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ENZYMOLOGIE INHIBITIONS ENZYMATIQUES

Notes de cours

Casimir BLONSKI

Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d’Orsay - UMR 8182 Groupe de Chimie Bioorganique et Bioinorganique LabEx LERMIT Université Paris-Sud 11 Orsay

Inhibition enzymatique

• inactivation d’une enzyme (ralentissement de la réaction enzymatique) par la liaison d’une petite molécule

– différente que la dénaturation

Types d’inhibition

• réversible

– compétitive

– incompétitive

– noncompétitive

• irréversible

– par marqueur d’affinité

– par inhibition suicide

Leonor Michaelis (1875-1940) and Maud Leonora Menten

(1879-1960)

The kinetics of invertase activity

Biochemische Zeitschrift 49, 333 (1913)

invertase activity Biochemische Zeitschrift 49 , 333 (1913) Saturation curve for an enzyme showing the relation
invertase activity Biochemische Zeitschrift 49 , 333 (1913) Saturation curve for an enzyme showing the relation
invertase activity Biochemische Zeitschrift 49 , 333 (1913) Saturation curve for an enzyme showing the relation

Saturation curve for an enzyme showing the relation between the

concentration of substrate and rate.

Inhibition compétitive

• la liaison de l’inhibiteur, à l’enzyme libre, empêche la liaison du substrat

Enz
Enz
Enz S S I Enz I
Enz
S
S
I
Enz
I
k 1 , S k 2 E E•S E + P k -1 k k
k 1 , S
k 2
E
E•S
E
+
P
k -1
k
k i , I
-i
E•I

Exemple de l’inhibition competitive

l’acide malonique ressemble à l’acide succinique et inhibe la déhydrogénase de succinate lors de sa liaison :

l’acide malonique ressemble à l’acide succinique et inhibe la déhydrogénase de succinate lors de sa liaison
l’acide malonique ressemble à l’acide succinique et inhibe la déhydrogénase de succinate lors de sa liaison
l’acide malonique ressemble à l’acide succinique et inhibe la déhydrogénase de succinate lors de sa liaison

Équations pour l’inhibition comp.

Équations pour l’inhibition comp. Graphique d’inhibition compétitive Graphique Michaelis-Menten d'inhibition
Équations pour l’inhibition comp. Graphique d’inhibition compétitive Graphique Michaelis-Menten d'inhibition
Équations pour l’inhibition comp. Graphique d’inhibition compétitive Graphique Michaelis-Menten d'inhibition
Équations pour l’inhibition comp. Graphique d’inhibition compétitive Graphique Michaelis-Menten d'inhibition

Graphique d’inhibition compétitive

Graphique Michaelis-Menten d'inhibition compétitive

v = V max = k cat [E] 0 [I] = 0 [I] = K
v = V max = k cat [E] 0
[I] = 0
[I] = K i
[I] = 2 K i
V
[S]
max
v =
[I] 
[S]
+
K
1
+
M
K i 
K M app
K
K M app'
M
Vitesse, v
V max / 2

[S]

Graphique d’inhibition compétitive

Graphique Lineweaver-Burk d'inhibition compétitive

[I] = 2 K i [I] = K i [I] = 0 -1 / K
[I]
= 2 K i
[I]
= K i
[I] = 0
-1 / K M app'
-1 / K M app
-1 / K M
pente = K M / V max
1 / V max
0
1/[S]
1/v

1

=

K

M

1 +

[I]

K

i

1

+

1

v

V

max

[S]

V

max

Détermination de K i (compétitive)

K  i  ⋅ 1 + 1 v V max [S] V max Détermination de

Équation pour IC 50 (compétitive)

équations de vitesse lorsque [I comp ] = IC 50 :

Équation pour IC 5 0 (compétitive) • équations de vitesse lorsque [I c o m p
Équation pour IC 5 0 (compétitive) • équations de vitesse lorsque [I c o m p
Équation pour IC 5 0 (compétitive) • équations de vitesse lorsque [I c o m p
Équation pour IC 5 0 (compétitive) • équations de vitesse lorsque [I c o m p

Inhibition incompétitive

l’inhibiteur est lié par le complexe E•S

• l’inhibiteur est lié par le complexe E•S Exemple de l’inhibition incompétitive • inhibition de

Exemple de l’inhibition incompétitive

• inhibition de la phosphatase alkaline par la L- phénylalanine:

E•S Exemple de l’inhibition incompétitive • inhibition de la phosphatase alkaline par la L- phénylalanine: 9
E•S Exemple de l’inhibition incompétitive • inhibition de la phosphatase alkaline par la L- phénylalanine: 9
E•S Exemple de l’inhibition incompétitive • inhibition de la phosphatase alkaline par la L- phénylalanine: 9

Équations pour l’inhibition incomp.

Équations pour l’inhibition incomp. Graphique d’inhibition incompétitive Graphique Michaelis-Menten d'inhibition
Équations pour l’inhibition incomp. Graphique d’inhibition incompétitive Graphique Michaelis-Menten d'inhibition
Équations pour l’inhibition incomp. Graphique d’inhibition incompétitive Graphique Michaelis-Menten d'inhibition
Équations pour l’inhibition incomp. Graphique d’inhibition incompétitive Graphique Michaelis-Menten d'inhibition

Graphique d’inhibition incompétitive

Graphique Michaelis-Menten d'inhibition incompétitive

v = V max = k cat [E] 0 [I] = 0 [I] = K
v
= V max = k cat [E] 0
[I] = 0
[I] = K i
[I] = 2 K i
K M app
K
M
K M app'
[S]
V max app / 2
Vitesse, v
V max app ' / 2
V max / 2

v =

V [S] max  [I]   1 +    K  
V
[S]
max
[I] 
 1 +
K
i

[S] +

K M  [I]   1 +    K   i
K
M
[I] 
 1 +
K
i

Graphique d’inhibition incompétitive

Graphique d’inhibition incompétitive Détermination de K i (incompétitive) 11
Graphique d’inhibition incompétitive Détermination de K i (incompétitive) 11

Détermination de K i (incompétitive)

Graphique d’inhibition incompétitive Détermination de K i (incompétitive) 11

Équation pour IC 50 (incompétitive)

équations de vitesse lorsque [I incomp ] = IC 50 :

de vitesse lorsque [I i n c o m p ] = IC 5 0 :
de vitesse lorsque [I i n c o m p ] = IC 5 0 :

Inhibition non-compétitive

c o m p ] = IC 5 0 : Inhibition non-compétitive • l’inhibiteur est lié

• l’inhibiteur est lié par l’enzyme libre et par le complexe E•S

Exemple de l’inhibition non -comp. • inhibition de la bisphosphatase de fructose par le AMP

Exemple de l’inhibition non-comp.

• inhibition de la bisphosphatase de fructose par le AMP :

non -comp. • inhibition de la bisphosphatase de fructose par le AMP : Équations pour l’inhibition

Équations pour l’inhibition noncomp.

Inhibition non-compétitive simple • l’affinité de l’inhibiteur est indépendante de la présence de substrat (i.e.
Inhibition non-compétitive simple • l’affinité de l’inhibiteur est indépendante de la présence de substrat (i.e.
Inhibition non-compétitive simple • l’affinité de l’inhibiteur est indépendante de la présence de substrat (i.e.

Inhibition non-compétitive simple

• l’affinité de l’inhibiteur est indépendante de la présence de substrat (i.e. K i = K i ')

K M n’est pas affecté

– V max est diminué par le facteur de

  1 +

[I]

i

K

'

Graphique d’inhibition non-compétitive simple Graphique Michaelis-Menten d'inhibition noncompétitive simple v = V
Graphique d’inhibition non-compétitive simple Graphique Michaelis-Menten d'inhibition noncompétitive simple v = V

Graphique d’inhibition non-compétitive simple

Graphique Michaelis-Menten d'inhibition noncompétitive simple

v = V max = k cat [E] 0 [I] = 0 [I] = K
v = V max = k cat [E] 0
[I] = 0
[I] = K i
[I] = 2 K i
K
M
Vitesse, v
V max app' / 2 V max app / 2
V max / 2

[S]

v =

V [S] max  [I]   1 +    K  
V
[S]
max
[I] 
 1 +
K
i
[S] + K
M

Graphique d’inhibition non-compétitive simple

Détermination de K i (non-compétitive simple) • équation pour la diminution de V m a
Détermination de K i (non-compétitive simple) • équation pour la diminution de V m a

Détermination de K i (non-compétitive simple)

• équation pour la diminution de V max :

K i (non-compétitive simple) • équation pour la diminution de V m a x : Inhibition

Inhibition non-compétitive mixte

• l’affinité de l’inhibiteur dépend de la présence de substrat (i.e. K i K i ')

– V max est toujours diminué par le facteur de

K M est affecté selon K i et K i '

  1 +

[I]

i

'

K

'   1 +   [I]     i ' K Inhibition
'   1 +   [I]     i ' K Inhibition

Inhibition non-compétitive mixte

• lorsque K i < K i ', K M augmente et l’inhibition ressemble à l’inhibition compétitive :

lorsque K i < K i ', K M augmente et l’inhibition ressemble à l’inhibition compétitive
lorsque K i < K i ', K M augmente et l’inhibition ressemble à l’inhibition compétitive

Inhibition non-compétitive mixte

• lorsque K i > K i ', K M diminue et l’inhibition ressemble à l’inhibition incompétitive :

l’inhibition ressemble à l’inhibition incompétitive : Détermination de K i ' (non-compétitive mixte)
l’inhibition ressemble à l’inhibition incompétitive : Détermination de K i ' (non-compétitive mixte)

Détermination de K i ' (non-compétitive mixte)

• équation pour la diminution de V max :

Détermination de K i (non-compétitive mixte) • équation pour la variation de K M :

Détermination de K i (non-compétitive mixte)

• équation pour la variation de K M :

mixte) • équation pour la variation de K M : Équation pour IC 5 0 (non-comp.

Équation pour IC 50 (non-comp. simple)

• équations de vitesse lorsque [I noncomp ] = IC 50 :

20
20
20
20

Inhibition irreversible

• pour des inhibiteurs réversibles, on utilise le K i comme un indice de l’efficacité de l’inhibition

• pour les inhibiteurs irréversibles, on utilise le k inact et le

K I

• il y a deux types d’inhibiteurs irréversibles :

– réactifs du site actif (marquage par affinité)

– inhibiteurs basés sur le mécanisme suicide »)

(substrats «

Marqueurs par affinité

• démontrent la spécificité envers un groupement fonctionnel des acides aminés du site actif

– analogues de substrat pour favoriser sa liaison dans les site actif

– comprennent aussi un groupement réactif (pharmacophore) – typiquement un électrophile qui réagit avec un nucléophile dans le site actif

• possèdent un seul site saturable et réagissent de manière stœchiométrique (1 mol de I/mol de E)

Marquage par affinité

• l’enzyme est protégée contre cette inhibition par le substrat (ou co-facteur)

• la perte d’activité suit une cinétique de premier ordre, parce que l’enzyme est consommée comme un réactif pendant la réaction

• l’inhibition est accompagnée de la modification covalente de l’enzyme :

– l’enzyme demeure inactive après la séparation de l’excès de l’inhibiteur

– l’inhibiteur reste lié à la protéine après dialyse ou filtration sur gel (ou sur membrane) même après la dénaturation de l’enzyme

Exemples de marquage par affinité

TPCK (Tosyl phenylalanine chloromethyl ketone)

• ressemble un amide de la phénylalanine, mais le groupement chlorométhyle cétone effectue l’alkylation de la His57 de la chymotrypsine :

O O Cl CH 2 CH 2 Cl NH NH N N H O S
O
O
Cl
CH 2
CH 2
Cl
NH
NH
N
N
H
O
S
O
N
NH
O
S
O
Enz
Enz
CH 3
CH 3

DIFP (diisopropyl phosphofluoridate)

• réagit avec le groupement hydroxyle des résidus de sérine :

• réagit avec le groupement hydroxyle des résidus de sérine : O O P O F

O

O P O F HO
O
P
O
F
HO
• réagit avec le groupement hydroxyle des résidus de sérine : O O P O F

Enz

• réagit avec le groupement hydroxyle des résidus de sérine : O O P O F
O O P O F O Enz H
O
O
P O
F O
Enz
H

PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride)

• utilisé pour inhiber des protéases et réagit aussi avec des résidus de sérine :

protéases et réagit aussi avec des résidus de sérine : CH 2 O S O F

CH 2

O S O F HO Enz
O
S
O
F
HO
Enz
avec des résidus de sérine : CH 2 O S O F HO Enz O CH
O CH 2 S O F O H
O
CH 2
S
O
F O
H

Enz

Exemples de marquage par affinité

avec des résidus de sérine : CH 2 O S O F HO Enz O CH

Analyse cinétique

• liaison rapide à l’équilibre de l’inhibiteur suivie de la formation lente et irréversible d’un complexe inactif :

k 1 k -1
k
1
k
-1

k -1

k 1

k inact

complexe

covalent

E

+ I

E•I

E + I E•I E I

E

I

K I

=

inactif

• la proportion d’enzyme sous forme E•I augmente avec la concentration de I

• E•I s’inactive suivant une cinétique du premier ordre

Mesure de k inact

k inact peut être déterminée en mesurant la perte d’activité en fonction du temps (k obs ) à différentes concentrations d’inhibiteur :

100 [I] = 0 90 80 constante de vitesse = k obs 70 60 [I]
100
[I] = 0
90
80
constante de vitesse = k obs
70
60
[I] = 0.2 × K I
50
[I] = 0.5 × K I
40
[I] = K I
30
[I] = 2 × K I
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% activité

Temps (min)

27
27
27
27
27
27
27
28
28
29
29
29
30
30
30
30
30
31
31
31
31
31
31
32
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