1.

Introduccin

De todos los tipos de contaminacin ambiental puede destacarse la contaminacin del agua. En
diversos estudios como anlisis de alimentos, de agua de bebida, de productos farmacuticos o
del medioambiente, es importante determinar su calidad y conocer el nmero de
microorganismos presentes (Borrego, 1992).
Muchas veces el agua puede ser completamente transparente, incolora e inodora, pero aun as
estar contaminada (Granados & Villaverde, 1997), y para medir el nmero de bacterias presentes
se usan normalmente dos tcnicas. Una consiste en sembrar alcuotas de diluciones sucesivas de la
muestra, en tubos con medio lquido, y la otra tcnica consiste en sembrar las alcuotas en placas
de Petri con medio slido.
2. Objetivos

a) Determinar recuentos de bacterias en muestras de aguas por mtodo de diseminacin en
placa.
b) Determinar recuentos de bacterias en muestras de aguas por mtodo de inclusin en
placa.
c) Determinar recuentos de bacterias en muestras de aguas por mtodo de dilucin en tubo.
3. Mtodos analticos

a) Dilucin seriada por diseminacin en placa:
Se tom 1 ml de agua del frasco rotulado con el numero 4, y se traspaso utilizando pipetas
Pasteur al tubo de ensayo rotulado -1, que previamente contena agua destilada. Luego se
efectu la dilucin traspasando 1 ml del tubo -1 al tubo -2, y del tubo -2 al -3.
Se tomaron 0,2 ml de cada tubo y se depositaron en la superficie de placas con agar tripticasa,
previamente rotulados segn el tubo usado. Las placas fueron incubadas a 30C por 48 horas,
luego se contabilizaron las colonias visibles de cada placa.
b) Dilucin seriada por inclusin en placa:
Se utilizaron las mismas diluciones preparadas anteriormente. Traspasando 1 ml a placas Petri
esterilizadas, previamente rotuladas con la dilucin correspondiente. Luego se agregaron a cada
placa el contenido de un tubo de agar nutritivo fundido a bao Mara y enfriado a 45C. Se dejaron
en reposo por 5 minutos, para permitir la solidificacin del agar, y se incubaron las placas a 30C
por 48 horas. Se trabaj en duplicado. Y finalmente se contaron las colonias de igual modo que en
el mtodo por diseminacin.
c) Dilucin seriada en tubo:
Se efectuaron las diluciones a partir de la muestra de agua 3, en tres tubos del mismo modo que
en los mtodos anteriores. Esta vez sembrando 1 ml de cada uno, en tres tubos conteniendo
medio de cultivo lquido. Se trabajo en triplicado, y se incubaron los tubos a 30C, por 48 horas.
Los resultados se interpretaron segn la Tabla del N.M.P (numero ms probable).
4. Resultados

Tubo -1 -2 -3
150 17 7
Tabla 1: resultados de dilucin por diseminacin.
Tubo -1 -2 -3
Serie 1 220 120 40
Serie 2 180 92 30
Tabla 2: resultados de dilucin por inclusin (duplicado).
En las placas donde se utiliz el mtodo de diseminacin en placas, se contabilizaron las colonias y
el resultado fue de 150 UFC (unidades formadoras de colonias) en el tubo -1, 17 en el tubo -2 y
7 en el tubo -3 (tabla 1). Sin embargo el resultado debe expresarse en UFC por ml, por lo tanto
hicimos el siguiente clculo:
N de UFC * cantidad de ml * dilucin
Diseminacin en placas:
150*0,2*100=3000 UFC/ml (tubo -1)
17*0,2*10=34 UFC/ml (tubo -2)
7*0,2*1= 3,4 UFC/ml (tubo -3)
Para realizar el recuento de las bacterias donde se utilizo el mtodo de dilucin por inclusin en
placas, se realizaron dos series, y los resultados tambin se calcularon con la formula anterior para
determinar la cantidad de unidades formadoras de colonias por ml.
Inclusin en placas:
Serie 1: 220*1*100=22000 UFC/ml (tubo -1)
120*1*10=1200 UFC/ml (tubo -2)
40*1*1= 40 UFC/ml (tubo -3)
Serie 2: 180*1*100=18000 UFC/ml (tubo -1)
92*1*10=920 UFC/ml (tubo -2)
30*1*1=30 UFC/ml (tubo -3)

Finalmente en la dilucion seriada en tubos, los resultados se interpretaron segn la tabla NMP,
donde los tubos positivos son los que presentaron turbides devido al crecimiento bacteriano. El
resultado fue 3-3-3, es decir todos los tubos fueron positivos, por lo tanto el numero mas probable
de bacterias, segn la tabla, es mayor o igual a 2.400 por ml.
5. Discusin

Los mtodos utilizados nos permitieron determinar el nmero de clulas viables, es decir, aquellas
capaces de dividirse y originar descendencia (Granados & Villaverde, 1997). Las muestras fueron
sometidas a dilucin ya que las poblaciones bacterianas suelen ser muy grandes, y resultara
imposible contarlas. Es por esto que se trabaja con muestras muy pequeas y diluidas.
En los mtodos de dilucin sobre placas, el conteo se basa en la suposicin de que cada bacteria
crece y se divide para producir una colonia, lo que no siempre es cierto. Con frecuencia las
bacterias crecen unidas en cadenas o como grumos, por consiguiente a menudo una colonia no se
produce como resultado de una nica bacteria sino de segmentos cortos de una cadena o de un
agregado bacteriano (Tortora et al, 2007). Por esto los recuentos suelen nombrarse como
unidades formadoras de colonias.
En el mtodo por inclusin la desventaja es que ciertos organismos son sensibles al calor y pueden
resultar daados por el agar fundido, siendo incapaces de formar colonias. En cambio la tcnica de
diseminacin permite el crecimiento de todas las colonias (Tortora et al, 2007).
De todos los mtodos empleados, el recuento por diseminacin en placas es el mas exacto,
considerando que la exactitud es la capacidad de acercarse al valor real. En cuanto a precisin, en
nuestro caso, el recuento por turbidez fue el mas preciso, ya que los resultados fueron iguales en
todas las replicas.
Un mtodo que no se llevo a cabo fue el de microscopa de epifluorescencia. Con este mtodo se
contabilizan los microorganismos totales, es decir, vivos, muertos y activos, logrando determinar
la biomasa, tras teir la muestra con naranja de acridina (Borrego, 1992).
6. Conclusiones

El agua es un recurso vital para la humanidad, por lo tanto, poder determinar su calidad es de
suma importancia. Para esto llevamos a cabo en el laboratorio tres tcnicas diferentes de recuento
bacteriano; dilucin seriada por inclusin en placas, dilucin seriada por diseminacin en placa, y
dilucin seriada en tubos. De estos tres mtodos el ms exacto fue el recuento en placas por
diseminacin, ya que logramos contar fcilmente las colonias presentes, tomando en cuenta que
estas pudieron crecer con normalidad, a diferencia de la tcnica por inclusin donde algunas
bacterias fueron afectadas por el calor. Tambin en la dilucin en tubos solo obtuvimos una
aproximacin segn la tabla sin considerar el grado de turbidez del agua, sin embargo, fue el mas
preciso ya que se obtuvo el mismo resultado en todas las replicas.

7. Bibliografa.

- Borrego J. 1992. Mtodos microbiolgicos rpidos para anlisis de aguas y alimentos.
Universidad de Mlaga. Espaa. 384 pp.

- Granados R. & M. Villaverde 1997. Microbiologa. Volumen 1. Editorial Paraninfo. Espaa.
352 pp.

- Tortora G. , B. Funke & C. Case. 2007. Introduccin a la microbiologa. Ed. Mdica
Panamericana. Espaa. 959 pp.











Universidad de Concepcin
Facultad de Ciencias Naturales y Oceanogrficas








Tcnicas de recuento viable
de bacterias en agua






Nombre: Iara Cid Del Rio
Asignatura: Microbiologa
Concepcin, Mayo de 2013