UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

Laboratorio de Gentica

Prctica N1: MITOSIS Y PREPARACION DE MEDIO CULTIVO PARA
Drosophila melanogaster

I. OBJETIVOS

El alumno aprender las tcnicas necesarias para poder teir y observar las
distintas fases del proceso mittico.
Reconocer mediante vista microscpica las distintas etapas o fases de la mitosis en
clulas vegetales.
Conocer la elaboracin de un medio de cultivo y llevarla a cabo para que este en
ptimas condiciones para su uso.
Familiarizarse con los materiales que se utilizan para hacer un medio de cultivo
Aplicar los conocimientos obtenidos en el manejo de medios de cultivo y el clculo
de los materiales a utilizar dependiendo de cuanto medio se necesita.

II. INTRODUCCIN

La mitosis es un proceso por el cual el material gentico (ADN) se reparte
equitativamente, previa duplicacin, entre las dos clulas hijas producto de la divisin
celular, es caracterstico de las clulas eucarsticas. La duplicacin de material gentico
y organeros citoplasmticos tiene varias fases y para su estudio se ha dividido en:
profase, metafase, anafase, telofase y citocinesis, en esta prctica identificaremos
estas fases con ayuda del microscopio y mtodos de tincin, y as aprenderemos que
una mitosis completa produce clulas genticamente idnticas, lo cual es el
fundamento del crecimiento y la reparacin tisular.
Un medio de cultivo consiste en un gel o una solucin que cuenta con los nutrientes
necesarios para permitir la viabilidad de organismo o microorganismos.

III. FUNDAMENTO TEORICO
MITOSIS
La mitosis es el tipo de divisin celular por el cual se conservan los orgnulos y la
informacin gentica contenida en sus cromosomas, que pasa de esta manera a las
clulas hijas resultantes de la mitosis. La mitosis es igualmente un verdadero proceso de
multiplicacin celular que participa en el desarrollo, el crecimiento y la regeneracin del
organismo. Este proceso tiene lugar por medio de una serie de operaciones sucesivas
que se desarrollan de una manera continua, y que para facilitar su estudio han sido
separadas en varias etapas.


El resultado esencial de la mitosis es la continuidad de la informacin hereditaria de la
clula madre en cada una de las dos clulas hijas. El genoma se compone de una
determinada cantidad de genes organizados en cromosomas, hebras de ADN muy
enrolladas que contienen la informacin gentica vital para la clula y el organismo.
Dado que cada clula debe contener completa la informacin gentica propia de su
especie, la clula madre debe hacer una copia de cada cromosoma antes de la mitosis,
de forma que las dos clulas hijas reciban completa la informacin. Esto ocurre durante
la fase S de la interfase, el perodo que alterna con la mitosis en el ciclo celular y en el
que la clula entre otras cosas se prepara para dividirse.
Tras la duplicacin del ADN, cada cromosoma consistir en dos copias idnticas de la
misma hebra de ADN, llamadas cromtidas hermanas, unidas entre s por una regin
del cromosoma llamada centrmero. Cada cromtida hermana no se considera en esa
situacin un cromosoma en s mismo, sino parte de un cromosoma que
provisionalmente consta de dos cromtidas.
En animales y plantas, pero no siempre en hongos o protistas, la envoltura nuclear que
separa el ADN del citoplasma se desintegra, desapareciendo la frontera que separaba el
contenido nuclear del citoplasma. Los cromosomas se ordenan en el plano ecuatorial de
la clula, perpendicular a un eje definido por un huso acromtico. ste es una estructura
citoesqueltica compleja, de forma ahusada, constituido por fibras que son filamentos
de microtbulos. Las fibras del huso dirigen el reparto de las cromtidas hermanas, una
vez producida su separacin, hacia los extremos del huso. Por convenio cientfico, a
partir de este momento cada cromtida hermana s se considera un cromosoma
completo, y empezamos a hablar de cromosomas hermanos para referirnos a las
estructuras idnticas que hasta ese momento llambamos cromtidas. Como la clula se
alarga, las fibras del huso tiran por el centrmero a los cromosomas hermanos
dirigindolos cada uno a uno de los polos de la clula. En las mitosis ms comunes,
llamadas abiertas, la envoltura nuclear se deshace al principio de la mitosis y se forman
dos envolturas nuevas sobre los dos grupos cromosmicos al acabar. En las mitosis
cerradas, que ocurren por ejemplo en levaduras, todo el reparto ocurre dentro del
ncleo, que finalmente se estrangula para formar dos ncleos separados.
Se llama cariocinesis a la formacin de los dos ncleos con que concluye habitualmente
la mitosis. Es posible, y ocurre en ciertos casos, que el reparto mittico se produzca sin
cariocinesis (endomitosis) dando lugar a un ncleo con el material hereditario duplicado
(doble nmero de cromosomas).
La mitosis se completa casi siempre con la llamada citocinesis o divisin del
citoplasma. En las clulas animales la citocinesis se realiza por estrangulacin: la clula
se va estrechando por el centro hasta que al final se separa en dos. En las clulas de las
plantas se realiza por tabicacin, es decir, las clulas hijas construyen una nueva
regin de pared celular que dividir la una de la otra dejando puentes de citoplasma
(plasmodesmos). Al final, la clula madre se parte por la mitad, dando lugar a dos
clulas hijas, cada una con una copia equivalente y completa del genoma original.
Cabe sealar que las clulas procariotas experimentan un proceso similar a la mitosis
llamado fisin binaria. No se puede considerar que las clulas procariotas experimenten
mitosis, dado que carecen de ncleo y nicamente tienen un cromosoma sin
centrmero.
[5]

Fases del ciclo celular
La divisin de las clulas eucariticas es parte de un ciclo vital continuo, el ciclo
celular, en el que se distinguen dos perodos mayores, la interfase, durante la cual se
produce la duplicacin del ADN, y la mitosis, durante la cual se produce el reparto
idntico del material antes duplicado. La mitosis es una fase relativamente corta en
comparacin con la duracin de la interfase.
Interfase
La clula est ocupada en la actividad metablica preparndose para la mitosis (las
prximas cuatro fases que conducen e incluyen la divisin nuclear). Los cromosomas
no se disciernen claramente en el ncleo, aunque una mancha oscura llamada
nucleolo, puede ser visible. La clula puede contener un centrosoma con un par de
centriolos (o centros de organizacin de microtbulos en los vegetales) los cuales son
sitios de organizacin para los microtbulos.
Profase

Los dos centros de origen de los microtbulos (en verde) son los centrosomas. La
cromatina ha comenzado a condensarse y se observan las cromtidas (en azul). Las
estructuras en color rojo son los cinetocoros. (Micrografa obtenida utilizando
marcajes fluorescenteses).
Es la fase ms larga de la mitosis. Se produce en ella la condensacin del material
gentico (ADN, que en interfase existe en forma de cromatina), para formar unas
estructuras altamente organizadas, los cromosomas. Como el material gentico se ha
duplicado previamente durante la fase S, los cromosomas replicados estn formados
por dos cromtidas, unidas a travs del centrmero por molculas de cohesinas.

Uno de los hechos ms tempranos de la profase en las clulas animales es
duplicacin del centrosoma; los dos centrosomas hijos (cada uno con dos centriolos)
migran entonces hacia extremos opuestos de la clula. Los centrosomas actan como
centros organizadores de microtbulos, controlando la formacin de unas estructuras
fibrosas, los microtbulos, mediante la polimerizacin de tubulina soluble. De esta
forma, el huso de una clula mittica tiene dos polos que emanan microtbulos.
En la profase tarda desaparece el nuclolo y se desorganiza la envoltura nuclear.
Prometafase
La membrana nuclear se desensambla y los microtbulos invaden el espacio nuclear.
Esto se denomina mitosis abierta, y ocurre en una pequea parte de los organismos
multicelulares. Los hongos y algunos protistas, como las algas o las tricomonas,
realizan una variacin denominada mitosis cerrada, en la que el huso se forma dentro
del ncleo o sus microtbulos pueden penetrar a travs de la membrana nuclear
intacta.
Cada cromosoma ensambla dos cinetocoros hermanos sobre el centrmero, uno en
cada cromtida. Un cinetocoro es una estructura proteica compleja a la que se anclan
los microtbulos. Aunque la estructura y la funcin del cinetocoro no se conoce
completamente, contiene varios motores moleculares, entre otros componentes.
Cuando un microtbulo se ancla a un cinetocoro, los motores se activan, utilizando
energa de la hidrlisis del ATP para "ascender" por el microtbulo hacia el
centrosoma de origen. Esta actividad motora, acoplada con la
polimerizacin/despolimerizacin de los microtbulos, proporcionan la fuerza de
empuje necesaria para separar ms adelante las dos cromtidas de los cromosomas.
Cuando el huso crece hasta una longitud suficiente, los microtbulos asociados a
cinetocoros empiezan a buscar cinetocoros a los que anclarse. Otros microtbulos no
se asocian a cinetocoros, sino a otros microtbulos originados en el centrosoma
opuesto para formar el huso mittico. La prometafase se considera a veces como
parte de la profase.
Metafase
A medida que los microtbulos encuentran y se anclan a los cinetocoros durante la
prometafase, los centrmeros de los cromosomas se congregan en la "placa
metafsica" o "plano ecuatorial", una lnea imaginaria que es equidistante de los dos
centrosomas que se encuentran en los dos polos del huso. Este alineamiento
equilibrado en la lnea media del huso se debe a las fuerzas iguales y opuestas que se
generan por los cinetocoros hermanos. El nombre "metafase" proviene del griego
que significa "despus."
Dado que una separacin cromosmica correcta requiere que cada cinetocoro est
asociado a un conjunto de microtbulos (que forman las fibras cinetocricas), los
cinetocoros que no estn anclados generan una seal para evitar la progresin
prematura hacia anafase antes de que todos los cromosomas estn correctamente
anclados y alineados en la placa metafsica. Esta seal activa el checkpoint de
mitosis
Anafase
Cuando todos los cromosomas estn correctamente anclados a los microtbulos del
huso y alineados en la placa metafsica, la clula procede a entrar en anafase (del
griego que significa "arriba", "contra", "atrs" o "re-").
Entonces tienen lugar dos sucesos. Primero, las protenas que mantenan unidas
ambas cromatidas hermanas (las cohesinas), son cortadas, lo que permite la
separacin de las cromtidas. Estas cromtidas hermanas, que ahora son cromosomas
hermanos diferentes, son separados por los microtbulos anclados a sus microtbulos
al desensamblarse, dirigindose hacia los centrosomas respectivos.
A continuacin, los microtbulos no asociados a cinetocoros se alargan, empujando a
los centrosomas (y al conjunto de cromosomas que tienen asociados) hacia los
extremos opuestos de la clula. Este movimento parece estar generado por el rpido
ensamblaje de los microtbulos.
Estos dos estadios se denominan a veces anafase temprana (A) y anafase tarda (B).
La anafase temprana viene definida por la separacin de cromtidas hermanas,
mientras que la tarda por la elongacin de los microtbulos que produce la
separacin de los centrosomas. Al final de la anafase, la clula ha conseguido separar
dos juegos idnticos de material gentico en dos grupos definidos, cada uno
alrededor de un centrosoma.
Telofase
La telofase es la reversin de los procesos que tuvieron lugar durante profase y
prometafase. Durante la telofase, los microtbulos no unidos a cinetocoros continan
alargndose, estirando an ms la clula. Los cromosomas hermanos se encuentran
cada uno asociado a uno de los polos. La membrana nuclear se reforma alrededor de
ambos grupos cromosmicos, utilizando fragmentos de la membrana nuclear de la
clula original. Ambos juegos de cromosomas, ahora formando dos nuevos ncleos,
se descondensan de nuevo en cromatina. La cariocinesis ha terminado, pero la
divisin celular an no est completa.
Citocinesis
La citocinesis es un proceso independiente, que se inicia simultneamente a la
telofase. Tcnicamente no es parte de la mitosis, sino un proceso aparte, necesario
para completar la divisin celular. En las clulas animales, se genera un surco de
escisin (cleavage furrow) que contiene un anillo contrctil de actina en el lugar
donde estuvo la placa metafsica, estrangulando el citoplasma y aislando as los dos
nuevos ncleos en dos clulas hijas. Tanto en clulas animales como en plantas, la
divisin celular est dirigida por vesculas derivadas del aparato de Golgi, que se
mueven a lo largo de los microtbulos hasta la zona ecuatorial de la clula. En
plantas esta estructura coalesce en una placa celular en el centro del fragmoplasto y
se desarrolla generando una pared celular que separa los dos ncleos. El
fragmoplasto es una estructura de microtbulos tpica de plantas superiores, mientras
que algunas algas utilizan un vector de microtbulos denominado ficoplasto durante
la citocinesis. Al final del proceso, cada clula hija tiene una copia completa del
genoma de la clula original. El final de la citocinesis marca el final de la fase M.
Consecuencias de la mitosis
Mediante el proceso mittico, el material gentico se divide en dos ncleos idnticos,
con lo que las dos clulas hijas que resultan si se produce la divisin del citoplasma (ver
citocinesis) sern genticamente idnticas. Por tanto, la mitosis es un proceso de
divisin conservativo, ya que el material gentico se mantiene de una generacin celular
a la siguiente. La mayor parte de la expresin gnica se detiene durante la mitosis, pero
mecanismos epigenticos funcionan durante esta fase, para "recordar" los genes que
estaban activos en mitosis y transmitirlos a las clulas hijas.



MEDIO DE CULTIVO
Un medio de cultivo consiste en un gel o una solucin que cuenta con los nutrientes
necesarios para permitir (bajo condiciones favorables de pH y temperatura) el
crecimiento de microorganismos, clulas o incluso pequeas plantas. Segn qu se
quiera hacer crecer, el medio requerir unas u otras condiciones. Generalmente se
presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados, al
prepararse podemos encontrarlos en estado slido, semislido y lquido. El objetivo
ltimo del cultivo es variado: antibiograma, identificacin, multiplicacin...
Segn sus cualidades fsicas distinguimos:
Lquidos
Semi-slidos
Slidos
Segn su formulacin:
Qumicamente definidos: se conoce exactamente la cantidad de cada uno de los
compuestos que hay en el medio.
Complejos: se realizan a partir de extractos naturales (extracto de levadura,
sangre,...). Por tanto, no se conoce exactamente cul es la composicin del
medio. Sin embargo, presenta la ventaja de que ya estn presentes todos o casi
todos los elementos que una clula puede requerir.
Segn su uso:
Selectivos: permiten seleccionar el crecimiento de una especie o grupo
determinado (hongos, bacterias entricas, protozoos...).
Diferenciales: permiten identificar una especie o grupo por su crecimiento
diferencial en este medio.
De enriquecimiento: son medios diseados para permitir el crecimiento del
mximo nmero de especies posible. Pueden usarse, por ejemplo, para estudiar
todos los microorganismos presentes en una muestra.
Mnimo: contienen la mnima cantidad de nutrientes posible que permite el
crecimiento de una especie.
De transporte: est preparado para servir de almacenamiento temporal a
especmenes transportados. manteniendo su viabilidad y su concentracin.



IV. MATERIALES Y REACTIVOS

Mitosis
Cebolla con races
Bistur
Estilete
Luna de reloj
Mechero
Pinzas de madera
Vial
Mascarillas
Fijador carnoy
Carmn actico
Microscopio




Medio de Cultivo
Cocina
Olla
Cuchara
Frascos de vidrio
Gasa
Algodn
Papel kraff
Pabilo
Tijera
Estufa u autoclave
Azcar blanca
Levadura
Agar
Acido propinico
V. PARTE EXPERIMENTAL

MITOSIS
Previamente debemos tener nuestra cebolla con races de unos 2 a 3 centmetros,
luego seleccionamos una de las races y con ayuda del bistur cortamos una de las
puntas (2 mm), exactamente la zona meristemtica.











Luego con ayuda del estilete colocamos los fragmentos de la raz cortada en un vial
conteniendo fijador Carnoy y por el tiempo de 30 minutos.










Pasados los 30 minutos sacamos las muestras de races y las colocamos en una luna
de reloj que tenga unas gotas de carmn actico












y llevamos al calor del mechero hasta que entre en ebullicin por espacio de 15
segundos. Esperando siempre que salga vapor.













Retire el fragmento de raz con una pinza de punta fina y colquela sobre un porta
objetos y agrguele una gota de carmn actico.















Tape la preparacin con una laminilla cubre objetos, y sobre esta ponga un papel
absorbente. Presione el cubre objetos con la yema del dedo pulgar y luego con la
extremidad plana de un lpiz y presionar un poco mas fuerte hasta convertir el
material del porta objetos en una capa delgada (squash). al realizar esta operacin,
tenga cuidado para no romper el cubre objetos.













Limpie el exceso de colorante del porta objetos con papel higinico y lleve el
preparado al microscopio para su observacin a menor y mayor aumento.
Identifique las diferentes fases de la divisin celular, analice, explique y
esquematice.


MEDIO DE CULTIVO

Previamente nuestros frascos de vidrio deben estar my bien lavados con ayuda de
una escobilla y detergente, se enjuagan con agua limpia y se dejan secar boca abajo.

A cada frasco le haremos un tampn a base de algodn y gasa


















Colocamos los tampones y ponemos una cubierta de papel kraff, amarramos con
pabilo y llevamos a esterilizar.















En tanto se esterilizan los frascos, vamos preparando el medio de cultivo. Y
empezamos pesando los materiales que a vamos a utilizar para hacer 600 ml de
medio. (12 gr de agar, 12 gr de levadura, 18gr de azcar blanca, 3ml de acido
propionico)











12 gr de levadura 18 gr de azcar blanca

Procedemos a preparar el medio, en uan olla agregamos el agua y los materiales ya
pesados y revolvemos hasta q se disuelva todo.










Por ltimo agregamos el acido propionico y llevamos a enfriar poniendo la olla en
agua fra, vertemos nuestro medio de cultivo en los frascos de vidrio ya
esterilizados.













III. RESULTADOS

MITOSIS
Al llevar nuestros porta objetos con las muertas ya preparadas y observar al
microscopio pudimos identificar las siguientes fases:










Profase Temprana Profase Tarda Metafase













Anafase Tardia Telofase Tardia Citocinesis



MEDIO DE CULTIVO

Concluida la prctica obtenemos nuestros medios de cultivo ya listos en los cuales
vamos a mantener nuestras moscas Drosophilas.













IV. CONCLUSIONES

Las clulas meristemtica de las races se encuentran en contante divisin y
multiplicacin lo que nos permite apreciar las diferentes etapas o fases de la
mitosis.
Para poder apreciar las fases de la mitosis es necesario teir las clula y
llevarlas por un proceso que nos permita contrastar sus ncleos.
La mitosis es un proceso complejo que consta de varias fases, pero para su
estudio se ha dividido en nueve fases muy marcadas.
Los medios de cultivo son esenciales para poder hacer viable le desarrollo de
organismo y microorganismos.
El medio de cultivo debe estar libre de contaminacin y poseer los nutrientes
necesarios para la alimentacin de nuestro cultivo.

V. REFERENCIAS

De Robertis, Eduardo / Hib, Jose / Ponzio, Roberto BIOLOGA CELUALR Y
MOLECULAR de De Robertis Duodcima edicin Editorial El Ateneo
Argentina

Pierce, Benjamn GENETICA Un Enfoque Conceptual Segunda edicin
Editorial Medica Panamericana 2006 Espaa.

http://es.wikipedia.org/wiki/Mitosis

http://es.wikipedia.org/wiki/Medio_de_cultivo