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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE


SCIENTIFIQUE

Universit Mentouri Constantine
Facult des Sciences de la Nature et de la Vie
Dpartement des Sciences de la Nature et de la Vie
N d!ordre
N de srie


En vue de lobtention du diplme de Magister
en Biochimie-Microbiologie appliques

Prsent par :

Dendouga Wassi la

Thme

I solement et identification de moisissures productrices de
protases partir de milieux extrmes.
Extraction et tude des proprits de la protase produite





Directeur de la thse : M echakr a. A


Anne Universitaire : 2006

1





Au cours des deux dernires dcennies, le dveloppement de la microbiologie a abouti
lobtention de matriels biologiques trs divers, modifis gntiquement ou non et
susceptibles dtre utiliss dans des procds de production de vitamines, dhormones, de
vaccins et denzymes. Les enzymes dorigine microbienne, prsentent des proprits et des
spcificits diverses. Ces proprits refltent de plus en plus leurs utilisations dans divers
domaines dapplications, tels que lindustrie alimentaire humaine et animale, les dtergents
pour lessives, lindustrie des tanneries et lindustrie pharmaceutique. Environ 40% des
enzymes industrielles sont dorigine fongique (Botton et al ; 1999). La culture des
champignons pour la production denzymes seffectue soit sur substrat solide, soit en culture
submerge comme cest le cas pour la production de la plupart des mtabolites dorigine
microbienne. Au cours des trente dernires annes, un nombre important de ces fermentations
est ralis sur des dchets agroalimentaires pour produire principalement des hydrolases.

De nombreux sous-produits rejets par lindustrie alimentaire peuvent tre rcuprs et
utiliss dans diffrents secteurs industriels et agricoles, selon leurs caractristiques et les
possibilits des marchs (alimentation animale et humaine). La valorisation des dchets
agroalimentaires par les microorganismes (valorisation biotechnologique) permet la cration
demplois, de nouvelles sources de profits et une avance technologique. En France,
lindustrie laitire rejette elle seule 780 000 tonnes/an de lactosrum (Nakais et Modler,
2000). Par sa composition biochimique, celui-ci peut tre un milieu favorable la production
denzymes, en particulier les protases.

Cest cette caractristique que nous avons exploit dans ce travail dans le but dtudier la
production des protases par des moisissures locales isoles de milieux extrmes. Pour cela
nous nous somme fixs plusieurs objectifs, raliss en 5 tapes.

La 1
re
tape est lisolement des moisissures sur diffrents milieux, puis la slection des
souches protolytiques laide dun milieu glos au lait (lait glos).

I I n nt tr ro od du uc ct ti io on n
2
La 2
eme
tape est ltude de la composition chimique du lactosrum (milieu de fermentation).

La 3
eme
tape est la production des protases par les souches slectionnes dans ltape
prcdente sur deux milieux de fermentations, lun synthtique et lautre naturel, chacun
trois pH diffrents.

La 4
me
tape porte sur le dosage de lactivit protasique exocellulaire et endocellulaire des
souches slectionnes, dans le but de dterminer la souche la plus performante et le milieu
favorable la production des protases.

La 5
me
tape enfin, consiste en une extraction de lenzyme par prcipitation, suivie de ltude
de ses caractristiques physicochimiques et cintiques.

ChapitreI : Etudebibliographique
3










































Fig. 01 : Principales classes des moisissures (Frazier, 1967).


Mucorales
Mucor
Zygorrhynchus
Rhizopus
Absidia
Thamnidium

Septomyctes
Basidiomyctes Ascomyctes Zygomyctes Oomyctes Deutromyctes


Melanconiales Moniliales
Moniliaceae Dematiaceae Tuberculariaceae
Eumyctes
Fusarium Aspergillus
Penicillium
Trichothecium
Geotrichum
Monilia
Sporotrichum
Botrytis
Cephalosporium
Scopulariopsis
Trichoderma
Cladosporium
Helminthosporium
Alternaria
Stemphylium
Stachybotrys
Entomophthorales Sphaeropsidales
Phycomyctes

Cryptococcales
ChapitreI : Etudebibliographique
4
1. Moisissures

1.1. Gnralits

Les moisissures peuvent tre dfinies comme des microorganismes htrotrophes
filamenteux et immobiles, dont la structure cellulaire est celle dune cellule eucaryote
classique (Nicklin et al., 2000). Certaines vivent en symbiose avec des vgtaux, dautres sont
des parasites des vgtaux ou des animaux, dautres enfin sont des saprophytes se
dveloppant aux dpens de substrats inertes ou en voie de dcomposition (Bourgeois, 1989 ;
Leveau et Bouix, 1993). Les moisissures possdent un appareil vgtatif constitu par un
thalle filamenteux, le myclium, dont les filaments sappellent des hyphes. Le myclium peut
diffrencier des organes forts varis selon les groupes, spcialiss dans la multiplication et la
dissmination, auxquels on accorde la dnomination globale de spores (Bourgeois, 1989).

1.2. Classification

Les moisissures ne correspondent pas un groupe systmatique homogne, mais se
situent en diverses familles de champignons microscopiques. Leur classification est base sur
des caractres morphologiques (structure du myclium) et le mode de reproduction (Davet,
1996). Les Eumyctes (les vrais champignons) forment un groupe trs vaste incluant les
classes principales des moisissures (Bourgeois, 1989), savoir les Zygomyctes, les
Ascomyctes, les Basidiomyctes et les Deutromyctes (voir fig. 01).

Zygomyctes

Ces moisissures possdent un thalle myclien non cloisonn et des organes de
reproduction sexue (Guiraud, 1998). La famille la plus importante dans cette classe est celle
de Mucorales qui comprennent un grand nombre de moisissures saprophytes mais aussi
quelques espces parasites des champignons, des animaux et des hommes (mucormycoses) et
surtout des contaminants de nombreux produits alimentaires (Leveau et Bouix, 1993 ; Boiron,
1996 ). Certaines Mucorales sont parfois utilises industriellement en raison de leurs activits
enzymatiques (amylase, protase,) comme Rhizopus et Mucor (Guiraud, 1998).


ChapitreI : Etudebibliographique
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Aspergillus
















































Fig. 02 : Quelques champignons filamenteux (voir annexe 07 ).

Geotrichum

Penicillium Cladosporium Mucor
Trichoderma
F Fusarium
St Stachybotrys
Alternaria Trichothecium Scopulariopsis Helminthosporium Neurospora
Botrytis
Cephalosporium Rhizomucor Rhizopus
Acremonium
ChapitreI : Etudebibliographique
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Ascomyctes

Les Ascomyctes sont dfinis comme des champignons thalle myclien cloisonn,
dont le mode de reproduction est sexu avec des spores endognes (ascospores). Cette classe
regroupe de nombreux parasites des vgtaux mais aussi de nombreuses moisissures
(Guiraud, 1998). Elles sont cependant plus particulirement nombreuses dans lordre des
Eurotiales, des Microscales et des Sphaeriales. Dans cette classe, le genre le plus connu est
Endothia et Neurospora (Bourgeois, 1998).

Basidiomyctes


Elles regroupent seulement certaines moisissures parasites. Elles sont caractrises par
un thalle myclium sept et une reproduction sexue avec la formation de spores exognes
(basidiospores), cest le cas de Agaricus et Coprinus (Botton et al., 1999).

Deutromyctes


Egalement appels champignons imparfaits, les Deutromyctes sont caractriss par un
myclium cloisonn et une reproduction vgtative ralise par des spores asexues ou par
simple fragmentation du myclium (Boiron, 1996). Ces moisissures constituent la majeure
partie des Hyphales ; elles sont classes en fonction des caractristiques des organes
conidiens et du mode de groupement des hyphes. Le groupe des Deutromyctes contient un
grand nombre de contaminants de vgtaux et de produits alimentaires : Trichoderma,
Cephalosporium, Fusarium, Geotrichum, cette classe regroupe aussi les Penicillium et les
Aspergillus (Frazier, 1967; Punt et al., 2002). La fig. 2 montre des exemples de quelques
genres appartenant ces diffrentes classes.

1.3. Mode de reproduction

Les moisissures produisent des organes de reproduction que lon appelle de faon
gnrale spores et qui peuvent avoir une origine sexuelle ou vgtative. Les spores dorigine
sexuelle rsultent dune fcondation (zygospores et oospores) ou dune miose (ascospores ou
basidiospores) alors que les spores dorigine vgtative rsultent dune simple mitose que lon
appelle frquemment conidies. Elles assurent la reproduction et la dissmination chez les
ChapitreI : Etudebibliographique
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espces de formes imparfaites, mais on les trouve galement chez les autres groupes o elles
coexistent au cot des formes de reproduction sexue et leur type varie selon les moisissures
- Les thallospores sont formes aux dpens du thalle par transformation dlments
prexistants.
- Les sporangiospores sont des cellules flagelles ou non ne provenant pas dune fraction
prexistante du thalle.
- Les conidiospores sont des cellules qui ne sont pas issues directement dune portion
prexistante du thalle. Ces spores toujours terminales naissent dun filament appel
conidiophore (metulae, phialide, etc.) (Guiraud, 1998).

1.4. Conditions de croissance

1.4.1. Elments nutritifs

Les moisissures sont des microorganismes htrotrophes, elles exigent donc la prsence
des lments nutritifs de base (carbone, azote et ions minraux) dans le milieu qui assure leur
croissance. Les moisissures possdent une panoplie enzymatique extrmement riche qui leur
permet dutiliser plus efficacement encore que les bactries les substrats les plus complexes.
Leur digestion doit commencer dans le milieu extrieur par des enzymes excrtes
(extracellulaires) ou lies la paroi, car seules les molcules de taille relativement petite
peuvent franchir les parois et gagner le cytoplasme (Davet, 1996).

Source de carbone et dnergie

Pratiquement tous les composs organiques peuvent tres utiliss comme source de
carbone et dnergie par les moisissures. La plupart dentre elles peuvent mtaboliser le
glucose et le saccharose avec quelques polysaccharides comme lamidon et la cellulose
(Boiron, 1996 ; Nicklin et al., 2000). Certaines dentres elles produisent des lipases
extracellulaires capables dhydrolyser les lipides en glycrol et acides gras qui peuvent tres
assimils par beaucoup despces fongiques, alors que seulement certaines espces utilisent
les acides organiques et lthanol (Boiron, 1996).



ChapitreI : Etudebibliographique
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Source dazote

La plupart des moisissures assimilent lammoniaque sous forme de sels (NH
4
+
) dont la
prsence rprime lutilisation dautres sources azotes (nitrate, acides amins, protines).
Lammoniaque est transform en acide glutamique, en glutamine ou en dautres acides
amins par transamination (Boiron, 1996), alors que seules certaines espces utilisent le
nitrate, dautres ne peuvent crotre quen prsence dazote organique et aucune moisissure ne
peut fixer lazote atmosphrique (Punt et al., 2000).

Elments minraux

La prsence des ions minraux et mtaux dans le milieu de culture est ncessaire pour la
croissance et la reproduction de plusieurs espces fongiques, il sagit essentiellement de
sulfate, de magnsium, de potassium, de sodium et de phosphore avec des concentrations plus
au moins diffrentes selon lespce (Uchicoba et al., 2001). Des traces dlments tels que le
fer, le cuivre, le manganse, le zinc et le molybdne, sont ncessaires la plupart des
moisissures pour la production des cytochromes, des pigments, des acides organiques, etc.
(Boiron, 1996).

1.4.2. Facteurs physicochimiques

Les facteurs physicochimiques ont une grande influence sur le dveloppement des
moisissures ainsi que sur la germination, nous examinerons successivement quelques
paramtres importants.

Temprature

La temprature joue un rle prpondrant dans la croissance myclienne, elle intervient
galement dans la sporulation et la germination des spores (Bourgeois, 1989). La plupart des
moisissures sont msophiles avec des optima de croissance de 25 35!C (Botton et al., 1999 ;
Julien, 2002). Quelques espces sont thermotolrantes ou thermophiles et peuvent crotre
haute temprature (au dessus de 50!C) avec une croissance optimale aux environ de 20
25!C, Aspergillus fumigatus en est un bon exemple (Botton et al., 1999 ; Nicklin et al., 2000).
Dautres sont des psychrophiles ou psychrotolrantes se dveloppant basses tempratures
ChapitreI : Etudebibliographique
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(entre -5 et 10!C) tels que Helicostylum pulchrum, Chrysosporium pannorum et
Cladosporium herbarum, ces espces peuvent survivre mme -60!C, on les rencontre dans
des entrepts frigorifiques (Davet, 1996 ; Botton et al., 1999).

Humidit

Les moisissures ont en gnral un besoin en eau faible par apport aux autres
microorganismes (Davet, 1996). Nanmoins, lhumidit a une grande influence sur le
dveloppement des moisissures non seulement sur la croissance myclienne et la sporulation
mais plus particulirement sur la germination des spores (Bourgeois, 1989).

Les moisissures myclium non cloisonn sont les plus sensibles la dessiccation ; leur
dveloppement cesse lorsque le potentiel hydrique descend au dessous de - 4 MPa (mga
pascal). Les moisissures myclium cloisonn supportent en moyenne jusqu " 10 MPa.
Cependant, les Aspergillus et les Penicillium peuvent en gnral se dvelopper des
potentiels hydriques de lordre de " 20 MPa (Davet, 1996).

pH

La grande majorit des champignons filamenteux se dveloppent dans une zone de pH
de 4.5 " 8.0 (Botton et al., 1999), bien quils soient capables de crotre dans une large gamme
de pH avec une tendance crotre dans des milieux lgrement acide .Cest le cas de
Fusarium culmorum, Trichoderma harzianum et Aspergillus oryzae. (Urbanek et al., 1984 ;
Delgado-Jarana et al., 2002). Cependant, les enzymes extracellulaires produites dans des
milieux complexes peuvent avoir des optima de pH dactivit trs diffrents (plus acides ou
plus basiques) (Botton et al., 1999).

Le pH influe sur la croissance de ces microorganismes soit indirectement en agissant sur
la disponibilit des lments nutritifs ( pH acide, le fer reste sous forme dions ferreux
assimilable), soit directement par action sur la membrane cellulaire. Par ailleurs, les
champignons modifient souvent le pH du milieu par absorption slective et change dions,
production de CO
2
ou de NH
3
ou par production dacides (Boiron, 1996).


ChapitreI : Etudebibliographique
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Oxygne

La quantit doxygne mise la disposition des moisissures est un facteur important de
dveloppement. La plupart sont arobies, les plus exigeantes vivent dans les rgions
priphriques des substrats, les moins exigeants peuvent se dvelopper en profondeur comme
Fusarium oxysporum et Aspergillus fumigatus. Certaines peuvent mme supporter une
anarobiose trs stricte comme Neocallimastix (Bourgeois, 1989 ; Botton et al., 1999).

Lumire

Les radiations du spectre visible (380 " 720) nont en gnral pas daction sur la
croissance vgtative des champignons mais peuvent agir sur la sporulation. La plupart des
moisissures nexigent pas de lumire pour leur croissance, ni pour la germination de leurs
spores (Botton et al., 1999).

1.5. Intrt industriel des moisissures

Actuellement, les moisissures jouent un rle primordial dans divers domaines
dapplications ; elles sont utilises dans les industrie alimentaires, chimiques, la biolixiviation
et la biotransformation, etc. Cependant lindustrie nexploite commercialement quun petit
nombre de mtabolites de quelques espces seulement (Boiron, 1996). Leur intrt
conomique repose sur leur activit biologique dans la production dune grande diversit de
molcules produites au cours des mtabolismes primaires et secondaires, exploites en
particulier par lindustrie pharmaceutique et en mdecine (Larpend-Gourgaud et Sanglier,
1992).

1.5.1. Intrt alimentaire

Les champignons filamenteux sont des producteurs importants dacides organiques tels
que lacide gluconique, lacide malique, lacide actique et lacide citrique (Leveau et Bouix,
1993 ; Boiron, 1996). Ce dernier est notamment produit par Aspergillus niger, o 60% de sa
production est destine au secteur alimentaire (Botton et al., 1999).

ChapitreI : Etudebibliographique
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La production de biomasse peut tre une source importante pour lalimentation animale
et mme humaine, en servant de complmentation des produits craliers. Quelques espces
fongiques ont un grand usage, cest le cas dAspergillus niger, de Fusarium graminearum et
de Trichoderma harzianum (Botton et al., 1999 ; Larpent- Gourgaud et Sanglier, 1992 ;
Delgado-Jarana et al., 2002)

Les enzymes fongiques restent toujours les outils cls de la biotechnologie et refltent de
plus en plus limportance et le rle infini des moisissures dans les diffrentes applications
alimentaires. Aspergillus niger est un bon exemple, il produit la cellulase, lamylase,
linvertase et la pectinase, employes principalement comme des catalyseurs biologiques en
glucoserie, brasserie et pour la fabrication des boissons. Cette moisissure secrte aussi des
protases, des lipases et des estrases utilises dans diffrentes applications alimentaires
(Kosikowski, 1988 ; Scriban, 1999).

1.5.2. Intrt chimique

Il sagit essentiellement de lutilisation des protases alcalines dAspergillus oryzae et
de Stachybotrys chartarum dans les dtergents (Miller, 2002).

La production de cellulase par Aspergillus niger et Trichoderma harzianum prsente une
diversit dapplications industrielles, o 48% de sa production par ces deux espces fongiques
et le genre Penicillium est utilise pour lindustrialisation des papiers et les textiles (Delgado-
Jarana et al., 2002).

Certains genres fongiques tels que Aspergillus, Mucor et Penicillium sont capables de
produire des lipides en quantits importantes et constituent une source potentielle dutilisation
chimique (Botton et al., 1999).

En biolixiviation seules les bactries prsentent un intrt industriel. Cependant,
certaines moisissures possdent dintressantes proprits ; Aspergillus ochraceus,
Penicillium funiculosum et Rhizopus arrhizus sont capables dabsorber de luranium du
minerai. Les milieux de culture carencs en facteurs de croissance et en sels minraux,
diminuent le taux de croissance, mais stimulent ce phnomne (Boiron, 1996 ; Larpent-
Gourgaud et Sanglier, 1992 ; Botton et al., 1999).
ChapitreI : Etudebibliographique
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En biotransformation les moisissures ont une zone troite dapplication. Un exemple
remarquable est lhydrolyse enzymatique de la pnicilline V par Penicillium chrysogenum et
Fusarium entranant la formation dacide amino-6-pnicillanique qui est un intermdiaire
important de la production de pnicillines semi synthtiques telles que lampicilline et
lamoxycilline (Durand et Monson, 1988).

1.5.3. Intrt pharmaceutique

La production industrielle en vitamines se limite une partie de la synthse de la
riboflavine produite spcialement par Eemothecium ashbyii cultiv en milieu agit et
supplment en lipides. La vitamine A pourrait faire lobjet dune production microbiologique
par les champignons notamment les espces de lordre des mucorales (Botton et al., 1999).

Les champignons filamenteux sont des grands producteurs dantibiotiques tel que la
pnicilline produite par le genre Penicillium et la cphalosporine produite par
Cephalosporium (Larpend- Gourgaud et Sanglier, 1992 ; Botton et al., 1999). Cependant les
acides organiques dorigine fongique nont pas une application pharmaceutique importante
(Divies, 1984).

1.5.4 Intrt mdical

Les premiers produits dorigine fongique en mdecine sont les alcalodes de lergot de
seigle (ergotamine), utiliss en gyncologie et pour diverses autres indications (Boiron, 1996 ;
Botton et al., 1999).

La dcouverte de la cyclosporine, puissant agent immunodpresseur, puis la mise en
vidence de corrlation entre lactivit de certaines enzymes et diverses pathologies ont
permis de donner un grand essor aux sciences mdicales et pharmaceutiques (Botton et al.,
1999 ; Richard, 2005).

1.6. Isolement des moisissures

La plupart des milieux naturels air, sol, eau et matires premires alimentaires peuvent
servir de matriel de dpart pour lisolement des moisissures (Clark et al., 1985 ; Karam,
ChapitreI : Etudebibliographique
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2000 ; Julien, 2002), ces chantillons naturels contiennent aussi plusieurs espces
bactriennes et des levures. Llimination de ces microorganismes pour lisolement slectif
des champignons filamenteux est ralis en le combinant traitement des milieux de cultures
par un antibiotique avec le choix et le contrle des conditions de culture. Il est important du
choisir un chantillon aussi important que le permet la mise en vidence du microorganisme
dsir (Ulacio et al., 1997).

1.6.1. Choix dchantillons naturels

Le choix de lchantillon naturel est dterminant pour la mise en vidence du
microorganisme recherch. Initialement, les souches microbiennes ont souvent t isoles du
sol ou dlments naturels (Julien, 2002). Gnralement, les microorganismes producteurs des
hydrolases sont localiss l o ces substances sont abondantes. Par exemple, les
microorganismes scrtant des cellulases sont nombreux dans les sols des forts
(Scriban,1999) tandis que les espces protolytiques, elles sont localises dans les dbris de
fromageries (Peppler et Perlman, 1979 ; Fuke et Matsuoka, 1993 ; Punt et al., 2002).

1.6.2. Addition des antibiotiques

Lisolement des moisissures est ralis le plus souvent partir de produits contenant
galement des bactries et des levures, donc il est ncessaire demployer des inhibiteurs
spcifiques pour les dtruire. Laddition dantibiotiques aux milieux de cultures est utilise
pour empcher le dveloppement des bactries. Les antibiotiques utiliss sont : le
chloramphnicol 0,5 mg/ml, loxyttracycline 0,1 mg/ml, la streptomycine 30 40 g/ml, la
colistine 0,08 mg/ml, la novobiocine 0,1mg/ml ou des colorants (rose Bengale 35 67mg/l,
cristal violet 10mg/l) (Guiraud, 1998). En raison de leur stabilit, la gentamycine et la
chloramphnicol peuvent tres striliss avec le milieu ; leurs larges spectres daction en font
des antibiotiques trs utiliss (Botton et al., 1999).
Lorsque les levures sont trs abondantes dans le milieu, il est parfois possible dutiliser
de lactidione mais faible concentration de faon ne pas inhiber la croissance des
champignons filamenteux recherchs (concentration 2 mg/l) (Guiraud, 1998 ; Waller, 2004).



ChapitreI : Etudebibliographique
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1.6.3. Choix des milieux de cultures slectifs

Le choix des milieux de cultures est galement dterminant dans lisolement des
moisissures (Harrigan et McCance, 1976). Les milieux disolement de base (et de numration
des spores) sont souvent communs ceux dcrits pour les levures tels que Czapec, le milieu
malt (voir annexe 01) (Chakraborty et al., 1995 ; Biezen et al., 1977) ou le milieu de Mossel
(Botton et al., 1999). Lors des isolements, ce dernier inhibe la prolifration des bactries en
raison de leur acidit.

1.6.4. Conditions disolement

Pour permettre lexpression la plus complte possible des microorganismes recherchs,
il convient de retenir au laboratoire les facteurs et paramtres de lenvironnement naturel qui
ont pu favoriser limplantation dune flore particulire. La plupart des moisissures requirent
pour leur dveloppement de loxygne et croissent bien en labsence de lumire. Leur
tolrance lgard du pH est souvent tendue mais avec gnralement une prfrence pour les
pH lgrement acides. Concernant la temprature, leur gamme compatible avec la croissance
est trs large et diffre selon les espces (Botton et al., 1999 ; Julien, 2002 ; Coulibaly et
Agathos, 2003).

1.6.5. Slection des moisissures protolytiques

La mise en vidence de lactivit protolytique chez divers microorganismes ncessite
un milieu de culture protin, o les protines jouent le rle dune source azote et mme
dune source du carbone. Parfois, elles constituent un inducteur de la synthse de protases
par les microorganismes (Durand et Monson, 1998). Les diffrentes protases peuvent
prsenter une spcificit vis--vis de certaines protines natives ou dnatures telles que
lalbumine, la casine, la globuline, llastine, linsuline, etc. Lobservation dune zone claire
autour de la colonie microbienne prouve la production dune ou de plusieurs protases
(Colwell et Grigorova, 1989 ; Richard, 2005).




ChapitreI : Etudebibliographique
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2. Activit protolytique


Les enzymes protolytiques sont des hydrolases formes dune ou de plusieurs chanes
polypeptidiques. Les protases catalysent le clivage des liaisons peptidiques de toute molcule
protique, elles scindent les protines en fragments polypeptidiques, qui seront par la suite
transforms sous linfluence des peptidases en leurs sous-units constitutives, les acides
amins, offrant une multitude de structures (Frazier, 1967 ; Scriban, 1999).

Ces enzymes sont gnralement synthtises sous forme de zymognes inactifs, ce qui
permet de protger la cellule contre tout effet dsastreux. Lactivation du zymogne en
enzyme active ncessite une modification covalente irrversible. La formation des enzymes
protolytiques est parfois rprime par ladjonction au milieu dun hydrolysat de protines ou
dun mlange dacides amins (Pelmont, 1995 ; Scriban, 1999).

2.1. Protases dorigine vgtale

Les protases sont prsentes chez toutes les espces vivantes. Les vgtaux ont, avant
les microorganismes, t lobjet de recherche en vue disoler des enzymes protolytiques,
cest le cas de la bromlaine extraite de tige de lananas (Ananas comosus Merr), la ficine
issue du figuier (Ficus glabrata) (Alais, 1975 ; Scriban, 1993 ; Moodie, 2001) ces deux
enzymes sont proches de la papane ; extraite du latex dune plante quatoriale et tropicale
(Carica papaya), qui, elle seule, peut rompre des liaisons peptidiques que la trypsine et la
pepsine rompent sparment. Il en est probablement de mme pour les prparations
enzymatiques provenant de chardons, dartichauts, de gaillets, de courges, etc (Alais, 1975).
La kratinase, une autre protase qui dgrade les cheveux et les laines est produite par
quelques groupes de plantes (Rao et al., 1998).

2.2. Protases dorigine animale

Seules les protases scrtes par lestomac des ruminants prsentent un intrt
industriel ; la prsure prpare partir du quatrime estomac des veaux est la plus rpandue et
la plus ancienne ainsi que les pepsines bovines et porcines. Lactivit non spcifique des
enzymes pancratiques, trypsine et chymotrypsine, les rendent moins importantes que les
ChapitreI : Etudebibliographique
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enzymes gastriques (McKenzie, 1971 ; Alais, 1975 ; Scriban, 1999). Des tudes rcentes
permettent aussi lidentification des protases chez les helminthes : Schistosoma sp ; Fasciola
sp ; Taenia sp et Haemonchus sp, o elles apparaissent comme cibles potentielles majeures en
thrapie et vaccination antiparasitaire (Trap et Boireau, 2000).

2.3. Protases dorigine microbienne

Les protases peuvent tres produites par les moisissures, les levures et les bactries.

2.3.1. Protases des moisissures

Les enzymes fongiques reprsentent 40% du march mondial des enzymes industrielles.
Les protases constituent les enzymes les plus importantes qui peuvent tres produites par
plusieurs genres fongiques tels que Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Mucor, Rhizopus,
Geotrichum, Fusarium, Rhizomucor, Endothia, etc. Ce groupe denzymes dispose de
possibilits dapplications biotechnologiques trs tendues. Actuellement elles sont de plus en
plus utilises en boulangerie, dans lindustrie alimentaire humaine et animale, dans les
dtergents pour lessives, dans lindustrie des tanneries et lindustrie pharmaceutique (Frazier,
1967 ; Ul-haq et al., 2003).

2.3.2. Protases des levures

Certaines levures produisent aussi des enzymes protolytiques, il sagit essentiellement
des genres Saccharomyces, Rhodotorula, Candida, Debaryomyces. Saccharomyces cerevisiae
par exemple, produit trois types de protases ; une aspartylprotase, une srine protase et une
mtalloprotase. Lactivit protolytique de ces genres est utilise particulirement pour
laffinage des fromages (Kresze, 1991 ; Boiron, 1996).

2.3.3. Protases des bactries

Il sagit essentiellement de la subtilisine ou subtilase, une protase produite par Bacillus
subtilis et quelques genres apparents. Celle-ci est trs stable et rsiste bien laction des
dtergents. Par ailleurs, elle est naturellement excrte dans le milieu, ce qui facilite sa
ChapitreI : Etudebibliographique
17
purification (Calk et al., 2000 ; Frazier, 1967). Les bactries psychrotrophes du lait et en
particulier, Pseudomonas fluorescens et P. putida produisent des mtalloprotases
thermorsistantes utilises en particulier pour la coagulation du lait et pour laffinage du
fromages. Ces bactries sont dtruites par la pasteurisation mais les protases extracellulaires
quelles produisent ne sont que partiellement inactives (Cousin et al., 1982). Les protases
extracellulaires de Streptococcus lactis jouent un rle trs important dans laffinage des
fromages (Desmazeaud, 1978).

2.4. Classification et nomenclature

Selon la nomenclature de lunion internationale de biochimie et biologie molculaire
(IUBMB, 1998), les protases sont classes dans le sous groupe 4 du groupe 3 (hydrolases).
Cependant, elles ne se soumettent pas facilement dans ce systme de classification cause de
la complexit de leur structure et de leur mcanisme daction ; leur classification se base sur
plusieurs critres tels que la longueur de la chane polypeptidique, le mode dattaque de la
chane, le pH dactivit et la nature de rsidu impliqu dans le site actif (Colwell et Grigorova,
1989 ; Rao et al., 1998).

2.4.1. Selon longueur de la chane polypeptidique

Cest le premier critre de classification des enzymes protolytiques. Il existe deux
catgories; les protases, qui scindent la molcule protique en fragments polypeptidiques et
les peptidases qui hydrolysent les polypeptides et les transforment en acides amins libres
(Frazier, 1967 ; Colwell et Grigorova, 1989).

2.4.2. Selon le mode dattaque de la chane polypeptidique

En fonction de leur mode dattaque, les peptidases sont subdiviss en deux classes ; les
endopeptidases et les exopeptidases (Scriban, 1999 ; Moodie, 2001). Ces dernires sont elles
"mmes subdivises en deux sous-classes les aminopeptidases et les carboxypeptidases. Les
aminopeptidases commencent leur action par lextrmit NH
2
libre du polypeptide et leur
activit dpend souvent de la prsence dion mtallique ; les carboxypeptidases commencent
leur attaquent par lextrmit COOH libre du polypeptide (voir fig. 03) (Scriban, 1999 ; Trap

ChapitreI : Etudebibliographique
18



























Fig. 03 : Mode dattaque de la chane polypeptidique (Scriban, 1999).






+
NH
2
" CH " CO ---------NH" CH" COOH
R R
NH
2
" CH " CO ---------NH" CH" COOH
R R
endopeptidase
NH
2
" CH " COOH
NH
2
" CH " CONH " CH" CO------
NH
2
" CH " COOH NH
2
" CH " CONH " CH" COOH
R R R
+
exopeptidase aminopeptidase carboxypeptidase
NH
2
" CH " CONH " CH " COOH ------------------------ NH
2
" CH " CONH " CH " COOH

R R R R
R
+
R R
ChapitreI : Etudebibliographique
19
et Boireau, 2000). Lactivation de ces diffrentes enzymes conduit la libration de di et
tripeptides qui sont ensuite hydrolyss en acides amins (Scriban, 1999).

2.4.3. Selon le pH dactivit

Selon ce paramtre, les enzymes protolytiques de diffrentes origines sont classes en
trois groupes : des protases acides ; neutres et alcalines (Hartely, 1960 ; Martinelli et
Kinghorn, 1994). Dans ce contexte, les moisissures reprsentent un groupe de
microorganismes physiologiquement diffrents des autres groupes, elles possdent une
gamme denzymes actives des pH diffrents, cest le cas des protases produites par
Aspergillus oryzae, Penicillium camenberti et Penicillium roqueforti. Certaines protases
fongiques ont des optima de pH trs acides de 2.5 5.0 (Botton et al., 1999 ; Auberger et al.,
1985 ; Mechakra et al., 1999).


2.4.4. Selon la nature de rsidu impliqu dans le site actif

Les squences primaires et la spcificit des acides amins de leur site actif ont permis
la classification des endopeptidases en quatre grandes familles, les srylprotases, les
cystylprotases, les aspartylprotases et les mtalloprotases (IUBMB, 1998).

Srylprotases

Les protases srine sont trs rpandues dans la nature, aussi bien chez les eucaryotes
que chez les procaryotes. Elles forment une famille denzymes apparentes entre elles ainsi
quavec certaines estrases ; leur mcanisme catalytique implique lintervention dun rsidu
srine. Parmi ces protases, on trouve la chymotrypsine, la trypsine, llastase et la subtilisine
(Reginald et al., 1975 ; Kortt et al., 1994 ; Pelmont, 1995 ; Trap et Boireau, 2000).

Cystylprotases

Cest galement une grande famille de protases, leur activit catalytique ncessite la
prsence dhistidine, daspartate et la cystine. Elles comprennent entre autres la papane, la

ChapitreI : Etudebibliographique
20




















Fig. 04 : Mcanisme daction des protases (Pelmont, 1995).













ChapitreI : Etudebibliographique
21
bromlaine, la ficine et les cathepsines (B, L et H) du complexe lysosomial qui participent au
renouvellement des protines dans la cellule (Kresze, 1991 ; Pelmont, 1995).

Aspartylprotases

Les protases aspartate sont des enzymes rpandues chez les eucaryotes des
champignons aux vertbrs, elles fonctionnent de prfrence en milieu acide. Certaines sont
labores par des rtrovirus (sarcome de Rous). La pepsine et la chymosine (rnine)
appartiennent aussi cette famille. Toutes ces enzymes sont caractrises par la prsence de
deux rsidus essentiels daspartate et sont inhibes par la pepstatine ou par des poxydes
(Pelmont, 1995 ; Rao et al., 1998).

Mtalloprotases

Ce sont des hydrolases qui contiennent des cations mtalliques dans leur site actif,
gnralement du zinc. Le mtal est un agent lectrophile qui exacerbe la ractivit de leau
avant son attaque nuclophile sur le carbonyl de la liaison peptidique rompre. Les exemples
les plus remarquables sont la thermolysine et les endopeptidases de la brosse intestinale de la
famille des astacines (Pelmont, 1995 ; Jakubowski, 2001).

2.5. Mode daction

Le mode daction des protases diffre dune enzyme l'autre par la nature de leur site
actif, bien quelles aient toutes le mme principe de base. Ce processus catalytique est rsum
dans trois tapes :
- Dans les deux premires tapes, lenzyme dforme la liaison peptidique et renforce la
polarit du carbonyl, qui facilite son attaque nuclophile conduisant la formation dune
liaison covalente transitoire entre le morceau portant le carbonyl du substrat et lenzyme avec
la libration de lautre morceau (le premier produit) proton par un proton cd dun rsidu
enzymatique.
- Dans la troisime tape, une nouvelle substitution nuclophile est exerce par le OH
-
dune
molcule deau et libre le deuxime produit de la raction, o le site actif de lenzyme se
trouve rgnrer par un proton (de lH
2
O) (Pelmont, 1995).
ChapitreI : Etudebibliographique
22
2.6. Proprits analytiques

Lactivit protolytique, comme toute raction enzymatique, dpend fortement du pH et
de la temprature. Pour la plupart des enzymes, on distingue facilement une troite zone dite
de pH optimum et de temprature optimale o la vitesse de raction est la plus grande. La
vitesse des ractions enzymatiques dpend aussi de la prsence de certains activateurs ou des
inhibiteurs (Penasse, 1974).

Tableau n!1 : Proprits analytiques de quelques enzymes protolytiques (Deymi et al.,
1981).

Classe Exemple Origine pH
Optimal
T
Optimale
Inhibiteur

S
e
r
y
l

p
r
o
t

a
s
e
s


chymotrypsine
trypsine
subtilisine


p.extracellulaire
endopeptidase


pancras
//
B .subtilis
B.licheniformis
B.amyloliquefaciens
Fusarium culmorum
Trichoderma viride

8.0 - 8.5
7.5 " 8.0
7.4
10
10
8.3 " 9.6
7.0 " 8.0

35
45
60
56
60
50
40

nombreux aa
PPN ou OP
TSF
inhibiteurs naturels
PMSF
nombreux aa


C
y
s
t

y
l
p
r
o
t

a
s
e


papane
ficine
protase neutre
aminipeptidase
streptopain
cathepsineK

Carica papaya
Ficus globrata
Geotrichum candidum
Lactobacillus helveticus
Streptococcus sp
cellules animales

8.0 " 8.5
4.0 " 6.0
7.0
7.0
7.2
6.5

35
35
42
37

37


Hg
EDTA
oxydants
agents chlateurs
// et EDTA
A
s
p
a
r
t
y
l
p
r
o
t

a
s
e
s


pepsine A
chymosine
cathepsine D
p.extracellulaire
//



estomac
estomac de veau
cellules animales
Trichoderma harzianum
Aspergillus niger


1.5 " 2.5
4.0 " 4.5
2.5 " 3.5
4.5
4.6

40
40 " 42
37
40
50

alcools
pepstatine des poxydes
( EPNP et le DAN)



M

t
a
l
l
o
p
r
o
t

a
s
e
s


carboxypeptidaseA
carboxypeptidaseB
P.bactrienne
collagnase

lintestin grl des vertbrs
//
Micrococcus caseolyticus
Cellules animales




7.5
8.0
7.4
7.4

37
37
50
38

certains aa
certains aa
agents chlateurs


ChapitreI : Etudebibliographique
23
Tableau n!2 : Quelques protases fongiques et leurs applications industrielles.


Genre

Espce

Type denzyme

Applications industrielles

Rfrences




Aspergillus





niger

oryzae

melleus
candidus
flavus
saitoi
parasiticus
sojae

p.ac

p.ac, p.n et p.al

p.al
//
//
p.ac
p.al
p.al

aide digestive, prparation des
souces de soja et panification
attendrissage des viandes, aide
digestive, dtergents, brasserie
dtergents pour lessives
//
clinique
Affinage des fromages
dtergents pour lessives
prparation des souces de soja


Jernejc et Cimerman, 2001.
Rugsaseel et al., 1995.
Davidson et al., 1975.
Haussnert et al.,1996.
Dahot, 1987
Jernejc et Cimerman, 2001
//
Dahot, 1987
//
Botton et al., 1990

Endothia


parasitica p.ac

Coagulation du lait et laffinage
des fromages

Durand et Monson, 1982

Fusarium


culmorum

p.ac
p.al


Mdicale (phytopathologie)
Hydrolyse des protines crales


Urbanek et Yirdaw, 1984
Pekkarinen et al., 2002

Geotrichum


candidum

p.n

Affinage des fromages

Boiron, 1996

Mucor


bacilliformis
miehei
pusillus


p.ac

Coagulation du lait

Fernandez-Lahore et al.,1998
Durand et Monson, 1982


Penicillium


camenberti
expansum
requeforti
tanthinellum


p.ac, p.n et p.al
p.ac
p.ac, p.n et p.al
p.ac

Industrie laitire (affinage des
fromages et la coagulation du
lait)

Auberger et al., 1985
Dahot, 1987
Dai et al., 2004.Modler et al.,
1974.Sodek et Hofmann,
1970

Rhizomucor

miehei


p.ac

Coagulation du lait et
lattendrissage des viandes


Boiron, 1996

Rhizopus

oligosporus


p.ac

Hydrolyse des protines
destines lindustrie
alimentaire


Ul-Haq et al., 2003

Stachybotrys

chartarum

p.al

Dtergents


Miller, 2002

Trichoderma


harzianum
viride


p.ac
p.n

Applications alimentaire et
mdicale

Delgado-Jarana et al., 2002
Uchicoba et al., 2001
ChapitreI : Etudebibliographique
24
2.7. Applications industrielles des protases

La naissance de lindustrie des enzymes a concid avec le dbut du vingtime sicle et
avec lapparition des premires enzymes microbiennes, essentiellement des amylases.
Aujourdhui, lapplication de diffrentes enzymes a connu un grand essor dans des domaines
extrmement varis. Les principales industries utilisatrices de protases sont les dtergents
pour lessives, la tannerie, la biosynthse industrielle, la laiterie, la panification, la brasserie et
lapplication mdicale et pharmaceutique (voir tableau n! 2) (Durand et Monson, 1982 ;
Siezen , 1988 ; Rao, 1998).

2.7.1. Applications chimiques

Les dtergents constituent lapplication industrielle la plus importante des enzymes, les
protases reprsentent environ 60% du march mondial o elles jouent un trs grand rle dans
lamlioration du pouvoir dtergent dune lessive ; elles sont capables de dissoudre les taches
protiques basse temprature contrairement aux produits chimiques qui ne possdent pas des
proprits quivalentes mme haute temprature (Garicia- Conesa et al., 1999). Dans ce
contexte, la subtilisine de Bacillus est lune des enzymes les plus tudies et les mieux
connues, 80% de sa production tant dvolue ce secteur. Plus de 50 de ces enzymes ont t
identifies et la squence primaire de 40 dentres elles est connue (Heslot, 1996 ; Garicia-
Conesa et al., 1999).

Dans les tannerie, les protases alcalines dAspergillus et de Bacillus remplacent de plus
en plus frquemment les substances chimiques et toxiques employes au cours de la
production (confitage, lpilage et le reverdissage des peaux). De cette faon, on conomise
de vastes quantits de chaux, de sulfure de sodium, de solvants divers et surtout de sels
chromiques toxiques, rduisant ainsi considrablement la pollution des eaux et le travail des
dcharges (Rao ,1998).

2.7.2. Applications mdicales et pharmaceutiques

Les protases sont impliques dans des nombreuses fonctions des cellules eucaryotes.
De plus, elles jouent un rle critique dans la virulence des agents pathogne (Colwell et
ChapitreI : Etudebibliographique
25
Grigorova, 1989) et plus particulirement des parasites. Lensemble des rles cls
protolytiques dans la virulence parasitaires en font des cibles potentielles en thrapie et
vaccination antiparasitaire. Des essais vaccinaux contre la leishmaniose utilisant la gp63, une
mtalloprotase zinc, ont t raliss, cette molcule tant implique dans les stades
prcoces de linvasion parasitaire. Plusieurs cystylprotases de trmatode Fasciola hepatica
semblent tre de bons candidats pour lummunodiagnostic. De mme des protases identifies
chez diffrents parasites et utilises comme vaccin recombinant font actuellement lobjet
dtudes (Trap et Boireau, 2000).

En dehors de la vaccination antiparasitaire, des inhibiteurs spcifiques des protases
virales ont actuellement un grand intrt comme mdicaments potentiels, car ils sont
susceptibles de bloquer la production de virus partir dune cellule dj infecte (Heslot,
1996).

Les enzymes protolytiques dAspergillus oryzae sont utilises comme des aides
digestives pour compenser certaines carences pathologiques (Haussner et al., 1996 ; Rao et
al., 1998) la collagnase de Clostridium ou la subtilisine sont employes en combinaison avec
des antibiotiques pour traiter des brlures et des blessures (Rao, 1998).

2.7.3. Applications alimentaires

Lapplication des protases lindustrie alimentaire nest pas rcente. Pour la
fabrication des fromages, seules les enzymes coagulantes fongiques ont donn de bons
rsultats, souvent comparables ceux obtenus avec la prsure et la pepsine bovine et porcine.
Cependant, la majorit des prparations coagulantes provenant du rgne vgtal ont donn des
rsultats dcevants car elles possdent le plus souvent une activit protolytique trs leve,
qui se traduit par lapparition dinconvnients technologiques majeurs (Alais, 1975 ; Peppler
et Perlman, 1979)

En panification, laction protolytique dAspergillus oryzae, de la papane ou de la
bromlaine sur le gluten amliore la manipulation de la pte et augmente le volume de la mie
en rduisant le temps de ptrissage (Durand et Monson, 1982 ; Moodie, 2001).
ChapitreI : Etudebibliographique
26
Lenzyme bactrienne, la subtilisine est utilise comme additif dans les conserves
alimentaires pour dtruire les spores des germes Clostridium (Rao et al., 1998 ; Durand et
Monson, 1982).

La papane et certaines enzymes protolytiques microbiennes, telle que la protase
alcaline dAspergillus oryzae, sont employes comme des additifs pour augmenter la
digestibilit des aliments et lattendrissage des viandes. La protase neutre de la mme espce
est utilise pour laffinage des fromages (Fedrick et al., 1986 ; Durand et Monson, 1982 ;
Frazier, 1967 ; Haussner et al., 1996).

En brasserie, laction protolytique de la papane donne la bire finie une bonne stabilit
collodale froid (Durand et Monson, 1982).

3. Lactosrum

3.1. Dfinition

Cest un produit laitier liquide de couleur jaune obtenu durant la fabrication du fromage,
de la casine ou de produits similaires, par sparation du caill aprs coagulation du lait et/ou
des produits drivs du lait. Le caill reprsente lensemble des protines non solubles et la
matire grasse alors que le lactosrum contient toutes les substances solubles du lait (lactose,
protines et minraux solubles, un peu de matire grasse) (Dion et al., 1978 ; Luquet et
Bonjean-Linczowski, 1985).

Lactosrum doux

Cest un coproduit des fromages pte cuite, pte press et de la casine, obtenu aprs
le traitement du lait par voie enzymatique, gnralement par la prsure, avec un pH variant
entre 5,7 et 6,5.




ChapitreI : Etudebibliographique
27
Lactosrum acide

Cest la phase aqueuse rsultant de la fabrication des fromages ptes molles ou
fraches ou de casines, pour lesquels le caillage lieu sans emprsurage c'est--dire par
acidification (coagulation lactique) do leur nom. Le pH du lactosrum acide varie entre 4 et
5 (Imbert-pondaven, 1977 ; Alais, 1975, Luquet et Bonjean-Linczowski, 1985).

3.2. Composition chimique

La composition chimique du lactosrum varie considrablement selon la source du lait,
les diffrents traitements que lon fait subir pour le transformer en produits consommables et
les procds de fabrication (Laplanche, 2004).

Tableau n!3 : Composition chimique des deux types du lactosrum en g/l (Alais, 1975).



composant chimique


Lactosrum doux

Lactosrum acide

Matire sche
Lactose
Lipides
Matires azotes totales
Cendres
Calcium
Phosphore
Potassium
Chlorure
Acide lactique

55 75
40 57
0 5,0
7,0 11,0
4,0 6,0
0,4 0,6
0,4 0,7
1,4 1,6
2,0 2,2
0 0,3

55 65
38 55
0 2,0
4,8 10,5
6,0 8,0
1,2 1,4
0,5 0,8
1,4 1,6
2,0 2,2
7,0 8,0



ChapitreI : Etudebibliographique
28

Tableau n!4 : Activit biologique des protines et des peptides du lactosrum (Mclntoch,
1998 ; Berry, 2000).


Protine ou peptide

Activit probable


Protines du lactosrum brut

Anti-cancrogne
Stimule le systme immunitaire
Prolonge la dure de vie
Rduit le cholestrol


lactoglobuline
lactorphine
lactalbumine
lactorphine

Facilite la digestion
Augmente le contrle de la douleur
Anti-cancrogne
Augmente le contrle de la douleur



Lactoferrine




lactoferricine

Antimicrobien (antibactrien/antiviral)
Contrle le transport du fer
Stimule le systme immunitaire
Anti-inflammatoire
Favorise la croissance des cellules
Anti-cancrogne
Antimicrobien


immunoglobuline

Immunit passive


lactoperoxidase

Antibactrien


Srum-albumine srorphine

Augmente le contrle de la douleur


glycomacropeptide

Facilite la digestion






ChapitreI : Etudebibliographique
29
3.3. Intrt industriel du lactosrum

Il ny a pas si longtemps, le lactosrum liquide tait souvent trait comme un dchet
tandis quaujourdhui on le considre comme un sous-produit utile de la production laitire.
Les produits base de lactosrum constituent un segment relativement neuf des marchs
laitiers mondiaux. Depuis 1994, le commerce international du lactosrum a connu une hausse
annuelle de prs de 25% (Nakais et Modler, 2000).

3.3.1. Intrt alimentaire

Une quantit considrable de lactosrum est utilise dans lalimentation animale, et le
march international de lalimentation animale et des ingrdients connexes est en pleine
expansion. De plus, il constitue un ingrdient alimentaire valeur ajoute, utilis dans une
vaste gamme daliments et de boissons (Granger et Jean-Blain, 1982 ; Lowisfert, 1994 ; Dryer
et al., 2001).

3.3.2. Intrt mdical

Actuellement, les scientifiques valuent les effets bnfiques des fractions de protines
de lactosrum et leur intrt qui pourraient offrir des avantages fonctionnels en matire de
sant. Lutilisation de ces fractions est fort prometteuse pour ce qui est doffrir, aux secteurs
de lalimentation et de la nutrition, des occasions de dvelopper de nouveaux produits
vraiment efficaces contre les maladies du cur (rduction du cholestrol et de la tension
artrielle), les ulcres, les cancers, etc. (voir tableau 04) (Girard, 2000 ; Berry, 2000).

3.3.3. Intrt biotechnologique

En biotechnologie, le lactosrum par sa composition biochimique possde
dintressantes proprits comme milieu de fermentation pour plusieurs microorganismes
assimilants le lactose comme source de carbone et dnergie. Il sagit des levures de
boulangerie telles que Saccharomyces cerevisiae, Candida kefyr et Kluyveromyces fragilis
(Metz et al., 1968 ; Ecalard, 1990 ; Gana et Touzi, 2001), cette dernire est cultive sur le
lactosrum doux dprotin et enrichi par des facteurs de croissance dans le but de produire
de la biomasse (Gana et Touzi, 2001). Lutilisation du lactosrum comme milieu de culture
ChapitreI : Etudebibliographique
30
est galement favorable au dveloppement de moisissures. Penicillium camemberti a permis
la production des protases acides, neutres et alcalines en utilisant plusieurs facteurs de
croissance slectionns par des mthodes statistiques (Jollivet et Belin, 1993 ; Mechakra et
al., 1999 ; Benlounissi, 2004). Ce coproduit laitier a t utilis aussi pour la fermentation de
Mucor miehei et Endothia parasitica produisant des aspartylprotases (Saint-Paul et al.,
1984 ; Seker et al., 1999). Le lactosrum dprotin a servi comme milieu de base pour la
production de la cellulase par la moisissure Aspergillus niger (Leghlimi, 2004). Certaines
espces bactriennes comme Lactobacillus bulgaricus fermentent sur des milieux de cultures
base de lactosrum pour la production dacides organiques et de diffrentes enzymes (Jannot
et al., 1984 ; Ecalard, 1990 ; Miyakawa et al., 1992).


























ChapitreII : Matriel et mthodes
31
1. Mthode disolement des moisissures productrice des protases

1.1. Prlvement

Des prlvements ont t raliss partir de quatre sites diffrents de la Sebkha dune
ville saharienne ! El-Mghair (qui se trouve 140 Km au sud de Biskra), dans le but
disoler des souches productrices denzymes protolytiques thermostables. Tous les
prlvements (du sol et de leau) sont raliss dans des conditions daseptie rigoureuse et
rcuprs dans des flacons et sachets striles et paraffins. Lchantillonnage a t fait
diffrents niveaux comme suit :
A. Au niveau du lac principal une distance de 5 m du bord et une profondeur de 50 cm
sous leau.
B. Dans une flaque deau avoisinant le lac une profondeur de 15 20 cm.
C. Du sol avoisinant le lac une profondeur de 20 cm
D. Du sol des palmeraies distantes de 30 m du lac une profondeur de 50 cm (sol).
Aprs la rcupration des chantillons, des suspensions du sol sont prpares partir
dune simple dilution puis le pH de tous les chantillons mesur tel que prconis dans la
bibliographie (Harrigan et McCance, 1976).

1.2. Milieux disolement

Trois milieux synthtiques sont employs pour lisolement des moisissures (Harrigan et
McCance, 1976) :
- lAgar blanc (voir annexe 01)
- le milieu Czapek Dox (voir annexe 02)
- le PDA (potato dextrose agar) (voir annexe 03)
La croissance bactrienne est inhibe par laddition de gentamycine aux milieux de
culture avant leur strilisation une concentration de 5 mg/l (Botton et al., 1999).

1.3. Mthode disolement

Pour prparer les suspensions du sol, 1g de chaque chantillon est dilu dans 9 ml deau
distille strile (Clark et al., 1985 ; Ulacio et al; 1997), puis une srie de dilutions dcimales
ChapitreII : Matriel et mthodes
32
est effectue sur les deux types dchantillons. Pour les deux chantillons deau, la dilution est
de 10
-1
10
-5
et pour les deux suspensions du sol la dilution est partir de 10
-1
jusqu10
-10

(Ulacio et al ; 1997). Aprs la prparation des dilutions, une agitation vigoureuse avec le
Vortex permet lhomognisation des milieux. A chaque chantillon, il a t attribu un code
dsignant son origine et son degr de dilution.

Par ailleurs, les milieux sont ensemencs dans des boites de Ptri raison de 1ml par
dilution (Ikasari et Mitchell, 1994). Les boites sont incubes 30"C et sont observes
quotidiennement pendant deux semaines. Les moisissures dveloppes sur le premier milieu
(Agar blanc) sont repiques individuellement sur Czapek Dox puis sur PDA. Aprs leur
incubation dans les mmes conditions et leur purification, elles sont ensemences sur le
milieu slectif.

2. Mise en vidence de lactivit protolytique

Les colonies appartenants aux champignons filamenteux sont ensemencs sur le milieu
slectif (lait glos) (voir annexe 04) par un repiquage au centre ; lincubation lieu dans une
tuve 30"C. Le lait glos est prpar trois concentrations en lait crm : 10%, 20% et
30% (Harrigan et McCance, 1976).

Ce milieu (la glose en lait) prsente plusieurs avantages tels que la simplicit de
prparation, la varit et la richesse en protines et le faible cot (Smith, Gordon et Clark,
1952). Lutilisation de ce milieu permet la mise en vidence de lactivit protolytique par
lapparence dune zone claire autour de la colonie productrice (Anagnostakis et Hankin,
1975 ; Harrigan et McCance, 1976).

A partir du deuxime jour et jusquau septime, des mesures sur le diamtre de chaque
colonie et sa zone dhydrolyse sont effectues. Celles-ci permettent de slectionner les
souches protolytiques les plus performantes. Chaque opration (repiquage et mesure) est
ralise en triple. Toutes les moisissures qui ont dvelopp une zone dhydrolyse sont
observes au microscope optique (objectif 25 et 40) dans le but de les identifier.


ChapitreII : Matriel et mthodes
33
3. Mthodes didentification

Lidentification des moisissures fait essentiellement appel aux caractres culturaux
(identification macroscopique) et la morphologie (identification microscopique), rarement
des proprits biochimiques (Botton et al., 1999).

3.1. Identification microscopique

Toutes les moisissures protolytiques isoles sont soumises une identification
morphologique ralise par une tude microscopique. Cette dernire est effectue par un
prlvement soigneux dun petit fragment de la flore microbienne (quelques spores et un
fragment myclien la marge du thalle) laide dune anse en platine strile. Ce fragment est
ensuite transfr sur une lame, en lui ajoutant comme diluant du lactophnol-bleu coton (voir
annexe 05), lobservation microscopique est ralise au grossissement 25 et 40 et 100.
Ce type didentification est fond essentiellement sur ltude morphologique de myclium
(absence ou prsence de cloisons, couleur, diffrentiation,) et des spores (forme, couleur,
texture des parois,) (Harrigan et McCance, 1976 ; Oteng-Gyang, 1984 ; Guiraud, 1998).

3.2. Identification macroscopique

La moisissure slectionne aprs fermentation (voir ci-dessus ) est soumise une
identification macroscopique par un examen de la culture sur cinq milieux gloss; Czapek,
CYA, malt-agar, MEA et PDA (voir annexe 06, 07 et 08) (Ottaviani et al., 1988 ; Botton et
al., 1999 ; Jernejc et Cimerman, 2001). Lexamen permet de dterminer les quatre caractres
culturaux suivants : la vitesse de croissance, la texture et la couleur du thalle, la couleur du
revers de la culture et lodeur (Harrigan et McCance, 1976 ; Rinaldi et al., 1998 ; Botton et
al., 1999). Cette tude est ralise en triple.

4. Conservation

Les moisissures sont conserves par la mthode la plus simple et la plus communment
utilise au laboratoire qui consiste repiquer ces souches la fin de leur croissance en tubes
sur glose incline (Botton et al., 1999), en utilisant comme milieu de conservation le CYA.
ChapitreII : Matriel et mthodes
34
















Fig. 5 : La courbe dtalonnage des spores d!Aspergillus sp. A 09.
















Fig. 6 : La courbe dtalonnage des spores de Stachybotrys sp. C 01.
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8

R=0.99995
Y=0.1035X
a
b
s
o
r
b
a
n
c
e


6
5
0

n
m
nombre de spores 10
6
/ml
4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
R=0.9999
Y=0.10117X
a
b
s
o
r
b
a
n
c
e


6
5
0

n
m
nombre de spores 10
5
/ml
ChapitreII : Matriel et mthodes
35
(Parks, 1997). Aprs une semaine dincubation 30"C, les cultures sont conserves 4"C
(Botton et al., 1999).

5. Mthodes de production des protases

Les moisissures retenues daprs les diamtres de leurs zones dhydrolyse sont utilises
pour la production des protases. Pour cela, elles sont prpares afin dobtenir un inoculum.

5.1. Prparation de linoculum

5.1.1. Prparation des suspensions des spores

La sporulation des cinq moisissures est ralise sur milieu PDA (potato dextrose agar)
rparti dans des erlenmeyers de 250 ml raison de 40 ml/ flacon. Lincubation lieu
temprature ambiante. Aprs une semaine, les spores sont rcupres par addition de 50 ml
deau distille strile et une agitation vigoureuse (200 rpm) (Seker, Beyenal et Tanyola,
1999 ; Mechakra et al., 2002).

5.1.2. Dnombrement des spores

Le comptage de spores des diffrentes suspensions est estim par mesure de
labsorbance 650 nm par un spectrophotomtre de type Lambda EZ 150. Les lectures
photomtriques sont traduites en nombre de spores laide des courbes dtalonnage tablies
par dnombrement au microscope (objectif 40) laide dune cellule de comptage (la
cellule de thomas) (Lenoir et Choisy, 1971 ; Mechakra et al., 2002) (voir fig. 5 et 6)..

5.2 Mthode de culture

Les cultures ont pour but de slectionner la moisissure produisant lactivit protolytique
la plus leve. Pour cela, nous avons ralis des fermentations de deus milieux, lun
synthtique (Czapek modifi) et lautre naturel ( base de lactosrum)


ChapitreII : Matriel et mthodes
36
































Fig. 07 : prparation du milieux de fermentation base de lactosrum.
Acidification spontane
Lait coagul
Filtration (papier filtre n" : 1)
Caillot
Lactosrum acide
(pH 4,6)
Centrifugation 1520 g (pendant 20 min)
Culot
Milieu de base

Dilution (2 :1, v/v)
Phosphate
mono + disodique
(0.2M) / (0.2M)
Phosphate
disodique
(0.2 M)
+
Enrichissement
Phosphate
monosodique
(0.2 M)

Strilisation 110"C pendant 20min
Trois milieux de fermentation base de lactosrum
MF3
(pH : 8,5)

MF1
(pH : 4,5)

MF2
(pH : 7,0)

Lait
+
Enrichissement
+
Enrichissement
ChapitreII : Matriel et mthodes
37
5.2.1. Prparation des milieux de fermentation

Milieu synthtique (Czapek modifi)

Ce milieu utilis est driv du milieu de Czapek (bouillon) mais sa teneur en glucose est
ramene 10 g/l et le nitrate est remplac par 10 g/l de peptone trypsique (pour la
composition chimique complte du milieu voir annexe 09) (Auberger et al., 1995 ; Guiraud,
1998). Le milieu a t prpar trois pH diffrents ; le pH de 4,5 est obtenu par addition de
phosphate monosodique (0,2 M), le pH 7,0 en utilisant le phosphate mono et disodique (0,2
/0,2 M) et le pH 8,5 en ajoutant le phosphate disodique (0,2 M) (Auberger et al., 1995). Les
milieux sont verss dans des erlenmeyers de 250 ml raison de 50 ml de milieu de production
par erlen, puis striliss 110"C pendant 20 min.

Milieu base de lactosrum

Le milieu de base est le lactosrum acide obtenu par coagulation spontane du lait semi-
crm commercial ! Dialy # produit localement, puis filtration sur papier filtre n" : 1 ( ce
niveau le pH est de 4,6). Le filtrat est alors centrifug 1520 g pendant 20 min. Le surnageant
obtenu est partag en trois parties, chacune est additionne dun tampon diffrent (2 :1, v/v)
(voir ci-dessus), permettant lobtention de milieux de base trois pH diffrents (4.5 ; 7.0 ;
8.5) (voir fig. 07). Les milieux ainsi prpars sont enrichis par deux facteurs (trypticase et les
sels MgSO
4
et le FeSO
4
) (pour la composition chimique complte du milieu voir annexe 10)
slectionns dans le cadre dune tude prcdente par optimisation en utilisant un plan
factoriel fractionn (Mechakra et al., 1999). Les niveaux optima de ces deux facteurs ont t
dtermins laide dun plan composite centr (Benlounissi, 2004).

Les ractions enzymatiques ont t effectues dans les mmes conditions dans tous les
erlenmeyers tout le long du travail avec une srie de trois rptitions. Pour chaque erlen
lactivit enzymatique endocellulaire et exocellulaire est la moyenne de trois dosages.

5.2.2. Conduite de la fermentation

Les souches slectionnes ont t cultives sur les deux milieux (Czapek modifi et le
lactosrum) aux trois pH diffrents 4,5, 7,0 et 8,5. Chaque milieu est ensemenc par un
ChapitreII : Matriel et mthodes
38
Broyage lultra-turax
(Minute/ Vitesse Max)
Filtrat
Milieu ferment
Myclium
Suspension 10%
(Poids humide/volume)
Lavage l!eau distille
Egouttage (30 min)
Addition du tampon
Extrait enzymatique
exocellulaire
Extrait enzymatique
endocellulaire
















































Fig. 08 : prparation des extraits enzymatiques.

Milieu de culture ensemenc
Incubation 30"C pendant une semaine
Ajustement du pH
la valeur initiale
ChapitreII : Matriel et mthodes
39
volume dtermin dune suspension de spores de lune des cinq souches aprs mesure de
labsorbance 650 nm et par rfrence la courbe dtalonnage, de manire avoir un taux
de 10
5
spores par ml de milieu (Chakraborty, Srinivasan et Raghanan, 1995 ; Auberger,
Lenoir et Bergre, 1999). Les milieux ensemencs sont incubs 30"C pendant sept jours
sous agitation environ 100 rpm. Les exprimentations sont ralises en triple.

6. Etude de lactivit protolytique produite

6.1. Prparation des extraits enzymatiques

Aprs les fermentations, le myclium dvelopp est spar du milieu par filtration sur
papier filtre n" : 1. Le filtrat de culture, dont le pH est ajust la valeur initiale, reprsente la
prparation exocellulaire. Le myclium est rinc leau distille, goutt sur linge propre
pendant 30 min, puis pes. Une suspension du myclium 10% (poids humide/volume) dans
le tampon voulu est soumise un broyage lultra-turax pendant une minutes la vitesse
maximale en prsence de Triton 100 1%. Le broyat reprsente lextrait endocellulaire
(voir fig. 08) (Auberger et al., 1995; Mechakra et al., 1999).


6.2. Mthode de dosage de lactivit protolytique
Lactivit protolytique est dose selon la mme mthode dcrite par Auberger et al.,
1995 et modifie par Mechakra et al., 1999.

Principe

Les protases catalysent lhydrolyse des protines et des polypeptides pour les
transformer en fragments protiques, en peptides simples et en acides amins libres, La
prcipitation par le TCA permet de rcuprer les fragments solubles dans le filtrat. La
prsence des groupements tyrosine dans le filtrat est traduite en activit protolytique
(exprim par heure dhydrolyse et par ml de milieu) par un dosage colorimtrique laide du
ractif de Folin-Ciocalteu. Celui-ci ragit avec ces groupements et avec le tryptophane pour
donner par rduction un complexe bleu.



ChapitreII : Matriel et mthodes
40
Raction enzymatique

Lactivit protolytique est dtermine par utilisation de la casine comme substrat. Le
mlange ractionnel est prpar comme suit :
- 1 ml de lextrait enzymatique dcongel juste avant le dosage.
- 0,5 ml du tampon (pour chaque pH, en ajoute un tampon spcial).
- 2,5 ml de la solution de casine dans le citrate de sodium (0,02 M) pH 7,0.
Aprs agitation, le mlange est incub 40"C au bain marie pendant 1 heure. La raction
est ensuite arrte par addition de 5 ml de TCA 4%, ce qui entrane la prcipitation des
protines. Le mlange est laiss reposer 15 20 minutes, puis filtr sur papier Whatman n" 2.

Protocole de dosage

Les composs azots non protiques prsents dans le filtrat sont doss selon la mthode
dAnson, (1938) selon le protocole ci-dessous.
On mlange :
- 1 ml du filtrat.
- 2 ml de Na
2
CO
3
15% dans le NaOH (0,1N).
On agite et on laisse incuber pendant 15 min temprature ambiante, puis en ajoute 0,5
ml de ractif de Folin-Ciocalteu dilu au 1/10
eme
, et 6,5 ml deau distille. Aprs agitation
vigoureuse, on laisse reposer 5 heures temprature ambiante lobscurit, en enfin on lit
labsorbance 750 nm, les valeurs obtenues sont converties en activit laide dune courbe
talon pralablement tablie. Lunit protolytique est dfinie par la concentration de tyrosine
en g rsultant de lhydrolyse enzymatique dans un ml de milieu et pendant une heure du
temps.

Prparation de la courbe dtalonnage

La gamme-talon est tablie partir dune solution mre de tyrosine dont les
concentrations sont comprises entre 0 et 100 g /ml selon le mme protocole dcrit
prcdemment pour le dosage de lactivit. Cependant, lextrait enzymatique est remplac par
la solution de tyrosine comme lindique le tableau suivant :


ChapitreII : Matriel et mthodes
41



























Fig. 09 : La courbe dtalonnage de la tyrosine.






0 20 40 60 80 100
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
R=0.99891
Y=0.00304X
a
b
s
o
r
b
a
n
c
e


7
5
0

n
m
concentration de tyrosine en ug/ml
ChapitreII : Matriel et mthodes
42
Concentration en tyrosine (g /ml) 0 20 40 60 80 100
Solution mre de tyrosine (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
TCA (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Na
2
CO
3
(ml) 2 2 2 2 2 2
Folin-Ciocalteu (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Eau distille (ml) 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5


Les lectures au spectrophotomtre 750 nm des diffrentes concentrations ont permis
de tracer la courbe dtalonnage (voir figure n"9).

Les rsultats des dosages de lactivit protolytique des cinq souches ont permis la
rtention dune seule souche, celle ayant donn la meilleure activit. Aprs la filtration du
milieu de production sur papier Whatman n" 1, le filtrat est centrifug 4"C pendant 10 min
1140 g. Le surnageant constitue lextrait enzymatique brut (Benlounissi, 2004).

6.3. Mthode dextraction de lenzyme par le sulfate dammonium

Principe

Laddition de sulfate dammonium une solution protique aqueuse entrane une
diminution de la constante dilectrique, donc de la stabilit des protines, ce qui conduit leur
prcipitation (Osterlund et Janson, 1997). Aprs la sparation de prcipit par centrifugation,
les protines et en particulier lenzyme tudier subissent une dialyse.

Protocole de prcipitation

Le sulfate dammonium est utilis diffrentes concentrations 30%, 60% et 85%. Pour
cela, on a prpar une solution mre sature de 85%, cette dernire est refroidie puis rajoute
lextrait enzymatique brut jusqu la concentration dsire (concentrations ascendantes).
Aprs lagitation du mlange dans un bain de glace (T$4") pendant 2 heures au moins, on
centrifuge le mlange 2280 g pendant 20 min 4"C. Le culot est remis en solution dans


ChapitreII : Matriel et mthodes
43
un petit volume de tampon phosphate 0.1M (10 ml) pH 4.5. Le surnageant est repris pour
la deuxime phase de prcipitation selon la mme mthode quavec la premire concentration.
Le culot rsultant aprs chaque centrifugation est galement redissout dans le mme tampon.
Aprs chaque prcipitation on dtermine lactivit protasique et la concentration en protines
totales (Desmazeau et Hermier, 1968).

Dialyse

Lextrait enzymatique obtenu aprs chaque prcipitation est dialys dans un boudin en
cellophane (260CO30) (pour sa prparation voir annexe 11) contre un grand volume (un litre)
de tampon phosphate (0.1M) pH 4.5, sous agitation pendant 24 h 4"C.

6.4. Etude des proprits de lenzyme

Influence de pH

Linfluence de pH sur lactivit enzymatique est estime par laddition (au mlange
ractionnel) de tampons afin dobtenir diffrentes valeurs de pH, c'est--dire des pH compris
dans lintervalle [2 % 9]. Pour cela, on ajoute les systmes tampons suivants :
- Pour lintervalle [2 % 5] : citrate (0,1 M)/ phosphate monosodique (0,1M) (avec des
variations de 0.5 units).
- Pour lintervalle [5 % 7] : phosphate monosodique (0,2 M)/ phosphate disodique (0,2 M)
(avec des variation de 0.5 units).
- Pour lintervalle [7 %9] : phosphate disodique (0,2M)/NaOH (1N) (avec des variations de
0.5 units).

Influence de la temprature

Leffet de la temprature dincubation est dtermin par mesure de lactivit protasique
de lextrait brut incub pendant 1 heure des tempratures variant de 20"C 90"C avec un
incrment de 5"C, pH optimal.



ChapitreII : Matriel et mthodes
44
Stabilit thermique

Ltude de la stabilit thermique 60"C, 70"C , 80"C et 90"C a t ralise par dosage
de lactivit enzymatique aprs chaque incubation du mlange ractionnel pour un intervalle
de temps allant jusqu 120 min, avec des prlvements toutes les 10 minutes.

Mesures des paramtres cintiques

Dans le but de dterminer les constantes cintiques de lenzyme (V
m
/K
M
), lactivit
enzymatique est mesure aux optima de pH et de temprature en prsence de diffrentes
concentrations de casine soluble variant entre 0,5% et 5% avec un intervalle de variation de
0,5%.

7. Etude de la composition chimique du lactosrum

7.1. Dosage des protines

Principe

Les protines sont doses par la mthode de Lowry et al., (1965) dont le principe de
base est fond sur la rsultante de deux ractions. Dans le premier temps, la prsence de
sulfate de cuivre en milieu alcalin entrane la formation dun complexe entre lion cuivrique et
la liaison peptidique avec lapparition dune coloration violette proportionnelle la quantit
daminoacides prsentes dans le milieu (raction de Biuret). La deuxime raction rsulte de
la rduction de tyrosine et tryptophane prsents dans les protines par le constituant actif du
ractif de Folin-Ciocalteu lacide phosphomolybdo-tungstique pour donner naissance un
complexe bleu.

Ractifs

- Solution A : Na
2
CO
3
2% dans le NaOH (0,1N).
- Solution B : tartrate double de sodium et de potassium 2% dans leau distille.
- Solution C : CuSO
4
, 5H
2
O 1% dans leau distille.
ChapitreII : Matriel et mthodes
45




























Fig. 10 : La courbe dtalonnage des protines.





0 100 200 300 400 500
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
R=0.99962
Y=0.00051X
a
b
s
o
r
b
a
n
c
e


7
5
0

n
m
concentration de BSA en ug/ml
ChapitreII : Matriel et mthodes
46
- Solution E : ractif de Folin-Ciocalteu dilu au 1/10
eme
.
- Solution F : solution mre de BSA (srum albumine bovine) 500 g/ml pour la courbe
dtalonnage.

Protocole

En ajoute 1 ml du lactosrum 1ml de la solution D. Le mlange est laiss pendant 15
min temprature ambiante, ensuite en ajoute au mlange 3 ml de la solution E. Aprs
agitation rigoureuse, lchantillon est incub temprature ambiante lobscurit pendant 45
minutes. Labsorbance est lue 750 nm.

Prparation de la courbe dtalonnage

La gamme-talon est tablie partir dune solution mre de BSA dont les concentrations
sont comprises entre 0 et 500 g/ml. Le mlange ractionnel de diffrentes concentrations est
prpar selon le mme protocole dcrit ci-dessus et comme lindique le tableau suivant :

Concentration de BSA (g /ml) 0 100 200 300 400 500
Solution F (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Eau distille

(ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Solution D (ml) 1 1 1 1 1 1

La lecture des absorbances de diffrentes concentrations, a permis de tracer la courbe
dtalonnage (voir figure n" 10).

7.2 Dosage des sucres

Principe

La dtermination de la concentration des sucres est ralise par la mthode de Dubois et
al., (1956) dont le principe repose sur la raction suivante : Lacide sulfurique
concentr provoque chaud le dpart de plusieurs molcules deau partir des oses. Cette
dshydratation saccompagne par la formation dun hydroxy-mthylfurfural (HMF) dans le
ChapitreII : Matriel et mthodes
47
















Fig. 11 : La courbe dtalonnage de glucose.















Fig. 12 : La courbe dtalonnage du lactose.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
R=0.9995
Y=0.01521X
a
b
s
o
r
b
a
n
c
e


4
8
8

n
m
concentration de glucose en ug/ml
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
R=0.9999
Y=0.00551X
a
b
s
o
r
b
a
n
c
e


4
8
8

n
m
concentration de lactose en ug/ml
ChapitreII : Matriel et mthodes
48
dans le cas dhexose et dun furfural dans le cas dun pentose. Ces composs se condensent
avec le phnol pour donner des complexes colors (jaune orang). Lintensit de la coloration
est proportionnelle la coloration des oses prsents dans lchantillon doser.

Ractifs

- Solution mre de lactose 100 g/ml pour la courbe talon du lactose.
- Solution mre de glucose 100 g/ml pour la courbe talon de glucose.
- Solution de phnol 5% dans leau distille.
- Acide sulfurique 95% de puret et de densit d=1,83.

Protocole

Ce dosage permet la dtermination des concentrations de glucose et du lactose dans le
lactosrum. Pour cela 1ml de lchantillon dilu, on ajoute 1ml du phnol 5% puis 5 ml
dacide sulfurique. Aprs agitation, on laisse le mlange ractionnel reposer 10 min
temprature ambiante, puis on lincube au bain Marie 30"C pendant 30 min. Aprs la lecture
des absorbances au spectrophotomtre (Lambda EZ150) 488 nm, les valeurs obtenues sont
traduites en concentrations de glucose et lactose par rfrence des courbes dtalonnage
pralablement tablies.

Prparation de la courbe dtalonnage

La gamme-talon des deux courbes a t tablie partir des deux solutions mres, lune
de glucose et lautre de lactose des concentrations comprises entre 0 et 100 g/ml dans les
deux cas (voir fig. n" 11 et 12).

Concentration des sucres (g/ml) 0 20 40 60 80 100
Solution mre (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Eau distille (ml) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Phnol 5% (ml) 1 1 1 1 1 1
Acide sulfurique (ml) 5 5 5 5 5 5

ChapitreII : Matriel et mthodes
49
7.3. Dtermination de la matire sche

La mthode consiste faire desscher un chantillon (10 ml de lactosrum) introduit
dans une capsule pralablement sche et tare dans une tuve 105"C jusqu lobtention
dun poids constant (plus de 5 heures), cette opration est ralise en plusieurs sries et les
rsultats sont exprims en mg au litre. Ils sont calculs par la formule suivante (Afnor, 1986) :



M1 : masse en gramme de la capsule vide.
M2 : masse en gramme de la capsule et du rsidu.
V : volume de lchantillon en ml.
MS (%)=100% -H (%). /H : humidit.

7.4. Dtermination des cendres

Les cendres sont dtermines par incinration. La prise dessai ayant servi la
dtermination de la matire sche ( 105"C pendant 20h) est suivie par une calcination au four
moufle 550"C pendant 5h, les cendres exprimes en pourcentage de masse sont donnes
par la formule (Audigi et al., 1984)




M0 : masse de la capsule et les cendres
M1 : masse de la capsule vide
M2 : masse de la capsule et la prise dessai.

MS= (M2-M1) (100/V) mg/l
C%= (M0-M1/M2-M1) 100(%)
mg/ml

ChapitreIII : Rsultats et discussions
50
1. Isolement

Les cultures des prlvements sur milieu dAgar blanc ont permis lisolement de
quarante huit souches diffrentes. Les rsultats sont rassembls dans le tableau 5 ; ils font
apparatre la rpartition du nombre de colonies appartenant aux champignons filamenteux
apparus dans chaque chantillon.

Tableau n! 5 : Isolement des moisissures sur lAgar blanc.

Echantillon Origine pH Nombre de colonies
A Lac principal 7,39 20
B Flaque deau avoisinant le lac 7,43 15
C Sol avoisinant le lac 6,89 9
D Sol des palmeraies 7,28 4


Lemploi de lAgar blanc au cours de lisolement est fond sur linhibition de
limplantation rapide des microorganismes et en particulier les bactries. Ce milieu a permis
aussi dinhiber lenvahissement des moisissures qui se caractrisent par leur prolifration trs
rapide, mme sur des milieux basse valeur nutritive (Weiser et al., 1971 ; Tucker et Thomas,
1992). Lenvahissement est du une panoplie enzymatique extrmement riche des
moisissures par rapport aux bactries et aux levures (Davet, 1996 ; Waites et Morgan, 2001).

Toujours dans le but dempcher la prolifration bactrienne, on a procd laddition
de gentamycine avec une concentration de 5 mg/l. Selon la littrature (Jarvis, 1973 ; Iwahashi
et al., 1987 ; Botton et al., 1999) et les expriences ralises au laboratoire, la gentamycine
est lun des antibiotiques typiques et ce grce sa stabilit vis--vis de la temprature et la
pression (conditions de strilisation) ; il se caractrise ainsi par leur larges spectres daction.
Ces derniers sont prouvs par les rsultats obtenus lors de lisolement. Le pouvoir inhibiteur
de la gentamycine et lutilisation de lAgar blanc comme milieu disolement ont permis de
rduire lapparition des bactries. Le nombre rduit des colonies levuriennes a vit
lutilisation dun antilevurien.
ChapitreIII : Rsultats et discussions
51
Les petites colonies filamenteuses apparues ont t prleves de lAgar blanc et
repiques sur le milieu Czapek Dox. Le dveloppement rapide des colonies sur ce milieu
reflte sa richesse en lments nutritifs indispensables. Cette opration est suivie par des
repiquages successifs sur PDA et sur Czapek Dox qui ont permis dobtenir quarante huit
moisissures pures.

2. Mise en vidence de lactivit protolytique

Le choix des milieux de culture est dterminant dans lisolement et le dnombrement
des microorganismes ; il lest aussi dans la mise en vidence de lactivit enzymatique et
surtout dans le choix de la substance protique employe comme substrat pour la production
des protases (Clarke et Steel, 1966). Pour cela, on a utilis le milieu au lait glos (la glose
au lait) comme milieu slectif.

Les rsultats obtenus aprs lensemencement des laits gloss donnent des zones
dhydrolyse de dimensions similaires dans les trois concentrations (10%, 20% et 30%), ce qui
indique le peu deffet de la concentration du lait sur la croissance et sur la production des
protases. Cependant les zones dhydrolyse apparues prouvant la production des protases
sont plus claires avec les concentrations de 20% et 30% par rapport 10%.

Les tests de protolyse sont raliss sur le lait glos 30% ; ils ont permis la mise en
vidence de lactivit protolytique chez quinze moisissures parmi quarante huit souches
diffrentes. Six souches sont caractrises par des zones dhydrolyse trs faibles (< 2 mm)
(juste autour du leurs myclium). Alors que les autres souches, neuf moisissures ; sont
caractrises par des zones dhydrolyse, dont le diamtre varie de 2 11 mm. Ces rsultats
permettent de considrer ces souches comme des moisissures productrices de protases
exocellulaires (Smith et al., 1952 ; Duce et Thomas, 1959). Cette tape conduit retenir les
neuf souches (voir tableau n!6). Parmi lesquelles, cinq ont un diamtre suprieur 5 mm ;
elles sont slectionnes pour les fermentations. Les mesures sont effectues partir du
deuxime jour jusquau septime. Lenvahissement de ce milieu par la majorit des
moisissures tudies a limit les mesures une semaine dincubation.


ChapitreIII : Rsultats et discussions
52
Fig. 13: Stachybotrys sp. C 01
Fig. 15 : Aspergillus sp. A 34
Fig.17: Aspergillus sp. A 09
Fig. 16 : Aspergillus sp. A 39


































Fig. 14 : Geotrichum sp. B 12
ChapitreIII : Rsultats et discussions
53
Il est noter que mme en absence dune activit protolytique exocellulaire, on observe
un envahissement du milieu par les moisissures. Ceci indique une utilisation des sucres totaux
prsents dans le lait comme source de carbone et dnergie ou par la production dune activit
protolytique endocellulaire.

Tableau n! 6 : Mise en vidence de lactivit protolytique exocellulaire sur le lait glos
30%

espces
jours
diamtre de la colonie (mm) diamtre de la zone dhydrolyse (mm)
2
eme
3
eme
4
eme
5
eme
6
eme
7
eme
2
eme
3
eme
4
eme
5
eme
6
eme
7
eme
Aspergillus sp
A 39

11

25

29

38

47

*

3

6

10

11

11

*
Aspergillus sp
A 09

16

20

32

47

63

*

/

2

4

7

10

*
Aspergillus sp
A 34

13

28

42

57

*

*

/

3

7

10

*

*
Geotrichum sp
B 12

10

16

20

27

30

32

2

4

5

6

7

8
Stachybotrys sp
C 01

05

08

13

20

27

31

/

1

2

4

5

6
Aspergillus sp
B 06

16

23

52

*

*

*

/

3

4

*

*

*
Fusarium sp
A 08

08

15

17

20

23

25

/

1

1

2

3

3
Penicillium sp
A 13

09

18

28

39

41

53

/

2

2

3

3

3
Geotrichum sp
C 25

15

19

21

23

36

39

/

1

1

2

2

2


* : envahissement du milieu. / : absence de la zone dhydrolyse.


ChapitreIII : Rsultats et discussions
54















Fig. 18 : Photos. Microscopiques dA. niger isol (10).







Fig. 19 : Photo. Microscopique des spores dA. niger isol (10).








Fig. 20 : Aspergillus niger (Botton et al., 1999).

ChapitreIII : Rsultats et discussions
55
3. Identification

3.1. Identification microscopique

Lobservation microscopique au grossissement " 25 et " 40 a permis lidentification des
genres des diffrentes souches protolytiques isoles. Les rsultats obtenus sont mentionns
dans le tableau n! 6.

Lidentification microscopique des espces repose sur des critres morphologiques et
sur lontognie des spores, c'est--dire la conidiognse (aspect, couleur et structure des
conidiophores). Ltude microscopique de la souche Aspergillus A 09 (slectionne par
rapport sa production en protases exocellulaires aprs les fermentations) est ralise au
grossissement " 100. Les rsultats sont similaires ceux dcrits dans la
bibliographie (Jackson, 1962 ; Weiser et al., 1971 ; Bennett, 1985 ; Dai et al., 2004) savoir :
- des filaments mycliens septs.
- des conidiophores lisses, non ramifis, longs, larges, parois paisses et bruns.
- une tte Aspergillaire bruntre fonc, rayonnante et la vsicule terminale globuleuse et
bisrie.
- des phialides de petites tailles par rapport aux metules.
- des conidies globuleuses, noires, chinule trs verruqueuses.

3.2. Identification macroscopique :

Ltude microscopique ralise pralablement est complte par une tude
macroscopique dans le but de dterminer lespce de la souche slectionne (Aspergillus sp
A09). Ce type dtude est primordial pour lidentification de la moisissure (aspect de la
colonie, couleur, revers et la vitesse de croissance,). Dans ce cas Aspergillus sp A 09 est
incub 30!C pendant une semaine sur cinq milieux nutritifs gloss. Ltude macroscopique
est ralise par des observations lil nu et des mesures quotidiennes. Les rsultats obtenus
sont rassembls dans le tableau n!7.



ChapitreIII : Rsultats et discussions
56

Tableau n!7 : Identification macroscopique de la souche A 09.


milieu

diamtre de la
colonie (mm)

vitesse de
croissance

Couleur de la colonie

revers

Czapek DOX

32

lente

noire

incolore

CYA

55

rapide

noire

pale jaune

Malt Agar

39

rapide
blanche au dbut et
entirement noire aprs
la sporulation

jaune

MEA

40

rapide
blanche au dbut et
entirement noire aprs
la sporulation

incolore

PDA

56

rapide

blanche au dbut et
entirement noire aprs
la sporulation

pale jaune


Daprs la bibliographie, ces rsultats indiquent que la souche examine correspond
lespce Aspergillus niger (Raper et Fennell, 1965 ; Ottaviani et al., 1988 ; Botton et al.,
1999 ; Guiraud, 1998 ; Jernejc et Cimerman, 2001). Lanalyse du tableau permet la
conclusion suivante :

- La souche identifie pousse rapidement sur la plupart des milieux utiliss,
- La colonie est granuleuse de teinte noirtre sur les diffrents milieux,
- Le revers de la colonie est incolore jaune.







ChapitreIII : Rsultats et discussions
57
4. Composition chimique du lactosrum

Le milieu de fermentation est prpar partir de lactosrum acide prpar au laboratoire
par fermentation spontane. Ltude de la composition chimique de ce lactosrum a donn les
rsultats rsums dans le tableau n!8.

Tableau n! 8 : composition chimique du lactosrum (g/l)

Paramtre mesur Valeur obtenue

pH
matire azote totale
sucres totaux
lactose
matire sche
cendres


4,6
01,24
49,66
39,67
62,91
07,37


Lanalyse de ces rsultats fait apparatre des teneurs en sucres totaux reprsentant 79%
de la matire sche totale du lactosrum, dont 63% correspondent au lactose, ce qui est en fait
un aliment trs nergtique et qui constitue la source principale de carbone et dnergie pour
plusieurs microorganismes possdant le systme -galactosidase (Luquet et Boudier, 1984 ;
Kosikowski, 1988 ; Trystram et al., 1991 ; Lejeune et Baron, 1995)

La teneur en lactose concorde avec celle rapporte par Alais (1975), soit environ 40 g/l.
Notons que au cours de la coagulation une partie de lactose a t transforme en acide
lactique, ce qui justifie sa teneur rduite dans ce type du lactosrum par rapport au lactosrum
doux qui contient en moyenne 48 g/l (Alais, 1975).

Les protines reprsentent une valeur de 1,24 g/l pour un litre du lactosrum, cette
valeur est infrieure celle rapporte par la bibliographie (Alais, 1975 ; Luquet et al., 1985 ;
Assenat, 1985). Cette faible teneur en protine sexplique par la mthode de prparation du
ChapitreIII : Rsultats et discussions
58






Tableau n!9 : Activit protolytique exocellulaire des cinq souches sur les diffrents milieux.



Souche isole

activit protolytique sur le
lactosrum (g/ml/h)


activit protolytique sur
Czapek modifi (g/ml/h)


diamtre
dhydrolyse
(mm)
pH
acide
pH
neutre
pH
alcalin
pH
acide
pH
neutre
pH
alcalin
Aspergillus
niger A 09

4325

1933

/

4667

2053

/

10
Aspergillus sp
A 39

/

422

3918

/

468

4015

11
Aspergillus sp
A 34

/

/

3176

/

/

3181

10
Geotrichum sp
B 12

/

2683

629

/

2630

707

08
Stachybotrys sp
C 01

/

/

215

/

/

1028

06











ChapitreIII : Rsultats et discussions
59
lactosrum. Les valeurs mentionnes dans la bibliographie correspondent des lactosrums
industriels contenant beaucoup de perte, alors que notre lactosrum subit une filtration sur
papier filtre suivie dune centrifugation permettant une bonne sparation du caill.

La carence en matire azote totale est corrige par laddition dune source protique
exogne ; la trypticase avec une concentration de 11,4 g/l, afin dobtenir un milieu de culture
quilibr (Benlounissi, 2004).

Par ailleurs, le lactosrum contient des teneurs en matire minrale plus leves que
celles dcrites par Alais (1975) et Luquet et al., (1985). La teneur en matire sche est
lgrement infrieure celle annonce par Alais (1975), alors que la valeur du pH est
similaire de celle dcrite par Luquet et Bonjean-Linczowski (1985).

5. Fermentations

A partir du travail doptimisation laide dun plan factoriel fractionn ralis par
Mechakra et al.,(1999), nous avons retenu les trois facteurs ayant donn la meilleure
production de la protase acide, savoir la trypticase ; les sels minraux (magnsium et fer)
et le lactose. Les niveaux optima de ces deux facteurs et de lactose ont t dtermins laide
dun plan composite centr.

Les rsultats des diffrents dosages (exocellulaires) sur les diffrents milieux de
fermentation (Czapek modifi et le lactosrum, chacun trois pH diffrents) sont runis dans
le tableau n! 9.

5.1 Comparaison de lactivit protolytique exocellulaire et endocellulaire des
cinq souches sur les deux milieux de fermentation

Lanalyse des rsultats et la comparaison des activits protolytiques sur les diffrents
milieux (deux milieux avec trois pH diffrents) indiquent que les productions des protases
exocellulaires par les trois espces dAspergillus A 09, A 34 et A 39 et par Geotrichum sp B
12 obtenues sur les deux types de milieux sont trs proches pour un mme pH. Par ailleurs, on
remarque que les diffrentes souches ne produisent pas le mme type dactivit. Pour la
souche A 09, la meilleure activit est obtenue pH acide pour les deux milieux (4325 U sur le
ChapitreIII : Rsultats et discussions
60
lactosrum et 4667 U sue le Czapek). Pour la souche B 12, la production de protase est
favorise par le pH neutre (2683 U sur lactosrum et 2630 U sur Czapek). Pour les deux
autres souches dAspergillus (A 39 et A 34) la meilleure production est obtenue pH alcalin
(environ 4000 U pour la 1
re
et 3200 U pour la 2
me
). Quant la 5
me
souche, C 01
correspondant Stachybotrys, la production de protase exocellulaire est meilleure obtenue
pH alcalin ; elle est par ailleurs meilleure sur milieu de Czapek (1028 U contre 215 U pour le
lactosrum).

Ces rsultats permettent de considrer le lactosrum comme un milieu favorable la
production des protases par les genres Aspergillus et Geotrichum isols au cours de cette
tude. Ces rsultats sont similaires ceux dcrits par la littrature (Duce et Thomas,
1956 ; Clarke et Steel, 1966 ; Shahani et al., 1973).

Par ailleurs, les rsultats des activits sur les diffrents milieux montrent que seuls
Geotrichum B 12 et Aspergillus A 39 possdent des protases endocellulaires par rapport aux
autres moisissures. Elles sont cependant beaucoup plus faibles que les activits exocellulaires
(voir tableau n! 10).

Tableau n! 10 : Activit protolytique endocellulaire.



Souche isole

activit protolytique
endocellulaire sur le
lactosrum (g/ml/h)


activit protolytique
endocellulaire sur Czapek
modifi (g/ml/h)
pH
acide
pH
neutre
pH
alcalin
pH
acide
pH
neutre
pH
alcalin
Aspergillus sp
A 39

/

/

142

/

/

105
Geotrichum sp
B 12

/

332

257

/

468

169




ChapitreIII : Rsultats et discussions
61





Tableau n! 11 : Rsultats des prcipitations et des dialyses.


prparation
Activit
protolytique
totale (U)
Protines
totales
(mg)
Activit
spcifique
(U/mg)
Facteur de
purification

Rendement
(%)
Extrait
enzymatique
brut

4105

09,32

440,45

1

100
Prcipit
30%

4023

03,20

1257,18

02,85

98,00
Prcipit
65%

3973

01,95

2037,43

04,62

96,78
Prcipit
85%

2691

01,11

2424,32

05,50

65,55
Dialyse du
prcipit
30%

3625

01,40

2589,28

05,87

88,30
Dialyse du
prcipit
65%

2419

0,90

2687,77

06,10

58,92
Dialyse du
prcipit
85%

1887

0,51

3700

08,40

45,96





ChapitreIII : Rsultats et discussions
62
5.2. Slection de la souche la plus performante sur le lactosrum

Les rsultats mentionns dans le tableau n!9 permettent la slection de la souche A 09
comme tant la plus performante par rapport la production en protase exocellulaire. Cette
moisissure produit une activit de 4325 U pH acide, contre 2683 U pour Geotrichum sp B
12 pH neutre et 3918 U, 3176 U pour les deux espces dAspergillus A 39 et A 34
respectivement, tout les deux pH alcalin. Stachybotrys sp C 01 donne la plus faible activit
sur le lactosrum par rapport aux autres moisissures.

Aspergillus niger A 09 possde une activit de 4325 U dans un pH acide contre 1933 U
dans un pH neutre avec une absence dactivit dans le pH alcalin. Donc, il est clair que cette
souche produit une protase acide et une protase neutre. Ces rsultats sont proches des
rsultats trouvs dj dans diffrentes recherches (Kumagai et al., 1981 ; Dal Degan et al.,
1992 ; Singh et al., 1994).
Les activits obtenues par fermentations des diffrents milieux confirment les rsultats
obtenus sur laits gloss.

6. Extraction de la protase acide produite par la souche slectionne

6.1. Prcipitation par le sulfate dammonium

Lanalyse des rsultats rsums dans le tableau n!11 fait apparatre que la prcipitation
par le sulfate dammonium avec les deux concentrations de saturations de 65% et 85% a
permis daccrotre lactivit spcifique de prs de cinq fois. Alors que la premire fraction
prcipite 30%, a t augmente de seulement trois fois. Ces rsultats se rapprochent de
ceux rapports par la bibliographie (Desmazeaud et Hermier, 1968 ; Davidson et al., 1975 ;
Fuk et al., 1988 ; Furukawa, 2003).

Le rendement de la purification qui prsente la proportion en pourcentage de lactivit
de lenzyme purifie qui reste par rapport lactivit enzymatique initiale est de 98% pour la
fraction de 30%. La deuxime fraction de 65% donne un rendement enzymatique gal 97%,
le rendement de la dernire fraction 85% est de 66%. On peut traduire la diminution du


ChapitreIII : Rsultats et discussions
63





















Fig. 21 : Effet du pH sur lactivit de lenzyme.























Fig. 22 : Effet de la temprature sur lactivit de lenzyme.



10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
20
40
60
80
100
A
c
t
i
v
i
t


p
r
o
t

o
l
y
t
i
q
u
e

(
%
)
Temprature (C)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
20
40
60
80
100
pH
A
c
t
i
v
i
t


p
r
o
t

o
l
y
t
i
q
u
e
(
%
)
ChapitreIII : Rsultats et discussions
64
rendement par une perte de matriel biologique chaque tape de purification, o cette
dernire augmente. Le facteur de purification est de plus en plus lev au fur et mesure des
tapes, cela reflte lapproche de plus en plus dune enzyme pure.

6.2. Dialyse

La dialyse a permis daccrotre lactivit spcifique presque huit fois, cela est ralis par
llimination de sulfate dammonium et des impurets.

7. Etude des caractristiques de la protase acide de la souche slectionne


7.1. Effet du pH sur lactivit protasique


Daprs la figure 21, on note laugmentation de lactivit protolytique du pH 2,5
jusqu pH 4,0, o elle garde une activit importante jusqu pH 5,5. Au dla de cette valeur,
lactivit diminue. A pH 6,5 lenzyme a perdu environ 40% de son activit.

La mme figure indique que la souche slectionne prsente galement une activit
protasique pH neutre, mais cette activit est moins importante que la premire. Cette
moisissure produit donc au moins deux protases, lune ayant un pH optimum de 4,0 et lautre
un pH optimum de 7,0. Les deux types de protase se dnaturent aux pH alcalins. Les
rsultats obtenus se rapprochent de ceux rapports par Singh et al., (1994) par rapport la
protase acide.

7.2. Effet de la temprature sur lactivit protasique

La figure 22 montre que lactivit enzymatique croit rgulirement dans la zone de
temprature de 20 50!C pour atteindre le maximum dactivit dans un intervalle de 45
50!C. Ce rsultat est proche de celui rapport par plusieurs rfrences bibliographiques
(Singh et al., 1994 ; Moreira et al., 2001). A 60!C, lenzyme conserve une activit rsiduelle
jusqu 90% aprs une heure dincubation.


ChapitreIII : Rsultats et discussions
65






















Fig. 23 : Etude de la thermostabilit de lenzyme.




















Fig. 24 : Effet de la concentration du substrat sur lactivit de lenzyme.






0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
A
c
t
i
v
i
t


p
r
o
t

o
l
y
t
i
q
u
e

(
%
)
Temps(min)
60C
70C
80C
90C
0 1 2 3 4 5
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
A
c
t
i
v
i
t


p
r
o
t

o
l
y
t
i
q
u
e

(
%
)
C o n c e n t r a t io n en c a s i n e ( % )
ChapitreIII : Rsultats et discussions
66
Toutes les ractions enzymatiques ncessitent une reconnaissance du site actif par lenzyme et
le substrat, cette approche est assure, exclusivement, et au hasard par lagitation molculaire,
cette dernire augmente avec llvation de la temprature qui accrot ainsi le nombre de
collisions (Penasse, 1974).

7.3. Etude de la thermostabilit


Lexamen de la figure 23 montre que la protase acide dAspergillus niger A 09 est trs
stable 60!C,o lenzyme garde presque 84% de son activit aprs 90 minutes. Lactivit
rsiduelle atteint 60% 70!C et 80!C pour un temps dincubation de 40 minutes. Aprs 60
minutes dincubation lenzyme perd 63% de son activit 80!C. Par contre, elle perd
seulement 40% de son activit 70!C. A 90!C et lorsque le temps dincubation est de 30 min,
lactivit rsiduelle atteint 33%, par contre elle reprsente 20% aprs 60 min dincubation.
C'est--dire que notre enzyme a perdu environ 80% de son activit cette temprature.


7.4. Effet de la concentration du substrat sur lactivit protasique

Lactivit enzymatique est mesure diffrentes concentrations de casine. La figure 24
indique que lactivit maximale est obtenue pour une concentration en substrat de 2,5%. Elle
fait apparatre une courbe hyperbolique indiquant que la cintique est de type michalien. La
reprsentation graphique suivant la mthode de Lineweaver et Burk a permis de calculer la
constante cintique de Michaelis (K
M
=0,01 g/ml) et la vitesse maximale V
m
=5,6 #g/ml/min.


67




Dans le cadre de la recherche des enzymes protolytiques labores par des moisissures
locales, quatre prlvements ont t effectus partir deau de Sebkha et du sol environnant
dune ville saharienne Algrienne ! El-Mghair ". Les cultures des prlvements sur lagar
blanc ont permis lisolement des quarante huit moisissures diffrentes. Le pouvoir inhibiteur
de la gentamycine et lutilisation de lagar blanc au cours de lisolement ont permis de rduire
lapparition des bactries. Ltude de lactivit protasique sur les laits gloss trois
concentrations en lait crm a rvl la production des protases chez quinze souches. Neuf
souches ont une activit protolytique importante (le diamtre de leurs zones dhydrolyse est
suprieur 2 mm).

Pour lidentification des moisissures protolytiques isoles, une tude microscopique est
effectue. Cette dernire a permis de dterminer les genres soit, 4 Aspergillus, 2 Geotrichum,
1 Fusarium, 1 Penicillium et 1 Stachybotrys. Cette tape est complte par une tude
macroscopique ralise sur quatre milieux gloss diffrents dans le but didentifier lespce
de la souche A 09 slectionne aprs les fermentations. Ltude macroscopique a confirm
lespce ; il sagit dAspergillus niger.

Ltude de la composition chimique du lactosrum acide a rvl sa richesse en sucres
totaux en particulier en lactose qui peut servir de source de carbone et dnergie. Cette tude a
montr galement sa richesse en sels minraux et sa carence en protines. Pour cela, lemploi
du lactosrum comme milieu de fermentation ncessite son enrichissement, particulirement
en source azote, dans ce cas, la trypticase.

Le dosage de lactivit protolytique exocellulaire et endocellulaire a montr que le
lactosrum est un milieu favorable la production des protases par les genres Aspergillus et
Geotrichum. Il montre galement que Aspergillus niger A 09 est la souche la plus performante
par rapport sa production en protase exocellulaire, en effet elle produit une activit trs
leve en protase acide (4325 U).

Lextraction de lenzyme par le sulfate dammonium 85% de saturation a permis
lobtention dun rendement de 66% et un degr de purification suprieur 5. La dialyse du
C Co on nc cl lu us si io on n
68
prcipit 85% a entran un accroissement de lactivit spcifique de huit fois avec un
rendement en activit de 46%. Ces rsultats sont similaires ceux rapports par les travaux du
laboratoire.

Afin de mieux connatre la protase produite, nous avons tudi ses proprits ce qui
permet de connatre les ventuelles applications. Cette tude a donn un pH optimum de 4.0 et
une temprature optimale comprise entre 45#C et 50#C. La stabilit thermique de lenzyme est
reflte par une activit rsiduelle de 30% 90#C pendant 30 minutes.

Tous ces rsultats montrent la richesse de nos milieux extrmes en moisissures et les
possibilits offertes pour la recherche de nouvelles espces hyperproductrices denzymes
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Abstract


48 different strains are isolated from four natural samples picked from the lack of El-
Mghair!. The study of the proteolytic activity produced on skim milk Agar with three skim
milk concentrations 10, 20 and 30% showed that 6 strains have a very weak hydrolysis
zones (< 2 mm), whereas 9 have given a hydrolysis zones whose diameters vary from 2 to
11 mm. Among this last, 5 strains (the diameter > 5mm) were selected. The chemical
analysis of the whey showed its heigh content in total sugars (49.60 g/l), in particular in
lactose (39.67g/l), in mineral salt (7.37 g/l) and its proteins deficiency (1.24 g/l). The
proteinase production by the 5 selected moulds was carried out in two different mediums;
the Czapek and the enriched whey. The dosages of the proteolytic activity exocellular and
endocellular showed that the whey is a favourable medium for protease production by the
studies species (as much the Czapek). This dosage shows equally that the strain A 09 is the
most perforate compared to its production in exocellular protease. This strain produces an
activity of 4325 U at acid pH against 2683 U for Geotrichum sp B 12 at a neutral PH and
against 3918 U and 3176 U for the two species of Aspergillus A 39 and A 34 respectively,
both at alkaline PH. Stachybotrys C 01 gives the weakest activity on the two mediums.
The identification of the most perforate mould revealed that is Aspergillus niger. The acid
proteinase produces by this last was extracted in tow operations; precipitation with the
ammonium sulphate at 85% and dialysis. The extract gives an output of 46% and a
purification rate higher than 8. The kinetic study of the protease of A. niger gives a V
m
=
5.6 #g/ml/min and K
M
= 0.01g/ml. An optimal temperature varies between 45 and 50$C
with an optimum pH of 4.0. It keeps 30% of the total activity at 90$C during 30 min.


Key words: protease, proteolytic mould, extreme mediums, skim milk Agar, Aspergillus
niger, whey.






Dendouga Wassila Datedesoutenance:26/06/2006

Isolement et identification de moisissures productrices de protases partir de milieux
extrmes. Extraction et tude des proprits de la protase produite.


Rsum
48 souches diffrentes sont isoles partir de quatre chantillons naturels prlevs de Sebkha
dEl-Mghair. Ltude de lactivit protolytique produite sur les laits gloss trois
concentration en lait crm 10%, 20% et 30% a montr que 6 souches ont donn des zones
dhydrolyse trs faibles (<2mm), alors que 9 souches ont donn des zones dhydrolyse ayant
des diamtres variant entre 2 et 11mm. Parmi ces dernires, 5 souches (un diamtre >
5mm) ont t slectionnes. Lanalyse chimique du lactosrum a montr sa richesse en
sucres totaux (49,60 g/l), en particulier en lactose (39,67 g/l) ; en sels minraux (7,37 g/l) et
une carence en protines (1,24 g/l). La production des protases par les 5 moisissures
slectionnes a t ralise sur deux milieux diffrents, le Czapec modifi et le lactosrum
enrichi. Le dosage de lactivit protolytique exocellulaire et endocellulaire montre que le
lactosrum est un milieu favorable la production des protases par les espces tudies
(autant que le Czapec), ce dosage montre galement que la souche A 09 est la plus
performante par rapport sa production en protase exocellulaire. Cette souche produit une
activit de 4325 U pH acide contre 2683 U pour Geotrichum sp B 12 pH neutre et 3918 U
et 3176 U pour les deux autres espces dAspergillus A 39 et A 34 respectivement, tous les
deux pH alcalin. Stachybotrys C 01 donne la plus faible activit sur les deux milieux.
Lidentification de la souche la plus performante a rvl quil sagit de lespce Aspergillus
niger. La protase acide produite par cette dernire est extraite en deux oprations ;
prcipitation au sulfate dammonium 85% et dialyse. Lextrait donne un rendement de 46%
et un taux de purification suprieur 8. Ltude cintique de la protase acide dA. niger
09(A) isol a donn une V
m
5,6 = g/ml/min et un K
M
= 0,01g/ml. Sa temprature optimale
varie entre 45 et 50!C avec un pH optimum de 4,0. Elle garde 30% de lactivit totale
90!C pendant 30 min.

Mots cls : Protase, moisissures protolytiques, milieux extrmes, lait glos, Aspergillus
niger, lactosrum.

Laboratoire de recherche : Laboratoire de gnie enzymatique et biotechnologie,
dpartement des sciences de la nature et de la vie, Facult des sciences.