Profesor Asociado: NAJLE; Roberto Profesor Adjunto: CERIANI, Carolina Profesor Adjunto: SOLANA, Hugo Jefe de Trabajos Prcticos: ELISSONDO, Mariana Jefe de Trabajos Prcticos: DIAZ, Mara del Carmen Jefe de Trabajos Prcticos: GENTILE, Mara la Ayudantes de Primera: LARSEN, Karen Ayudantes de Primera: SCARCELLA, Silvana Ayudantes de Primera: HERRERA; Marcela Ayudante Alumno: SOLANA, Maria Victoria
De la reglamentacin de cursada: Tal como se expresa en el reglamento de enseanza y promocin que se transcribe a continuacin, los alumnos debern cumplimentar con asistencia y/o interrogatorio su 75% en los Trabajos Prcticos.
"Regularizacin de los TP",del REGLAMENTO DE ENSEANZA Y PROMOCION Art 10:Los alumnos regulares en los cursos prcticos debern aprobar el 75% de los TP para poder rendir el examen final. Los cursos permitirn que los alumnos que no hayan asistido al 75% de los prcticos, recuperen hasta un 5% de los mismos para llegar a completar el 75%. Aquellos alumnos que hayan asistido al 75% y no hayan alcanzado los requisitos mnimos de aprobacin, podrn recuperar el 50% de los TP perdidos(desaprobados y no asistidos) Art 13: En cada curso (cuatrimestral o anual) se tomarn dos (2) pruebas parciales con sendos recuperatorios. Quienes tengan el 75% de sus TP aprobados y adeuden un parcial, podrn regularizar la cursada en el turno de examen inmediato a la finalizacin de la cursada, no pudiendo rendir el examen final en la misma mesa que recuperan.
Recomendaciones a observar
1.-El horario y comisin elegido o destinado es inamovible 2.-No se aceptarn cambios de comisin, luego de habrsele asignado a una de ellas. 3.-No se admitirn cambios por llegadas tarde o imprevistos ajenos al curso. 4.-Cuando se produzcan ausencias por razones de fuerza mayor, slo se admitirn certificados mdicos presentados dentro de las 48 horas posteriores a la inasistencia (tal justificacin no significa un "presente" al TP no asistido, sino una consideracin dentro del reglamento de recuperacin 5.-Cada TP lleva un interrogatorio escrito, previo al mismo, que versar sobre los temas de la gua, a clase terica relacionada al tema (si fue dictada),y, la bibliografa recomendada en la bibliografa. 6.-Previo al TP de cada semana, se recomienda leer las transparencias publicadas en el aula de TP, donde se reafirmar el siguiente TP y algn cambio que pudiera surgir
INDICE Pag TP 1 MICROSCOPIA 3 TP 2 ORGANELAS CITOPLASMATICAS Y NUCLEO 19 TP 3 FOTOSINTESIS Y RESPRACION 28 TP 4 MITOSIS Y MEIOSIS 43 SEMINARIO DE INTEGRACION (Nutricin) 54 SEMINARIO 59
TRABAJO PRACTICO N 1
MICROSCOPIO: BASES Y APLICACIONES
FORMAS Y TIPOS CELULARES
OBJETIVOS
Conocimiento y manejo del microscopio ptico comn
Realizacin de preparaciones microscpicas sencillas.
Observacin de clulas procariotas y eucariotas (animales y vegetales)
La unidad de organizacin de los seres vivos es la clula. Esta puede ser estudiada bajos distintos aspectos: morfolgico, qumico y fisiolgico. A cada uno de estos aspectos le corresponden mtodos de estudios particulares.
METODOS DE ESTUDIOS MORFOLOGICOS
Los estudios morfolgicos se realizaron mediante el uso de instrumentos de aumento denominados microscopios. El nivel de observacin se halla limitado por el poder de resolucin del microscopio utilizado. El poder de resolucin de cada microscopio, determina entonces, un limitado rango de dimensiones dentro del cual deber estar la estructura biolgica en estudio para que pueda ser discriminada.
Nivel de observacin Instrumento Dimensin Nivel de estructura biolgica Macroscpico Lmite inferior 0.1 mm Ojo y lente simple Desde 0.2 mm rgano Microscpico Lmite inferior 0.1 micrmetro (m) Microscopio comn Varios tipos de microscopios Desde 100m hasta 0.2 Desde 1m hasta 0.1 Tejidos Clulas Bacterias Submicroscpico Lmite inferior 10 A Microscopio de polarizacin Microscopio electrnico Desde 1000 A hasta 10 A
Componentes celulares Virus Macromolculas Microscpico Lmite inferior 1 A Difraccin de rayos X Desde 10 A hasta 1 A Molculas y tomos
Mientras que a nivel microscpico la unidad de medida es el metro o el milmetro (mm) a nivel microscpico es el micrmetro (m), que equivale a un milsimo de mm (10 -3 mm), y a nivel submicroscpico es el nanmetro (nm) que equivale a un milsimo de micrmetro(10 -3
m), y el Angstrom (A) que equivale a diez milsimas de micrmetro (10 -4 m)
En resumen: 1mm: 1000 micrmetros. 1 micrmetro: 1000 nanmetros. 1 micrmetro: 10.000 A.
Escala logartmica de las dimensiones microscpicas. Cada divisin principal representa un tamao 10 veces menor que la precedente
LOS INSTRUMENTOS OPTICOS Las lupas comunes, tienen poca aplicacin en el estudio de las clulas, pero basados en el mismo principio de una nica lente , los microscopios simples, fueron los pioneros en este campo de la investigacin biolgica. El microscopio compuesto o microscopio ptico comn (M.O.) consta bsicamente de dos sistemas de lentes, separados por una distancia fija. La lente ms cercana al objeto a observar se llama OBJETIVO y la prxima al ojo del observador OCULAR. Ambos sistemas estn montados sobre un tubo portalentes , cuyos movimientos estn controlados por dos tornillos: el TORNILLO MACROMETRICO desplaza el tubo con movimiento grosero, milmetros o centmetros y de esta manera se busca el enfoque del objeto a observar, y el TORNILLO MICROMETRICO que permite movimientos finos, se ajusta a la posicin de los dos sistemas de lentes para que el objeto quede en el foco exacto. Los microscopios presentan varias lentes objetivo intercambiables, por lo comn tres o cuatro, y ellas, estn insertadas sobre una pieza giratoria, llamada REVOLVER, que permite centrar la lente elegida.
En este microscopio, las imgenes se forman con los rayos de luz que llegan a las lentes, luego de atravesar el objeto a observar o muestra, que se encuentra apoyado en una placa de vidrio de poco espesor o portaobjetos, montada sobre una placa metlica del microscopio, que posee un agujero central, LA PLATINA. La platina puede tener clips para ajustar el portaobjetos o correderas deslizantes. Para iluminar la muestra se usa luz blanca natural o artificial reflejada sobre un ESPEJO en la base del microscopio. El espejo se mueve para dirigir el haz de luz perpendicularmente a la platina. Algunos microscopios cuentan, con un pequeo foco, adosado al pie del instrumento, en lugar de espejo. Con el fin de obtener una iluminacin eficiente es necesario concentrar los rayos luminosos de manera que la mayor cantidad de rayos atraviese el preparado y entren al sistema de lentes. Para ello se tiene una lente o sistema de lentes ubicado debajo de la platina se encarga de concentrar el haz de rayos de luz: el CONDENSADOR. Para eliminar los rayos ms perifricos, que forman imgenes distorsionadas, existe por debajo del condensador un DIAFRAGMA a iris que se abre y cierra como el diafragma de la mquina fotogrfica.
Analicemos ahora, algunos puntos referidos a la parte ptica del microscopio
El aumento es la relacin entre el tamao de la imagen obtenida de un objeto y el tamao real del mismo
Cada lente objetivo lleva inscripto su aumento: 5X, 10X, 40-45 X o 90-100X. (el signo X significa aumento) La imagen aumentada producida por el objetivo, es tomada por el ocular, y magnificada nuevamente. La imagen definitiva (que es invertida, respecto a la original) resulta del producto entre el aumento del objetivo por el aumento del ocular.
: ngulo de abertura
Lmite de resolucin: es la menor distancia a que pueden estar situados los dos puntos para su perfecta discriminacin. Depende de la longitud de onda de la luz utilizada durante la observacin y de la abertura numrica del objetivo
R: lmite de resolucin 0.61: constante de contraste mnimo que se puede detectar R: 0.61 x longitud de onda A N A N: abertura numrica del objetivo utilizado El poder de resolucin es mayor, cuanto menor sea la longitud de onda y mayor la abertura numrica. Es importante recordar que R es la inversa del poder resolutivo de manera que cuanto mayor sea sta, menor sera el lmite de resolucin.
Abertura numrica: es la capacidad del objetivo de utilizar un mayor o menor n de rayos luminosos en la formacin de la imagen microscpica.
n: ndice de refraccin del medio interpuesto entre el objeto que se observa y la lente frontal del objetivo
Sen : seno del semingulo de abertura.
El M.O. comn permite la observacin por transmisin de ciertos detalles estructurales hasta un lmite de resolucin de 0.5 micrmetros con objetivo de 40X y luz comn (longitud de onda 5500 A) Para conseguir mayor poder de resolucin (reduccin de R a 0.25 micrmetros se emplean objetivos de inmersin en aceite de cedro que tienen mayor abertura numrica (n aire: 1; n aceite: 1.515) Tambin puede emplearse luz violeta o ultravioleta que por tener una longitud de onda menor(2500 A) reduce el lmite de resolucin a 0.1 micrmetros.
Microscopio ptico comn: con objetivo seco 40 X....R: 0.5 m con objetivo de inmersin.. R:0.2m
A N: n. sen Angulo de abertura de un objetivo: es el ngulo limitado por los rayos ms perifricos que penetran en el sistema ptico y contribuyen a formar la imagen de un punto cualquiera del objeto. El poder de resolucin de un microscopio, es la capacidad del instrumento para dar imgenes distintas de dos puntos del objeto situados muy cerca uno del otro.
Microscopio para luz ultravioleta:...................R:0.1m
Los microscopios fotnicos no superan un cierto poder de resolucin, por la naturaleza de la luz y su longitud de onda.
La limitacin conferida por la naturaleza de la luz consiste en lo siguiente:
En general, dos objetos aparecen como uno solo, si la distancia que los separa es menor que la mitad de la longitud de onda de la luz empleada, o si la distancia entre las imgenes de tales objetos es ms pequea que lo indicado.
Qu ventajas y limitaciones presenta el microscopio ptico en la observacin de la clula?
De campo luminoso (muestra no coloreada y (muestra coloreada), de campo oscuro, de Contraste de fase, de interferencia diferencial ( Nomarski), Confocal, etc.
RECOMENDACIONES PARA EL USO DEL M.O. Comenzar la observacin con el objetivo de aumento ms bajo. Esto permitir una visin integral del preparado y seleccionar la mejor rea que luego podr observarse a mayor aumento. La iluminacin debe ser homognea , de buena intensidad pero no excesiva. Con bajo aumento se puede usar luz natural , pero a gran aumento es preferible la luz artificial Alinear objetivo con ocular, abrir el diafragma, colocar en posicin correcta el espejo y luego colocar el preparado Usar como primera lente la de menor aumento y acercarla usando el tornillo macromtrico Nunca acercar el objetivo al preparado , teniendo el ojo en el ocular, sino mirando de costado, para evitar romperlo e incluso daar la lente. Hay diferentes tipos de microscopios pticos
Con el microscopio ptico se pueden observar: La forma general de la mayora de las clulas procariontes La forma general de las clulas eucariontes Algunas organelas eucariontes: ncleo, nucleolo/s, cromosomas, mitocondrias, cloroplastos, flagelos, cilios, centrolos, vacuolas, pared celular. Estas estructuras se identifican con claridad utilizando alguna tcnica accesoria de preparacin de la muestra.
No se pueden observar con el M.O. Las bacterias ms pequeas La estructura interna de las clulas procariotas La estructura de las organelas eucariotas La membrana plasmtica Los conjuntos membranosos como retculo endoplasmtico rugoso (RER) y aparato de Golgi, aunque por ciertas tcnicas puede revelarse su ubicacin Los ribosomas
Ajustar siempre la observacin con el tornillo micromtrico, que se adecua a cada observador. Las lentes deben estar limpias porque pueden observarse manchas de suciedad Dado que el M.O. proporciona una imagen invertida del objeto, recordar que cuando un detalle se encuentra a la derecha del preparado debe mover la platina hacia la izquierda , y si est arriba debe mover hacia abajo Hacer siempre un dibujo de lo observado respetando las relaciones de tamao entre los distintos componentes visualizados. Indicar aumento de la observacin , diagnstico de lo observado y coloracin, si la posee.
Existen distintos tipos de microscopios en la actualidad entre los cuales podemos nombrar: MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA
Se basa en que una sustancia natural de las clulas o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energa absorbida como rayas luminosos. Siendo escasas las molculas autofluorecentes, su aplicacin ms difundida es para revelar una fluorescencia agregada, como en la deteccin de antgenos o anticuerpos. Tambin se puede inyectar molculas fluorescentes especficas en un animal o directamente en clulas y usarlas como marcadores.
MICROSCOPIO DE INTERFERENCIA (MI)
Con el que se pueden determinar las diferencias pticas de las estructuras celulares. Adems se calcula el peso seco de una clula o de una estructura observada. Tiene la ventaja de reflejar cambios de color en las clulas vivas. El MI da imgenes tridimensionales (efecto 3D), lo que con un procesador adecuado nos permite medir el grosor de las muestras observadas.
LA PTICA NOMARSKI U PTICA DE CONTRASTE INTERDIFERENCIAL
Es una tcnica de microscopa de luz que emplea filtros polarizantes y prismas para producir imgenes impresionantes con bastante tridimensionalidad. Adems, el uso de prismas permite obtener imgenes de colores brillantes sin necesidad de aplicar protocolos de tincin, ni de preparacin de muestras Este tipo de microscopa se caracteriza por su buena resolucin y contraste que ayudan a discernir tanto detalles superficiales como estructuras internas.
MICROSCOPIO DE FONDO CLARO
Para formar una imagen a partir de un corte histolgico usa luz visible, por esto la muestra debe ser lo bastante fina como para que los haces de luz puedan atravesarla. Tambin se usan mtodos de tincin, segn las necesidades, con el fin de aumentar los detalles en la imagen. El campo del microscopio est intensamente iluminado, mientras que los objetos observados aparecen ms oscuros. En general con este microscopio se pueden alcanzar los 1000 aumentos.
MICROSCOPIO DE LUZ ULTRAVIOLETA La imagen en el microscopio de luz ultravioleta depende de la absorcin de esa luz por las molculas de la muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, La muestra no se puede observar directamente a travs del ocular porque la luz ultravioleta puede daar la retina. El mtodo sirve para detectar cidos nuclicos, y protenas que contienen determinados aminocidos. Mediante longitudes de ondas especficas para la iluminacin se puede obtener mediciones espectrofotomtricas para cuantificar el DNA y el RNA de cada clula
MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE
Se utiliza cuando se necesitan ver objetos incoloros. Se usa una iluminacin por varios sitios y se miden diferencias de fase para poder "ver" el objeto. Una muestra microscpica normalmente se visualiza porque su densidad vara de unas zonas a otras. Con iluminacin de campo claros es muy difcil ver detalles de una muestra completamente transparente, (todas las zonas son de la misma densidad). Sin embargo, no todas tienen el mismo ndice de refraccin.
MICROSCOPIO DE LUZ POLARIZADA
Los microscopios de luz polarizada son microscopios a los que se les han aadido dos polarizadores (uno entre el condensador y la muestra y el otro entre la muestra y el observador),el material que se usa para ello es un cristal de cuarzo y un cristal de Nicol dejando pasar nicamente la luz que vibra en un nico plano (luz polarizada). Este tipo de microscopio se usa para poder identificar mejor sustancias cristalinas o fibrosas (como el citoesqueleto), sustancia amiloide, asbesto, colgeno, cristales de uratos, queratina, slice, y otras de origen exgeno
MICROSCOPIO CONFOCAL
Un microscopio confocal es un microscopio capaz de obtener imgenes tridimensionales de la clula. Se basa en un principio similar al de un microscopio de fluorescencia, pero se utilizan dos diafragmas confocales (uno antes de la muestra y otro despus) capaces de enfocar la iluminacin en un nico punto de la muestra. Se utiliza un lser como fuente luminosa, y con l se va barriendo la muestra por todo su volumen, plano a plano, creando muchas imgenes bidimensionales que un ordenador interpreta, generando finalmente una imagen tridimensional del objeto.
MICROSCOPIA ELECTRONICA
El avance trascendental en la Biologa celular lo constituy el desarrollo del microscopio electrnico
El microscopio electrnico utiliza en lugar de un haz de luz, haces de electrones de una longitud de onda (0.05 A).Esta longitud de onda resulta 100.000 veces inferior a la de la luz empleada habitualmente (5500A) y logra un aumento y resolucin muy superior a la de los microscopios comunes u pticos y permite estudiar la ultraestructura o morfologa submicroscpica de la clula.
La microscopa electrnica de transmisin se basa en la dispersin de electrones que inciden y pasan a travs del objeto de manera que la imagen refleja la falta de electrones que fueron dispersados. Es el instrumento indicado para el estudio de la ultraestructura de la clula, es decir la morfologa detallada de los componentes de la misma. Esta capacidad es consecuencia de su gran Poder de resolucin, que resulta de su notable disminucin en la longitud de onda que utiliza. La microscopa electrnica de barrido (scanning) utiliza los electrones que se reflejan en la superficie del objeto y producen una imagen tridimensional. Una de sus mayores cualidades del ME de barrido es su capacidad de enfocar simultneamente elementos ubicados en distintos planos, es decir, tienen mucha profundidad de foco, con lo cual se logra la imagen tridimensional
DIFERENCIAS ENTRE EL MICROSCOPIO OPTICO Y EL MICROSCOPIO ELECTRONICO MO ME Imagen dada por Interferencia de rayos luminosos Dispersin de electrones Tubo Simple Al vaco Fuente Luz (fotones) Filamento de tungsteno Elementos Lentes: ocular, objetivo, condensador Bobinas electromagnticas Estudian clulas Vivas o muertas Muertas Observacin de la muestra Coloreada o no Sin coloracin o con aumento de contraste con tcnicas especiales Lmite de resolucin 2500 A a 0.25 micrmetros 10 A a 2 A Longitud de onda 5500 A (trmino medio) 0.056 A Aumento 500X a 1500X 20000X a 160.000X con lente intermedia. 1.000.000X o ms con aumento fotogrfico Nivel de observacin Estructuras Ultraestructura
La observacin por transmisin (de fotones o electrones) exige que los objetos a estudiar respondan a ciertas condiciones de espesor y contraste.
Para que la luz o los electrones puedan atravesarlos, el espesor no debe exceder de 10 micrmetros y 0.1 de micrmetro respectivamente. Como las clulas vivas poseen un espesor medio de 10 m slo pueden estudiarse en microscopios lumnicos, clulas aisladas o reunidas formando una capa delgada. En la mayora de los casos las condiciones de espesor se logran efectuando cortes de no ms de 5 m, para evitar que la superposicin de estructuras haga la imagen confusa.
Para efectuar cortes con micrtomo es necesario endurecer la muestra(por congelacin, inclusin en parafina, etc.) previa fijacin.
Tratamiento qumico o fsico que mata rpidamente las clulas y conserva sus estructuras evitando la aparicin de fenmenos de autlisis o desintegracin.
La observacin por transmisin slo proporciona datos si ciertas regiones del objeto absorben la luz ms que otras, es decir, si este objeto presenta contrastes. En general, los constituyentes celulares tienen muy pocos contrastes unos con respecto a otros, por lo cual se deben emplear ciertos artificios para aumentarlos. Es posible amplificar las diferencias muy pequeas que existen entre las diversas regiones de la clula, recurriendo a montajes pticos que utilizan la naturaleza ondulatoria de la luz, es el caso del microscopio de contraste de fases y del microscopio de interferencia. Por otra parte, se pueden crear artificialmente contrastes a nivel de ciertas estructuras celulares, para lograrlo, se realizan combinaciones, entre sus constituyentes qumicos y productos que absorben ciertas longitudes de onda de luz, llamados colorantes.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Clula procaritica Las clulas procariotas pertenecen al reino Monera.
Dentro de este reino encontramos a las bacterias que fueron las primeras clulas en aparecer sobre la tierra , precediendo a las eucariotas Pueden adoptar distintas formas y por ello tomar nombres particulares, estando en forma solitaria o en agrupaciones. Cuando su forma es redondeada se denominan cocos, si poseen forma de bastoncillo se llaman bacilos y si su forma es espiralada, espirilos en tanto que las formas agrupadas se conocen como: Diplococos (formados por una asociacin de dos cocos), Estreptococos (variedad de cocos cuyos individuos se presentan asociados en cadena), Estafilococos, ( variedad de cocos cuyos individuos se presentan asociados en racimos), Sarcinas, Estreptobacilos
Finalidad: Realizacin de un frotis bacteriano. Estudio de las formas y agrupaciones bacterianas
Materiales: Suero para fabricacin de queso Gouda Solucin colorante de azul de metileno Papel de filtro Objetivo de inmersin - Aceite de inmersin Asa de inoculacin Portaobjetos Mechero de Bunsen
Tcnica 1. Colocar una gota de yogur en el extremo de un portaobjeto muy limpio y desengrasado 2. Con la ayuda de otro portaobjetos extender la gota en forma pareja segn las indicaciones del jefe de TP 3. Secar el material pasando rpidamente el portaobjetos por la llama. No calentar demasiado el portaobjetos para no distorsionar las formas bacterianas. 4. Cubrir la muestra con azul de metileno y colorear durante 5 minutos 5. Escurrir el exceso de colorante y enjuagar dejando caer agua con suavidad sobre el preparado hasta que no salga coloreada. Secar el porta al aire 6. Observar con los diferentes aumentos desde el menor al mayor
Observacin mediante objetivo de inmersin a)Coloque una gota de aceite de cedro directamente sobre el frotis seco. Aplique sobre ella con mucho cuidado el objetivo de inmersin hasta tocarla; luego utilice el tornillo micromtrico hasta enfocar b)Observe y dibuje los tres tipos morfolgicos fundamentales de bacterias: Cocos, Bacilos, Espirilos, aislados o agrupados: Diplococos, Estreptococos, Estafilococos, Sarcinas, Estreptobacilos
Clula eucarionte
Finalidad: Observacin de protozoos Los protozoos son individuos unicelulares que pueden vivir libres o agrupados que pertenecen al reino Protista. Son protozoos amebas, paramecios, Euglena, Trypanosoma cruci, etc.
Materiales Agua de charco Cultivo de protozoos
Mtodo
1. Coloque una gota del material sobre un portaobjeto 2. Cubrir con un cubreobjeto 3. Observar con menor aumento buscando una zona donde los protozoos son abundantes. Si la muestra contiene material en descomposicin, es habitual encontrarlos alrededor de ste. Puede colocarse una fibra de algodn para entorpecer el movimiento de los protozoos y facilitar la observacin 4. Observar con el mayor aumento sin utilizar el objetivo de inmersin
Se representan algunas de los Protozoos que aparecen en aguas de charco o acuario con mayor frecuencia para que poder auxiliarse en la identificacin 1.- Stentor 2.- Didinium 3.- Colpoda 4.- Blepharisma 5.- Ceratium 6.- Naegleria 7.- Euplotes 8.- Stylonychia 9.- Vorticella
Resultados: 1) Dibujar lo observado reconociendo las formas celulares diferentes 2) Colocar referencias de aumento y diagnstico
Clula eucarionte Hemos elegido para esta parte del trabajo prctico las levaduras, hongos eucariontes unicelulares que se utiliza para conseguir una fermentacin industrial (Saccharomyces cerevisiae) y que es un organismo capaz de respirar aerbica o anaerbicamente Pueden hallarse aisladas o en pequeos grupos. Algunas presentan brotes que han sido originados por el proceso de gemacin (reproduccin sexual)
Finalidad Observacin de levaduras
Materiales: Levadura fresca de panadera Tubo de ensayo Porta y cubreobjeto
Mtodo 1. Tomar una pequea porcin de levadura y colocarla en un tubo de ensayo 2. Agregar agua tibia en cantidad suficiente como para conseguir una suspensin muy diluida. 3. Colocar una gota de la suspensin en un portaobjeto y cubrir con el cubreobjetos. 4. Observar primero con bajo aumento y luego con el mayor, sin usar el de inmersin
Resultados: 1)Dibujar una parte del campo con las levaduras a pocos aumentos. 2)Dibujar a gran aumento, sealando si lo observa ncleo y brotes.
Clula animal
Finalidad: Observacin de un frotis sanguneo Observacin de clulas anucleadas (eritrocitos) y mononucleadas (leucocitos polimorfonucleares) en el frotis
Materiales: Frotis de sangre fijada y coloreada con May-Grundwald Giemsa Objetivo de inmersin
Mtodo
1. Colocar el frotis en el M.O. 2. Observar con 40 X y luego con objetivo de inmersin.
Observacin En un frotis de sangre observamos distintos elementos que se diferencian entre s, por su tamao, color y estructura del ncleo, cuando ste existe. Los que predominan, son de tamao mediano, de color rojo anaranjado y sin ncleo: los glbulos rojos, eritrocitos o hemates. Si recordamos que el dimetro de los eritrocitos es de aproximadamente 7 m, esos elementos nos podrn servir para calcular aproximadamente el tamao de los otros elementos presentes en el mismo campo microscpico. Otras clulas algo mayores ( 10 a 12 m ),tienen ncleo lobulado ( 2,3,4 o 5 lbulos) de color violeta oscuro. Son glbulos blancos que poseen granulaciones citoplasmticas. De ah el nombre de granulocitos. Otros glbulos blancos, de tamao similar al de los hemates (8 m) con ncleo violeta oscuro, ligeramente escotado y escaso citoplasma, son los linfocitos. Los monocitos, son tambin leucocitos de 12-20 m con ncleo redondeado u oval, de color violeta oscuro.
Resultados
Observe y dibuje los elementos de la sangre, sealando los tipos celulares segn las descripciones anteriores(con 400X y 1000X)
Clula vegetal Finalidad: Realizacin de la preparacin microscpica Observacin de los componentes celulares tpicos de una clula vegetal y las caractersticas del tejido elegido
Materiales: Cebolla. Acido actico al 50% Lugol. Pinzas, tijera, escalpelo, portas y cubres, cuentagotas.
Mtodo: 1) Interesa como material, la epidermis interna de una escama de bulbo de cebolla. Para obtenerla, se corta una cebolla en dos mitades. Se separa manualmente en cascos, sacando entre cada dos cascos una capa fina y translcida, que es, precisamente, la epidermis interna, y se lleva a una cubeta de agua (o cpsula de Petri) para que se desenrolle. 2)Cortar dos trozos de esta epidermis. 3)Un trozo se coloca entre porta y cubre con una gota de agua, cuidando que quede bien extendido y sin burbujas de aire 4)El otro trozo se sumerge en cido actico al 50% durante 1 2 minutos (fijacin);luego en el colorante elegido, durante 2 y posteriormente se coloca entre porta y cubre para su observacin.
Observacin: (Recordar que para observar preparados sin teir, debe reducirse la entrada de luz, y en todos los casos, comenzar con aumentos dbiles) Las clulas de la epidermis de la cebolla, poligonales y grandes, se hallan ntimamente adheridas unas con otras. La pared se destaca muy clara teida por el colorante. En las clulas vivas se ven los ncleos aplanados (con 2 o ms nucleolos) adosados a la pared. A medida que las clulas van degenerando, el ncleo se redondea y tiende a situarse en el centro. El citoplasma tiene un aspecto bastante claro, en l se distinguen algunas vacuolas grandes, dbilmente coloreadas. En algunas ocasiones se observa que la preparacin tiene a manera de mosaico, otros estratos de clulas; stas proceden de las capas ms internas de las hojas que fcilmente han podido ser arrancadas al desprender la epidermis. Para la observacin es ms adecuado utilizar las zonas constituidas por un nico estrato epidrmico. Es caracterstica de las epidermis vegetales que sus clulas carezcan de cloroplastos, con excepcin de las clulas estomticas.
Resultados: 1)Dibujar un trozo de epidermis de cebolla a pocos aumentos. 2)Dibujar una clula a gran aumento, sealando pared celular , vacuolas y ncleo.
Clula animal
Finalidad: Observacin de clula multinucleada (clula muscular estriada voluntaria) en un preparado definitivo de corte de lengua
Observacin Las clulas o fibras del tejido muscular estriado voluntario de la lengua, cortadas longitudinalmente, se presentan en forma de cintas angostas, de color rojo, con varios ncleos situados en la periferia. Un mayor aumento y moviendo el tornillo micromtrico, es posible observar una estriacin transversal, sumamente apretada que corresponden a las zonas claras y oscuras de las miofibrillas (diferenciaciones citoplasmticas que intervienen activa- mente en la contraccin muscular) En corte transversal, las fibras aparecen poligonales, con ngulos redondeados, todas ellas de espesor semejante, separadas unas de otras por tejido conectivo. En estos cortes es posible establecer bien la posicin perifrica de los ncleos.
Resultados Observe y dibuje una fibra cortada longitudinalmente, sealando los ncleos y estriacin transversal
Clula animal
Finalidad: Observacin de otras formas celulares: clula estrellada en corteza cerebral o clula de Purkinje en corteza cerebelosa Adquirir destreza en el manejo del microscopio manejndolo de manera independiente
Observacin Existen muchas formas celulares. El tejido nervioso est formado por neuronas que son clulas nerviosas provistas de prolongaciones acompaadas por las clulas de la gla o neuroglia. Se calcula que el hombre posee al nacer alrededor de 10.000 millones de neuronas. En la neurona se reconoce un cuerpo celular o soma y las prolongaciones La observacin microscpica de las clulas tal como se presentan en los rganos permite apreciar por sobre todo su forma y muy poco de sus caracteres estructurales. Por eso se las tie, muchas veces con colorantes especiales que al ser absorbidos por distintas partes de las clulas, facilitan su visualizacin. Podemos observarlas con hematoxilina eosina(esta coloracin es la de uso ms frecuente en Histologa. La hematoxilina tie los ncleos de violeta y la eosina tie el citoplasma de rosado) o bien el mtodo de coloracin de Golgi donde un precipitado de sales de plata hace resaltar el cuerpo celular y las prolongaciones como una silueta oscura. Tambin utiliza nitrato de Ag, el mtodo de Cajal con el que pueden observarse las neurofibrillas en el cuerpo celular y en los polos dendritas y axn. Los colores que predominan en las neuronas tratadas por estos dos ltimos mtodos son el castao y el ocre
Resultados Enfoque el preparado proporcionado , y utilizando el mayor aumento, reconocer algunas de las neuronas visibles en ellos Realizar un esquema de las mismas, clasificndolas
UTILIZAR LOS CAMPOS QUE SE ADICIONAN PARA DIBUJAR CADA UNO DE LOS PREPARADOS
Diagnstico: Observacin de clula procarionte. Frotis de bacterias del yogur Aumento: Coloracin:.
Diagnstico: .. Diagnstico: .. Coloracin: Coloracin: Aumento: Aumento .
Diagnstico: .. Diagnstico: .. Coloracin: Coloracin: Aumento: Aumento .
Diagnstico: .. Diagnstico: .. Coloracin: Coloracin: Aumento: Aumento .
ACTIVIDADES
1.- En la tabla que se dibuja ms abajo se detallan algunas caractersticas especficas de los tipos de microscopios estudiados analice cada una y coloque una cruz en el casillero apropiado al tipo/s de microscopio/s que corresponde CARACTERISTICA M. ptico M E de transmisi n ME de barrido Tiene el mayor poder de resolucin Pueden observarse clulas vivas Permite visualizar detalles de la superficie celular Se pueden ver ribosomas aislados Pueden observarse clulas enteras Puede observarse la estructura interna de una clula procariota
La observacin mejora con el uso de colorantes Puede visualizarse una membrana plasmtica cortada transversalmente
Trabaja en alto vaco Su lmite de resolucin es de 0.25 micrones Su lmite de resolucin es de 100 A aproximadamente Su lmite de resolucin es de 10 a aproximadamente
Teniendo en cuenta los esquemas presentados ms arriba de escala logartmica y que: m :metro dm: Decmetro: 10 -1 m cm: centmetro:10 - 2m mm: milmetro : 10 -3 m m: micrmetro:10 -6 m nm: nanmetro : 10 -9 m A :Angstrom:10 -10 m
2.- En qu unidades se medirn estructuras pertenecientes a cada uno de los siguientes niveles? Nivel macroscpico Nivel microscpico Nivel ultramicroscpico
3.- Qu instrumentos le permiten observar y estudiar estructuras en cada uno de los niveles anteriores?
4.- Cul es el lmite de resolucin de: - ojo humano - microscopio ptico - microscopio electrnico
5)En qu unidades se medirn estructuras tales como: a- hgado b- un paramecio c- un glbulo rojo d- un glbulo blanco e- una bacteria f- una mitocondria g- un cloroplasto h- una neurona i- el espesor de una membrana j- la molcula de ADN
6) Expresa para cada una de ella su tamao aproximado, y luego ordnalas de mayor a menor dimensin
7).- Qu instrumentos permitiran observar y estudiar estructuras en cada uno de los niveles anteriores?
8.- Con qu instrumento observara? a)estructura interna del cloroplasto b)los diferentes estratos de la piel c)la forma de las neuronas d)la membrana plasmtica en detalle
9))En el siguiente cuadro, seale con qu instrumento ptico o electrnico podr observar cada estructura
TIPOS CELULARES O ESTRUCTURAS DIAMETRO PROMEDIO INSTRUMENTO Microtbulos 4 nm Estructuras subcelulares nm-m Virus 10 nm - 0.1m Micoplasmas, ricketsias 0.1m-1m Bacterias y algas cianofceas 0.5 m -5m Levaduras 5m Protozoos y algas unicelulares 10-200m Clulas vegetales en general 10-200m Clulas animales en general 10-60m Ovulo humano 100m Ovulo de avestruz 75 mm Acetabularia (alga ) 80-100 mm
TRABAJO PRCTICO N2
ORGANELAS CITOPLASMATICAS.- NUCLEO
OBJ ETIVOS -Observar y reconocer al MO estructuras celulares -Esquematizar lo observado a travs de la observacin e interpretacin de microfotografa electrnica -Conocer la ultraestructura de los componentes celulares
BASES TEORICAS
Las bases tericas que figuran en las guas de TP tienen como funcin introducir a los alumnos en el conocimiento del tema a fin de lograr su mejor desempeo durante el mismo, no pudiendo suplir, al conocimiento que deber lograr mediante la consulta bibliogrfica de cada caso. En el TP N 1 se puso de manifiesto que dado que las clulas deben cumplir mltiples papeles en la enorme gama de seres vivos diferentes, existe tambin una gran diversidad celular. Hay, una gran variedad de tamaos y formas celulares y en cada caso la estructura final y la presencia o desarrollo de estructuras especiales es generalmente consecuencia del proceso de diferenciacin que permite a las clulas cumplir con una funcin particular. El siguiente cuadro sinptico presenta un resumen de las diversas estructuras que presentan las clulas animales y vegetales
glucoclix Cubiertas celulares cutculas C pared celular(vegetales)
Membrana plasmtica Sistema vacuolar E citoplasmtico Retculo endoplsmico Aparato de Golgi Organelas Envoltura nuclear L Citoplasma citoplasmticas Lisosomas Mitocondrias Ribosomas Plstidos (vegetal) U Peroxisomas Citoesqueleto
L Citosol
envoltura nuclear A Nucleo carioplasma o matriz nuclear cromatina (cromosoma en divisin) nuclolo
Toda clula durante su vida pasa por dos perodos, uno de divisin y otro de interfase o no divisin Durante el perodo de interfase toda clula eucariota presenta tres componentes o compartimentos especiales. Ellos son:
A.-Membrana Plasmtica B.-Citoplasma C.-Ncleo
Cada uno de estos componentes contiene a su vez diversas estructuras o subcomponentes, tal como se ven en el cuadro precedente. De todos ellos nos dedicaremos a: 1)Retculo endoplsmico rugoso 2)Aparato de Golgi 3)Mitocondrias 4)Plstidos
Todas estas estructuras se consideran organelas, ya que para ello cumplen los siguientes requisitos: a)estn presentes durante toda la vida de la clula o la mayor parte de ella b)presentan una morfologa relativamene constante c)cumplen una funcin particular
Tambin observaremos el aspecto que presenta el ncleo interfsico 5)Ncleo interfsico
Retculo Endoplasmtico Rugoso
Objetivos: Reconocer la localizacin del RER en clulas secretoras de un acino pancretico
Caractersticas: El RER constituye la mayor parte del sistema vacuolar citoplasmtico ( o sistema de endomembranas).Est formado por tmulos y sacos aplanados cuya superficie externa presenta ribosomas asociados ,encargados de la sntesis de protenas. Por esta razn se encuentra muy desarrollado en clulas que participan activamente en la sntesis de protenas, como por ejemplo las clulas de los acinos pancreticos que producen las enzimas del jugo pancretico. Funciones del RER 1.-Sostn mecnico 2.-Acumulacin y procesamiento de protenas exportables 3.-Intercambios entre la matriz citoplasmtica y los compartimentos del retculo (los iones y las molculas pequeas que son transportados a travs de las membranas del retculo) 4.-Distribucin intracelular de sustancias
Observacin al M.O. del RER en clulas de acino pancretico El pncreas es una glndula de secrecin mixta (endcrina y excrina). Como glndula excrina produce un jugo que contiene enzimas importantes para la digestin del alimento El jugo pancretico va ser vertido en el intestino por un conducto. Las clulas que sintetizan las enzimas se hallan dispuestas en las glndulas en pequeos acmulos, cada uno de los cuales se llama acino. En ellos, las clulas estn dispuestas rodeando una pequea luz central hacia donde envan su secrecin, que luego pasar a un sistema de conductos. Cada clula del acino se asemeja a una porcin de un pastel con base ancha y vrtice estrecho. La secrecin de acuerdo a esta disposicin es liberada por el vrtice de la clula pudindose verse porque aparece en forma de cuerpos redondeados denominados grnulos de cimgeno. El citoplasma cercano a la base de la clula tiene color azul oscuro que pone de manifiesto una considerable cantidad de ARN que se concentra en esta parte. Con el ME se observa que estas partes basales que se tien intensamente presentan vesculas aplanadas y tbulos membranosos muchas veces dispuestos paralelamente, con ribosomas adheridos a sus superficies externas Mtodo de tincin: Azul de toluidina
Objetivo especfico Reconocer la localizacin del aparato de Golgi en corte de epiddimo
Caractersticas: Es una parte diferenciada del sistema de endomembranas. Al ME se observa como un apilamiento de sacos aplanados ,dispuestos concntricamente ,con una cara convexa (proximal) y una cncava(distal),con bordes dilatados y vesculas y vacuolas ubicadas cerca de esos bordes. En las clulas que presentan una estructura polarizada su ubicacin es definida y se presenta entre el ncleo y el polo de la clula, donde se libera la secrecin El tamao y distribucin dentro de la clula y otras caractersticas (como el n de sacos apilados) vara de acuerdo al estado metablico de la clula. Todo el sistema vacuolar citoplasmtico parece ser una estructura muy dinmica. Es muy probable que esa dinmica est dada por el flujo de membranas o interconversiones entre las membranas de las distintas estructuras que lo componen.
Funciones del aparato de Golgi
1.-Circulacin intracelular de sustancias 2.-Sntesis de polisacridos complejos (ejemplo:celulosa) 3.-Formacin de glucoprotenas de secrecin 4.-Concentracin, condensacin y empaquetamiento de sustancias de secrecin dentro de una vescula limitada por una membrana 5.-Concentracin y empaquetamiento de enzimas hidrolticas dentro de una vescula limitada por una membrana 6.-Formacin del fragmoplasto en la divisin de clulas vegetales
Observacin al MO del aparato de Golgi en epiddimo
El epiddimo es un rgano que forma parte del aparato reproductor masculino. Est formado por un conjunto de tbulos que se ubican por encima de cada testculo y cumple con la funcin de completar la maduracin de los esperma- tozoides, que logran all su completo poder fecundante. Se ha elegido este rgano para la observacin del aparato de Golgi por su gran actividad secretoria que facilita la observacin de la organela en sus clulas.
Importante: Recordemos que en el M.O. lo que se puede observar es la localizacin de las organelas ,ya que su estructura se encuentra por debajo del poder de resolucin de este instrumento
Objetivo: *Reconocer vesculas de secrecin en clulas caliciformes, en corte de vellosidad intestinal.
Caractersticas: Son clulas especializadas en secretar moco. Reciben su nombre porque la porcin supranuclear de las clulas suele hallarse distendida por la secrecin, tanto, que la clula adopta la forma de copa o cliz. El ME muestra que la secrecin de las clulas caliciformes se halla acumulada en las vesculas del Aparato de Golgi. Elegimos un corte de vellosidades intestinales, porque ste presenta clulas caliciformes en abundancia, las que mediante el moco que secretan, protegen a la mucosa intestinal de los daos qumicos y mecnicos a los que se encuentra expuesta.
Mtodo de tincin: P.A.S.(Schiff).Este reactivo se utiliza para el reconocimiento de mucopolisacridos; que en este caso tie la secrecin de prpura.
Objetivo: Reconocer la localizacin de las mitocondrias en hepatocitos
Caractersticas; Son estructuras de forma variada ,que se encuentran en el citoplasma de protozoos, clulas animales y vegetales. Sus dimensiones son de aproxima- damente 0.5um y 1-2 um de longitud. Su distribucin es bastante uniforme, pero en ciertos casos se concentran alrededor del ncleo u ocupan todo el citoplasma Estn constituidas por dos membranas y dos compartimentos. La membrana externa es lisa y rodea al organoide, La interna,en cambio, enva hacia el interior invaginaciones denominadas crestas mitocondriales. La membrana interna divide a la mitocondria en dos compartimentos : 1)cmara externa 2)cmara interna. Esta ltima se halla ocupada por material protenico relativamente denso, que comunmente se denomina matriz mitocondrial. Dentro de la matriz mitocondrial. se encuentran ribosomas pequeos (tipo procarionte)y una molcula de ADN circular
Funciones de las mitocondrias
En ellas se llevan a cabo dos pasos del proceso de respiracin celular: Ciclo de Krebs (en matriz mitocondrial) Fosforilacin oxidativa con produccin de ATP y agua, en crestas mitocondriales La produccin de ATP, es la principal fuente de energa qumica de reserva, para ser utilizados en las diversas actividades de la clula.
Observacin al MO de mitocondrias en clulas hepticas
El exmen de un corte de hgado muestra los hepatocitos dispuestos en hileras o cordones o clulas que en corte parecen tener anchura de una sola clula. Suelen anastomosarse unas con otras, rodeando vas sanguneas o sinusoides hepticos Estos son vas de paso de sangre de mayor calibre que los capilares,y actuando nutriendo a los hepatocitos y permitiendo que stos expulsen sustancias de desecho y secreciones hacia el torrente vascular. Cada hepatocito contiene un millar o ms mitocondrias. Esta abundancia se debe a los variados tipos de actividad metablica que lleva a cabo este tipo celular. De todos modos la cantidad de mitocondrias no es fija, dependiendo del estado funcional de la clula: cuando la actividad de sta requiere un alto gasto de energa, el n de mitocondrias es elevado.
Tcnica de tincin:Mtodo de Regaud(hematoxilina frrica)
Objetivo: Reconocer cloroplastos, cromoplastos y leucoplastos en material vegetal fresco
Caractersticas: Estas organelas exclusivas de la clula vegetal y algas eucariontes, pueden diferenciarse en plstidos incoloros o leucoplastos y plstidos coloreados cromoplastos y cloroplastos.
A.-Los leucoplastos estn rodeados por una doble membrana, no contienen pigmentos y se caracterizan por acumular sustancias de reserva. B.-Los cromoplastos tambin estn limitados por una doble membrana y presentan pigmentos diferentes de la clorofila. Su funcin es dar color a las flores y frutos, a fin de dotarlos de una coloracin atractiva para los animales que intervienen en la polinizacin y dispersin de frutos y semillas. C.-Los cloroplastos, de importancia fundamental para la clula vegetal, ya que en ellos se lleva a cabo el fenmeno de fotosntesis. Poseen clorofila como pigmento principal, pero, puede tener diversas cantidades de otros pigmentos. El cloroplasto posee forma ovoide o de disco biconvexo con 10 um de largo x 3um de dimetro. Est limitado por dos membranas que no presentan puntos de contacto. En el interior presenta una matriz o estroma, donde se encuentran ribosomas pequeos (tipo procarionte) y una molcula de ADN circular y un sistema de membranas. Las membranas internas del cloroplasto se disponen formando vesculas aplanadas llamadas tilacoides. Estos se agrupan como pilas de moneda formando los grana. Los grana tambin estn comunicados entre s mediante vesculas.
Observacin de plstidos al MO
A.-Leucoplastos: en papa puede observarse que los grnulos de almidn estn incluidas en leucoplastos. Se los ve como delgadas capas concntricas depositadas alrededor de un punto, el hilio.
B.-Cromoplastos: se pueden observar en pulpa de tomate o de morrn. Se acumulan con mucha frecuencia alrededor del ncleo como pequeas esferas coloreadas.
C.-Cloroplastos: en epidermis de hoja de lirio o malvn, se observa, entre las clulas epidrmicas, unas clulas arrionadas agrupadas por parejas que forman los estomas; en estas clulas se encuentran cloroplastos, que se ven como esferas de color verde. A B C
A B C Diagnstico Coloracin Aumento
NUCLEO
Objetivo Reconocer al MO las diferencias entre ncleo interfsico y en divisin
Toda clula pasa en el transcurso de su vida por dos perodos: el interfsico o de no divisin y el de divisin
Ncleo interfsico
Caractersticas: En el ncleo interfsico se presentan las siguientes estructuras 1.-Envoltura nuclear: formada por sculos aplanados o cisternas compuestas por dos membranas. Estas se unen a nivel de los poros, orificios que permiten la transferencia de material entre ncleo y citoplasma. La membrana interna est en contacto con fibras de cromatina, la externa tiene ribosomas adosados. 2.-Nucleoplasma o jugo nuclear: ocupa todo el espacio nuclear. Es un coloide de composicin similar al citoplasma 3.-Cromatina: sustancia que rige indirectamente todos los procesos vitales de la clula y que durante la divisin se condensa formando los cromosomas. 4.-Nucleolo/s: generalmente esfrico y muy refringente. Puede ser nico o varios. Su funcin es el armado de ribosomas antes que estos pasen al citoplasma
Funciones del ncleo 1) Almacenamiento de la informacin gentica 2) Duplicacin del material gentico (ADN) 3) Transcripin y formacin del ARN a partir de una molcula de ADN
Ncleo en divisin
El aspecto del ncleo cambia durante el perodo de divisin celular debido a que sufre las siguientes transformaciones: -Desaparece la envoltura nuclear y los nucleolos -Se condensa la cromatina formando cuerpos que se colorean intensamente
BIBLIOGRAFIA Alberts,B;Bray D;Lewis,U y col.Biologa Molecular de la clula.Ed Omega. Espaa.1986 Berkaloff y col. Biologa y Fisiologa celular.Ed Omega.Espaa.1987. Curtis Helen. Biologa.Ed Panamericana.BsAs.1992 De Robertis y De Robertis. Biologa celular y molecular.Ed El Ateneo.1986
ACTIVIDADES DE AUTOEVALUACION
1.- Diferencie: ncleo de nucleolo REL de RER cloroplastos de mitocondrias
2.-Cules son las principales diferencias entre una clula animal y una clula vegetal?
3.-Cul es la interaccin entre ribosomas, retculo endoplasmtico, aparato de Golgi y vesculas de secrecin, en la sntesis y envo del nuevo material de membrana y en la exportacin de protenas por la clula?
4.-En funcin de los conocimientos de la relacin organelas-funcin que componentes esperara que fuesen los ms destacados en cada uno de los siguientes tipos celulares? -clula muscular -espermatozoide -clulas de las hojas verdes -glbulos blancos