Pondom AmpIified PoIymorphic DMA

AmpIificocion oIeoforio de ADM

poIimorfico
DIA0M
DIA0M

STICO 8ASADO EM LA
STICO 8ASADO EM LA
IMPPESI
IMPPESI

M DI0ITAL: PAPD
M DI0ITAL: PAPD
Tecnico PAPD's
Tombien se Ie conoce como AP-PCP o
PCP con primers orbifrorios
Es un mefodo poro creor impresion
digifoI genomico medionfe Io
ompIificocion por PCP en especies en
Ios cuoIes se conoce muy poco de su
secuencio ufiIi;ondo poro eIIo un
primer de secuencio orbifrorio
Los orregIos de frogmenfos de ADM
son generodos por ompIificocion
usondo primers orbifrorios que inicion
Io snfesis de ADM o porfir de sifios
genomicos en Ios cuoIes oporeon o cosi
oporeon
MormoImenfe se uso un soIo primer de
I0 nucIeofidos de Iongifud
EjempIo: OP-A0I
CAGGCCTTCA
Fundomenfos
Supone que exisfen por puro
probobiIidod esfodsfico,
suficienfes sifios de
reconocimienfo poro eI primer
disfribuidos de monero oIeoforio
en eI ADM bIonco
AmpIificocion de ADM ononimo con
primers de secuencio orbifrorio
Correspondencio enfre frogmenfos
ompIificodos y bondos en un geI
_
+
Obfencion de PAPD's
1 2
1
2
Origen deI poIimorfismo de Ios
PAPD's
1
2
3
4
5
1 2 3 4 5
Procedimienfo bosico poro
PAPDs
Obfener eI moferioI vegefoI
Exfroer eI ADM
PCP + EIecfroforesis + Fofogrofo
Obfener Io mofri; de resuIfodos
Inferprefor Ios resuIfodos
Progromo de PCP poro PAPDs
4b cicIos
94"C I min.
3o"C I min.
7Z"C Z min.
AmpIificocion
DesnofuroIi;ocion
Union primers
PoIimeri;ocion
Ventugus de Ios RAPD's
Anonimos: Mo requieren conocimienfo
previo deI genomo
Mo requiere mucho pure;o deI ADM
Ensoyo ropido, simpIe y borofo
Mmero iIimifodo de morcodores
PoIimorfismo eIevodo
AnoIi;on fodo eI genomo
Desventugus de Ios RAPD's
Herencio dominonfe
PeproducibiIidod infroIoboroforio
Inferprefocion de bondos
Tronsferencio o ofros Ioboroforios
ReproducibiIidud de RAPD's
Lo fecnico PAPDs es muy sensibIe o
oIferociones deI profocoIo
Es necesorio opfimi;orIo oI comien;o y no
combiorIo
Poromefros o confroIor:
-Morco de Io ADM poIimeroso
-Confidod y coIidod deI ADM
-Concenfrociones en Io me;cIo de reoccion
-Morco deI fermocicIodor
-Progromo de ompIificocion
-Condiciones de eIecfroforesis
Interpretucin de bundus
de RAPD's
Subjefividod
que bondos se incIuyen en eI onoIisis y
cuoIes no7
ProbIemos de Io co-migrocion:
- Uno bondo deI mismo fomoo en dos
individuos MO represenfo necesoriomenfe
eI mismo frogmenfo de ADM
- Uno bondo MO confiene necesoriomenfe un
nico frogmenfo de ADM
ApIicociones
EsfobIecimienfo de Io reIocion enfre y
denfro de especies (foxonomo
moIecuIor)
Idenfificocion de cepos
VoriobiIidod genefico
A
p
I
i
c
o
c
i
o
n
e
s
:

I
d
e
n
f
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d
o
d

v
o
r
i
e
f
o
I

e
n

p
o
p
o
PerfiIes de PAPDs de voriedodes
de vid (Vifis vinifero L.)
Primer OP-D03
PerfiIes de PAPDs de voriedodes
de vid (Vifis vinifero L.)
Primer OP-E0Z
AnIisis de ADN puru
curucterizur cepus de XyIeIIu
fustidiosu utiIizundo RAPD's
ANLISIS DE LOS PERFILES
ELECTROFORTICOS DE RAPD's
Los frogmenfos ompIificodos son onoIi;odos bosodos
en Io feoro de Io foxonomo numerico (Sneofh y
SokoI, I973).
Codo frogmenfo es considerodo un dofo de fipo
binorio, es decir que fiene dos esfodos,
presencio/ousencio.
Con bose en Io onferior se reoIi;o uno mofri; bosico
de dofos, en Io cuoI codo uno de Ios genofipos es
comporodo con eI resfo de Ios mismos incIuidos en Io
evoIuocion. A porfir de esfo mofri; se coIcuIon Ios
coeficienfes de osociocion de Dice Ios cuoIes miden
Ios coincidencios y diferencios.
Poro Ios coincidencios se obfiene eI ndice
de simiIifud (IS), coIcuIondo con bose en
eI nmero de frogmenfos comporfidos
enfre Ios dos oisIomienfos, dividido enfre
Io sumo de fodos Ios frogmenfos en Ios
dos oisIomienfos.
Poro eI coIcuIo de Ios diferencios, o Io
unidod se Ie resfo eI ndice de simiIifud (I-
IS).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 0 1 0 1 0 0 0 1
0 0 0 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 0 1 1 1 0 1 0
0 0 0 1 0 0 0 0 0 0
1 0 1 0 0 1 1 1 0 1
0 0 0 0 0 0 0 1 0 1
1 1 0 0 1 1 1 1 1 0
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
PerfiIes de PAPDs de voriedodes
de vid (Vifis vinifero L.)
Primer OP-D04
8ibIiogrofo
WeIsh, J. ond McCIeIIond. I990.
Fingerprinfing genomes using PCP wifh
orbifrory primers. MucI. Acids Pes.
I8:7ZI3-7ZI8.
WiIIioms, J.0.I., IubeIik, A.P., Livok, I.J.,
PofoIski, J.A., ond Tingey, S.V. I990. DMA
poIymorphisms ompIified by orbifrory
primers ore usefuI os o genefic morkers.
MucI. Acids Pes. I8:ob3I.
DIFERENCIACI
DIFERENCIACI

N DE ESPECIES DE
N DE ESPECIES DE
Trichogramma
Trichogramma
(HYMENOPTERA:
(HYMENOPTERA:
TRICHOGRAMMATIDAE) DE IMPORTANCIA COMO
TRICHOGRAMMATIDAE) DE IMPORTANCIA COMO
AGENTES DE CONTROL BIOL
AGENTES DE CONTROL BIOL

GICO DE PLAGAS
GICO DE PLAGAS
AGR
AGR

COLAS
COLAS
Murthu Putriciu Espu Murthu Putriciu Espu u Lunu AIegundro u Lunu AIegundro
Sonz Sonz Iez Hern Iez Hern ndez y Omur S, AIvurudo ndez y Omur S, AIvurudo
S S mez mez
Trichogramma spp
Identificacin
- Tamao pequeo (0.7-1.0 mm de longitud) (Pinto, 1998)
- Carencia de caractersticas de diagnstico suficiente
- Identificacin a travs de antenas (Pinto, 1998) y genitalias
de machos (Nagarkatti y Nagaraja, 1971).
- Genitalias similares (Pinto, 1998).
- No existe la identificacin de hembras (Pinto, 1996). - No existe la identificacin de hembras (Pinto, 1996).
- Reproduccin partenogentica (Pinto, 1998).
- Identificacin por especialistas (Stouthamer et al., 1999).
- Especies crpticas
OBJETIVO
Diferenciar a nivel gentico especies de
Trichogramma de importancia como agentes de
control de plagas agrcolas en regiones
representativas de Mxico, mediante la amplificacin
aleatoria de ADN polimrfico
Diferenciar a nivel gentico especies de
Trichogramma de importancia como agentes de
control de plagas agrcolas en regiones
representativas de Mxico, mediante la amplificacin
aleatoria de ADN polimrfico
Loboroforio de 0enefico
moIecuIor
FocuIfod de Agronomo
UAML
MATERIALES Y
MTODOS
Etruccin de DNA
Un especimen
b00 I de omorfiguodor TAE - 30 min.
Incubocion en I00 I de CheIex-I00 b7 y 3 I de
profeinoso I
o0 min o bo"C con ogifocion en vorfex codo Ib min.
Incubocion finoI o 9b"C duronfe I0 min
I. CPEPO8 Cd. Obregon VoIIe Yoqui (Lob) T. prefiosum
Z. LAPI8 CESA8E0 0fo. (Lob) T. pinfoi
3. Vefo Sfo Monico Torreon Cooh. (Lob) T. exiguum
4. LAPI8 CoIero, Zoc. (Lob) T. fuenfesi
b. ViIIonuevo, Zoc. (compo) T. deion
o. Los Mochis, Sin (compo) T. ofopoviriIio
Especies
REACCIONES TIPO RAPD
Z.b mI de ADM
Z.b mI de buffer PCP (I0X)
Z mI de MgCIZ
dMTPs 0.4 mM
40 pmoIes de primer
I unidod de en;imo Toq DMA poIimeroso
Progromo fermico:
(b min o 94"C, b min o 40 C, b min o 70 C) (30 cicIos de I min o
94 C, I min o bb C y Z min o 70 C) (I0 min o 70 C)
Primers oIeoforios
F-0I b'-AC0 0AT CCT 0-3'
F-03 b'-CCT 0AT CAC C-3'
F-04 b'-00T 0AT CA0 0-3'
F-0b b'-CC0 AAT TCC C-3'
F-0o b'-000 AAT TC0 0-3'
F-07 b'-CC0 ATA TCC C-3'
F-08 b'-000 ATA TC0 0-3'
F-09 b'-CCA A0C TTC C-3'
F-0I0 b'-00A A0C TT0 0-3'
A B
C
D D
E E E E E
F
G G
H H H
I J
K
L L M M M
N N N
O O
P P P P
Q Q
R R R
S
T
U U
D D
J J
AnIisis de geIes
Mofri; de presencio o ousencio de bondos
Mofri; de presencio o ousencio de bondos
MuIfivoriofe SfofisficoI
Pockoge MVSP 3.I (Iovoch
Compufing Services
Penfroefh, UI I999).
MuIfivoriofe SfofisficoI
Pockoge MVSP 3.I (Iovoch
Compufing Services
Penfroefh, UI I999).
Coefficiente de
Juccurd
Sg= D/{+C+D}
C~ bondos soIo en eI
segundo individuo
8~ bondos soIo en eI
primer individuo
D~ bondos comporfidos
Mefodo de ogrupomienfo UP0MA
Primer F-01 Primer F-05 Primer F-08
Primer F-04 Primer F-07 Primer F-010
Primer F-03 Primer F-06 Primer F-09
190 fragmentos polimrficos
Tallas de 100-1700 pb
ResuItudos
I. T. prefiosum
Z. T. pinfoi
3. T. exiguum
4. T. fuenfesi
b. T. deion
o. T. ofopoviriIio
UP0MA Coeficienfe de Joccord
T.atopovi T.atopovi T. deion T. deion T. pintoi T. pintoi T. pretios T. pretios T. fuente T. fuente (T. exigu) (T. exigu)
T.atopovi T.atopovi *** *** 0.233 0.233 0.109 0.109 0.150 0.150 0.125 0.125 0.113 0.113
T. deion T. deion 0.233 0.233 *** *** 0.096 0.096 0.114 0.114 0.132 0.132 0.132 0.132
T. pintoi T. pintoi 0.109 0.109 0.096 0.096 *** *** 0.218 0.218 0.074 0.074 0.094 0.094
T.
pretiosu
T.
pretiosu
0.150 0.150 0.114 0.114 0.218 0.218 *** *** 0.142 0.142 0.152 0.152
T.
fuentesi
T.
fuentesi
0.125 0.125 0.132 0.132 0.074 0.074 0.142 0.142 *** ***
0.937 0.937
T. exiguu T. exiguu 0.113 0.113 0.132 0.132 0.094 0.094 0.152 0.152 0.937 0.937 *** ***
TobIo I. Mofri; de simiIoridod enfre Ios o especies de
Trichogrommo en esfudio, con bose en Ios coeficienfes de
simiIoridod de Joccord.
TobIo I. Mofri; de simiIoridod enfre Ios o especies de
Trichogrommo en esfudio, con bose en Ios coeficienfes de
simiIoridod de Joccord.
Fig. 1 Agrupamiento de las seis especies de Trichogramma mediante el
coeficiente de similaridad de Jaccard y el mtodo de agrupamiento UPGMA