-* CON EL MICROSCOPIO DE LUZ SE RESUELVEN DETALLES DEL ORDEN DEL MICRN,

MIENTRAS QUE CON EL MICROSCOPIO ELECTRNICO SE ALCANZAN A RESOLVER OBJETOS

DEL ORDEN DE LOS ANGSTROM.
-* LA MANERA DE ILUMINAR DEFINE LA CALIDAD DE LA IMAGEN OBTENIDA.
-* CARACTERSTICA BSICA EN LA CUAL DIFIEREN LOS ORGANELOS INTRACELULARES ES
SU NDICE DE REFRACCIN.
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MICROSCOPA
Los diversos elementos que existen en la naturaleza, presentan tamaos, formas y
composiciones distintas, la mayora de ellas pueden verse, algunas a simple vista,
y otras mediante instrumentos.
Natura!"a #! a Lu"$
La luz blanca est constituida por varios colores diferentes (Isaac e!ton", esta
forma parte del espectro electromagn#tico. $uede ser descrita mediante dos
modelos%
$or su forma de propagaci&n, naturaleza ondulatoria ('ames (ler)
*ax!ell"
$or su forma de interactuar con la materia, naturaleza corpuscular &
fot&nica (+lbert ,instein"
La luz visible forma parte de una estrec-a fran.a que va desde longitudes de onda
de /00 nm (violeta% corta" -asta los 100 nm (ro.o% larga" 0./ 2 0.1 mm.
M%&r'(&')%' #! Lu" ' M%&r'(&')%' )t%&' *MO+$ ,l
microscopio de luz es un aparato &ptico usado para ampli3car y
resolver detalles 3nos de un ob.eto microsc&pico. ,l microscopio
&ptico tiene un lmite resoluci&n de cerca de 400 nm (0.4 5m".
,ste limite se debe a la longitud de onda de la luz (0./60.1 5m".
Las c#lulas observadas ba.o el microscopio &ptico pueden estar
vivas o 3.adas y teidas.
,st compuesto de diferentes partes%
*ecnica
,. Ba(! ' )%!% sirve de soporte al microscopio y suele tener el peso su3ciente
para darle estabilidad al aparato.
-. C'u./a% une la platina a la base y sostiene al condensador y al diafragma.
0. Tu1'% sostiene al ocular y al ob.etivo y los mantiene separados por la distancia
de traba.o correcta.
2. Bra"'% continuaci&n de la base o pie que permite movilizar al microscopio con
la mano.
3. Pat%/a% sostiene las preparaciones con la muestra colocadas sobre una
perforaci&n central que de.a pasar la luz que viene del condensador o del espe.o.
4. P%/"a(% sostienen a la lmina portaob.eto con 3rmeza sobre la platina.
5. R!6'6!r% permite colocar en posici&n de traba.o, alternativamente, los
ob.etivos que posee el microscopio.
7. T'r/%' .a&r'.8tr%&'% mueve la platina -acia arriba o -acia aba.o, acercando
o ale.ando rpidamente el ob.etivo a la distancia de traba.o aproximada con
respecto a la muestra.
9. T'r/%' .%&r'.8tr%&'% permite mover lentamente y con precisi&n el tubo
-acia la platina o viceversa.
7ptica
,:. O&uar!(% compuestos por lentes que multiplican el aumento del ob.etivo.
,stn ubicados en la parte superior del tubo. 8n buen ocular (90x" puede permitir
un aumento total de 9000x.
:I$;< =, L,:,<
(;>,?@,:
,<
(I*+@,
?,+L"
Aorman imgenes reales
donde el ob.eto est
fuera del plano focal, y la
imagen se forma detrs
de la lente, se observa
aumentada e invertida.
=I>,?@,:,<
(I*+@,
>I?:8+L"
Aorman imgenes
virtuales donde el ob.eto
est dentro del plano
focal, la imagen se forma
delante de la lente y se
observa aumentada pero
; invertida.
,,. O1;!t%6'(% compuesto por lentes de diferente aumento. <e encuentran
ubicados en la parte inferior del tubo (sistema de revolver". ormalmente un
microscopio de luz dispone de tres lentes ob.etivo% 90B, /0B y 900B,
independientes e intercambiables. (ada uno de ellos tiene un aumento dado, y su
prop&sito es magni3car el ob.eto para producir una imagen real que se proyecta
-asta el plano focal del ocular. ,sta imagen, a su vez, es magni3cada por el ocular
para producir la imagen virtual, que es vista por el o.o de observador. ,l ob.etivo
de 90B es el ms corto de los tres, le sigue el de longitud intermedia con un
aumento de /06/CB. ,l ms largo de todos es el ob.etivo de inmersi&n que tiene un
aumento de 900B. ,l nDmero del aumento lo tienen inscrito en su parte lateral. La
distancia focal de cada uno de ellos es de aproximadamente 9E mm, / mm y 9.F
mm respectivamente. =istancias focales con los tres ob.etivos ms comDnmente
utilizados Inmersi&n, /0 B y 90 B
=e iluminaci&n
,-. <u!/t! #! u"% puede utilizarse luz arti3cial de una lmpara externa o una
que se inserta en la base o pie del microscopio. (uando se utiliza la lmpara
externa se requiere de un espe.o.
,0. E()!;'% lo requieren aquellos microscopios que traba.an con lmparas
externas y permite reGe.ar -acia arriba la luz que debe atravesar el diafragma, la
platina, la preparaci&n y el sistema &ptico. ,l espe.o plano se utiliza cuando -ay
bastante luz y el c&ncavo cuando -ay poca luz.
,2. C'/#!/(a#'r% concentra el -az luminoso en la preparaci&n.
,3. D%a=ra>.a% regula la cantidad de luz que pasar a trav#s de la preparaci&n.
;cula
r
:ub
o
?evolver
(olum
na
:ornillo
macrom#trico
:ornillo
microm#trico
;b.etiv
o
$inzas
su.etadoras
$latin
a
$latin
a
=iafrag
ma
(ondensad
or
Hot&n de
(ontrol de
Iluminaci&n
Has
e
Sistema
ptico
OCULAR
Lente situada cerca
del ojo del
observador. Ampla
la imagen del
objetivo.
OBJET!O
Lente situada
cerca del la
preparaci"n#
Ampla la imagen
de $sta.
CO%&E%'A&OR
Lente (ue concentra
los ra)os luminosos
sobre la preparaci"n.
&A*RA+,A
Regula la cantidad
de lu- (ue entra en
el condensador.
*OCO
&irige los ra)os
luminosos .acia el
condensador.
Sistema
mecnico
'O/ORTE
,antiene la parte
"ptica. Tiene dos
partes0 el pie ) la
columna.
/LAT%A
Lugar donde se
deposita la
preparaci"n.
TUBO
Contiene los sistemas
de lentes
RE!1L!ER
/ermite2 al girar2
cambiar los
objetivos.
TOR%LLO' &E
E%*O3UE
Macromtrico (ue
apro4ima el
en5o(ue )
micromtrico (ue
consigue el
en5o(ue correcto.
AMPLI<ICACIN$ AUMENTO DEL TAMA?O DE LA IMAGEN.
AMPLI<ICACIN TOTAL$ DADO POR EL PRODUCTO DE LA LENTE OCULAR POR EL
OBJETIVO.
AMPLI<ICACIN VACA$ INCREMENTO DE LA IMAGEN SIN QUE PUEDA PERCIBIRSE
MA@ORES DETALLES.
BIRRE<RINGENCIA$ DESDOBLAMIENTO DE UN RA@O LUMINOSO CUANDO SE PROPAGA EN
UN MEDIO CU@AS PROPIEDADES DEPENDEN DE LA DIRECCIN DE AQUEL.
<LUOROCROMOS$ MOLACULAS QUMICAS QUE ABSORBEN LUZ A UNA DETERMINADA
LONGITUD DE ONDA @ EMITEN A OTRA DI<ERENTE.
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PODER DE RESOLUCIN$ ,l concepto de resoluci&n est relacionado con la
capacidad de distinguir detalles 3nos en una imagen. ,n otras palabras, es la
distancia mnima D a la cual podemos distinguir, claramente, dos puntos como
entidades separadas. La resoluci&n alcanzable por un microscopio est limitada
por la longitud de onda de la luz, segDn la sig. ,cuaci&n conde D es la distancia
mnima entre dos puntos de la muestra que la resoluci&n debe separar, es la
longitud de onda de la luz y es el ndice de refracci&n del medio. :eta es una
medida de la capacidad de la lente para concentrar la luz y se relaciona
directamente con su ngulo de curvatura. ,l lmite de resoluci&n para un
microscopio de luz es ligeramente menor a 0.4 micr&metros (0.44Im" & 400nm.
La ampli3caci&n total de un microscopio de luz es el producto de la ampli3caci&n
de dos sistemas de lentes (ocular y ob.etivo". =e la f&rmula anterior se puede
concluir que mientras ms corta es la longitud de onda empleada, ms pequea
ser la estructura visible. =ebido a que normalmente se utiliza una fuente de luz
visible, la longitud de onda promedio es constante y por lo tanto el poder de
resoluci&n depender de la apertura num#rica. <egDn su de3nici&n la apertura
num#rica est relacionada con el ndice de refracci&n del medio que -ay entre la
muestra y el ob.etivo. =ebido a que el ndice de refracci&n del aire es menor que el
del vidrio, los rayos luminosos se refractan o se desvan cuando pasan de la lmina
portaob.eto al aire. <i la mayora de los rayos luminosos se refractan en un ngulo
muy grande, se pierden para el ob.etivo. <i colocamos entre la lmina y el ob.etivo
de 900 B un aceite de inmersi&n que tenga un ndice de refracci&n
aproximadamente igual al del vidrio, disminuye la desviaci&n y un porcenta.e
mayor de rayos luminosos procedentes de la muestra pasarn directamente al
ob.etivo, consigui#ndose una mayor resoluci&n y una imagen ms clara, efecto del
aceite de inmersi&n para aumentar el poder de resoluci&n. ,n conclusi&n para
obtener la imagen de mayor aumento, ms ntida y con mayor poder de resoluci&n
se debe%
=isponer de lentes de &ptima calidad.
=isponer de oculares de gran aumento.
:raba.ar con el ob.etivo de inmersi&n.
8tilizar aceite de inmersi&n de buena calidad.
VARIEDADES DEL MICROSCOPIO DE LUZ @ SUS APLICACIONES
,. (ampo claro, brillante o luminoso% La luz proveniente de la fuente converge
sobre la muestra se forma un campo brillante alrededor de la imagen de la
muestra. ,l contraste lo provee la tinci&n de las muestras ya que el material
a observar se colorea con colorantes espec3cos que aumentan el contraste
y revelan detalles que no aprecian de otra manera. <e utilizan 4 tipos de
preparaciones%
-* TEMPORALES% *uestra J(olorante J*edio de *onta.e
-* <IJAS% *uestra J Ai.adores J :inci&n J *edio de *onta.e
La tinci&n de @ram es la ms importante de las tinciones diferenciales. Las
c#lulas @ram positivo o retienen el cristal violeta cuando se tratan con etanol
mientras que las @ram negativo o no lo tienen y se tien entonces del color
ro.o de la safranina.
-. (ampo ;scuro% 8tiliza una luz muy intensa en forma de un cono -ueco
concentrado sobre el esp#cimen. ,l campo de visi&n del ob.etivo se
encuentra en la zona -ueca del cono de luz y s&lo recoge la luz que se reGe.a
en el ob.eto. $or ello las porciones claras del esp#cimen aparecen como un
fondo oscuro y los ob.etos minDsculos que se estn analizando aparecen
como una luz brillante sobre el fondo. ,sta forma de iluminaci&n se utiliza
para analizar elementos biol&gicos transparentes y sin manc-as, invisibles
con iluminaci&n normal.
0. (ontraste de Aases% (onvierte la diferencia de ndices de refracci&n en
diferencias de intensidad (brillo y oscuridad relativas". ,sta conversi&n
depende de la capacidad de las ondas de luz para interactuar entre s,
propiedad denominada interferencia. $ermite observar muestras vivas, o
carentes de color. <e usa principalmente para aumentar el contraste entre
las partes claras y oscuras de las c#lulas sin colorear. ,s ideal para
especmenes delgados, o c#lulas aisladas. +centDa la diferencia entre el
ndice de refracci&n de las c#lulas y del medio, incrementando el contraste
de c#lulas translDcidas, sin uso de colorantes. ,n el microscopio de fase el
cono de luz es ms estrec-o que en el de campo oscuro, y entra en el campo
de visi&n del ob.etivo, que contiene un dispositivo en forma de anillo que
reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la
longitud de onda. ,ste tipo de iluminaci&n provoca variaciones minDsculas en
el ndice de refracci&n de un esp#cimen transparente, -aci#ndolo visible.
2. Aluorescencia% 8tiliza mol#culas Guorescentes que con radiaci&n invisible,
emiten radiaci&n visible. 8tiliza luz de longitud de onda corta (8>" para
excitar los electrones de la muestra. La muestra se KtieL con una sustancia
Guorescente (fuorocromos" que absorbe la energa de las ondas cortas de la
luz y emite la luz de longitudes de ondas ms largas (verde".
3. Luz $olarizada (microscopa diferencial de contraste de interferencia% =I(" %
<e basa en la birrefringencia de los ob.etos. 8sa luz polarizada plana. Las
muestras se colocan entre dos lminas polaroid que tienen sus direcciones
de vibraci&n perpendiculares. 8tiliza dos rayos de luz polarizada y las
imgenes combinadas aparecen como si la c#lula estuviera proyectando
sombras -acia un lado. Aue diseado para observar relieves de especmenes
muy difciles de mane.ar, es muy utilizado en los tratamientos de fertilizaci&n
in6vitro actuales. =I( se usa cuando el esp#cimen es muy grueso para usar
contraste de fases. 8tiliza 3ltros polarizantes para observar estructuras con
birrefringencia (emite brillantez". ,n el microscopio polarizante los minerales
presentan numerosas propiedades &pticas de gran ayuda para su estudio
que no se mani3estan en el microscopio de campo claro por ser
birrefringentes.
4. (onfocal% (ombina la microscopa Guorescente con el anlisis electr&nico de
la imagen para obtener imgenes tridimensionales. 8tiliza muestras de
cortes seriados, teidas con Guorescencia, para reconstruir una imagen
tridimensional.
5. ;tras dos variantes son%
Contraste Modulado de Hofman De Iluminacin Rheinberg
MICROSCOPA ELECTRNICA
P'#!r #! R!('u&%B/: =ebido a que el microscopio electr&nico utiliza electrones
y los electrones tienen una longitud de onda de 0.00/nm (900,000 ms corta que
la de la luz", pueden mostrar estructuras muc-o ms pequeas, por lo que
presentan alto poder de resoluci&n. May dos tipos
bsicos de *icroscopios ,lectr&nicos%
*icroscopio de transmisi&n electr&nico (*:,"
*icroscopio electr&nico de barrido (<canning
,lectron *icroscope% <,*" o :ridimensional (*,:"
,. *icroscopa de transmisi&n% 8n *,: mira c#lulas
muertas, despu#s de -aber sido 3.adas y teidas con
iones de metales pesados. Los electrones son
dispersados cuando pasan a traves de una 3na secci&n del esp#cimen, y luego
detectados y proyectados -acia una imagen sobre una pantalla Guorescente.
Lmite de ?esoluci&n de 9 a 4nm. $ermite la observaci&n de muestra en cortes
ultra3nos. $ara utilizar un *:, debe cortarse la muestra en capas 3nas, no
mayores de un par de miles de angstroms. <e coloca una placa fotogr3ca o una
pantalla Guorescente detrs del ob.eto para registrar la imagen aumentada. Los
microscopios electr&nicos de transmisi&n pueden aumentar un ob.eto -asta un
mill&n de veces. ,ntre las aplicaciones del :,* para el estudio de materiales no6
biol&gicos y biol&gicos podemos nombrar%
9. =eterminaci&n de estructura cristalina en minerales, metales, etc.
4. ,studio de catalizadores.
N. =eterminaci&n de impurezas, precipitados, etc.
/. Identi3caci&n de bordes de grano e interfaces en metales.
C. ,studio de fases y zonas cristalinas en polmeros.
E. =eterminaci&n de tamao de partcula en catalizadores, minerales, etc.
1. Identi3caci&n de planos cristalinos.
F. (ambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos
t#rmicos.
O. ?ealizaci&n de estudios de -istoqumica para identi3car compuestos
espec3cos.
90. ,studios de ultraestructura de te.idos vegetales y animales.
99. ?econocimiento de virus.
94. ,studios de citoqumica.
9N. ,studios de estructuras moleculares.
-. *icroscopa de Harrido o tridimensional% Los electrones
c-ocan (barren" con la muestra, en lugar de atravesarla.
$roduce imgenes tridimensionales de la super3cie del
ob.eto. Lmite de ?esoluci&n de 90nm. (rea una imagen
ampliada de la super3cie de un ob.eto. o es necesario
cortar el ob.eto en capas para observarlo, sino que puede
colocarse en el microscopio con muy pocos preparativos. <u
funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un -az
muy concentrado de electrones, de forma parecida al
barrido de un -az de electrones por la pantalla de una
televisi&n. Los electrones del -az pueden dispersarse de la
muestra o provocar la aparici&n de electrones secundarios. Los electrones perdidos
y los secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electr&nico situado a
los lados del esp#cimen. (ada punto ledo de la muestra corresponde a un pxel en
un monitor de televisi&n. (uanto mayor sea el nDmero de electrones contados por
el dispositivo, mayor ser el brillo del pxel en la pantalla. + medida que el -az de
electrones barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor.
Los microscopios electr&nicos de barrido pueden ampliar los ob.etos 400.000 veces
o ms. *ediante el <,* se estudian%
9. *orfologa super3cial de minerales, catalizadores, etc.
4. ,lectrodep&sitos
N. +d-erencia 3bra6matriz en polmeros.
/. (ambios morfol&gicos de materiales sometidos a tratamientos qumicos.
C. Aormas de cristalizaci&n de minerales.
E. (ontrol de calidad de catalizadores industriales.
1. *orfologa super3cial interna de partculas polim#ricas.
F. *orfologa de te.idos u &rganos animales y vegetales.
O. ,studio de mol#culas
90. ?econocimiento de f&siles.
COMPARACION ENTRE MICROSCOPIOS DE LUZ @ ELECTRONICO
Los microscopios de luz y electr&nico son esencialmente, id#nticos. :anto uno
como otro nos permiten ampli3car aquellos ob.etos que son indistinguibles a
nuestro o.o. La diferencia fundamental entre los dos es la fuente de iluminaci&n.
*ientras el microscopio de luz utiliza un -az de luz en el rango de las longitudes
de onda del visible, el microscopio electr&nico emplea un -az de electrones de
muy corta longitud de onda que permite obtener una mayor resoluci&n. La sig.
:abla involucra caractersticas generales de los microscopios electr&nicos y no
considera las diferencias particulares entre :,* y <,*.
MICROSCOPIO
DE LUZ
MICROSCOPIO
ELECTRONICO
Iluminacin Haz de luz Haz de electrones
Longitud de onda 2000 - 7500 0.037 - 0.086
Lentes Vidrio Electromagnticas
Medio Atms!era Vac"o
Resolucin 2000 3
Magnificacin #0 $ - 2000 $ #00 $ - %50000 $
ocali!acin &ec'nica Elctrica
Cont"aste A(sorcin - )e!le$in *cattering
PREPARACIONES PARA MICROSCOPIA ELECTRNICA
T%/&%B/ P'(%t%6a$ Las muestras de te.ido se cortan en secciones 3nas y se
tien con sales de metales pesados como el tetra&xido de osmio, acetato de
uranilo y citrato de plomo. ,stos iones se unen a gran variedad de
estructuras celulares que aparecen oscuras en la imagen 3nal.
T%/&%B/ N!>at%6a$ ,l metal pesado se deposita sobre toda la re.illa que
sostiene la muestra, excepto en los sitios donde -ay partculas% <e coloca
una gota de soluci&n de tinci&n (acetato de uranilo o fosfotungstato de
potasio" sobre una re.illa que contiene las partculas que deben examinarse y
se permite evaporar la mayor parte de la gota -asta sequedad. (omo
consecuencia de la tensi&n super3cial, la tinci&n suele rodear la partcula
sobre la pelcula de apoyo y penetrar en todas las irregularidades abiertas en
la super3cie de la partcula.
S'.1r!a#' #! .!ta ' R8)%&a ('.1r!a#a (moldeado de sombra"% <e
emplean las partculas como ob.etos para moldear su sombra. Las plantillas
se colocan en una cmara sellada en donde se -a practicado el vaco. ,n la
cmara se encuentra un 3lamento compuesto de un metal pesado (de
ordinario platino" y carb&n. ,l 3lamento se calienta a temperatura elevada
provocando su evaporaci&n y dep&sito de un recubrimiento metlico sobre
las super3cies accesibles dentro de la cmara. ,l metal se deposita sobre las
super3cies enfrentadas al 3lamento, en tanto que las super3cies opuestas de
la muestra y el espacio que ocupa la re.illa en su sombra carecen de
revestimiento y no pueden dispersar electrones. Las reas dentro de la
sombra aparecen brillantes sobre la pantalla, en tanto que las regiones
revestidas de metal aparecen de color oscuro. ,sta relaci&n se invierte sobre
una placa fotogr3ca que es un negativo de la imagen. ,sto crea un efecto
de sombra que se -ace negativa en la placa fotogr3ca.
S!)ara&%B/ )'r &'/>!a&%B/ ' Cr%'=ra&tura$ :#cnica de preparaci&n de
muestras en la que estas se criogenizan y se realiza un corte sobre ellas. <e
realiza un sombreado con platino. ,sta t#cnica permite la observaci&n de las
membranas celulares. (ongelaci&n rpida con nitr&geno lquido a 69OEP( y
separaci&n con 3lo de un bistur.
Gra1a#' )'r &'/>!a&%B/ ' Cr%'>ra1a#'$ $ermite la observaci&n de las
super3cies externas de las membranas celulares adems de sus caras
internas, se evapora la capa de -ielo y luego se recubre con metal pesado.
R!&u1r%.%!/t' &'/ .!ta )!(a#'$ La super3cie celular se recubre con un
metal pesado y se utiliza un -az de electrones que barre toda la muestra,
obteni#ndose una imagen tridimensional. <e utiliza para estudiar c#lulas
completas.