Arch Med Vet 41, 185-195 (2009)

REVISIN BIBLIOGRFICA
Biologa de las clulas madre embrionarias (ES cells) en distintas especies:
potenciales aplicaciones en biomedicina
#
Biologyofembryonicstemcells(EScells)indifferentspecies:
potentialapplicationsinbiomedicine
ME Arias, R Felmer
*
LaboratoriodeBiotecnologaAnimal,InstitutodeInvestigacionesAgropecuarias,INIA-Carillanca,Temuco,Chile.
SUMMARY
Embryonicstemcells(EScells)areundifferentiatedcellsthatderivefromtheinnercellularmass(ICM)ofblastocyst-stageembryos.Thesecellscan
growindefinitelyinvitropreservingtheabilitytodifferentiateintoallcelltypesofanindividual.EScellshavebecomeapowerfultooltostudytheearly
embryonicdevelopment,infunctionalgenomic,togenerategenetargetedtransgenicanimalsandrecentlyinanimalcloningandmedicine.Furthermore,
currentresearchdevelopedontheirbiologicalpropertiesandpossibleapplicationsinregenerativemedicine,duetotheirenormouspotentialofrepair,
areopeninggreatpossibilitiesthatwillallowtodesign,inthenearfuture,revolutionarytherapiestodiversehumandiseasesnowadaysincurables.Inthis
reviewthegeneralaspectsoftheisolation,derivation,culture,differentiationandtransformationofthesecellsindifferentanimalspeciesaredescribed
aswellastheirpromisingapplicationsinbiomedicine.
Palabrasclave:clulasmadreembrionarias,clonacin,terapiadereemplazocelular.
Keywords:embryonicstemcells,cloning,cellreplacementtherapy.
INTRODUCCIN StemCells)quesonlasclulasenlasqueseenfocaresta
revisin.Estasclulasderivandelamasacelularinterna
Lasclulasmadresonclulasindiferenciadas,inmadu- (ICM,delinglsInnerCellMass)deunembrinalestado
ras,autorrenovablesycapacesdegenerarunoomstipos de blastocisto, esto es, dependiendo de la especie, 4-7
declulasdiferenciadas.Enlascondicionesadecuadas, dasdespusdelafecundacin(figura1).Estaestructura
estasclulaspuedendividirseindefinidamenteconservando particularsurgecomoresultadodeunaseriededivisiones
siempreunapoblacinestabledeclulasmadre,quebajo sucesivasdelasclulasembrionarias(oblastmeras),las
las condiciones apropiadas y recibiendo los estmulos cualesseespecializanparaconformarunaestructurahueca
adecuadospuedendiferenciarsehaciadiferentestiposde constituidaporunacapaexternadeclulasdenominada
clulasespecializadasdeunorganismoadulto(Evansy trofoectodermo(TE),einteriormenteporclulasenforma
Kaufman1981,Dasycol2008).Dependiendodelaetapa deracimo(elICM).Lacapaexternadeclulascontina
dedesarrollo,esposiblediferenciarcuatrotiposdeclulas sudesarrolloparaformarlaplacentayotrostejidosnece-
madre:i)lasclulasmadreembrionariastotipotenciales, sariosparalaimplantacinyposteriordesarrollofetaldel
ii)lasclulasmadreembrionariaspluripotenciales,iii)las embrineneltero,mientrasquelasclulasinternasse
clulasmadremultipotencialesyiv)lasclulasmadrepro- desarrollanyespecializanenlostejidosdelasdiferentes
genitorasunipotenciales.Laclulamadreporexcelenciay capasgerminalesdelembrin,endodermo,mesodermoy
queocupaelprimernivelcorrespondealvulofecundado ectodermo,formandoastodoslostejidosdeunorganismo
ocigoto,elcualestotipotenteyaquepuedegenerartodas (Hooper 1992). Las clulas madre embrionarias se les
lasclulasquedarnlugaralorganismoadulto,incluidas denominaentoncespluripotentes,yaquepuedengenerar
las clulas somticas, germinales y extraembrionarias todoslostiposcelularesdelcuerpo,peronopuedendar
(GjorretyMaddox-Hyttel2005). origen a las clulas de la placenta. De esta forma, los
Lasclulasdelsegundonivelcorrespondenalasc- embriones preimplantacionales constituyen el material
lulasmadreembrionarias(EScells,delinglsEmbryonic departidadeeleccinparaelaislamientodelasclulas
madreembrionarias,convirtindoseenelprincipalfoco
decontroversiaparalaaplicacindeestatecnologaen
humanos,yaqueparasuderivacinsehacenecesariala
destruccindelembrin.
Aceptado:21.01.2009.
Existenotrasdosfuentesapartirdelascualesespo-
# FinanciadoenparteporproyectoFONDECYT1080216
sibleaislarclulasmadreembrionarias:i)lasgerminales
* LaboratoriodeBiotecnologaAnimal,InstitutodeInvestigaciones
(EGC,delingls EmbryonicGermCells),lascualesse
Agropecuarias,INIA-Carillanca.CaminoCajnVilcns/n,km10,
Casilla58-D,Temuco,Chile;rfelmer@inia.cl desarrollan en los tejidos gonadales del embrin o feto
185
MEARIAS,RFELMER
yquedanlugarposteriormentealosgametos(figura1)
(Shamblottycol2001)yii)lasdecarcinoma(ECC,del
inglsEmbryonicCarcinomaCells),lascualesprovienen
detumorescomplejosdenominadosteratocarcinomas,que
derivandegnadasadultas(figura1)(Skakkebaekycol
1987).Estastresfuentesdeclulasmadreembrionarias
tienenlacapacidaddediferenciarseinvitro,contribuyendo
alalneagerminalluegodesuinyeccinenblastocistos
endesarrollo.Noobstante,dadalanaturalezatumoraly
cariotipo anormal de las clulas embrionarias de carci-
noma,lamayorpartedelasinvestigacionesconclulas
madreembrionariassehanrealizadoapartirdelasclulas
derivadasdelamasacelularinterna.
Apartirdelaislamientodelasprimeraslneasdeclulas
madre embrionarias en ratn (Evans y Kaufman 1981,
Martin1981),estetipodeclulashansidoinvestigadas
intensamente ya que poseen dos caractersticas que las
convierten en nicas en relacin a otras clulas madre
especficasderganosidentificadashastalafecha.Lapri-
meraeslacapacidaddeautorrenovacininvitro,esdecir,
puedenmantenerseencultivoluegodenumerosospasajes
yduranteperodosprolongados(quizsindefinidamente)
comounapoblacinhomogneadeclulasindiferenciadas,
conservandouncariotiponormal.Lasegundacaracterstica
eslapluripotencialidad,pudiendooriginar,bajoestmulos
adecuados,cadacluladeunindividuo.Estacapacidad
quedenevidenciacuandoBradleyycol(1984)inyectaron
clulas madre embrionarias de ratn en blastocistos en
desarrollo,observandomstardelacontribucindeestas
clulasatodoslostejidosdelosratonesquimerasadultos
generados,incluyendolalneagerminal.
Eneltercernivelseencuentranlasclulasmadreadultas
(SC,delinglsStemCells)quesonclulasmultipotenciales,
yaqueposeenunacapacidadlimitadaparadiferenciarse,
dandoorigensloalasclulasdeunrganoconcretoenel
embriny/oeneladulto(figura1).Elejemplomsclsico
deestasclulassonlasclulasmadredelamdulasea,
lascualespuedengenerarlostiposcelularesdelasangre
ydelsistemainmune(Lovell-Badge2001)ylasclulas
madredelaplacentay/ocordnumbilical,queseextraen
almomentodelpartoyqueenChilehanadquiridogran
relevancialuegodelarecientecreacindelprimerbanco
pblicodeclulasmadre
1
,enelcualsecriopreservanestas
clulas por tiempo indefinido para futuros tratamientos
deenfermedades,sobretododeltipohematolgicocomo
leucemias,anemiasylinfomas.
Finalmenteenelcuartonivelseencuentranclulascon
limitadacapacidadproliferativaymsbienunatendenciaa
launipotencialidad,esdecir,quepuedenoriginarsolamente
clulasterminales.Algunosejemplosdeestasclulasson
lasclulasprogenitoraseritroidesolasclulasprogenitoras
neuronales,lascualessediferencianexclusivamenteen
eritrocitos y neuronas, respectivamente. De esta forma,
dependiendodelpotencialdelaclulamadre,stapuede
http://www.sochigen.cl/noticias-30-05-2007.htm
clasificarseentotipotentesiescapazdegenerartodaslas
clulasdelembrinydeltejidoextraembrionario,pluripo-
tentesipuedecreartodoslostiposcelularesqueformarn
elembrin,multipotentesisloescapazdegenerarlos
tiposcelularesdeltejidodedondeproviene,ounipotente
sidalugaraunnicotipocelular(Temple2001).
DERIVACINYCULTIVODECLULASMADRE
EMBRIONARIASENDIFERENTESESPECIES
Las clulas madre embrionarias fueron aisladas por
primera vez desde la masa celular interna de blastocis-
tos de ratn en 1981 (Evans y Kaufman 1981, Martin
1981). Estos estudios preliminares fueron la base para
que aos ms tarde se hayan logrado establecer lneas
declulasmadreembrionariasapartirdeotrasespecies
comoelhmster(Doetschmanycol1988),cerdo(Evans
y col 1990,Vackoba y col 2007), bisonte (Sukoyan y
col 1993), macaco de la India (Thomson y col 1995),
marmota(Thomsonycol1996),pollo(Painycol1996),
bovino(Sticeycol1996,Cibelliycol1998,Wangycol
2005), humano (Thomson y col 1998), perro (Hayes y
col 2008) y gato (Yu y col 2008). Ms recientemente,
enpocasespeciessehanaisladolneasdeclulasmadre
embrionariasapartirdeembrionesclonados,generados
porfecundacininvitroy/opartenognesis(Wakayama
ycol2001,Cibelliycol2002,Wangycol2005,Byrney
col2007,Maiycol2007).
Enunprincipio,lasclulasmadreembrionariasderatn
fueronderivadasymantenidasencocultivoconclulas
embrionariasdelamismaespeciedenominadasclulasali-
mentadoras,lascualesaportabanlosfactoresdecrecimiento
necesariosparaqueestasclulascrezcanadecuadamente,
mantenganuncariotiponormalypreservensucapacidad
de autorrenovacin y pluripotencia (Evans y Kaufman
1981,Martin1981).Estudiosposterioresidentificaronuna
citoquinaderivadadeestasclulas,elfactorinhibidorde
laleucemia(LIF,delinglsLeukemiaInhibitingFactor),
comounadelasmolculasclavesenprevenirsudiferen-
ciacinyenmantenersucapacidaddeautorrenovacin
(Smithycol1988,Niwaycol1998,Matsudaycol1999).
Estefactoresproducidoporclulasdediferentesespecies
incluyendolneascelularesdefibroblastosderatn(STO
MouseFibroblastCellLine),clulasdehgadoderatas
bfalo(BRL,delinglsBuffaloRatLiver),clulasVero
yfibroblastosembrionarioshumanos(Smithycol1988,
Peaseycol1990,Talbotycol1995).Deestaforma,para
elcultivodelasclulasmadreembrionariasderatnse
puedeutilizarLIFproducidoporlasclulasSTO,aligual
que medio condicionado BRL combinado con clulas
alimentadoras y/o medios libre de clulas empleando
LIFrecombinanteencombinacinconsuerobovinofetal
(Smithycol1988,Williamsycol1988).
Enelhumano,recientementesehanderivadoclulas
madreembrionarias,clulasembrionariasdecarcinoma
yclulasembrionariasgerminales.Sinembargo,slolas
186
1
CLULAS MADRE EMBRIONARIAS, CLONACIN, TERAPIA DE REEMPLAZO CELULAR
TROFOECTODERMO
ADULTO
(TE)
FETO
MASA CELULAR TERATOCARCINOMA
INTERNA
(MCI)
FECUNDACIN
BLASTOCISTO
Clulas Madre Clulas Embrionarias Clulas Madre Clulas Embrionarias
Embrionarias Germinales Adultas de Carcinoma
(ES cells) (EG cells) (Stem cells) (EC cells)
ModificadadeDonovanyGearhar,2001.
Figura 1. Origendelosdiferentestiposdeclulasmadredisponibles.Derivacindeclulasmadreembrionarias(EScells),clulas
madredecarcinoma(ECcells),clulasembrionariasgerminales(EGcells)yclulasmadredeadulto(Stemcells).
Originofthedifferenttypesofstemcellsavailable.Derivationofembryonicstemcells(EScells),embryoniccarcinomacells(ECcells),
embryonicgermcells(EGcells)andadultstemcells(Stemcells).
clulasmadreembrionariasderivadasdeembrionespro-
ducidosporfecundacininvitroparecieranmantenerla
mayoradelaspropiedadespluripotencialesestablecidas
paralasclulasmadreembrionariasderatn(Thomson
ycol1998,Reubinoffycol2000).Estasclulashumanas
sondenominadascomnmenteclulasmadreembriona-
rias humanas, aunque por razones ticas su capacidad
parareingresaralaembriognesisy/ocolonizarlalnea
germinalnohasidoprobada,porloqueenrigorselas
debera denominar clulas humanas parecidas a las
clulasmadreembrionarias(hESlikecells).Sibienlas
condiciones de cultivo para estas clulas no estn bien
definidas como para las clulas madre embrionarias de
ratn, los protocolos de cultivo desarrollados en los l-
timosaoshanpermitidomantenerpoblacionesolneas
de estas clulas en cultivo por perodos prolongados,
conservandouncariotiponormalysuscaractersticasin-
cluyendosupotencialdediferenciacininvitroeinvivo.
As,actualmenteestasclulaspuedencrecersobreclulas
alimentadorasconmediolibredesueroysuplementado
con bFGF (del ingls basic Fibroblast Growth Factor),
tambin sobre placas revestidas con laminina y medio
condicionadoporfibroblastosembrionariosderatnocon
medioconteniendoLIFrecombinanteenlapresenciade
BMP4(delinglsBoneMorphogenicProtein4),lacual
permitesustituirlosrequerimientosdesuerobovinofetal
(Thomsonycol1998,Amitycol2000,Xuycol2001,
Yingycol2003).
Enelcasodeanimalesdomsticoscomoelbovino,
paraelaislamientoycultivodelasclulasmadreembrio-
nariasbovinas,sehanutilizadodiferentestiposcelulares
como sustrato, incluyendo fibroblastos fetales bovinos
(Firstycol1994),clulasepitelialesdeterobovino(van
Stekelenburg-Hamersycol1995),clulasSTO(Talboty
col1995),fibroblastosepitelialesderatn(Cibelliycol
1998,Mitalipovaycol2001)yfibroblastoshumanosde
pulmn (Iwasaki y col 2000). Sin embargo, a pesar de
habersegeneradohastalafechaalmenosseislneasde
clulasmadreembrionariasenestaespeciequeexhiben
pluripotenciatantoinvitrocomoinvivo,todasvaranentre
senmorfologayenmarcadoresgenticosdeexpresin
normalmente asociados a estados de indiferenciacin y
pluripotencia de estas clulas en otras especies (Stice
y col 1996, Cibelli y col 1998, Kitiyanant y col 2000,
Mitalipova y col 2001, Saito y col 2003, Wang y col
2005). Ms an, a pesar de haberse generado quimeras
transgnicas,luegodelainyeccindeestasclulasmodi-
ficadasgenticamenteenembrionesendesarrollo,nose
hademostradolacontribucindeestasclulasalalnea
germinalyporlotantosutransmisinaladescendencia
(NiemannyReichelt1993,Cibelliycol1998,Iwasakiy
col2000,WangyZhou2003).
PROPAGACINDELASCLULASMADRE
EMBRIONARIASINVITRO
Engeneral,lasclulasmadreembrionariassepropagan
pordisociacinenzimticadelascoloniasysembrando
clulasindividualesparalaformacindenuevascolonias
(EvansyKaufman1981,Thomsonycol1995,1996,Cibelli
ycol2002).Enelbovino,adiferenciadeotrasespecies,las
clulasmadreembrionariasnoformancoloniasdespusde
187
MEARIAS,RFELMER
ladisociacinenzimticayposteriorresembrado(Sticeycol
1996,Cibelliycol1998,Mitalipovaycol2001).Adems,
estasclulassonsensiblesalasenzimasutilizadasparala
disociacin,incluidaslatripsinaempleadaparadisociar
clulasmadreembrionariasderatnylacolagenasatipo
IVyproteasaE,empleadasparaladisociacindeclulas
madreembrionariashumanas(Wangycol2005).Todas
estasenzimasintervienenfuertementeenlacapacidadde
autorrenovacinycausandiferenciacinespontnea.Sin
embargo, recientemente Roach y col (2006) reportaron
lageneracindeclulasmadreembrionariasbovinasque
pudieronserdisociadasutilizandounabajaconcentracin
detripsina0,05%/EDTA.Aunqueelmtodonecesitaser
optimizadoencadacaso,estosinvestigadoreshandesa-
rrolladolneasdeclulasmadreembrionariasbovinascon
morfologasimilaralasestablecidasparaclulasmadre
embrionariashumanasyderatn,ascomomarcadores
deexpresinidnticosalosqueseexpresanenembriones
bovinosenestadodeblastocistos(Roachycol2006).
DIFERENCIACINDELASCLULASMADRE
EMBRIONARIAS
Elgranobjetivodelatecnologadelasclulasmadre
embrionariasconsisteendirigirloscultivosdeclulasin-
diferenciadashacialaformacindetejidosyrganospara
terapiasdereemplazocelular(RipponyBishop2004).Las
clulasutilizadasparaestospropsitosteraputicosdeben
serseleccionadasporsuestabilidadgenticaynormalidad,
antesdeiniciarlaaplicacinteraputicaenhumanos.De
estaforma,elprincipaldesafoparalaaplicacinfutura
delasterapiasdesustitucincelulareselcontrolsobre
ladiferenciacindeestasclulashaciatejidosespecfi-
cos. Es por tanto necesario desarrollar procedimientos
que conduzcan eficazmente a la diferenciacin de las
clulasmadreembrionariashacialostiposespecficosde
clulasqueserequieranencadacaso.Ladiferenciacin
invitrodeestasclulasserealizaremoviendodelmedio
decultivolosfactoresquelasmantienenindiferenciadas
yaplicandolosestmulosapropiadosnecesariosparasu
diferenciacinhacialastreslneasgerminalesembriona-
rias(figura2)(Keller1995,Smith2001).Cuandoestas
clulas son cultivadas en suspensin, en ausencia de
factoresantidiferenciacin,formanagregadoscelulares
tridimensionalesllamadoscuerposembrionarios(EB,del
inglsEmbryoBodies)(figura2),losqueluegode2-4
dasencultivoformanelendodermo,dandolugaraun
cuerpoembrionariosimple,elcualsediferenciaalcuarto
dagenerandounaestructuramscomplejaconepitelio
columnarymembranabasal(Leahyycol1999).Enesta
etapa, los cuerpos embrionarios son llamados cuerpos
embrionariosqusticos(EvansyKaufman1981,Keller
ycol1993,Ngycol2005).Lacontinuacinencultivo
y la exposicin a los estmulos y/o agentes qumicos
adecuados pueden inducir la diferenciacin de estos
cuerpos embrionarios hacia un linaje especfico, por
Totipotente
Pluripotente
Clulas ES
Cuerpo Embrionario
Clulas Nerviosas Clulas Cardacas Clulas Pancreticas
Ectodermo Mesodermo Endodermo
ModificadodeWobusyBoheler,2005
Figura 2. Diferenciacin in vitro de clulas ES. Las clulas
madreembrionariaspluripotentessederivaninvitrodelamasa
celular interna de blastocistos en desarrollo. La prolongacin
delcultivodeestasclulasgeneraestructurasvaformacinde
agregadostridimensionalesdenominadascuerposembrionarios,
los que bajo estmulos adecuados se diferencian en los tipos
celularesdelastrescapasgerminales,mesodermo,ectodermo
yendodermo.
InvitrodifferentiationofEGcells.PluripotentEScellsare
derivedinvitrofromtheinnercellmassofdevelopingblastocysts.The
continuationofthesecellsinculturegeneratestri-dimensionalstructu-
resdenominatedembryobodies,whichunderappropriatestimulican
differentiateinthecellulartypesofthe3germinallayers,mesoderm,
ectodermandendoderm.
ejemplocidoretinoicoparaladiferenciacinaclulas
neuronales(Ezekielycol2007),aFGF(delinglsacidic
FibroblastGrowthFactor)yHGF(delinglsHepatocyte
GrowthFactor)paradiferenciacinenclulashepticas
(Hu y col 2003), TSH (del ingls Thyroid Stimulating
Hormone)paraladiferenciacinenadipocitos(LuyLin
2008)yenconjuntobFGF,IGF-1(delinglsInsulin-like
GrowthFactor-1)ynicotinamidaparasudiferenciacin
en clulas semejantes a los islotes del pncreas, entre
otros(Liuycol2005,Lierschycol2006).
Para determinar el potencial de diferenciacin in
vivo,lasclulasmadreembrionariasdeorigenanimalse
agreganaembrionesdeochoclulasoaembrionesenla
etapadeblastocistoparaoriginarunaquimeraenlaque
posteriormenteesnecesarioestablecerlacontribucinde
estasclulasenlaformacindelamasacelularinternay
deltrofoectodermo(Saitoycol2003)yenalmenosun
porcentajenoinferioral10%enlaformacindealgn
tejidoenlosanimalesnacidos(Sticeycol1996,Cibelli
188
CLULAS MADRE EMBRIONARIAS, CLONACIN, TERAPIA DE REEMPLAZO CELULAR
ycol1998).Comoporrazonesticasestaevaluacinno
sepuederealizarenhumanos,enlasclulasmadreem-
brionariashumanasytambinenlasdealgunosanimales,
lapluripotenciainvivoseconfirmaporlaformacinde
teratomas,luegodesuinyeccinenratonesconinmuno-
deficienciacombinada(Stojkovicycol2004).
MARCADORESDEPLURIPOTENCIAASOCIADOS
ALASCLULASMADREEMBRIONARIAS
Los anlisis moleculares han revelado que la cito-
quinaLIFactaatravsdelaactivacindelreceptorde
membranagp130delfactordetranscripcinSTAT3(del
inglsSignalTransducerandActivatorofTranscription
3)(Niwaycol1998,Matsudaycol1999),mientrasque
elefectodeBMP4estaramediadoporlaactivacindel
factordetranscripcinSMAD(delinglsSmallMothers
Against Decapentaplegic) y la subsiguiente induccin
delfactorinhibitoriodeladiferenciacin(Id,delingls
InhibitoryDifferentiationFactor)detipobHLH(delingls
basic Helix-Loop-Helix).Adems de STAT3 e Id, otros
dosfactoresdetranscripcinquehanmostradotenerroles
fundamentalesenlamantencindelestadoindiferenciado
delasclulasmadreembrionariassonOct-4(delingls
Octamer Transcription Factor-4) (Niwa y col 2000) y
Nanog(Chambersycol2003,Mitsuiycol2003).
Oct-4esesencialparaeldesarrolloinicialdelapluri-
potencialidadenelmacizocelularinternodecigotosde
ratnyparamantenerlapluripotencialidaddelasclulas
madreembrionarias,respectivamente.Noobstante,anlisis
cuantitativosrevelaronquelosnivelesaltosdeexpresinde
estefactorinducenladiferenciacindelasclulasmadre
embrionariasderatnhacialneasdelendodermoymeso-
dermo,mientrasquenivelesbajosdeexpresininducen
prdidadelapluripotencialidadydesdiferenciacinhacia
clulas del trofoectodermo (Niwa y col 2000). Por esta
razn,sehapostuladoaestefactordetranscripcincomo
reguladormaestrodelapluripotencialidad,ejerciendosu
efectomediantelaregulacindelaexpresindealmenos
sietegenesnecesariosparaladiferenciacin(Pesceycol
1998).Enotrasespeciescomocerdos,bovinosyhumanos
tambinsehaconfirmadolapresenciadeestefactorenel
macizocelularinternoyeneltrofoectodermo(vanEijky
col1999,Kirchhofycol2000,Saitoycol2003),llevando
aespecularunafuncinsimilaraladelasclulasmadre
embrionariasderatn(Mitalipovaycol2003,Reubinoff
ycol2000).Deigualforma,sehaidentificadoaNanog
comootrofactormaestroreguladordelapluripotencia-
lidaddelasclulasmadreembrionarias(Chambersycol
2003, Mitsui y col 2003). La expresin de este factor
se ha observado tanto en clulas madre embrionarias
de ratn como humanas, estando ausente en las clulas
diferenciadas.Sinembargo,Nanogescapazdemantener
laautorrenovacindeclulasmadreembrionariasderatn
independientementedelavaSTAT3/LIFasociadaalfactor
detranscripcinOct-4.
Las clulas madre embrionarias de ratn exhiben
ademsactividadfosfatasaalcalina(Resnickycol1992)
ytelomerasa(Armstrongycol2000),aligualquemuchas
de las lneas de clulas madre embrionarias humanas
(Smith 2001, Carpenter y col 2003, Ginis y col 2004).
Noobstante,enclulasmadreembrionariasbovinasesta
actividadesmuyvariable(Talbotycol1995,Sticeycol
1996,Strelchenko1996,Cibelliycol1998).Adicionalmente
existenantgenoscaractersticosasociadosalapluripoten-
cialidaddelasclulasmadreembrionariasdenominados
marcadores de indiferenciacin y/o pluripotencia. Los
antgenosembrionariosespecficosdeSSEA-1(delingls
StageSpecificEmbryonicAntigen-1)ySSEA-3seobservan
enclulasmadreembrionariasderatn,mientrasquelas
clulasmadreembrionariashumanasexpresanSSEA-3y
SSEA-4(Carpenterycol2003).Enelcasodelasclulas
madreembrionariasbovinas,estudiosinmunohistoqumicos
revelaronlaexpresindeSSEA-1(Saitoycol2003),pero
sehanobtenidoresultadoscontradictoriosconrespecto
a la expresin de SSEA-3 y SSEA-4 (Mitalipova y col
2001,Saitoycol2003).
TRANSFORMACINGENTICADELAS
CLULASMADREEMBRIONARIASMEDIANTE
RECOMBINACINHOMLOGADIRIGIDA(GENE
TARGETING)
Enladcadadelosochentaseestablecielgranvalor
delasclulasmadreembrionariascomoherramientapara
experimentos de mutagnesis dirigida, al reemplazar o
eliminar(knock-out)selectivamenteundeterminadogen
en el genoma de un animal. Para llevar esto a cabo, se
realiza la modificacin gentica del gen seleccionado
en una copia clonada del mismo, la cual se transfiriere
posteriormentealgenomadelasclulasmedianterecom-
binacinhomlogaconunasecuenciadeADNsimilaren
elcromosoma.Siestasclulasseinyectanenembriones
deratnendesarrollo(blastocistos)puedencolonizarel
embrinygenerardescendenciatransgnica,contribuyendo
eficientemente hacia la lnea germinal de las quimeras
resultantes,lasqueluegodesuretrocruzamientopermiten
lageneracindeunalneapuradeanimaleshomocigotos
paralamodificacingenticadeseada(Gosslerycol1986,
Robertsonycol1986).
Lostrabajospionerosderecombinacinhomlogaen
clulasmadreembrionariasderatnsentaronlasbasesdel
primermodeloanimalparaelsndromedeLesch-Nyhan,un
rarodesordenneurolgicocaracterizadoporladeficiencia
delaenzimahipoxantinafosforibosiltransferasa(HPRT,del
inglsHypoxanthine-GuaninePhosphoribosylTransferase)
(Doetschmanycol1987,ThomasyCapecchi1987).De
estaforma,estatcnicaentregalosinvestigadoresuna
poderosaherramientaparageneraranimalestransgnicos
conmutacionesprecisasensugenoma,contndosehasta
lafechaconmsde5.000genesinactivadosenelratn.
Estos modelos estn siendo utilizados para el estudio
189
MEARIAS,RFELMER
de diversas enfermedades genticas y para comprender
procesos biolgicos incluyndose para el anlisis de la
funcin y regulacin de genes endgenos (Houdebine
2002). Sin embargo, a pesar de su gran utilidad, estos
modelos knock-out tienen pocas posibilidades reales
paradesarrollartratamientosclnicosoparaestudiarlos
efectosalargoplazoenlasaludcomoresultadodeestas
modificaciones.Laprincipalrestriccindelmodelamiento
de patologas humanas en el ratn estn dadas por sus
diferencias fisiolgicas y reproductivas, incluyendo el
nmero de progenie, su menor tamao y corta vida, lo
que ha motivado por aos la generacin de animales
domsticosquepuedanconstituirseenmejoresmodelos
paraserutilizadosparaestospropsitos.
Apesardelosesfuerzos,lasaplicacionesdeestatec-
nologaenespeciesdomsticassehanvistorestringidas
debidoaqueannosehademostradoquelasclulasmadre
embrionariasgeneradasenestasespeciescontribuyana
lalneagerminal(NiemannyReichelt1993,Cibelliycol
1998,Iwasakiycol2000,WangyZhou2003).Noobstante
estedesalentadorescenario,actualmentelatecnologade
transferencianucleardeclulassomticasestabriendo
nuevasoportunidades.Medianteelnacimientodelaoveja
Dolly(Wilmutycol1997),estatecnologademostrno
slolacapacidaddeutilizarclulassomticasparagenerar
unindividuoadulto,sinoademslafactibilidaddemani-
pulargenticamenteestasclulasparageneraranimales
que adems de ser clonados son tambin transgnicos
(Schnieke y col 1998). Este importante hito cientfico
pavimentelcaminoparalostrabajospionerosderecom-
binacinhomlogaenanimalesdomsticos,permitiendo
deestaformalageneracindelosprimerosmodelosde
animales domsticos con mutaciones definidas en su
genoma.Unodeestosmodelosbuscaprevenirelrechazo
hiperagudoqueseproduceeneltrasplantederganosde
cerdoahumanos,quesecreeestaradadoporeleptope
-1,3-galactosaqueestpresenteenlasclulasdecerdo
peronoenlasclulashumanas,porloquesueliminacin
podraaplacaralgunosdelosaspectosdelestmulodere-
chazo(WangyZhou2003).Recientementesehalogrado
laeliminacindeestegenenclulassomticas,lasque
fueronposteriormenteutilizadascomodonantesdencleo
enexperimentosdetransferencianuclear,generndoselos
primeroscerdosknock-outparaestamutacin,estandoa
laesperalasinvestigacionesdelostejidosyrganosde
estosanimalesenotrosmodelosnohumanos,quesinduda
entregarnvaliosainformacinrespectoalmecanismode
rechazohiperagudo,acercandolasposibilidadesparala
utilizacindeestosrganosentrasplanteshumanos(Dai
ycol2002,Phelpsycol2003,Sharmaycol2003).
La encefalopata espongiforme bovina (EEB), ms
conocidacomoenfermedaddelasvacaslocas,esunaenfer-
medadneurodegenerativacausadaporprotenasresistentes
a proteasas denominadas priones (PrP, del ingls Prion
Protein)(vanKeulenycol2008).Debidoaquelasovejasy
losbovinosposeengenesfuncionalesdelosprionesyson
utilizadosparagenerarproductosbiomdicos,talescomo
gelatina,colgenoyrecientementeprotenashumanasen
biorreactorestransgnicos,sehacenecesariodisponerde
animalesresistentesalospriones.Losprimerosmodelos
deratonesgeneradosdondeseeliminunacopiadelgen
delprion(PrP
+/-
)noevidenciaronanormalidadesensu
conducta, mientras que los homocigotos nulos (PrP
-/-
)
nodesarrollaronlascaractersticasclnicasypatolgicas
clsicasdelscrapieluegodesuinoculacinconpriones
de ratn (Bueler y col 1994). Estos hallazgos sugieren
quelaeliminacindeestegenenovejasybovinospodra
permitirlageneracindemodelosanimalesresistentesala
EEBoalscrapie.Losprimerosexperimentostendientes
a demostrar esta hiptesis corresponden a los trabajos
recientes de Denning y col (2001) quienes generaron
ovejasheterocigotasparaestegen,estandoalaesperala
generacindelneasdeanimaleshomocigotosnulos,antes
dequesepuedaevaluarlasobrevivenciayresistenciade
estosanimalesalaenfermedad.
APLICACIONESDELASCLULASMADRE
EMBRIONARIASENBIOMEDICINA
DESARROLLODENUEVASDROGAS
Se ha sugerido que las clulas madre embrionarias
puedentenersuaplicacineneldescubrimientoydesarrollo
denuevasdrogasconpotencialfarmacutico(figura3).
Enefecto,algunostiposcelularescomocardiomiocitosy
hepatocitosgeneradosdesdeclulasmadreembrionarias
humanas podran proporcionar una poblacin ideal de
clulas para evaluar con mayor exactitud la efectividad
deundeterminadofrmacoosutoxicidad(Keller2005).
Estesistemaproporcionaraventajasadicionalesyaque
lasclulashumanaspuedenrevelarlatoxicidaddeciertas
drogasquenonecesariamentesedetectanenlosanlisis
convencionales,comoenlosensayosdesarrolladoscon
lneascelularesderatnolosensayosllevadosacaboin
vivoenanimales.
TERAPIADEREEMPLAZOCELULAR
La aplicacin de las clulas madre embrionarias
queharecibidomayoratencinenlosltimosaoses
laterapiadereemplazocelularomedicinaregenerativa
(figura 3),quepermitira el tratamientodeunaamplia
variedaddeenfermedadesdebilitantes,talescomodiabetes
tipo I, enfermedades cardiovasculares, enfermedad de
Parkinsonyenfermedadesdelasclulassanguneas(Doss
ycol2004).Enestecaso,loquesebuscaesreemplazar
clulas daadas por clulas funcionales que restituyan
lafuncinnormaldelostejidosurganosdeformams
eficientequeatravsdeterapiasconvencionalescomo
sonlostrasplantes, lasterapias farmacolgicas y/olos
tratamientos con protenas recombinantes. Sin embar-
go,hastalafechaelxitodeestasterapiaseslimitado,
190
CLULAS MADRE EMBRIONARIAS, CLONACIN, TERAPIA DE REEMPLAZO CELULAR
FECUNDACIN
Blastocisto estndar
Manipulacin Gentica
Ganancia de funcin (knock in)
Prdida de funcin (knock out)
Biologa del Desarrollo
TRANSFERENCIA NUCLEAR DE CLULAS
SOMTICAS
clula somtica
Blastocisto clonado
ovocito
Clulas Madre
Embrionarias (ES cells)
Clonacin
teraputica
Terapia de Reemplazo Descubrimiento de Drogas
Celular
Endodermo Ectodermo
Mesodermo Heart Muscle Cells
ModificadodeKeller,2005
Figura 3. Usospotencialesdelasclulasmadreembrionarias(EScells)eninvestigacinymedicina.Generacindeclulasmadre
embrionariasdesdeblastocistosnormales(fecundacin)odesdeblastocistosclonados(transferencianucleardeclulassomticas).
Potential use of stem cells (EG cells) in research and medicine. Generation of ES cells from normal blastocysts (fertilization) or from
blastocystderivedfromcloning(somaticcellnucleartransfer).
existiendo varias interrogantes que an necesitan ser
resueltas.Unadeellaseselnmerodeclulasquedeben
sertrasplantadasysuestadodediferenciacin.Adems,
eneltrasplanteconclulasmadreembrionariasexisteel
riesgodecontaminacinconclulasmadreembrionarias
residuales no diferenciadas, las cuales se sabe pueden
desarrollarteratomascuandosontrasplantadas(Evansy
Kaufman1981,Thomsonycol1998).Estohamotivado
a que actualmente se estn desarrollando tcnicas que
permitanlapurificacindeclulasconunlinajedetermi-
nadoparaserutilizadasconseguridadenlostrasplantes
(Liycol1998,Dossycol2004).
Otroobstculoasobreponereslacompatibilidaddo-
nante/receptoryelrechazoaltrasplante,paralocualseha
sugeridoestablecerunbancodemuchaslneasdeclulas
madreembrionariasqueincluiranunaproporcinsignifi-
cativadelostiposdehistocompatibilidadenlapoblacin
(Keller2005).Actualmenteexistenmuchasinvestigaciones
enfocadasadescubrirclulasprogenitorasquesirvancomo
bancodeclulasparausosteraputicos,evalundosevarias
estrategias que incluyen terapias celulares derivadas de
clulasautlogas,delneascelularesestablecidasdesde
unavariedaddeclulasmadreincluyendolamdulasea,
cordnumbilical,clulasmadreembrionarias,ascomo
clulasdetejidosyrganosdeanimalesgenticamente
modificados(Asaharaycol2000,Fodor2003).
CLONACINTERAPUTICA
Para sobreponer el problema habitual del rechazo
del injerto por el sistema inmunolgico del receptor se
handesarrolladonumerosasestrategias,lamsreciente
y conflictiva es quizs la clonacin teraputica, la cual
involucra la obtencin de clulas madre embrionarias
isognicasdesdeembrionesclonados,lasquepuedenser
diferenciadas especficamente en clulas regenerativas
parapacientesquerequierenterapiadetrasplantecelular
(Hanycol2007).Enlaclonacinteraputicalosncleos
declulassomticasdeunpacientesonfusionadoscon
ovocitosenucleados,cultivndolosinvitrohastalaetapa
de blastocistos y derivando de la masa celular interna
lneasdeclulasmadreembrionariasisognicashumanas
(figura3).Sinembargo,laslimitacionesdeesteprocedi-
mientoestndadasporlaprohibicinqueexisteenmuchos
pasesparagenerarembrioneshumanosclonadosypor
la escasez de ovocitos humanos para estos propsitos
(Mombaerts2003).
Elapoyoqueexisteactualmenteparageneraryutilizar
lneasdeclulasmadreembrionariashumanasvaraentre
losdiferentespases.EnInglaterra,porejemplo,laHFEA
(The Human Fertilisation and EmbryologyAuthority)
2
2
www.hfea.gov.uk
191
MEARIAS,RFELMER
aproblageneracindelneasdeclulasmadreembrio-
nariashumanasdeembrionessobrantesdeprocedimientos
defecundacininvitro,decisinquetambinhanimpul-
sadoEspaaySuiza.Ennuestropas,encambio,seha
promulgadorecientementelaLey20.120(DiarioOficial
22/09/06)enlacualseprohbelaclonacindesereshu-
manosparacualquierfinyladestruccindeembriones
para obtener las clulas madre embrionarias. En Corea
del Sur y otros pases asiticos se aprob la utilizacin
deembrioneshumanosclonadosparagenerarlneasde
clulasmadreembrionarias(Bavisterycol2005),situacin
que gener gran conmocin en la comunidad cientfica
mundial,cuandoenelao2004Woo-SukHwangysus
colaboradores anunciaron la obtencin de 11 lneas de
clulasmadreembrionariashumanas,queprovenande
embrionesclonadosdepacientescondiversasenfermeda-
desinmunolgicascongnitas,talescomodiabetestipoI
ylesionesenlamdulaespinal(Hwangycol2004).Sin
embargo,elmismoinvestigadordeclarposteriormente
quesutrabajopublicadoenlarevistaSciencehabasido
unengao,aunquesulaboratorioposealatecnologay
capacidadesparallegarahacerlo.
Unaformadeevitarlautilizacindeembrionesclonados
sonlosresultadospromisoriosquerevelanqueambosga-
metos,ovocitosyespermatozoides,puedenpotencialmente
derivarsedesdeclulasmadreembrionariascrecidasinvitro
(Hubnerycol2003,Toyookaycol2003,Geijsenycol
2004).Otraestrategiaparagenerarlneasdeclulasmadre
embrionariasisognicasconsisteenlafusindeclulas
somticas con clulas madre embrionarias, mtodo que
hapermitidogenerarlneascelulareshbridasconcierta
conservacindelapluripotencialidad(Tadaycol2001).
Msrecientemente,investigadoresdelInstitutoAdvanced
CellTechnologydeEE.UU.
3
describieronunmtodoalter-
nativoparaestablecerclulasmadreembrionariasusando
unatcnicadebiopsiadeclulasembrionarias,similara
lautilizadaparadiagnsticogenticopreimplantacional,
quenointerfiereconelpotencialdesarrollodelembrin.
En este caso, blastmeras individuales fueron extradas
desde un embrin de ratn y/o humano a partir de las
cuales se desarrollaron clulas madre embrionarias que
semantuvieronencultivopormsdeochomeses,mos-
trandouncariotiponormalylosmarcadoresclsicosde
pluripotencia,incluyendoOct-4,SSEA-3,SSEA-4,TRA
(delinglsTcellReceptorAlpha)-1-60,TRA-1-81,Nanog
y fosfatasa alcalina (Chung y col 2006, Klimanskaya y
col2006).
CONCLUSIN
La gran variedad de lneas de clulas madre em-
brionarias humanas y de otras especies disponibles
actualmentehapermitidounmayorconocimientodela
fisiologa de estas clulas incluyendo aspectos claves
http://www.advancedcell.com/
de su regulacin y diferenciacin in vitro.A pesar de
queactualmentenoexistenterapiasbasadasenclulas
madreembrionariasensereshumanos,puessenecesita
demsinvestigacionesyensayosclnicosantesdeque
estndisponibles,lagranpromesadeestasclulasreside
enlaposibilidaddeencontrarcuraotratamientosms
eficacesaenfermedadescrnicascomodiabetes,cncer,
Alzheimer,Parkinsonyenfermedadescardiovasculares,
debidoalacapacidaddeestasclulasparacrecerinde-
finidamente y diferenciarse in vitro en mltiples tipos
celularesy/otejidos.Sinembargo,noobstanteelpoten-
cial que encierran estas clulas, an persisten grandes
desafosporsuperarantesdequepuedanserutilizadas
efectivamenteenterapiascelulares,particularmentelos
motivadosporpreocupacionesticasypolticas.Sehace
evidenteentonceslanecesidaddeseguirinvestigandoen
laderivacinycaracterizacindeestasclulasenotras
especiesanimales,antesdequepodamosvercumplidas
lasgrandesexpectativasquesehangeneradoentornoa
susprometedorasaplicaciones.
RESUMEN
Lasclulasmadreembrionarias(ESCdelingls,EmbryonicStemCells)
sonclulasindiferenciadasquederivandelamasacelularinterna(MCI)
deembrionesenestadodeblastocisto.Estasclulassecaracterizanporsu
habilidadparacrecerindefinidamenteinvitroyconservarlacapacidadde
diferenciarsehaciatodoslostiposcelularesdeunindividuo.Lasclulas
madre embrionarias se han constituido en una poderosa herramienta
paraestudiosdeldesarrolloembrionario,genmicafuncional,parala
generacindeanimalestransgnicosvarecombinacinhomlogayms
recientementeenclonacinymedicina.Debidoasupotencialaplicacin
enlamanipulacinespecficadegenes,elaislamientodeestasclulasen
especiesdomsticascomoelcerdoyelbovinopodratenernumerosas
aplicacionesagropecuarias,farmacuticasybiomdicas.Msan,las
actualesinvestigacionesdesarrolladasacercadesuspropiedadesbiolgicas
ysobresusposiblesaplicacionesenmedicinaregenerativa,debidoal
enormepotencialdereparacinqueencierran,estnabriendograndes
posibilidadesquepermitirn,enunfuturonomuylejano,disponerde
revolucionariasterapiasparadiversasenfermedadeshumanasquehoy
endasonincurables.Enestarevisinsedescribenaspectosgenerales
del aislamiento, derivacin, cultivo, transformacin y diferenciacin
deestasclulasendiferentesespeciesascomotambinalgunasdesus
potencialesaplicacionesenbiomedicina.
AGRADECIMIENTOS
La recopilacin de material bibliogrfico as como tambin los
costosdepublicacindeesteartculofueronfinanciadosporproyecto
FONDECYT1080216.
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