e) Agar-Agar: es un hidrato de carbono complejo, obtenido de algas marinas, que se caracteriza porque,
a las concentraciones utilizadas en los medios de cultivo, se funde a 100C, y se mantiene en estado
lquido hasta aproximadamente los 45C; a temperaturas inferiores solidifica como gel. No es
degradado por la gran mayora de las bacterias, por este motivo se utiliza como gelificante de medios
slidos.

2.2.- Clasificacin de los medios de cultivo.
Se clasifican de acuerdo a:



Su estado fsico:
a) Lquidos: reciben el nombre genrico de caldos. Se envasan en tubos de ensayo, frascos o
matraces.
b) Slidos: contienen agar-agar como gelificante en una concentracin que vara entre 1,5 y 2%, lo que
los hace slidos a la temperatura habitual de incubacin (entre 25 y 37C). Luego de esterilizarlos al
autoclave, el medio fundido se envasa en placas de Petri estriles. Tambin, estos medios se pueden
preparar en tubos de ensayo. Una vez autoclavados y antes que el agar se solidifique (50C), los
tubos se pueden dejar enfriar en un plano inclinado de modo que al gelificar el agar, se forma un
ngulo sobre la superficie del vidrio, ste se conoce con el nombre de agar tendido o agar estra.
c) Semislidos: Contienen una concentracin de agar de 0,5%. Se utilizan para estudiar porpiedades
fisilgicas como la movilidad bacteriana

Su composicin qumica:
a) Medio general o base: permite la multiplicacin de una gran variedad de bacterias. Por ejemplo, agar
nutritivo que contiene extracto de carne, peptona y agar, disueltos en agua. Estos medios de cultivo se
pueden usar adems como base para la preparacin de medios de cultivo ms complejos
(enriquecidos).
b) Medios mnimos: contienen un mnimo de sustancias nutritivas para el desarrollo de bacterias. Ej.
una fuente de carbono como glucosa o glicerol y sales inorgnicas.

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c) Medios enriquecidos: son medios de cultivos generales o base a los que se les adiciona otros
compuestos orgnicos como factores de crecimiento, suero, sangre, etc.
d) Medios selectivos: contienen compuestos qumicos que inhiben selectivamente el desarrollo de algn
grupo de bacterias. Por ejemplo, la adicin de cristal violeta inhibe el desarrollo de los Gram (+),
permitiendo el desarrollo de los Gram (-). Otros compuestos que pueden incluir los medios selectivos
son antibiticos, sales biliares, otros colorantes, cloruro de sodio, cidos o bases.
e) Medios diferenciales: contienen algn compuesto qumico o un indicador de pH que permite observar
diferencias bioqumicas entre las bacterias. Por ejemplo, un medio puede contener un hidrato de
carbono (glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, etc.) el que al ser fermentado por una determinada
bacteria producir un compuesto cido, el que se puede evidenciar por el viraje del indicador de pH.
f) Medios de enriquecimiento: se basan en el principio de libre competencia entre las bacterias. En
estos medios, se desarrollan ms rpidamente aquellas bacterias para las que el medio de cultivo es
ms favorable. Por ejemplo, en un medio que contiene lactosa como nico azcar fermentable, las
bacterias capaces de fermentar lactosa se multiplicarn ms rpidamente que las que no lo hacen, de
modo que, luego de incubar habr predominantemente bacterias fermentadoras de lactosa.
g) Medios selectivos y diferenciales: existen medios que renen ambas condiciones, es decir,
contienen compuestos qumicos que inhiben el desarrollo de un grupo de bacterias y contienen
adems algn compuesto qumico o un indicador de pH que permite observar diferencias bioqumicas
entre las bacterias. (Ej. Agar MacConkey usado para las bacterias de la Familia Enterobacteriaceae
(descrito ms adelante).


3. SIEMBRA Y AISLAMIENTO.

Al trabajar con bacterias es necesario usar tcnicas especiales que permitan multiplicar las bacterias,
trabajar con cultivos puros y evitar contaminacin con otros grmenes.
El estudio normalmente se inicia con la siembra de la bacteria, es decir, la inoculacin de la muestra
en un medio de cultivo adecuado. Esta siembra debe hacerse en condiciones aspticas. Los instrumentos
usados son: asa o aguja metlica (platino o nicrn), pipeta Pasteur, pipeta, trula. Las pipetas deben estar
estriles y protegidas con algodn card en el extremo que se lleva a la boca. Las asas se esterilizan en la
llama del mechero en el momento de usarlas. De esta manera se evita introducir bacterias contaminantes.
Despus de sembrar se debe incubar por un tiempo determinado y a una temperatura adecuada. Las
bacterias de importancia en medicina se incuban a 37C durante 18 a 24 horas.
Para la identificacin de bacterias se requiere que stas estn en cultivos puros, es decir, libres de
otras bacterias u otros microorganismos contaminantes, por lo tanto para poder estudiarlas e identificarlas
debemos aislarlas. Existen diversos mtodos para el aislamiento bacteriano. El mtodo ms utilizado es la
diseminacin sobre una placa Petri que contiene un medio de cultivo slido adecuado (ver esquema en la
siguiente pgina). Consiste en sembrar una pequea cantidad de muestra en una zona de la superficie de una
placa. A partir de esta zona inicial las bacterias se diseminan, realizando trazos paralelos con el asa, sobre la
superficie del agar; luego se realiza un segundo trazado a partir del anterior y despus un tercero y as
sucesivamente, esterilizando el asa en la llama entre cada trazado. El objetivo es dispersar cada vez ms la

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muestra para obtener bacterias aisladas. Luego de incubar, cada una de estas bacterias dar origen a una
colonia aislada o clon, la cual est constituida por millones de bacterias y es por consiguiente un cultivo puro.
Este procedimiento de obtencin de colonias aisladas se utiliza ya sea sobre medios de cultivo
bsicos, en los que tericamente podr crecer cualquier bacteria presente en la muestra, o bien en medios de
que permiten inhibir el crecimiento de la flora acompaante (medios selectivos) y/u observar propiedades
bioqumicas como, por ejemplo, la capacidad de fermentar algn azcar (medio diferencial).



3.1 Caractersticas de las colonias

Luego de la siembra e incubacin, se obtienen colonias. Las distintas especies generarn colonias cuyas
caractersticas son propias de esa especie en esa condicin de cultivo.
a) Tamao: es posible obtener colonias desde muy pequeas, con un dimetro inferior a 1 milmetro,
hasta colonias de 5 a 10 cm de dimetro. Algunas especies tienen la habilidad de moverse sobre la
superficie del agar, como Proteus, y forman una especie de velo o pelcula sobre la superficie.
b) Borde: puede ser circular, liso, irregular, lobulado, rizoide, etc.
c) Elevacin: pueden ser planas, levantadas, convexas, cncavas, en forma de ficha de damas, etc.
d) Pigmentacin: la colonia puede ser incolora, pigmentada o puede producir un pigmento difusible.
e) Caractersticas pticas: pueden ser opacas o brillantes, traslcidas u opalescentes.
f) Consistencia: mucoide, seca, filante (al tocarla con el asa forma como hilos), como engrudo.
g) Superficie: lisa, rugosa o escamosa.


4. DETERMINACIN DEL NMERO DE BACTERIAS

Frecuentemente es necesario determinar el tamao de una poblacin bacteriana y para ello se realiza
un recuento de clulas bacterianas. Se pueden distinguir dos tipos de recuento bacteriano:
a) recuento de clulas viables: bacterias vivas, capaces de multiplicarse.
b) recuento total: no distingue entre las bacterias vivas y muertas.

4.1. Recuento de clulas viables.
En estas tcnicas lo que se pretende es conocer el nmero de bacterias vivas, capaces de
multiplicarse presentes en un cierto volumen o masa de muestra (Ej.: orina, alimento, agua, producto
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

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farmacutico, etc.). El primer paso es hacer una dilucin seriada de la muestra ocupando material estril
(pipetas graduadas o automticas) y diluyentes adecuados (H
2
O, suero salino, solucin Ringer, agua
peptonada al 0,1%, etc.). Habitualmente las diluciones tiles se encuentran entre 10
-6
y 10
-9
segn el tipo de
muestra.

41.1.- Recuento de clulas viables en placa. Siempre se trabaja, por lo menos, en duplicado
con las placas bien rotuladas. Se agrega a las placas un volumen conocido de cada dilucin. Se debe usar un
rango de diluciones de modo de obtener entre 25 y 250 colonias en la placa, que es el rango de colonias
adecuado para contar sin cometer errores ya sea por defecto o exceso. Para contar las colonias se utiliza un
cuenta colonias de Quebec o bien la observacin directa de la placa. Este recuento en placa se puede hacer
de dos maneras: a) recuento en placa en profundidad y b) recuento en placa en superficie.
4.1.1a.- Recuento en placa en profundidad: Se funde agar de recuento u otro medio
adecuado y se mantiene a 45C. Se vierte un volumen de cada dilucin en el centro de la placa vaca. Luego
se agrega el agar fundido, se homogeneiza dejando solidificar, y se incuba 24 a 48 horas. Se cuentan todas
las colonias, incluyendo aquellas que quedaron atrapadas en el agar y que son de menor tamao. Para
expresar el resultado se calcula el promedio del nmero de colonias y se debe dividir por el factor de dilucin
en la cual se cont. Ejemplo: si se cuenta un promedio 125 colonias al plaquear 1 mL de la dilucin 10
-6
, el
resultado que se informa es 1,3 por 10
8
unidades formadoras de colonias/mL (ufc/mL).
4.1.1b.- Recuento en placas en superficie: Se coloca un volumen conocido de la dilucin a
ensayar sobre la superficie de una placa que ya contiene el medio nutritivo. Se extiende con un rastrillo o
esptula de Drigalski de modo de diseminar bien la muestra sobre la superficie del agar y luego se incuba 24-
48 hrs. El resultado se expresa en la misma forma anterior. En este caso, todas las colonias crecen sobre la
superficie del agar.
4.1.1c. Recuento mediante membranas filtrantes.
Se utiliza principalmente para lquidos que contienen pocas bacterias. Se pasa la muestra a travs
de filtros estriles (0,45 m dimetro de poro), que retienen las bacterias. Luego los filtros se depositan en un
medio de cultivo slido o flotando sobre un medio lquido y se dejan incubar. Las bacterias crecern sobre el
filtro formando colonias que pueden ser contadas.
Este mtodo ofrece algunas ventajas: se puede identificar las especies bacterianas presentes mediante el
traspaso sucesivo del filtro a diferentes medios diferenciales; se puede concentrar la muestra, filtrando
grandes volmenes. Por ejemplo para agua potable se filtran 100 mL; se utiliza tambin en lquidos que
contengan algn agente inhibidor del desarrollo bacteriano (preservante, antibiticos), ya que una vez
filtrada la muestra, la membrana se puede lavar con algn diluyente para eliminar el agente.

4.2. Recuento Total
En la determinacin de recuentos totales no se puede distinguir las clulas viables de las no viables,
sin embargo, tienen la ventaja que el resultado se obtiene de inmediato y no es necesario esperar un perodo
de incubacin. Existen varios mtodos:


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4.2.1. Utilizando un microscopio y una cmara para contar bacterias.
Un ejemplo es la Cmara de Petroff-Hausser, que es una cmara semejante a la utilizada para contar
glbulos rojos, pero ms pequea. Esta cmara est reticulada y se llena por capilaridad con un volumen
determinado de muestra. Se cuentan al microscopio el nmero de bacterias presentes en varios cuadrados
al azar, se saca el promedio y como se conoce el volumen de cada cuadrado se calcula el nmero de
bacterias/mL de muestra. Como la profundidad es muy pequea y al microscopio se ven solamente 2
dimensiones se habla de volumen de los cuadrados. Este mtodo no sirve para microorganismos mviles.

4.2.2. Mtodos turbidimtricos.
Se puede medir la turbidez producida en el medio lquido por el desarrollo bacteriano. Se mide la
cantidad de luz absorbida en un espectrofotmetro. El mtodo es apropiado cuando ya hay cierta turbidez en
el medio, no sirve para las primeras fases del desarrollo, luego, a medida que las bacterias se multiplican, la
turbidez del cultivo aumenta. Se debe tener una curva de calibracin que relacione densidad ptica versus
recuento de grmenes viables, para as extrapolar el nmero de bacterias presentes en la muestra.
Habitualmente la turbidez se determina a una longitud de onda de 600nm.

4.3.3.- Mtodos indirectos.
Estos pueden ser determinacin de peso seco, medir la elaboracin de algn componente celular (por
ejemplo: protenas), medir el consumo de oxgeno, variacin del pH y otros. Con estos mtodos se mide el
aumento de masa celular y para conocer el nmero de bacterias/mL presentes en la muestra se debe
disponer de la curva de calibracin correspondiente.

5. ANTIBIOGRAMA

El antibiograma es una prueba de susceptibilidad de las bacterias frente a los diferentes agentes
teraputicos (antibiticos y quimioterpicos). El estudio de los diferentes agentes antibacterianos est en
constante revisin, ya que, da a da se desarrollan nuevos agentes antimicrobianos que son probados para
posibles usos teraputicos. Asimismo, muchas especies bacterianas van adquiriendo resistencia a los
antibiticos lo que genera un grave problema, pues esta resistencia se transmite de una especie a otra (esta
materia ser tratada en terico). Por otra parte, los diferentes mtodos de evaluacin de susceptibilidad a los
agentes antibacterianos estn en constante revisin y reglamentacin, para que las condiciones en que se
mide susceptibilidad en el laboratorio reflejen, lo ms fielmente posible, las condiciones fisiolgicas.
En general, las determinaciones de sensibilidad se efectan en aquellos microorganismos que
representan un riesgo clnico serio y que a la vez no poseen una sensibilidad conocida o predecible. En estos
casos, antes de administrar el antibitico o agente quimioteraputico es necesario tomar una muestra del
paciente (sangre, orina, etc.) y proceder al aislamiento de la bacteria causante de la infeccin. Una vez que el
microorganismo se encuentra en cultivo puro, se procede simultneamente a su identificacin y a efectuar las
pruebas de sensibilidad a los antibiticos, para as aplicar una terapia adecuada de acuerdo a la localizacin
de la infeccin.

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En casos de urgencia se puede efectuar un antibiograma sin identificar ni aislar el microorganismo
por ej., en casos de meningitis o cuando el Gram indique un nmero alto de un solo tipo de microorganismo.
Luego, el examen debe repetirse cuando se tiene la bacteria aislada. Adems, al efectuar el antibiograma
debe tomarse en cuenta si la bacteria es Gram (+) Gram (-), para as efectuar el ensayo de susceptibilidad
con los antibiticos adecuados. Tambin se debe considerar el sitio de la infeccin (por ej., infeccin sea,
urinaria, etc.)
Entre las determinaciones de sensibilidad utilizadas habitualmente en los laboratorios estn:

5.1. Mtodo de difusin en agar por discos de papel (Mtodo de Kirby-Bauer)
Este mtodo es rpido y econmico, y entrega una informacin cualitativa de la sensibilidad de la
bacteria al antibitico.
Sobre la superficie de una placa de agar Mller-Hinton (medio de cultivo rico diseado especialmente
para hacer ensayos de sensibilidad) se inocula una cantidad estandarizada de bacterias, sembrndolas en
forma pareja para obtener despus de la incubacin un csped de bacterias. A continuacin se colocan
discos de papel filtro impregnados con concentraciones conocidas de los diferentes antibiticos (se pueden
comprar en diferentes casas comerciales o bien, si se desea, se pueden preparar en el laboratorio). El
antibitico difundir desde el papel filtro al agar en forma radial. Se incuba la placa por 18 horas a 37C. Se
miden los halos de inhibicin de desarrollo y se interpretan de acuerdo a tablas confeccionadas previamente.
Los resultados se entregan como sensible (S), intermedio o moderadamente sensible (I), y resistente (R).

El tamao del halo de inhibicin de desarrollo es funcin de:
1.- la concentracin de la droga
2.- sensibilidad de la bacteria
3.- coeficiente de difusin de la droga en el agar
4.- tiempo y temperatura de incubacin
5.- pH y composicin del medio. Se usan preparados comerciales que den resultados reproducibles. P/ej.
Agar Muller-Hinton. Son medios de cultivo aceptados por el comit de la OMS para la normalizacin de
las pruebas de susceptibilidad .
6.- profundidad del medio en las placas. Esto est estandarizado: se usan placas de 9 cm de dimetro y se
agrega siempre el mismo volumen de medio de cultivo: 15 mL por placa. De esta manera las placas
poseen siempre la misma altura de agar.
7.- tamao del inoculo. Debe estar estandarizado ya que si ste es muy pequeo dar una sensibilidad
mayor a la real y si el inculo es muy denso pueden aparecer mutantes resistentes. En los mtodos de
difusin las mutantes resistentes aparecen como colonias aisladas dentro del halo de inhibicin, por lo
tanto esto indica que no se puede usar este antibitico y se debe informar como resistente. La forma
rigurosa de estandarizar un inculo es normalizando la turbidez por un mtodo fotomtrico utilizando
una suspensin de sulfato de bario como estndar, segn la escala de Mac Farland.

Errores ms frecuentes al realizar un antibiograma:
1.- densidad del inculo mal estandarizado
2.- usar cultivos que no estn puros

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3.- humedad o sequedad excesiva del medio de cultivo que puede conducir a un crecimiento demasiado
confluente o demasiado pobre.
4.- deterioro de los discos. Se deben guardar a 4C y sin humedad (utilizar un desecador)

Interpretacin del tamao de los halos de inhibicin de desarrollo al utilizar discos de papel:
La interpretacin se realiza de acuerdo a tablas proporcionadas por el fabricante de los discos. Se
basa en el hecho que existe una relacin entre la concentracin de un determinado antibitico necesaria para
inhibir una determinada cepa bacteriana y el halo de inhibicin de crecimiento.

Esto se relaciona con los
niveles que alcanzan las drogas en la sangre a las dosis teraputicas, para as determinar la susceptibilidad
o resistencia del microorganismo, en relacin a su utilizacin clnica. En algunos casos, como por ej. para
Nitrofurantona Acido Nalidxico, se toma en cuenta los niveles que debe alcanzar la droga en la orina.

5.2. Mtodo de dilucin en serie en medio lquido. Determinacin de la
concentracin inhibitoria mnima (CIM).
Este mtodo entrega una informacin cuantitativa de la concentracin mnima de antimicrobiano capaz
de inhibir el desarrollo del microorganismo. La forma ms habitual es realizar una serie de diluciones en base
dos del antimicrobiano, por ej. 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, etc. La CIM corresponde a la menor concentracin de
antimicrobiano a la cual no hay desarrollo bacteriano.
Las diluciones de antimicrobiano se hacen en un medio de cultivo adecuado y se siembran todos los
tubos con una misma concentracin de bacterias. Se inocula tambin un tubo sin antibitico como control de
desarrollo. Se incuba por 18 horas a 37C y luego se observa la turbidez. La dilucin ms alta de la droga en
que no se observa desarrollo corresponde a la CIM.
Como regla general para una terapia efectiva, la concentracin del antimicrobiano debe alcanzar en el
suero, sitio de infeccin o tejidos, a lo menos 2 a 4 veces la CIM del microorganismo causante de la infeccin.
En las infecciones urinarias, la concentracin de los antimicrobianos en la orina debe ser 10 a 20 veces la
CIM para obtener una buena respuesta teraputica. Por lo tanto, el conocimiento de los niveles fisiolgicos
alcanzables por los diferentes antimicrobianos es indispensable para un tratamiento adecuado.
Este mtodo se usa tambin para medir actividad o potencia de un antibitico (valorarlo). Para ello se
utilizan cepas patrones internacionales obtenidas de la ATCC (American Type Culture Collection)

Cundo est indicado solicitar un antibiograma?
Est indicado solicitar un antibiograma junto con el cultivo en:
1.- Estados infecciosos graves. Ej. meningitis
2.- Infecciones en que la experiencia demuestra alta frecuencia de microorganismos Gram negativos en
que puede haber cepas resistentes o multirresistentes, tambin si se sospecha la presencia de
estafilococos.
3.- Infecciones crnicas en que puede haber una seleccin de cepas resistentes.
4.- Si no se observa una respuesta clnica favorable al tratamiento
5.- Infeccin de rganos importantes.
6.- En casos de alergia a la droga de primera eleccin.

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Cundo no est indicado solicitar un antibiograma?
En enfermedades en las cuales el tratamiento actual est limitado en la prctica, al uso de un
antibitico. Ej. Fiebre tifoidea se administra cloranfenicol, Amigdalitis estreptoccica se administra penicilina.


6. IDENTIFICACIN DE BACTERIAS

Las bacterias en general se identifican mediante:
a) Microscopa: Forma y agrupacin: bacilos, cocos, racimos, cadenas, etc. Reaccin de Gram:
positiva, negativa;
b) Reacciones bioqumicas: se siembra la bacteria en un medio de cultivo que contiene algn
compuesto qumico (azcar, aminocido, etc.) y/o un indicador de pH que permite observar reacciones
bioqumicas de las bacterias. Por ejemplo, un medio puede contener un hidrato de carbono (por
ejemplo glucosa) el que al ser fermentado producir un compuesto cido el que se puede evidenciar
por el viraje del indicador de pH.
c) Otras propiedades: adems se puede investigar por ejemplo: reacciones serolgicas, movilidad,
formacin de cpsula, formacin de esporas, presencia de flagelos, de cuerpos de inclusin, etc.
Todas estas caractersticas juntas permiten clasificar bacterias dentro de un gnero y una especie.

En este prctico se realizar la identificacin de bacilos Gram negativos aerobios anaerobios
facultativos de la Familia Enterobacteriacea y aerobios estrictos de la Familia Pseudomonadaceae. Esto se
realizar mediante el estudio de reacciones bioqumicas utilizando medios diferenciales
Es importante destacar que para realizar las reacciones bioqumicas es condicin necesaria contar
con un cultivo puro de bacterias para evitar interferencias. Por lo tanto, la primera etapa es la obtencin de
este cultivo puro realizando aislamiento en placa. Posteriormente a partir de una colonia aislada, se realizan
las reacciones bioqumicas y/o serolgicas para identificar la bacteria.

6.1. Familia Enterobacteriaceae
Esta Familia est constituida por distintos grupos de microorganismos, que varan en sus propiedades
bioqumicas y composicin antignica. Son bacilos Gram negativos, aerobios anaerobios facultativos, no
esporulados y la mayora de los miembros de esta Familia son mviles.
Hay tres reacciones bioqumicas que ayudan a caracterizar esta Familia:
- todos fermentan la glucosa con formacin de cido o de cido y gas
- todos reducen los nitratos a nitritos
- no producen citocromo oxidasa.

IMPORTANCIA CLNICA.
Algunos miembros de esta Familia son constituyentes de la flora normal y mientras permanecen en el
intestino no causan enfermedades. Sin embargo, son patgenos cuando salen de su hbitat normal y
alcanzan otros rganos. Entre estos tenemos Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Proteus sp., que

13
producen principalmente infecciones del tracto urinario. Adems, E. coli es el principal causante de septicemia
y meningitis en recin nacidos. Algunas cepas de E. coli pueden causar gastroenteritis.
Otros miembros son siempre patgenos: Yersinia enterocoltica, Shigella sp. y Salmonella sp. Las dos
ltimas tambin pueden producir fiebres entricas (tifoidea y paratifoidea) y septicemia.

6.2. Familia Pseudomonadaceae.
Esta Familia est constituida por bacilos Gram negativos, aerobios estrictos, no esporulados. La
mayora de los miembros de esta Familia son mviles debido a la presencia de flagelos polares nicos o
formando penachos. Reacciones bioqumicas que ayudan a caracterizar esta Familia:
- NO fermentan la glucosa pero s la oxidan
- todos producen citocromo oxidasa, es decir son oxidasa positivos.
La especie ms importante de esta Familia es Pseudomonas aeruginosa o bacilo piocinico (productor de pus
azulada o verdosa). Produce un pigmento azul-verdoso soluble en agua que difunde al medio de cultivo: la
piocianina. Esta caracterstica es de gran ayuda en su clasificacin.
Pseudomonas aeruginosa: est ampliamente distribuida en suelos y aguas, por lo que suele
contaminar medicamentos, cosmticos, equipos de hospitales y otros (ventiladores). Se encuentra
frecuentemente contaminando las resinas de intercambio inico utilizadas en la industria farmacutica, lo que
ocasiona graves problemas de produccin. Puede ocasionar infecciones muy severas en personas
vulnerables: recin nacidos, quemados, pacientes inmuno-deprimidos o irradiados. En general son muy
resistentes a los antibiticos.


7. ESTUDIO DE BACTERIAS DE LA FAMILIA Enterobacteriaceae.

7.1. Aislamiento en placa
En primer lugar el microorganismo en estudio debe estar puro. Para aislar bacterias de la Familia
Enterobacteriaceae usaremos un medio diferencial-selectivo que es el Agar MacConkey. Este medio
contiene sales biliares y cristal violeta los cuales inhiben considerablemente la flora Gram (+). Contiene
adems lactosa y un indicador de pH Rojo Neutro. Si la bacteria fermenta la lactosa produce cidos, por lo
cual el indicador de pH, Rojo Neutro, vira a rojo y las colonias y el medio circundante se ven de color rosa a
rojo. Si la bacteria no fermenta la lactosa, no hay viraje del indicador.

7.2. Reacciones de identificacin
Las bacterias pueden utilizar distintos azcares a travs de varias rutas metablicas. Los productos
finales de estas reacciones dependern de la bacteria de que se trate, del azcar utilizado y de la ruta
metablica. En general estos productos son cidos (frmico, pirvico, lctico, etc.) y gases (CO
2
, H
2
). Existen
muchos medios de cultivo diseados para detectar estos productos.




14
7.2.1.- Agar con Hierro de Kligler (KIA)
El Agar con Hierro de Kligler es un medio rico que contiene los nutrientes necesarios para el
crecimiento de las bacterias y que permite visualizar la utilizacin de azcares. Adems de nutrientes como
extracto de carne, extracto de levadura y peptona, contiene:
- glucosa 0,1%
- lactosa 1,0%
- citrato de amonio y hierro
- indicador de pH rojo de fenol (amarillo pH cido, rojo pH alcalino)
Es un medio slido que se usa en tubo. Despus de la esterilizacin se deja enfriar en un plano
levemente inclinado de manera que queda el fondo del tubo lleno y una superficie inclinada (llamado "pico de
flauta"). La inoculacin de la muestra se realiza en profundidad (picando hasta el fondo del tubo), para
conocer el metabolismo anaerobico y en la superficie, para estudiar el metabolismo aerobico. El pH de este
medio es neutro y el indicador de pH da un color rojo anaranjado.
Este medio se usa para bacterias de la Familia Enterobacteriaceae, las que son capaces de utilizar
glucosa produciendo cido. La bacteria primero usar glucosa y, como la concentracin es baja, se agota
rpidamente. Si la bacteria fermenta solamente la glucosa, en el fondo del tubo se producirn cidos y el
indicador virar a amarillo. En cambio, en la superficie inclinada por efecto del metabolismo oxidativo de los
aminocidos presentes en el medio de cultivo, se producirn aminas y el indicador en la superficie virar a rojo
en la superficie. Si la bacteria adems fermenta la lactosa (que est en mayor concentracin) todo el tubo
virar a amarillo por la mayor produccin de cidos.
Si se produce gas se observar quiebres en el agar y/o su separacin del fondo del tubo.
Si la bacteria produce H
2
S, este reacciona con la sal de hierro dando sulfuro ferroso, un compuesto
insoluble de color negro.
En resumen en este medio se puede apreciar:
Utilizacin de glucosa : superficie roja (pH alcalino) / fondo amarillo (pH cido) se denomina K/A
Utilizacin de lactosa : fondo y superficie amarilla (pH cido) se denomina A/A
Produccin de gas : ruptura de la columna de agar
Produccin de H
2
S : ennegrecimiento del agar.

7.2.2.- Agar Hierro Lisina (LIA).
Las distintas bacterias poseen enzimas inducibles que pueden actuar sobre algunos aminocidos,
desaminndolos o decarboxilndolos. Ejemplo de estas reacciones enzimticas son: la decarboxilacin de la
lisina y la desaminacin de la lisina. Otro efecto de las bacterias sobre aminocidos azufrados es la remocin
del grupo -SH
2
, produciendo H
2
S.
Un medio de cultivo utilizado para observar estas reacciones es el Agar Hierro Lisina (LIA).
Este medio contiene adems de nutrientes como peptona y extracto de levadura.:
- aminocido lisina
- aminocidos azufrados
- glucosa
- citrato de hierro y amonio
- indicador de pH prpura de bromo cresol (amarillo a pH cido, morado a pH alcalino).

15
Este medio se envasa en tubos al igual que el medio KIA. Se inocula en profundidad y superficie. La
bacteria primero utiliza la glucosa, produce cido y el pH baja: el indicador vira a amarillo. Si la bacteria no
produce lisina decarboxilasa se mantendr esta coloracin amarilla. Si la bacteria produce la enzima lisina
decarboxilasa, la cual remueve el grupo COOH de la lisina dando como producto CO
2
y una diamina
(alcalina), entonces el indicador vira nuevamente a alcalino y se revierte el viraje de amarillo a morado.
Si la bacteria produce H
2
S ste reacciona con la sal de hierro formando sulfuro ferroso (negro).
Si la bacteria es capaz de desaminar a la lisina, la superficie se ver roja y el fondo amarillo.

En resumen en este medio se puede apreciar:
Decarboxilacin de lisina - : superficie morada (alcalina)/ fondo amarillo (cido) se denomina (K/A)
Decarboxilacin de lisina +: todo el tubo morado (alcalino) se denomina (K/K)
Desaminacin de lisina + : superficie roja / fondo amarillo se denomina (R/A)
Produccin de H
2
S : ennegrecimiento del agar
7.2.3.- Caldo Triptonado con urea (CTU).
Es un medio lquido que contiene adems de nutrientes bsicos:
- triptona
- urea
La urea se agrega despus de autoclavar, pues se descompone con el calor. Al momento de sembrar
se adiciona al medio de cultivo 2 gotas de urea al 50%. Un exceso de urea puede inhibir el desarrollo.
En este medio se puede observar
a) Produccin de ureasa: algunas bacterias poseen la enzima ureasa y pueden degradar urea a
amonaco y CO
2
. Esta reaccin es fcilmente evidenciable por que se produce pH alcalino debido a la
presencia del amonaco. El cambio de pH se evidencia por viraje de un indicador de pH como la
fenolftalena.
b) Produccin de indol: es una reaccin de desaminacin oxidativa del aminocido triptofano (presente
en la triptona) que da indol como uno de los productos. Despus de la incubacin se detecta el INDOL
mediante una extraccin con el reactivo de Kovacs (para-dimetil-amino-benzaldehdo en alcohol
amlico), el cual da un anillo rojo en la superficie (fase orgnica).
Siempre se debe hacer primero la deteccin de la ureasa y luego el ensayo del Indol, ya que el reactivo de
Kovacs altera el pH del medio de cultivo.

7.2.4.- Agar Citrato de Simmons (SC).
Este medio de cultivo contiene adems de sales minerales:
- Fosfato de amonio
- Citrato de sodio, como nica fuente de carbono
- Indicador de pH azul de bromo timol (verde a pH neutro, azul a pH alcalino)
Solamente aquellas bacterias que poseen la enzima citrato permeasa transportan el citrato a travs de
la membrana citoplasmtica y se desarrollan en este medio porque pueden usar citrato como nica fuente de
carbono. Una vez en el interior de la clula el in citrato es metabolizado a travs del ciclo de los cidos
tricarboxilicos. En este caso una reaccin positiva consiste en el CRECIMIENTO del microorganismo y viraje
del indicador de pH a color azul (alcalino). En la reaccin negativa no habr desarrollo y el indicador de pH,

16
azul de bromo timol, permanece de color verde (neutro). Esta prueba puede arrojar falsos negativo, debido a
errores en la inoculacin.

7.2.5.- Reaccin de la citocromo oxidasa.
Esta prueba bioqumica se realiza preferentemente a partir de un cultivo en agar TSA. Las bacterias
que producen citocromo oxidasa tienen la capacidad de oxidar el reactivo tetrametil-parafenilen-diamina a
indofenol. El reactivo de color rosa plido vira a rosa obscuro.

7.2.6.- Identificacin de la bacteria
Una primera identificacin de las especies de la Familia Enterobacteriaceae se logra realizando las
pruebas bioqumicas antes mencionadas. En muchos casos, es necesario realizar pruebas bioqumicas
adicionales como por ejemplo: fermentacin de otros azcares (tales como manitol, xilosa, arabinosa, etc.),
tolerancia a temperatura, reduccin de nitratos, decarboxilaccin de ornitina, movilidad, crecimiento en KCN,
etc.
Generalmente el diagnstico se confirma mediante reacciones serolgicas. Estas consisten en hacer
reacciones de aglutinacin en un portaobjetos utilizando una suspensin de la bacteria y antisueros
especficos.
Para la identificacin se utilizan tablas con las reacciones bioqumicas, como las que se muestran a
continuacin (no es necesario aprenderse las tablas).



TABLA I
Fermentacin de Glucosa positiva
Fermentacin de Lactosa positiva
Lisina deaminasa negativa
Produccin de H
2
S
Negativa
Lisina decarboxilasa positiva
b
Indol
positivo negativo
Escherichia coli Enterobacter spp.
Klebsiella spp.
NOTA: Todos producen gas de glucosa.
Todos son citrato positivo, excepto E. coli.
Todos son ureasa negativa, excepto Klebsiella, que puede ser positivo al 2 o 3
er
da.
a: ciertas especies de S. Arizona fermentan la lactosa lentamente.
b: ciertas especies de E. coli son lisina decarboxilasa negativa.
Positiva
Indol negativo
Lisina decarboxilasa
positiva negativa
Salmonella Arizona
a
Citrobacter freundii
TABLA I
Fermentacin de Glucosa positiva
Fermentacin de Lactosa positiva
Lisina deaminasa negativa
Produccin de H
2
S
Negativa
Lisina decarboxilasa positiva
b
Indol
positivo negativo
Escherichia coli Enterobacter spp.
Klebsiella spp.
NOTA: Todos producen gas de glucosa.
Todos son citrato positivo, excepto E. coli.
Todos son ureasa negativa, excepto Klebsiella, que puede ser positivo al 2 o 3
er
da.
a: ciertas especies de S. Arizona fermentan la lactosa lentamente.
b: ciertas especies de E. coli son lisina decarboxilasa negativa.
Positiva
Indol negativo
Lisina decarboxilasa
positiva negativa
Salmonella Arizona
a
Citrobacter freundii



17
TABLA II
Fermentacin de Glucosa positiva
Fermentacin de Lactosa negativa
Lisina deaminasa positiva
Produccin de H
2
S
Negativa
Lisina decarboxilasa negativa
Indol positivo
citrato
negativo positivo
Proteus morganii Proteus rettgeri
Providencia spp.
NOTA: P. vulgaris y P. mirabilis pueden o no utilizar citrato.
Todos producen un poco de gas de glucosa.
Todos son ureasa positivo, excepto Providencia que es ureasa negativa.
Positiva
Lisina decarboxilasa negativa
Indol
positivo negativo
Proteus vulgaris Proteus mirabilis
TABLA II
Fermentacin de Glucosa positiva
Fermentacin de Lactosa negativa
Lisina deaminasa positiva
Produccin de H
2
S
Negativa
Lisina decarboxilasa negativa
Indol positivo
citrato
negativo positivo
Proteus morganii Proteus rettgeri
Providencia spp.
NOTA: P. vulgaris y P. mirabilis pueden o no utilizar citrato.
Todos producen un poco de gas de glucosa.
Todos son ureasa positivo, excepto Providencia que es ureasa negativa.
Positiva
Lisina decarboxilasa negativa
Indol
positivo negativo
Proteus vulgaris Proteus mirabilis



TABLA III
Fermentacin de Glucosa positiva
Fermentacin de Lactosa negativa
Lisina deaminasa negativa
Produccin de H
2
S
Negativa
Lisina decarboxilasa
positiva negativa
NOTA: Todos son ureasa negativo, excepto algunas cepas de Yersinia enterocolitica.
No producen gas de glucosa Shigella, Serratia, Salmonella Typhi y Yersinia enterocolitica.
El resto produce gas de glucosa.
a: ciertas especies de Citrobacter son lactosa negativas y pueden ser indol positivo o negativo.
Positiva
Lisina decarboxilasa
positiva negativa
Indol
positivo negativo
Citrato positivo
Citrobacter
a
Citrato
negativo
Citrato
Edwarsiella negativo positivo
Salmonella Typhi o
Salmonella Arizona
Salmonella Paratyphi B
Indol negativo
Citrato positivo
Indol Serratia
negativo positivo
Salmonella Paratyphi A
o Shigella sp.
Shigella sp. o
Yersinia enterocolitica
Citrato negativo
TABLA III
Fermentacin de Glucosa positiva
Fermentacin de Lactosa negativa
Lisina deaminasa negativa
Produccin de H
2
S
Negativa
Lisina decarboxilasa
positiva negativa
NOTA: Todos son ureasa negativo, excepto algunas cepas de Yersinia enterocolitica.
No producen gas de glucosa Shigella, Serratia, Salmonella Typhi y Yersinia enterocolitica.
El resto produce gas de glucosa.
a: ciertas especies de Citrobacter son lactosa negativas y pueden ser indol positivo o negativo.
Positiva
Lisina decarboxilasa
positiva negativa
Indol
positivo negativo
Citrato positivo
Citrobacter
a
Citrato
negativo
Citrato
Edwarsiella negativo positivo
Salmonella Typhi o
Salmonella Arizona
Salmonella Paratyphi B
Indol negativo
Citrato positivo
Indol Serratia
negativo positivo
Salmonella Paratyphi A
o Shigella sp.
Shigella sp. o
Yersinia enterocolitica
Citrato negativo



18
8. ESTUDIO DE LA FLORA BACTERIANA NASAL Y FARNGEA

En este trabajo prctico se estudiarn cocos Gram (+) de las familias Micrococaceae y
Streptococaceae, presentes en secreciones nasal y faringea, respectivamente.

8.1. Familia Micrococcaceae
La Familia Micrococcaceae comprende los gneros Micrococcus, Staphylococcus y Planococcus.
Son bacterias Gram positivas, esfricas (cocos) agrupadas en racimo. Son catalasa positivos, reaccin que
se usa para diferenciar la Familia Micrococcaceae de otros cocos Gram positivos como por ejemplo
Streptococcus sp.
Las especies del gnero Micrococcus son saprfitas, se encuentran habitualmente en la piel de
mamferos, en el suelo y el agua. Tienen metabolismo estrictamente aerobio, a diferencia de las especies del
gnero Staphylococcus que son aerobios anaerobios facultativos.
Las principales especies del gnero Staphylococcus son: Staphylococcus aureus y Staphylococcus
epidermidis. S. epidermidis se encuentra en la piel y mucosas del hombre y animales. Normalmente no es
patgeno, sin embargo se comporta como un patgeno oportunista, por ejemplo en pacientes inmuno-
comprometidos y en presencia de cuerpos extraos como catteres, vlvulas cardacas, etc. S. aureus, en
cambio, es patgeno para el hombre. Produce una gran variedad de toxinas y enzimas responsables de su
patogenicidad. Entre ellas, produce una enzima llamada Coagulasa la cual es importante para la proteccin
frente al sistema inmune, ya que produce la encapsulacin de la bacteria. La presencia de esta enzima
permite diferenciar a S. aureus, la especie patgena, de los dems representantes del gnero

8.1.1 Aislamiento y caracterizacin:
El medio de cultivo utilizado para el aislamiento de S. aureus depender si la muestra es un alimento o
si se trata de una muestra clnica.
Para el aislamiento de S. aureus en muestras CLNICAS como pus, heridas, secreciones, etc. se utilizan:
a) AGAR SANGRE. ste es un medio enriquecido que contiene sangre defibrinada de cordero o de
conejo. Permite el desarrollo abundante de las especies de Staphylococcus y adems permite
visualizar la produccin de hemolisinas por lisis de los glbulos rojos alrededor de las colonias.
S. aureus : produce halos de hemlisis completa alrededor de las colonias, por la accin de
la alfa toxina.
S. epidermidis: no produce hemlisis o lo hace dbilmente.
Micrococcus: no produce hemlisis.
b) AGAR MANITOL SALADO O MEDIO DE CHAPMAN. Es un medio selectivo y diferencial que
contiene manitol, NaCl al 7,5% y el indicador de pH rojo de fenol. Micrococcus y Staphylococcus son
halotolerantes, y crecen en esta concentracin de NaCl. En este medio adems se evidencia la
fermentacin de manitol, la que se observa por el viraje del indicador a amarillo.
S. aureus: da colonias amarillas cremosas rodeadas de una zona amarilla, producto de la
fermentacin del manitol
S. epidermidis : generalmente no fermenta el manitol
Micrococcus : no fermenta el manitol.

19
En ambos medios se debe confirmar mediante tincin de Gram la presencia de cocos Gram (+) en
racimo, ya que otras especies pueden dar colonias semejantes. Una vez confirmada la presencia de cocos
Gram (+) en racimo se realizan pruebas bioqumicas para confirmar el diagnstico.

Si se sospecha que la colonia corresponde a Staphylococcus aureus, se realiza la prueba de la
COAGULASA. Esta es una prueba de PATOGENICIDAD, la cual se puede realizar de dos formas:
Tcnica en tubo: consiste en incubar plasma de conejo con gotas de cultivo lquido de
Staphylococcus. La reaccin positiva se observa como la aparicin de un cogulo a las 4 horas. Esta
tcnica detecta la coagulasa libre.
Tcnica en portaobjeto: a partir de un cultivo de Staphylococcus en medio slido, se hace una
suspensin abundante sobre una gota de agua. Esta suspensin debe ser lo ms homognea
posible. Sobre sta se coloca una o dos gotas de plasma de conejo y se homogeneiza. La reaccin
positiva se evidencia por aparicin de grumos o aglutinacin de las bacterias a los 20 segundos. Esta
tcnica detecta la coagulasa unida a membrana.

8.2. Familia Streptococcaceae. Gnero Streptococcus
El Gnero Streptococcus corresponde a cocos Gram positivos, anaerobios facultativos que se
disponen en pares o en cadenas y son catalasa negativos reaccin que los diferencia de la Familia
Micrococcaceae. Bajo ciertas condiciones de cultivo las clulas son ovoides o alargadas. Se encuentran en
diferentes superficies y mucosas del hombre y de algunos animales como cavidad oral, faringe, piel, tracto
intestinal. Algunas especies son utilizadas en la industria lechera para la elaboracin de quesos, leches
fermentadas y yoghurt (Streptococcus lactis).
Los miembros del gnero Streptococcus se clasifican de acuerdo a la:
1.- ACTIVIDAD HEMOLTICA: segn el tipo de hemlisis que presenten al ser cultivadas en placas de agar
sangre de conejo o de cordero.
a) Beta hemolticos: producen halos limpios de hemlisis alrededor de las colonias.
b) Alfa hemolticos: producen halos de hemlisis incompleta de color verdoso (viridans) alrededor de
las colonias.
c) Gama hemolticos: no producen hemlisis
2.- CONSTITUCIN ANTIGNICA DE LA PARED CELULAR: es la clasificacin de Lancefield. Se basa en
la composicin qumica y antignica de un carbohidrato presente en la pared celular y permite clasificar a
los estreptococos en grupos serolgicos que van desde la A hasta la U.
Ambas clasificaciones se asocian entre s, as tenemos por ejemplo estreptococos beta hemolticos
del grupo A como Streptococcus pyogenes, que es el ms patgeno del gnero.

Streptococcus pyogenes produce varias toxinas y enzimas responsables de su poder patgeno. Es
el agente causal de infecciones locales purulentas como amigdalitis, faringitis, otitis, etc. Adems provoca
enfermedades sistmicas como fiebre puerperal y escarlatina.
Streptococcus pneumoniae o pneumococo es otra especie importante de este gnero, agente
causante de neumonia lobar en el hombre. Es un diplococo no perfectamente esfrico, tiene forma de cabeza
de lanza ( lanceolado). Su forma virulenta se encuentra rodeada por una cpsula. Es habitante normal de la

20
faringe del hombre. Para su aislamiento las placas deben incubarse en un ambiente con 10% de CO
2
. En agar
sangre S. pneumoniae presenta alfa hemlisis y las colonias son planas con formas de fichas de damas.
Estreptococos fecales o enterococos (por ejemplo Streptococcus faecalis). Existen otras especies
de Streptococcus que habitan el intestino del hombre y animales y se les conoce con el nombre de
estreptococos fecales o enterococos. Se caracterizan porque generalmente son no hemolticos y pueden
crecer en condiciones de alta salinidad (NaCl 6,5%), pH bsico (pH 9,6) y presencia sales biliares en que
otros estreptococos no pueden hacerlo. Su presencia en alimentos o agua indica contaminacin fecal.

8.2.1 Aislamiento y caracterizacin
El aislamiento de Streptococcus pyogenes se efecta sembrando la muestra sobre una placa de agar
sangre. En este trabajo prctico, los alumnos se tomarn muestra farngea para determinar la presencia de
bacterias del gnero Streptococcus y estudiar algunas de sus propiedades. Los Streptococcus pyogenes
presentan las siguientes caractersticas:
1.- Hemlisis en placa de agar sangre. El medio base para el agar sangre no debe contener glucosa ya
que sta puede enmascarar la hemlisis. Se observa hemlisis limpia alrededor de las colonias, las cuales
son muy pequeas.
2.- Se debe confirmar mediante tincin de Gram la presencia de cocos Gram (+) en cadena ya que otras
especies pueden dar colonias semejantes, por ejemplo Staphylococcus. Una vez confirmada su presencia se
realizan pruebas adicionales para confirmar el diagnstico.
a) Prueba de sensibilidad a Bacitracina. Los estreptococos beta hemolticos del grupo A (Streptococcus
pyogenes) son sensibles al antibitico Bacitracina Otros estreptococos tambin son sensibles, sin
embargo no son beta hemolticos.
b) Pruebas serolgicas. El diagnstico de Streptococcus pyogenes se debe confirmar mediante reacciones
serolgicas con antisueros especficos para el antgeno superficial.


EJERCICIOS

Ejercicio # 1: Tincin de Gram
Objetivos: - aprender a realizar la tincin de Gram.
- diferenciar las diversas coloraciones, formas y agrupaciones de las bacterias.
Materiales: cultivos de diferentes bacterias, en medio slido y/o lquido.
asa de nicrn, mechero,
lminas portaobjeto limpias y desengrasadas, lpiz graso
reactivos de Gram: cristal violeta, solucin de iodo-ioduro, etanol 95, solucin de
safranina.





21
Procedimiento: (Ver esquema en la siguiente pgina 22)
1.- Limpie una lmina portaobjeto con alcohol; deje secar.
2.- Trace una lnea con un lpiz graso a una distancia de aproximadamente dos centmetros del borde.
3.- Hacer el frotis con el cultivo. Si es un cultivo lquido tome una gota con un asa (previamente
esterilizada a la llama) o con una pipeta Pasteur, y extindala sobre la superficie del vidrio. Si es un
cultivo slido, primero coloque una gota de agua de la llave con el asa, y sobre ella realice una
suspensin con el cultivo; extindala sobre el vidrio. Esta suspensin debe ser apenas lechosa de
modo de tener un nmero adecuado de bacterias.
No olvide esterilizar el asa despus de usarla. No la deje contaminada sobre el mesn.
4.- Seque suavemente el portaobjetos a la llama, de esta forma las bacterias quedan fijas al vidrio y
muertas.
5.- Cubra el frotis con cristal violeta y deje actuar por un minuto. Lave con agua.
Al lavar la lmina acurdese siempre de lavar el dorso de sta.
6.- Cubra el frotis con solucin de Iodo y deje actuar por un minuto. Lave con agua.
7.- Decoloracin. Esta es la etapa crtica. Escurra sobre el frotis etanol de 95. Repita hasta que observe
que no se libera ms colorante. Lave con agua.
8.- Tia con el colorante de contraste, safranina. Cubra el frotis con la solucin; deje actuar un minuto.
Lave con agua.
9.- Seque cuidadosamente con papel absorbente, sin restregar, o espere que se seque al aire.
10.- Observe con inmersin, sin cubre objeto.
NOTA: la gota de aceite se coloca antes de poner la lmina en la platina del microscopio ya que
as se evita ensuciarlo y debe ser lo ms pequea posible.
11.- Una vez observada la muestra deseche la lmina en los frascos con DESINFECTANTE ubicados en
cada mesn.

Ejercicio # 2: Contaminacin ambiental, flora bacteriana de las manos, del pelo,
gotas de aerosol emitidas al hablar, toser, etc.
Objetivos: - observar la existencia de bacterias en diversos hbitat.
- demostrar en forma prctica la contaminacin ambiental de los medios de cultivo.
Materiales: Placas Petri con Agar TSA (para bacterias) Placas Agar Papa Dextrosa (para hongos).
Procedimiento:
Da 1
1.- Dejar algunas placas con TSA y de Papa Dextrosa abiertas por 30 minutos en distintos lugares del
laboratorio, baos, jardines, etc. para observar contaminacin ambiental.
2.- En otras placas de TSA se buscar microorganismos presentes en los dedos, el pelo y el aerosol oral
(toser, conversar).
3.- Rotule sus placas y djelas en los recipientes plsticos en los cuales se llevarn a la estufa para
incubarlos a 37C por 48 horas para observar bacterias y a 28C por 72 horas para hongos.



22



23
Luego de 48 horas:
1.- Observe el desarrollo bacteriano en las placas .
2.- A continuacin realice el ejercicio #3 observando las caractersticas de las colonias.
3.- Realice tincin de Gram a diferentes colonias que le parezcan de inters.
Luego de 72 horas:
1.- Observe el desarrollo de hongos en las placas.
2.- Observe las caractersticas de las colonias en el microscopio de colonias.

Ejercicio # 3: Observacin de caractersticas de las colonias
Objetivo: - Conocer las diferentes caractersticas morfolgicas que presentan las colonias bacterianas.
Procedimiento:
1.- Observe a simple vista las colonias obtenidas en las placas que utiliz. Observe tambin las
caractersticas de las colonias en el microscopio de colonias (lupa estereoscpica). Compare las
colonias con las caractersticas descritas en la seccin 3.1.

Ejercicio # 4: Tincin de esporas.
Objetivo: - Aprender a realizar esta tincin y observar esporas libres e intracelulares de un
Bacillus sp.
Materiales: - cultivo de Bacillus sp en medio slido.
- asa de nicrn, mechero
- lminas portaobjeto, limpias y desengrasadas, lpiz graso
- verde de malaquita, safranina, papel filtro
Procedimiento:
1.- Limpie una lmina portaobjeto con alcohol; deje secar.
2.- Trace una lnea con un lpiz graso a una distancia de aproximadamente dos centmetros del borde.
3.- Hacer el frotis con el cultivo de Bacillus sp. Primero coloque una gota de agua de la llave con el asa, y
sobre ella realice una suspensin con el cultivo y extindala sobre el vidrio. Esta suspensin debe ser
apenas lechosa de modo de tener un nmero adecuado de bacterias.
No olvide esterilizar el asa despus de usarla. No la deje contaminada sobre el mesn.
4.- Seque suavemente a la llama, de esta forma las bacterias quedan fijas al vidrio y muertas.
5.- Cubra el frotis con un trozo de papel filtro. Humedezca el papel con una solucin del colorante verde
de malaquita. Esta tincin se realiza en caliente: para ello caliente la lmina suavemente sobre el
mechero hasta observar emisin de vapor. No sobrecaliente para evitar que se queme su muestra.
6.- Repetir 3 a 4 veces, agregando ms colorante sobre el mismo trozo de papel filtro y caliente al
mechero. Deje enfriar. Elimine el papel filtro en la olla.
7.- Lave con agua. Cubra el frotis con el colorante de contraste, safranina, 30 segundos.
8.- Lave con agua.
9.- Seque cuidadosamente con toalla nova, sin restregar, o espere que se seque al aire.
10.- Observe con inmersin, sin cubre objeto.

24
NOTA: la gota de aceite se coloca antes de poner la lmina en la platina del microscopio ya que
as se evita ensuciarlo y debe ser lo ms pequea posible.
11.- Una vez observada la muestra deseche la lmina en los frascos con DESINFECTANTE ubicados en
cada mesn.

Es posible observar esporas libres y esporas intracelulares. En estas ltimas es posible determinar si se
encuentran al centro o hacia un extremo de la clula, y si la espora deforma o no al bacilo.

Ejercicio # 5: Aislamiento de Enterobacteriaceae en placas de Agar MacConkey
Este ejercicio prctico consiste en el aislamiento e identificacin de distintas especies de bacilos Gram
negativos. En primer lugar el microorganismo en estudio debe estar puro, por lo tanto se debe efectuar un
aislamiento en placa de agar. Existen diferentes medios slidos para aislamiento.
Para aislar bacterias de la Familia Enterobacteriaceae usaremos un medio diferencial-selectivo que es el
Agar MacConkey (ver descripcin del medio en el captulo 7.1)
Objetivos: - Obtener colonias aisladas en placa de Agar MacConkey
- Reconocer colonias de microorganismos fermentadores y no fermentadores de lactosa.
Materiales: - Muestra de bacteria a identificar placa de Agar MacConkey, asa de nicrn, mechero, reactivos
para tincin de Gram

Da 1
1.- Realice tincin de Gram (Ejercicio #1). Observe si su muestra corresponde a un bacilo Gram
negativo. Recuerde todas las instrucciones y normas de seguridad. Recuerde que est
trabajando con bacterias potencialmente patgenas.
2.- Realice aislamiento en placa de agar MacConkey (vea descripcin y esquema en el captulo 3). No
olvide rotular su muestra y dejarla en los recipientes plsticos para llevarla a la estufa a incubar.
3.- Descarte el tubo con la muestra problema en las ollas que van al autoclave.
Luego de 18 a 24 horas:
1.- Observe su placa, vea si obtuvo colonias aisladas. Compare sus placas con otras placas de manera
de observar colonias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa. Anote su resultado.
2.- Realice tincin de Gram (Ejercicio # 1) de varias colonias aisladas. Observe si su muestra
corresponde a un bacilo Gram negativo y compruebe su pureza.
3.- Con una colonia aislada que se observe pura al microscopio, siembre la batera de medios
diferenciales. (Ejercicio #6).







25
Ejercicio # 6.-: Batera de Identificacin.
Objetivos: - Conocer e interpretar las diferentes reacciones bioqumicas de bacilos Gram negativos.
- Aprender a identificar especies bacterianas de la Familia en estudio.
Materiales: Para conservar la cepa Agar Tripticasa Soya (TSA)
Medios de cultivo diferenciales: Agar con Hierro de Kligler (KIA)
Agar con Hierro y Lisina (LIA)
Caldo triptonado con urea (CTU)
Agar Citrato de Simmons (SC)
Da 1.
Recuerde todas las instrucciones y normas de seguridad. Recuerde que est trabajando con bacterias
patgenas o potencialmente patgenas.
1.- A partir de una colonia aislada obtenida en Agar MacConkey (a la cual Ud. comprob su pureza
mediante la Tincin de Gram) siembre la batera.
KIA: Se siembra con aguja, inoculando el tubo en picadura hasta el FONDO y en zig-zag (o estra) en la
superficie.
LIA: Se siembra con aguja con tres picaduras hasta el FONDO y en estra en la superficie.
CTU: Se siembra con asa, agitando suavemente el inculo dentro del caldo. Agregar dos gotas de urea al
50% antes de incubar (el exceso de urea inhibe el desarrollo bacteriano).
SC: Se siembra en una sola lnea recta en la superficie con pipeta Pasteur.
TSA: Se siembra abundantemente solo en la superficie inclinada.

2.- A continuacin rotule bien los tubos e incbelos 18 a 24 horas a 37C.

Luego de 18 a 24 horas:
Desarrollo de la batera (esto se har en grupo para comparar reacciones positivas y negativas).
1. Compruebe primero si tiene desarrollo en todos los tubos, el tubo SC puede no tener desarrollo.
Observe los tubos de la batera:
KIA: Observar si hubo viraje del indicador, produccin de gas, produccin de H
2
S
Fermentacin negativa todo el tubo rojo K/K
Fermentacin de glucosa + fondo amarillo, superficie roja K/A
Fermentacin de lactosa + tubo completo amarillo A/A
Produccin de H
2
S fondo del tubo negro
Produccin de gas burbujas de aire atrapadas en el agar

LIA: Observar si hubo viraje del indicador, y produccin de H
2
S
Lisina decarboxilasa negativa fondo amarillo, superficie morada K/A
Lisina decarboxilasa positiva todo el tubo morado K/K
Lisina deaminasa positiva superficie roja R/A
Produccin de H
2
S fondo del tubo negro


26
CTU: Observar si hay desarrollo.
Primero se debe observar la ureasa y a continuacin el indol.
Ureasa: agregar gotas de fenolftalena, agitar suavemente.
Produccin de ureasa positiva : indicador vira a rojo
Produccin de ureasa negativo: no hay viraje del indicador.
Indol: agregar 4-6 gotas del reactivo de Kovacs, agitar.
produccin de indol positiva anillo de color rojo en la superficie.
produccin de Indol negativa anillo se observa de color amarillo.

SC: utilizacin de citrato positiva : superficie del agar color azul
utilizacin de citrato negativa: todo el agar de color verde

Reaccin de la citocromo-oxidasa:
a) Impregne un papel filtro con el reactivo de oxidasa recin preparado. (Si no va a usar el reactivo de
inmediato protjalo de la luz)
b) A partir del agar TSA tome abundante muestra con una pipeta Pasteur y frtela sobre el papel filtro.
La aparicin de un color rosado obscuro a los pocos segundos es una reaccin positiva.
Identificacin de la bacteria.
Utilice las tablas que estn en las pginas 16 y 17 para identificar su muestra. (No es necesario
aprenderse las tablas).


Ejercicio # 7: Observacin de bacterias al fresco.
Objetivo: - distinguir movilidad bacteriana de movimiento browniano, observar esporas sin teir.
Materiales: - cultivo de bacteria mvil en medio lquido y de bacteria esporulada.
- asa de nicrn, mechero
- lminas portaobjeto, limpias y desengrasadas, cubreobjetos.
Procedimiento:
1.- Limpie una lmina portaobjeto con alcohol; deje secar.
2.- Coloque una gota pequea de cultivo con el asa y cubra la preparacin con un cubreobjetos.
3.- Observe al microscopio de contraste de fase SIN INMERSIN con el lente objetivo marcado Ph.
Asegrese que el diafragma y el filtro estn en su sitio correcto.
4.- Una vez finalizada su observacin descarte la lmina en los recipientes para material de desecho que
va al autoclave. Recuerde que en este caso las bacterias estn vivas.
Movilidad: Es posible observar bacterias mviles las cuales se desplazarn rpidamente por todo
el campo del microscopio; otras presentarn slo movimiento Browniano.
Esporas: Es posible ver esporas muy refringentes sueltas o en el interior de las bacterias.



27
Ejercicios # 8 y 9: Bsqueda de cocos Gram positivos en secrecin nasal y en la
cavidad bucal
En la cavidad bucal existe un gran nmero de bacterias. La mayora constituye la flora normal, otras se
encuentran en forma transiente, y tambin es posible encontrar bacterias patgenas, cuando existe infeccin.
El objetivo del ejercicio es observar el gran nmero de bacterias, entre ellas cocceas Gram positivas,
que se encuentran en la cavidad oral y mucosa nasal, y observacin de hemlisis por estas bacterias en
placas de agar sangre.
Con una trula estril se tomar una muestra como se lo indicar el profesor. sta se sembrar en una
placa de agar sangre de cordero y se diseminar para obtener colonias aisladas. La placa se incuba a 37 C
durante 24 horas. Se observa aparicin de distintos tipos de colonias y de distintos tipos de hemlisis

Ejercicio # 8: Aislamiento y caracterizacin de Staphylococcus aureus de
muestra nasal.
Existe una proporcin de personas que son portadores nasales de Staphylococcus aureus. Esta bacteria es
fcilmente evidenciable en medios de cultivo adecuados. Produce una -hemolisina que produce halos de
hemlisis en las placas de agar sangre.
Objetivos: - Aislar Staphylococcus aureus desde secrecin nasal
- Identificar S. aureus mediante hemlisis y reacciones bioqumicas
Materiales: - trulas estriles
- placas de agar sangre
- placas de agar manitol salado (se conoce tambin como Agar Chapman)
- tubos con BHI (Brain Heart Infusion)
- agar TSA (Tryptic Soy Agar)
Da 1.-
1.- Tomar con una trula estril la secrecin de las fosas nasales anteriores haciendo girar la trula por la
mucosa del tabique y de las aletas nasales. Sembrar con la trula diseminando en 1/3 de las siguientes
medios (en el orden sealado)
placa agar sangre

placa de agar manitol salado
luego sumergir la trula en caldo BHI. Eliminar adecuadamente la trula.
2.- Completar la diseminacin de las bacterias en las tres placas con un asa de manera de obtener colonias
aisladas.
3.- Rotular e incubar el tubo y las placas a 37C por 24 horas.
Luego de 18 a 24 horas (Da 2)
1.- Observar las caractersticas de las colonias en cada medio.
Buscar colonias con caractersticas de S. aureus:
a) en placas de agar sangre: colonias amarillas rodeadas de halos de hemlisis;
b) en placas de agar manitol salado: colonias rodeadas de zona amarilla por fermentacin de manitol;
2.- Hacer tincin de Gram de colonias sospechosas. Hacer tincin de Gram del caldo BHI.
3.- Sembrar una colonia con caractersticas de S. aureus en Agar TSA

28
Luego de 18 a 24 horas (Da 3)
1.- REACCIN DE LA COAGULASA
A partir del agar estra hacer la reaccin de coagulasa en lmina
a) Colocar una gota de agua sobre una lmina portaobjeto. Hacer una suspensin densa, lechosa y
homognea a partir del cultivo en estra.
b) Colocar una a dos gotas de plasma sobre la suspensin; homogeneizar rotando la lmina.
Reaccin positiva: aglutinacin (formacin de grumos) de bacterias en 20 segundos.
En caso de reaccin dudosa se podr realizar la prueba de la coagulasa en tubo. El resultado de esta
prueba tendr que verlo el alumno en la tarde de ese mismo da ya que se incuba por 4 horas.

2.- REACCIN DE LA CATALASA:
a) En una lmina portaobjeto colocar una gota de H
2
O
2
(10 volmenes).
b) Con una pipeta Pasteur con su punta cerrada, tomar una muestra del cultivo en agar TSA y colocarla en
contacto con el H
2
O
2
.
c) Reaccin positiva: burbujeo intenso por desprendimiento de O
2
.
NOTA: esta reaccin debe hacerse con extremo cuidado en el caso de colonias tomadas de agar sangre,
ya que la enzima catalasa, presente en los eritrocitos al ser arrastrada junto con la muestra, puede dar
reacciones positivas falsas.

S. aureus S. epidermidis Micrococcus sp
Pigmento amarillos blanco variable
alfa hemolisina + - -
Coagulasa + - -


Ejercicio # 9: Aislamiento y caracterizacin de Streptococcus alfa y beta
hemolticos desde muestra de secrecin farngea

Objetivos: - Aislar Streptococcus alfa y beta hemolticos desde muestra de secrecin farngea
- Observar la diversidad de la flora bacteriana farngea
Materiales: - trulas estriles
- placas de agar sangre
- tubos con BHI +glucosa
Da 1.-
1.- Tomar con trula estril un frotis de la faringe haciendo rotar la trula por la superficie de la mucosa de las
amgdalas (utilice para esto un espejo).
2.- Sembrar con la trula una placa de agar sangre para la bsqueda de Streptococcus pyogenes. Pasar la
trula repetidamente por un sector de la placa (no ms de un tercio de la superficie total).
3.- La misma trula se agita en un caldo Brain Heart con glucosa. Descarte adecuadamente la trula.

29
4.- A continuacin disemine con asa la muestra que coloc en la placa de agar sangre para obtener colonias
aisladas y finalmente efecte pequeas incisiones en el agar, usando el asa como cuchillo en la zona de
cultivo. Con esto se consigue introducir Streptococcus pyogenes en el agar, pudiendo as evidenciar
mejor la hemlisis debida a hemolisina O, la cual se inactiva en presencia de oxgeno (es activa en forma
reducida).
5.- Rotular e incubar la placa y el tubo BHI.

Luego de 18 a 24 horas (Da 2)
1.- En placas de agar sangre las colonias de S. pyogenes se caracterizan por ser muy pequeas y estar
rodeadas de un halo de hemlisis limpia. Para asegurarse que corresponde a Streptococcus y no
Staphylococcus hemolticos, busque un colonia aislada, tome una parte de la colonia y efecte tincin de
Gram. Si no puede tomar slo una parte de la colonia, porque son demasiado pequeas, busque dos
colonias idnticas y tia una de ellas. Se busca cocos Gram positivos en cadena. Observe la placa y
busque adems estreptococos alfa hemolticos los cuales producen un halo de hemlisis incompleta de
color verdoso alrededor de la colonia. Tambin es posible que encuentre Staphylococcus sp. en la
muestra farngea. Efecte una tincin de Gram de dichas colonias.
2.- Caldos BHI: los estreptococos crecen frecuentemente formando grumos al fondo de un tubo de medio
lquido, principalmente si ste contiene glucosa. Agite bien y luego haga una tincin de Gram. En
tinciones de cultivos lquidos es posible observar la formacin de cadenas muy largas.
3.- Si obtuvo una colonia sospechosa de ser Streptococcus pyogenes siembre una placa de agar sangre de
la misma forma que en el da 1 punto 4
Luego de 18 a 24 horas (Da 3)
1.- Observe hemlisis de las colonias obtenidas y efecte tincin de Gram para observar cocos en cadena.


Ejercicio # 10.-: Recuento de bacterias viables en placa en profundidad.
Objetivos: - Aprender la tcnica de recuento en placa en profundidad.
Materiales: - Cultivo bacteriano.
- Placas de Petri y pipetas de 1 mL estriles.
- Tubos con 9 mL de agua estril para hacer las diluciones de la muestra.
- Tubos con 15 mL de Agar de Recuento esterilizado y posteriormente fundido y enfriado a
45C. Los tubos de Agar se mantienen en bao termorregulado a 45C hasta el momento
de ser utilizados.
- Cuenta Colonias de Quebec.

Da 1.
1.- Rotule los tubos y placas que va a utilizar.
2.- Haga diluciones de 10 en 10. Con la pipeta estril tome 1 mL de muestra y vace a un tubo con 9 mL de
agua estril. Descarte la pipeta adecuadamente. Con vortex o con otra pipeta estril agite la dilucin de

30
modo homogenizarla. As se obtiene la dilucin 10
-1
o dilucin 1/10. No olvide flamear los bordes al abrir y
cerrar el tubo.
De la dilucin 1/10 tome 1 mL con pipeta estril vace a un tubo con 9 mL de agua estril. Descarte la
pipeta. Con vortex o con otra pipeta estril agite la dilucin de modo que quede homognea. As se
obtiene la dilucin 10
-2
o dilucin 1/100.
Repita el procedimiento hasta llegar a la dilucin 10
-7
.
3.- Vace en forma estril 1 mL de la dilucin a una placa de Petri estril vaca. Rpidamente vace sobre la
muestra 15 mL de Agar de Recuento fundido y enfriado a 45C. Agite suavemente la placa sobre la
superficie del mesn (evite chorrear la tapa de la placa con agar). En cuanto empiece a solidificar deje de
agitar para que no se formen grumos. Rotule e incube a 37C por 18 horas. Se debe trabajar siempre en
duplicado.
Luego de 18 a 24 horas (Da 2)
1.- Observe la placa y cuente las colonias presentes. Puede contar toda la placa, media placa o bien utilizar
el cuenta colonias. Se escogen aquellas placas que contengan entre 25 y 250 colonias y se cuentan
todas las colonias, incluyendo aquellas que quedaron atrapadas en el agar y que son de menor
tamao.
2.- Multiplique su resultado por el factor de dilucin para obtener el recuento.
Ej. Promedio de las dos placas de la dilucin 10
-5
: 235 colonias. El resultado se expresa con 1 cifra
significativa: 2,4 x 10
7
colonias/mL o bien 2,4 x 10
7
ufc/mL (ufc: unidades formadoras de colonias). Se
expresa como colonias y no bacterias para as indicar que se realiz un recuento de clulas viables.

Ejercicio # 11.-: Antibiograma por difusin en agar con discos de papel (Mtodo
de Kirby-Bauer).
Objetivos: Aprender la tcnica de antibiograma con discos de papel.
Materiales: Cultivo con muestra.
Pipeta Pasteur y trulas estriles.
Tubos con 1 mL de agua estril, Placas con Agar Muller-Hinton.
Discos de diferentes antibiticos, pinzas.
Regla, tabla de interpretacin de halos de inhibicin de desarrollo.
Da 1.
1. Rotule los tubos y placas que va a utilizar.
2. Con la pipeta Pasteur estril tome aproximadamente 6 a 8 gotas de la muestra y agrguelas lentamente
al tubo con 1 mL de agua estril hasta la primera turbidez visible (use un tubo de agua sin inocular para
comparar la turbidez). sta es una forma simplificada de estandarizar el inculo sin leer DO. Descarte la
pipeta adecuadamente.
3. Humedezca la trula en el tubo con el inculo y siembre en forma pareja toda la superficie de las placas
de Agar Muller-Hinton. Si la trula est muy seca introdzcala nuevamente en el inculo y repita la
siembra. Deje secar la placa 5 a 10 min para que los microorganismos se adsorban en el agar.
4.- Con pinzas ligeramente flameadas tome los discos de antibiticos y depostelos sobre el agar ya
sembrado. Incube a 37C por 18 horas.

31

Luego de 18 a 24 horas (Da 2)
1.- Observe la placa y con una regla mida el dimetro de los halos de inhibicin de desarrollo en mm.
Interprete los resultados de acuerdo a las tablas que le sern entregadas. Los resultados se informan como
sensible (S), intermedio o moderadamente sensible (I), y resistente (R).





RESUMEN PROGRAMACIN DE TRABAJOS PRCTICOS

Ejercicio Lunes Martes Mircoles Jueves Viernes
PRUEBA
1
Tincin de
Gram

2
Contaminacin
Ambiental (CA)
Continuacin CA Continuacin
CA
Continuacin CA Continuacin CA
3
Observacin de
colonias (OC)
Continuacin OC
4
Tincin de esporas
5
Aislamiento Continuacin
Aislamiento

6
Siembra batera de
Enterobacteriaceae
Revelar batera
e identificar la
muestra

7
Observacin de
Mycobacterium
tuberculosis

9
Estudio de Muestra
Secrecin Nasal
(EMSN)
Continuacin
EMSN
Continuacin
EMSN

10
Estudio de Muestra
Secrecin Farngea
(EMSF)
Continuacin
EMSF
Continuacin
EMSF

11
Recuento en
placa en
profundidad
Continuacin
Recuento
12
Antibiograma Continuacin
Antibiograma
Actividad
demostrativa
Observacin al
Fresco