7541 01 Colilert 18 QT Validation Report Es Final

Validacin del mtodo Colilert
-18/Quanti-Tray
para el recuento de E. coli y de

bacterias coliformes en muestras de agua

ENERO DE 2008
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1
Validacin del mtodo Colilert
-18/Quanti-Tray

para el recuento de E. coli y de
bacterias coliformes en muestras de agua

1 Introduccin

El mtodo Colilert
-18/Quanti-Tray
es una prueba diseada especficamente para el

recuento NMP (Nmero Ms Probable) de E. coli y bacterias coliformes a partir de
muestras de agua potable u otras aguas de caractersticas similares, ya sea tratada
o sin tratar.

Colilert-18 detecta de manera simultnea el nmero de coliformes totales y E. coli
en el agua. Se basa en la Tecnologa de Sustrato Definido (Defined Substrate
Technology, DST). El reactivo DST se mezcla con 100 ml de muestra y se incuba
como prueba de presencia/ausencia (PA) o prueba para determinar el nmero ms
probable (NMP). Cuando las bacterias coliformes metabolizan el nutriente indicador
ONPG, el color de la muestra se vuelve amarillo. Cuando E. coli metaboliza un
segundo nutriente indicador (MUG), la muestra emite fluorescencia con luz UV. El
mtodo Colilert-18 permite la deteccin simultnea de estas bacterias en 18 horas, a
una concentracin de 1 ufc/100 ml y en presencia de nmeros tan elevados de
bacterias hetertrofas como 2 x 10
6
/100 ml de muestra.

El mtodo Quanti-Tray est diseado para obtener recuentos bacterianos
cuantitativos a partir de muestras de 100 ml utilizando los reactivos DST. La mezcla
de reactivo/muestra se aade a la bolsa Quanti-Tray y, antes de la incubacin, se
sella utilizando el dispositivo de sellado para Quanti-Tray. La bolsa est diseada
para que, tras el sellado, 51 pocillos contengan la mezcla de reactivo/muestra. El
dispositivo de sellado es un instrumento que consta de unos rodillos calientes,
accionados por motor, que se ha diseado para el sellado de las bolsas Quanti-Tray.
Se cuenta el nmero de pocillos positivos y, a partir de la tabla correspondiente, se
determina el NMP de bacterias coliformes y/o E. coli.

2 Alcance de la aplicacin del mtodo Colilert
-18/Quanti-Tray

El mtodo Colilert
-18/Quanti-Tray
est diseado principalmente para el anlisis de

agua potable y otros tipos de agua de caractersticas similares. Cuenta con un gran
nmero de autorizaciones en Norteamrica (EE.UU, Canad y Mjico), Sudamrica
(Brasil, Argentina, Chile y Colombia), Europa (Dinamarca, Alemania, Hungra,
Islandia, Irlanda, Italia, Noruega, Espaa y Reino Unido) y Extremo Oriente (Japn y
Corea). Adems, cuenta con la autorizacin para el anlisis de aguas embotelladas
(Asociacin Internacional de Agua Embotellada) y para el anlisis de agua purificada
para uso farmacutico (Farmacopea de los EE.UU). En los EE.UU. tambin recibi
la autorizacin por parte de la EPA (Agencia de proteccin medioambiental) para el
anlisis de bacterias coliformes y E. coli en aguas de manantial y aguas freticas, y
para el recuento de E. coli en aguas ambientales, de uso recreativo y residuales.

3 Identificacin de microorganismos diana (ISO/TR 13843 apartado 10.2.1 y
9.2)

En el mtodo Colilert
-18/Quanti-Tray
, las bacterias coliformes son aquellas que

producen un color amarillo por accin de la -galactosidasa sobre el orto-nitrofenil--
D-galactopiransido (ONPG), y E. coli son aquellas bacterias coliformes que,

2
adems, emiten una fluorescencia azul con luz UV por la accin de la -
glucuronidasa sobre el 4-metil-umbeliferil--D-glucurnido (MUG).

3.1 Modelo de exposicin basado en un cultivo puro (ISO/TR 13843 apartado
10.2.1)

Las definiciones de las reacciones por bacterias diana y no diana se confirmaron
mediante la exposicin del sistema Colilert-18/Quanti-Tray a cultivos puros de cepas
de referencia de E. coli, bacterias coliformes y bacterias Gram-negativas no
coliformes obtenidas a partir de las colecciones de la ATCC. Las reacciones tpicas
de estas cepas de referencia aparecen recogidas en la tabla 1. IDEXX utiliza estas
cepas para realizar los anlisis de control de calidad rutinarios del mtodo Colilert-
18/Quanti-Tray.

Tabla 1 Cepas de referencia de E. coli, bacterias coliformes y bacterias
Gram-negativas no diana, utilizadas para confirmar las reacciones
positivas y negativas tpicas del mtodo Colilert
-18/Quanti-Tray

Bacteria N ATCC* Reaccin mtodo Colilert-18
Escherichia coli 25922
Color amarillo intenso
Fluorescencia azul intenso con luz UV
Citrobacter freundii 8090
No emite fluorescencia con luz UV
Klebsiella pneumoniae 31488
Enterobacter aerogenes 13048
Pseudomonas aeruginosa 10145
No hay crecimiento
No hay color amarillo
Aeromonas hydrophila 35654
No hay crecimiento
No hay color amarillo
* Coleccin Americana de Cultivos Tipo

3.2 Estudios de sensibilidad, especificidad y selectividad (ISO/TR 13843
apartado 9.2)

En lo que respecta a los mtodos microbiolgicos, el informe tcnico ISO/TR 13843
define estas caractersticas de la siguiente forma:

Sensibilidad - la fraccin del total de positivos que se asigna correctamente en el
recuento obtenido;

Especificidad - la fraccin del total de negativos que se asigna correctamente en el
recuento obtenido;

Selectividad - el cociente ente el nmero de colonias diana y el nmero total de
colonias en el volumen de muestra.

En el caso del mtodo Colilert-18/Quanti-Tray, estas caractersticas estn
relacionadas con el nmero de pocillos positivos para coliformes o E. coli que,
efectivamente, contienen la bacteria diana, y con el nmero de pocillos negativos
que realmente son negativos para la bacteria diana. La valoracin de la sensibilidad,

3
la especificidad y la selectividad del mtodo Colilert-18/Quanti-Tray se logr
identificando los aislamientos -galactosidasa y -glucuronidasa positivos de los
pocillos positivos obtenidos a partir de muestras naturales en las que se aadieron
cantidades conocidas de agua de ro a muestras de agua potable sin cloro. Se
obtuvo 1 litro de muestra de agua potable sin cloro al que se aadieron cantidades
conocidas de tres fuentes de aguas superficiales (dos ros y un embalse). Tras la
incubacin, se seleccionaron 100 pocillos de color amarillo, pero que no emitan
fluorescencia, de las 30 muestras (3-5 pocillos por cada muestra). La seleccin se
llev a cabo de forma que se garantizara la inclusin de toda la gama de
intensidades posibles para el color amarillo. Asimismo, se seleccionaron 100 pocillos
de color amarillo, y que emitan fluorescencia, para abarcar toda la gama de
intensidades posibles para la fluorescencia. De las 30 muestras, slo se dispuso de
54 pocillos negativos, de los cuales dos mostraron un crecimiento turbio. Las
reacciones -galactosidasa y -glucuronidasa positivas y/o negativas se verificaron y
los aislamientos se identificaron utilizando paneles miniaturizados para la
identificacin de tipo BBL Crystal
TM
E/NF (Entricos/ No Fermentadores, Becton,
Dickinson and Company, Sparks, MD, EE.UU.).

3.2.1 Clculo de la sensibilidad, especificidad, selectividad, tasa de falsos
positivos y tasa de falsos negativos

Para cada parmetro los datos de identificacin se dividieron en cuatro categoras:

a = nmero de pocillos positivos que contenan coliformes o E. coli (verdaderos
positivos);

b = nmero de pocillos negativos que contenan coliformes o E. coli (falsos
negativos);

c = nmero de pocillos positivos que no contenan coliformes, ni E. coli (falsos
positivos);

d = nmero de pocillos negativos que mostraban crecimiento y que no contenan ni
coliformes, ni E. coli (verdaderos negativos).

A partir de los datos obtenidos, la sensibilidad, especificidad, selectividad, tasa de
falsos positivos y tasa de falsos negativos para coliformes y E. coli se calcularon de
la siguiente forma:

Sensibilidad = a / (a+b)
Especificidad = d / (c+d)
Selectividad = log
10
[(a+c) / (a+b+c+d)]
Tasa de falsos positivos = c / (a+c)
Tasa de falsos negativos = b / (b+d)

Adems se calcul un parmetro adicional, la eficiencia (E; fraccin de pocillos que
se asignan correctamente), mediante la frmula E = (a+d) / (a+b+c+d).

3.2.2 Coliformes distintos a E. coli

De los 100 pocillos amarillos sin fluorescencia con los que se realizaron subcultivos,
se obtuvieron aislamientos -galactosidasa. En estas placas no se observaron
reacciones -glucuronidasa. En el Apndice A1 se muestran las reacciones oxidasa
e indol, los perfiles BBL Crystal
TM
E/NF y las identificaciones de estos aislamientos.
Todos se identificaron como miembros de la familia Enterobacteriaceae distintos a E.

4
coli, -galactosidasa positivos y -glucuronidasa negativos. En total, se recuperaron
23 especies de coliformes (Tabla 2).

3.2.3 E. coli

De los 100 pocillos amarillos con fluorescencia con los que se realizaron subcultivos,
se obtuvieron aislamientos -glucuronidasa. En el Apndice A2 se muestran las
reacciones oxidasa e indol, los perfiles BBL Crystal
TM
E/NF y las identificaciones de
estos aislamientos. Se identificaron 99 aislamientos como E. coli. El ltimo se
identific como Klebsiella oxytoca. Este aislamiento present una reaccin -
glucuronidasa positiva en el panel Crystal
TM
E/NF.

3.2.4 Pocillos negativos

Se realizaron subcultivos con 54 pocillos negativos, de los cuales nicamente dos
haban presentado crecimiento. Estos dos pocillos presentaron colonias -
galactosidasa y -glucuronidasa negativas, que resultaron ser oxidasa positivas e
indol negativas (Apndice A3). Ambas colonias se identificaron como Shewanella
putrefaciens en el sistema BBL Crystal
TM
E/NF. No se obtuvo crecimiento en los 52
pocillos restantes.

Tabla 2 Identificacin de bacterias coliformes (nmero de aislamientos)
recuperadas a partir de pocillos positivos Colilert
-18/Quanti-Tray

para coliformes distintos a E. coli

Cedecea lapegei (1) Kluyvera ascorbata (12)
Citrobacter amalonaticus (2) Kluyvera cryocrescens (3)
Citrobacter freundii (10) Leclercia adecarboxylata (1)
Enterobacter aerogenes (1) Pantoea agglomerans (9)
Enterobacter asburiae (1) Serratia fonticola (1)
Enterobacter cancerogenus (1) Serratia liquefaciens (3)
Enterobacter cloacae (25) Serratia marcescens (1)
Enterobacter sakazakii (7) Serratia odorifera (1)
Escherichia vulneris (4) Serratia plymuthica (4)
Hafnia alvei (1) Serratia rubidea (1)
Klebsiella oxytoca (4) Serratia spp (1)
Klebsiella pneumoniae (6)

3.3 Determinacin de las caractersticas relacionadas con la sensibilidad y la
especificidad

3.3.1 Bacterias coliformes

En el contexto de la prueba Colilert-18/Quanti-Tray, los coliformes son
microorganismos que dan lugar a un color amarillo, emitiendo o no fluorescencia.
Los resultados para los parmetros calculados son los siguientes:

Sensibilidad = a / (a+b) = 200 / (200+0) = 1
Especificidad = d / (c+d) = 2 / (0+2) = 1
Selectividad = log
10
[(a+c) / (a+b+c+d)] = log
10
[(200+0) / (200+0+0+2)] = - 0,004
Tasa de falsos positivos = c / (a+c) = 0 / (200+0) = 0
Tasa de falsos negativos = b / (b+d) = 0 / (0+2) = 0
Eficiencia (E) = (a+d) / (a+b+c+d) = (200+2) / (200+0+0+2) = 1

5

3.2.3 E. coli

En el contexto de la prueba Colilert-18/Quanti-Tray, E. coli son microorganismos que
dan lugar a un color amarillo y emiten fluorescencia. Los resultados para los
parmetros calculados son los siguientes:

Sensibilidad = a / (a+b) = 99 / (99+0) = 1
Especificidad = d / (c+d) = 102 / (1+102) = 0,99
Selectividad = log
10
[(a+c) / (a+b+c+d)] = log
10
[(99+1) / (99+0+1+102)] = - 0,305
Tasa de falsos positivos = c / (a+c) = 1 / (99+1) = 0,01
Tasa de falsos negativos = b / (b+d) = 0 / (0+102) = 0
Eficiencia (E) = (a+d) / (a+b+c+d) = (99+102) / (99+0+1+102) = 0,995

Los resultados del anlisis de los datos demuestran que, para las bacterias
coniformes, el mtodo Colilert-18/Quanti-Tray tiene una sensibilidad y especificidad
elevadas y una tasa de falsos positivos y falsos negativos igual a cero. El mtodo es
tambin muy selectivo, con un valor de - 0,004, superior al valor de referencia -1 que
sugiere el informe tcnico ISO/TR 13843 para los mtodos de recuento de colonias.
Se puede decir que el mtodo es muy eficiente para bacterias coliformes, con un
valor de eficiencia de 1. Los datos de identificacin demuestran que el mtodo
Colilert
-
18/Quanti-Tray recupera una amplia gama de bacterias coliformes.

El mtodo Colilert-18/Quanti-Tray tambin es muy sensible y especfico para E. coli.
La selectividad (-0,305) es inferior a la obtenida para las bacterias coliformes. Este
es un resultado que cabe esperar en un sistema de anlisis dual en el que E. coli es
un subgrupo dentro de las bacterias coliformes. An as, el valor sigue siendo mejor
que el valor de referencia del informe tcnico ISO/TR 13843. El mtodo sigue siendo
muy eficiente (E = 0,995) para la deteccin de E. coli.

4 Incertidumbre del recuento (ISO 13843 apartado 10.2.1 y Apndice B)

La repetibilidad y la reproducibilidad son dos estimaciones de la fiabilidad que se
puede alcanzar con un mtodo analtico. Pueden ser valoraciones respecto al
mtodo en su conjunto utilizando muestras naturales adecuadas, o respecto a la
incertidumbre del recuento asociada con la lectura de resultados de un mtodo en
concreto. El resultado obtenido con cualquier mtodo depender de la facilidad con
la que los analistas puedan realizar un recuento de colonias o considerar una
reaccin NMP como positiva, lo que depender de lo distinta que sea la morfologa
de las colonias de los microorganismos diana o no diana a la hora de hacer un
recuento en agar, o de la nitidez de las reacciones positivas o negativas de las
pruebas NMP realizadas en caldo de cultivo. Por lo tanto, las valoraciones de la
incertidumbre del recuento son una indicacin de los posibles problemas que
podran darse al adoptar un mtodo de manera generalizada.

La repetibilidad (r) y la reproducibilidad (R) se definen de la siguiente forma:

Repetibilidad concordancia entre los resultados de mediciones sucesivas de la
misma medida, llevadas a cabo en las mismas condiciones de
medicin.

Reproducibilidad concordancia entre los resultados de mediciones de la misma
medida, llevadas a cabo en distintas condiciones de medicin.

6
Cuando esto se aplica a los recuentos de colonias microbiolgicas en placas de agar
o reacciones positivas en una prueba NMP, esas mismas o distintas condiciones
se refieren al analista que hace el recuento. Por lo tanto, en este contexto, la
repetibilidad es la concordancia entre los recuentos obtenidos por un mismo analista
tras repetir los recuentos y la reproducibilidad es la concordancia entre los recuentos
obtenidos por dos o ms analistas tras repetir los recuentos. Normalmente, la
valoracin de la reproducibilidad brinda ms informacin que la valoracin de la
repetibilidad.

El Apndice B del informe tcnico ISO/TR 13843 proporciona unas directrices sobre
la valoracin de la repetibilidad y la reproducibilidad del recuento utilizando
desviaciones estndar relativas (DER) de los recuentos repetidos. Adems,
recomienda que, en el caso de cultivos puros, las DER deberan ser < 0,02 (es decir,
una desviacin mxima del 2 %). Los analistas de IDEXX llevaron a cabo estudios
sobre la incertidumbre de los recuentos. Los datos estn incluidos en el Apndice B.
El recuento se realiz de manera que cada analista desconociera los recuentos
realizados por otros analistas, y los NMP resultantes se registraron como nmeros
enteros. Las DER calculadas para los NMP del sistema Colilert-18/Quanti-Tray
inoculado con un coliforme tpico (Klebsiella pneumoniae ATCC 33186) y E. coli
(ATCC 25922) fueron:

Klebsiella pneumoniae Repetibilidad = 0,022
Reproducibilidad = 0,020

Escherichia coli Repetibilidad = 0,000
Reproducibilidad = 0,007

Los valores para el coliforme tpico son del orden del valor de referencia < 0,02
(ISO/TR 13843 apartado B1), mientras que los valores para E. coli estn muy por
debajo del valor de referencia, indicando que con el mtodo Colilert-18/Quanti-Tray
puede lograrse un recuento del NMP fiable para Klebsiella pneumoniae y para E.
coli.

5 Robustez sensibilidad a lo largo del tiempo (ISO/TR 13843 apartado 10.2.2
y B.4)

Dos aspectos de la robustez son importantes para el mtodo Colilert
-18/Quanti-
Tray
: el periodo de incubacin recomendado de 18-22 horas y el periodo de validez

de hasta 15 meses cuando Colilert-18 se almacena entre 4 y 25 C. En el Apndice
C se incluyen los recuentos realizados por duplicado de suspensiones con un
nmero bajo de cultivos de referencia de E. coli, Klebsiella pneumoniae y
Citrobacter freundii tras 18 horas y 22 horas de incubacin para el mismo lote de
Colilert-18, almacenado durante 541 das a 25 C.

5.1 Robustez del tiempo de incubacin

Se obtuvieron 48 resultados emparejados para realizar los recuentos tras 18 horas y
22 horas de la incubacin. Para E. coli los 48 recuentos emparejados fueron los
mismos tras los dos tiempos de incubacin. Pero, para Klebsiella pneumoniae 47 de
los recuentos (98 %) resultaron iguales, mientras que el ltimo recuento emparejado
mostr un incremento de un nico pocillo positivo a las 22 horas de incubacin. Sin
embargo, para Citrobacter freundii hubo un incremento en los recuentos en 13 de las
muestras (27%) tras las 22 horas de incubacin, en comparacin con las 18 horas
de incubacin. Todos estos recuentos ms elevados, excepto uno, fueron
incrementos en un nico pocillo positivo o dos. Esta cepa de Citrobacter parece

7
mostrar una tasa de crecimiento relativamente ms lenta o una cintica enzimtica
ms dbil, en comparacin con las otras bacterias analizadas.

Los datos demuestran que para E. coli y para bacterias coliformes robustas, como
Klebsiella pneumoniae, el periodo de incubacin recomendado de 18-22 horas es
robusto. Pero en el caso de algunas bacterias con crecimiento ms lento, o
productoras de enzimas dbiles, puede haber un aumento en los recuentos a las 22
horas de incubacin, en comparacin con los recuentos obtenidos a las 18 horas de
incubacin.
El fenmeno de los incrementos en los recuentos a lo largo de un periodo de
incubacin recomendado (por ejemplo, de 18-24 horas para los mtodos tpicos de
filtracin con membranas de la norma ISO 9308-1) es muy conocido, especialmente
en el caso de coliformes ambientales. Sin embargo, siempre que los incrementos en
los recuentos tras una incubacin ms larga no sean excesivos, los recuentos
obtenidos a las 18 horas de incubacin, con fines prcticos y operativos, se
consideran aceptables.

5.3 Robustez del almacenamiento del medio Colilert-18

El medio Colilert-18 tiene un periodo de validez de 12 meses cuando se almacena
entre 4 y 25 C. Los datos de las tres bacterias analizadas con el mismo lote de
medio, conservado a 25 C y tras 541 das de almacenamiento (muy por encima del
periodo de un ao establecido), no muestran ninguna diferencia en el rendimiento.
Se eligi la temperatura de almacenamiento superior ya que, en comparacin con un
almacenamiento a temperaturas de refrigeracin, representa un mayor reto a la
estabilidad del medio Colilert-18.

6 Lmite superior de trabajo (ISO/TR 13843 apartado 10.2.4 y 6.3.3)

La prueba Colilert
-18/Quanti-Tray
es un mtodo de NMP con un rango de recuento

arbitrario entre 0 y 201, determinado por el nmero de pocillos de la bolsa Quanti-
Tray. Segn el apartado 6.3.3 del informe tcnico ISO/TR 13843, no puede
establecerse un lmite superior para los mtodos de NMP por razones prcticas y
estadsticas, ya que la precisin no depende de forma sencilla del nmero de
partculas introducido en la unidad de deteccin".

7 Precisin (ISO/TR 13843 apartado 10.2.5 y 9.5.5)

La precisin de un mtodo de NMP se describe mediante los intervalos de confianza
del 95% calculados para cada uno de los valores de NMP (ISO/TR 13843 apartado
9.5.5). En el Apndice D se incluyen los intervalos de confianza para los recuentos
obtenidos con el mtodo Colilert
-18/Quanti-Tray
, calculados a partir del programa

del Manual online para el Anlisis Bacteriolgico (Bacteriological Analytical Manual,
BAM; http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-a2.html#excl) de la FDA (Food and Drug
Administration) de los EE.UU.

Para cada NMP puede obtenerse una repetibilidad terica, basndose en el valor de
NMP y sus intervalos de confianza. En el Apndice D tambin se incluyen los
valores de incertidumbre relativa para cada NMP (log
10
DE, calculados a partir de los
intervalos de confianza del 95% del NMP) y de repetibilidad (incertidumbre estndar
relativa) expresados como coeficientes de variacin (CV%). Estos valores de
Poisson pueden utilizarse como valores de precisin mnima con los que cualquier
dato apropiado que pueda tener un laboratorio (por ejemplo, sobre la variacin a la
hora de decantar el volumen de anlisis o la incertidumbre de un recuento) puede
combinarse para obtener una estimacin global de la repetibilidad para cada NMP.

8

8 Bibliografa

8.1 Normas ISO

ISO 9308-1:2000 Water Quality Detection and enumeration of Escherichia coli and
coliform bacteria Part 1: Membrane filtration method. Ginebra: Organizacin
Internacional para la Estandarizacin.

ISO/TR 13843:2000(E) Water Quality Guidance on validation of microbiological
methods. Ginebra: Organizacin Internacional para la Estandarizacin.

9
Apndice A: Datos de los estudios de sensibilidad, especificidad y
selectividad (vase el apartado 3.2)

Apndice A1 Identificacin de aislamientos de pocillos amarillos sin
fluorescencia del mtodo Colilert
-18/Quanti-Tray

Ref.
aislamiento Oxidasa Indol Perfil Crystal E/NF Identificacin Confianza
Y1 - + 5765637153 Enterobacter sakazakii 0,5861
Y2 - - 4764417153 Pantoea agglomerans 0,7217
Y3 - + 4724477151 Kluyvera cryocrescens 0,9829
Y4 - - 7764477153 Enterobacter cloacae 0,9962
Y7 - + 5764475555 Klebsiella oxytoca 0,9825
Y9 - - 5764637051 Kluyvera ascorbata 0,9264
Y11 - - 7424676151 Citrobacter freundii 0,9335
Y13 - - 7764476157 Enterobacter sakazakii 0,6102
Y14 - + 5764637151 Kluyvera ascorbata 0,9925
Y16 - - 4764627151 Escherichia vulneris 0,5764
Y19 - - 7766276157 Serratia liquefaciens 0,5712
Y21 - - 3764217153 Cedecea lapagei 0,9835
Y23 - + 7764637157 Enterobacter sakazakii 0,9734
Y24 - + 5764627452 Leclercia adecarboxylata 0,999
Y25 - - 7764627555 Klebsiella pneumoniae 0,9154
Y27 - - 7765275557 Serratia rubidaea 0,9942
Y28 - - 4760056153 Enterobacter asburiae 0,9504
Y39 - + 5760467555 Klebsiella pneumoniae 0,9413

10
Y50 - - 7775637153 Enterobacter cancerogenus 0,5033
Y52 - - 5764677557 Enterobacter aerogenes 0,8747
Y57 - - 5764256057 Serratia plymuthica 0,8677
Y58 - + 5764676557 Serratia odorifera 0,7963
Y59 - + 5420677151 Citrobacter amalonaticus 0,8735
Y72 - - 5725654447 Serratia fonticola 0,9933
Y77 - + 5420677151 Citrobacter amalonaticus 0,8735
Y80 - - 7764276557 Serratia marcescens 0,9547
Y82 - - 5423614153 Hafnia alvei 0,9847

11
Y94 - - 7765256157 Serratia spp. 0,9846
Y96 - + 5464654151 Citrobacter freundii 0,9771

12
Apndice A2 Identificacin de aislamientos de pocillos amarillos con
fluorescencia del mtodo Colilert
-18/Quanti-Tray

Ref.
aislamiento Oxidasa Indol Perfil Crystal E/NF Identificacin Confianza
F1 - + 5464444171 Escherichia coli 0,9998

13
F80 - - 5464444171 Escherichia coli 0,9998

14
F100 - + 5765475577 Klebsiella oxytoca 0,7486

15
Apndice A3 Identificacin de aislamientos de pocillos negativos del mtodo
Colilert
-18/Quanti-Tray

Ref.
aislamie
nto
-Gal -Gluc Oxidasa Indol Perfil Crystal
E/NF
Identificacin Confianza
N1 NO HAY CRECIMIENTO
N4 - - + - 3103310212 Shewanella putrefaciens 0,9994
N17 - - + - 3103310212 Shewanella putrefaciens 0,9994

16

17
Apndice B: Datos de los estudios sobre la incertidumbre del recuento
(vase el apartado 4)

Apndice B1 Incertidumbre del recuento para NMP* de pocillos amarillos sin
fluorescencia de un sistema Colilert
-18/Quanti-Tray
inoculado
con Klebsiella pneumoniae ATCC 33186
*Nmero Ms Probable registrado como nmeros enteros

Analista A
Lectura 1
Analista A
Lectura 2
Lectura
Analista
B
Lectura
Analista
C
Repetibilidad Reproducibilidad
Muestra NMP NMP NMP NMP Media
Desv.
Est.
DER al
cuadrado
Media
Desv.
Est.
DER al
cuadrado
1 2 2 2 2 2,00 0,0000 0,0000 2,00 0,0000 0,0000
2 6 6 6 6 6,00 0,0000 0,0000 6,00 0,0000 0,0000
3 19 19 19 19 19,00 0,0000 0,0000 19,00 0,0000 0,0000
4 18 18 18 18 18,00 0,0000 0,0000 18,00 0,0000 0,0000
5 36 36 36 36 36,00 0,0000 0,0000 36,00 0,0000 0,0000
6 34 34 34 36 34,00 0,0000 0,0000 34,67 1,1547 0,0011
7 31 31 31 31 31,00 0,0000 0,0000 31,00 0,0000 0,0000
8 27 27 27 27 27,00 0,0000 0,0000 27,00 0,0000 0,0000
9 56 56 56 56 56,00 0,0000 0,0000 56,00 0,0000 0,0000
10 50 50 50 50 50,00 0,0000 0,0000 50,00 0,0000 0,0000
11 41 41 41 41 41,00 0,0000 0,0000 41,00 0,0000 0,0000
12 48 48 48 48 48,00 0,0000 0,0000 48,00 0,0000 0,0000
13 56 56 56 56 56,00 0,0000 0,0000 56,00 0,0000 0,0000
14 89 89 89 89 89,00 0,0000 0,0000 89,00 0,0000 0,0000
15 78 78 78 78 78,00 0,0000 0,0000 78,00 0,0000 0,0000
16 66 70 70 70 68,00 2,8284 0,0017 68,67 2,3094 0,0011
17 109 109 109 109 109,00 0,0000 0,0000 109,00 0,0000 0,0000
18 78 89 89 89 83,50 7,7782 0,0087 85,33 6,3509 0,0055
19 95 95 95 95 95,00 0,0000 0,0000 95,00 0,0000 0,0000
20 95 95 95 95 95,00 0,0000 0,0000 95,00 0,0000 0,0000
21 95 101 101 101 98,00 4,2426 0,0019 99,00 3,4641 0,0012
22 83 89 89 89 86,00 4,2426 0,0024 87,00 3,4641 0,0016
23 109 109 109 109 109,00 0,0000 0,0000 109,00 0,0000 0,0000
24 101 101 109 109 101,00 0,0000 0,0000 106,33 4,6188 0,0019
25 145 145 145 145 145,00 0,0000 0,0000 145,00 0,0000 0,0000
26 145 145 145 145 145,00 0,0000 0,0000 145,00 0,0000 0,0000
27 201 201 201 201 201,00 0,0000 0,0000 201,00 0,0000 0,0000
28 165 165 165 165 165,00 0,0000 0,0000 165,00 0,0000 0,0000
29 165 165 165 165 165,00 0,0000 0,0000 165,00 0,0000 0,0000
30 201 201 201 201 201,00 0,0000 0,0000 201,00 0,0000 0,0000

Suma
de DER 0,0147
Suma de
DER 0,0125
DERc 0,0221 DERc 0,0204

18
Apndice B2 Incertidumbre del recuento para NMP* de pocillos amarillos
con fluorescencia de un sistema Colilert
-18/Quanti-Tray

inoculado con E. coli ATCC 25922
*Nmero Ms Probable registrado como nmeros enteros

Analista A
Lectura 1
Analista A
Lectura 2
Lectura
Analista
B
Lectura
Analista
C
Repetibilidad Reproducibilidad
Muestra NMP NMP NMP NMP Media
Desv.
Est.
DER al
cuadrado
Media
Desv.
Est.
DER al
cuadrado
1 6 6 6 6 6,00 0,0000 0,0000 6,00 0,0000 0,0000
2 11 11 11 11 11,00 0,0000 0,0000 11,00 0,0000 0,0000
3 9 9 9 9 9,00 0,0000 0,0000 9,00 0,0000 0,0000
4 29 29 29 29 29,00 0,0000 0,0000 29,00 0,0000 0,0000
5 32 32 32 32 32,00 0,0000 0,0000 32,00 0,0000 0,0000
6 21 21 21 21 21,00 0,0000 0,0000 21,00 0,0000 0,0000
7 36 36 36 36 36,00 0,0000 0,0000 36,00 0,0000 0,0000
8 32 32 32 32 32,00 0,0000 0,0000 32,00 0,0000 0,0000
9 56 56 56 56 56,00 0,0000 0,0000 56,00 0,0000 0,0000
10 50 50 50 50 50,00 0,0000 0,0000 50,00 0,0000 0,0000
11 48 48 48 48 48,00 0,0000 0,0000 48,00 0,0000 0,0000
12 45 45 45 48 45,00 0,0000 0,0000 46,00 1,7321 0,0014
13 78 78 78 78 78,00 0,0000 0,0000 78,00 0,0000 0,0000
14 70 70 70 70 70,00 0,0000 0,0000 70,00 0,0000 0,0000
15 66 66 66 66 66,00 0,0000 0,0000 66,00 0,0000 0,0000
16 78 78 78 78 78,00 0,0000 0,0000 78,00 0,0000 0,0000
17 95 95 95 95 95,00 0,0000 0,0000 95,00 0,0000 0,0000
18 109 109 109 109 109,00 0,0000 0,0000 109,00 0,0000 0,0000
19 101 101 101 101 101,00 0,0000 0,0000 101,00 0,0000 0,0000
20 89 89 89 89 89,00 0,0000 0,0000 89,00 0,0000 0,0000
21 130 130 130 130 130,00 0,0000 0,0000 130,00 0,0000 0,0000
22 95 95 95 95 95,00 0,0000 0,0000 95,00 0,0000 0,0000
23 70 70 70 70 70,00 0,0000 0,0000 70,00 0,0000 0,0000
24 74 74 74 74 74,00 0,0000 0,0000 74,00 0,0000 0,0000
25 109 109 109 109 109,00 0,0000 0,0000 109,00 0,0000 0,0000
26 101 101 101 101 101,00 0,0000 0,0000 101,00 0,0000 0,0000
27 145 145 145 145 145,00 0,0000 0,0000 145,00 0,0000 0,0000
28 165 165 165 165 165,00 0,0000 0,0000 165,00 0,0000 0,0000
29 118 118 118 118 118,00 0,0000 0,0000 118,00 0,0000 0,0000
30 130 130 130 130 130,00 0,0000 0,0000 130,00 0,0000 0,0000

Suma
de DER 0,0000
Suma de
DER 0,0014
DERc 0,0000 DERc 0,0069

19
Apndice C: Recuentos por duplicado de suspensiones de E. coli, Klebsiella
pneumoniae y Citrobacter freundii de un sistema Colilert
-
18/Quanti-Tray
tras 18 horas y 22 horas de incubacin

utilizando Colilert-18 almacenado a 25 C durante 541 das
(vase el apartado 5)

Nmero de pocillos positivos
Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Citrobacter freundii Das desde
fabricacin
18 h 22 h
% de
cambio
18 h 22 h
% de
cambio
18 h 22 h
% de
cambio
8 2
4
7
2
4
7
0
0
0
12
11
15
12
11
15
0
0
0
11
14
16
11
14
16
0
0
0
15 9
16
8
9
16
8
0
0
0
9
19
13
9
19
13
0
0
0
2
5
7
3
5
7
+ 50 %
0
0
24 14
9
10
14
9
10
0
0
0
14
12
16
14
12
16
0
0
0
14
16
18
14
16
18
0
0
0
30 13
17
11
13
17
11
0
0
0
18
16
13
18
16
13
0
0
0
18
18
8
18
18
8
0
0
0
36 8
13
14
8
13
14
0
0
0
18
13
17
18
13
17
0
0
0
16
15
16
16
15
16
0
0
0
44 8
5
9
8
5
9
0
0
0
24
14
19
24
14
19
0
0
0
11
16
10
12
18
11
+ 9 %
+ 13 %
+ 10 %
56 13
4
4
13
4
4
0
0
0
10
16
14
10
16
14
0
0
0
6
7
11
7
14
11
+ 17 %
+ 100 %
0
84 10
8
8
10
8
8
0
0
0
14
16
19
14
16
19
0
0
0
11
8
12
11
8
12
0
0
0
111 9
5
21
9
5
21
0
0
0
20
12
12
20
12
12
0
0
0
20
17
17
20
17
17
0
0
0
138 3
2
9
3
2
9
0
0
0
14
15
12
14
15
12
0
0
0
8
10
13
9
10
13
+ 13 %
0
0
175 7
11
12
7
11
12
0
0
0
15
20
22
16
20
22
+ 7 %
0
0
16
20
30
16
21
30
0
+ 5 %
0
205 10
8
14
10
8
14
0
0
0
17
20
18
17
20
18
0
0
0
18
18
22
18
18
22
0
0
0
269 8
10
10
8
10
10
0
0
0
13
26
19
13
26
19
0
0
0
14
17
14
14
17
14
0
0
0
319 13
18
13
13
18
13
0
0
0
15
17
11
15
17
11
0
0
0
4
13
13
5
15
14
+ 25 %
+ 15 %
+ 8 %
367 2
11
2
11
0
0
12
21
12
21
0
0
17
20
17
20
0
0

20
10 10 0 20 20 0 21 21 0
541 7
10
9
7
10
9
0
0
0
13
17
16
13
17
16
0
0
0
11
11
8
11
12
9
0
+ 9 %
+ 13 %

Apndice D: Intervalos de confianza del 95% y repetibilidad terica
para cada uno de los valores de NMP para el sistema
Colilert-18/Quanti-Tray de 51 pocillos (vase el apartado 7)

Intervalos de
confianza del 95%
Repetibilidad terica
N de pocillos
reaccin
positiva
NMP por
100 ml de
muestra
Inferior Superior
Desviacin
estndar de la
repetibilidad
Log
10
DE
Incertidumbre
estndar
relativa
CV%
0 <1,0 0,0 3,7
- -
1 1,0 0,3 5,6
0,4343 100,0
2 2,0 0,6 7,3
0,3071 70,7
3 3,1 1,1 9,0
0,2508 57,7
4 4,2 1,7 10,7
0,2172 50,0
5 5,3 2,3 12,3
0,1943 44,7
6 6,4 3,0 13,9
0,1774 40,9
7 7,5 3,7 15,5
0,1643 37,8
8 8,7 4,5 17,1
0,1537 35,4
9 9,9 5,3 18,8
0,1450 33,4
10 11,1 6,1 20,5
0,1376 31,7
11 12,4 7,0 22,1
0,1313 30,2
12 13,7 7,9 23,9
0,1257 29,0
13 15,0 8,8 25,7
0,1209 27,8
14 16,4 9,8 27,5
0,1166 26,8
15 17,8 10,8 29,4
0,1127 26,0
16 19,2 11,9 31,3
0,1092 25,1
17 20,7 13,0 33,3
0,1061 24,4
18 22,2 14,1 35,2
0,1032 23,8
19 23,8 15,3 37,3
0,1005 23,1
20 25,4 16,5 39,4
0,0981 22,6
21 27,1 17,7 41,6
0,0959 22,1
22 28,8 19,0 43,9
0,0938 21,6
23 30,6 20,4 46,3
0,0919 21,2
24 32,4 21,8 48,7
0,0902 20,8
25 34,4 23,3 51,2
0,0885 20,4
26 36,4 24,7 53,9
0,0870 20,0
27 38,4 26,4 56,6
0,0856 19,7
28 40,6 28,0 59,5
0,0843 19,4
29 42,9 29,7 62,5
0,0830 19,1
30 45,3 31,5 65,6
0,0819 18,9
31 47,8 33,4 69,0
0,0809 18,6
32 50,4 35,4 72,5
0,0799 18,4

33 53,1 37,5 76,2
0,0791 18,2
34 56,0 39,7 80,1
0,0783 18,0
35 59,1 42,0 84,4
0,0776 17,9
36 62,4 44,6 88,8
0,0770 17,7
37 65,9 47,2 93,7
0,0765 17,6
38 69,7 50,0 99,0
0,0761 17,5
39 73,8 53,1 104,8
0,0758 17,4
40 78,2 56,4 111,2
0,0756 17,4
41 83,1 59,9 118,3
0,0756 17,4
42 88,5 63,9 126,2
0,0757 17,4
43 94,5 68,2 135,4
0,0761 17,5
44 101,3 73,1 146,0
0,0768 17,7
45 109,1 78,6 158,7
0,0778 17,9
46 118,4 85,0 174,5
0,0794 18,3
47 129,8 92,7 195,0
0,0819 18,9
48 144,5 102,3 224,1
0,0859 19,8
49 165,2 115,2 272,2
0,0929 21,4
50 200,5 135,8 387,6
0,1094 25,2
51 > 200,5 146,1 infinite
- -

7541 01 Colilert 18 QT Validation Report Es Final

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Validacin del mtodo Colilert

para el recuento de E. coli y de

es una prueba diseada especficamente para el

est diseado principalmente para el anlisis de

, las bacterias coliformes son aquellas que

: el periodo de incubacin recomendado de 18-22 horas y el periodo de validez

es un mtodo de NMP con un rango de recuento

, calculados a partir del programa

tras 18 horas y 22 horas de incubacin

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