ECNICAS UTILIZADAS PARA DETECTAR GLICOCONJUGADOS Y GLICANOS EN

SECCIONES DE PARAFINA:
1-TECNICA DE PAS.

El PAS tie nicamente hidratos de carbono?

La tcnica de PAS (cido peridico-Schiff) es y ha sido utilizada durante mucho tiempo por numerosos
investigadores como mtodo de identificacin de macromolculas con hidratos de carbono, pero como
veremos la reaccin PAS positiva puede deberse a la presencia de otras molculas muy diferentes a los
hidratos de carbono. Por lo tanto, segn Pearse (1985) la especificidad del PAS para la deteccin de
hidratos de carbono no puede ser aceptada sin una cualificacin.
Los hidroxilos libres de dos tomos de carbono adyacentes (como los grupos 1,2-glicol de las hexosas)
(Fig. 1) de macromolculas tisulares pueden ser visualizadas histoqumicamente mediante la oxidacin
a dialdehdos (con el cido peridico) y posterior condensacin de los grupos aldehdos con agentes
cromognicos como el reactivo de Schiff (Spicer et al., 1961, Spicer, 1992). Los grupos hidroxilos
adyacentes visualizados por el PAS estn presentes principalmente -pero no exclusivamente- en
residuos de carbohidratos (Spicer, 1961). Los azcares pequeos son solubles y, por lo tanto, no resisten
los diferentes lavados durante el procedimiento.

El resultado positivo puede indicar la presencia de algunos glicanos (polisacridos) como el glucgeno o
de glicoconjugados. Los glicoconjugados (hidratos de carbono unidos a otras molculas que no son
carbohidratos) incluyen a las glicoprotenas, proteoglicanos y a los glicolpidos (Spicer, 1992). Se ha
demostrado que con tiempos de oxidacin normales el PAS no reacciona con los glicosaminoglicanos
(polisacridos) ni con proteoglicanos (Pearse, 1985; Spicer, 1992). Por lo tanto, la positividad del PAS
se debe, en parte, a la presencia de glicoprotenas (neutras o levemente cidas ) y de glucgeno. A su
vez, slo algunas glicoprotenas neutras son PAS positivas (Pearse, 1985). La reaccin se debe a las
hexosas presentes en las glicoprotenas ya que las hexosaminas y cidos hexurnicos parecen no
contribuir en la reaccin (Pearse, 1985).
Los aminoglicoles presentes en los residuos amino terminales de la serina y treonina de protenas son
susceptibles a reaccionar con el PAS pero generalmente no estn presentes en gran cantidad para
contribuir significativamente a la tincin (Spicer et al, 1961). Entre otras sustancias PAS positivas
pueden detectarse protenas ricas en residuos de cistena (Pearse, 1985). A nivel extracelular las
glicoprotenas de la membrana basal, las fibras reticulares, las fibras colgenas y ciertas sustancias
hialinas son tambin PAS positivas (Sheehan y Hrapchak, 1980).
Los glicolpidos, fosfolpidos y algunos pigmentos de naturaleza lipdica como el ceroide son PAS
positivos. Tambin lo son los lpidos insaturados (Sheehan y Hrapchak, 1980).
Es importante destacar que las diferencias de intensidad de la reaccin del PAS de diferentes
estructuras en distintos trabajos pueden deberse a varias causas:
a- El fijador utilizado (Sheenan y Hrapchak, 1980). b- La tcnica de PAS utilizada (Pearse, 1985). Por
lo tanto, no creemos que cuantificar la tcnica de PAS sea de importancia, pero s lo es el hecho de que
una estructura dada sea o no PAS positiva. Es til analizar las diferencias en intensidades de la
reaccin, slo si la misma ha sido sometida a diferentes controles o si los tejidos han sido tratados de
igual forma.
Sin lugar a dudas es clara la necesidad de realizar otras tcnicas con el fin de cualificar los resultados PAS
positivos. Por ejemplo:
a) Tcnica de PAS sin oxidacin previa: permite asegurar que todos los productos PAS positivos son el
resultado de una oxidacin previa. Por lo tanto se debe realizar un control sin la oxidacin previa con el
cido peridico (Martoja y Martoja-Pierson, 1970).
b) Deteccin de lpidos en cortes de parafina: en general los lpidos son arrastrados por los solventes
durante la inclusin en parafina. Sin embargo, no debe descartarse el hecho de que se puedan teir
lpidos insolubles como algunos glicolpidos, fosfolpidos y lpidos insaturados (Spicer, 1992). Los
lpidos son extrados -segn Bancroft y Stevens 1990- si se tratan las secciones con una mezcla de
cloroformo y metanol o con acetona caliente. La bromacin previa a la tcnica de PAS puede utilizarse
para bloquear los grupos etilnicos PAS reactivos de los lpidos insaturados (Cohn, 1955). La reaccin
de Schiff con cido perfrmico para la deteccin de lpidos insaturados (Sheehan y Hrapchak, 1980) es
muy til si a la vez se realiza un control negativo con bromacin.
Para detectar la presencia de lpidos insolubles en cortes de parafina son tiles las tcnicas de Negro-
Sudan B para cortes de parafina (Pearse, 1985), Klver-Barrera (1953) para detectar fosfolpidos y
glicolpidos -como ganglisidos y cerebrsidos- (Pearse, 1985) y la reaccin modificada de Bruckner
(Pearse, 1985) para detectar glicolpidos.

c) Comprobacin de grupos 1-2 glicol: segn Martoja y Martoja-Pierson (1970) es indispensable la
comprobacin, mediante la reaccin de la acetilacin reversible, de que el carcter PAS positivo de una
estructura se debe nicamente a las funciones 1-2 glicol. Segn este autor este punto es verificado
mediante el bloqueo reversible de las funciones 1-2 glicol por acetilacin con actico anhidro y piridina
anhidra. Al acetilarse los hidroxilos vecinos, el cido peridico no puede actuar y los hidratos de
carbono oxidables dan PAS negativos. Mediante la saponificacin (desacetilacin) con hidrxido de
potasio se restaura la PAS positividad de dichas estructuras. Segn Hale (citado por Pearse, 1985) la
acetilacin bloquea todas las sustancias posiblemente PAS positivas y la desacetilacin restaura su
actividad. Para Pearse (1985) esta reaccin carece de fines prcticos, aunque en su libro de
histoqumica (apndice 15, de la parte primera) menciona la tcnica sealando que la reaccin negativa
luego de la acetilacin indica la presencia de grupos 1-2 glicol.
d) Presencia de glucgeno: El mtodo ms til para identificar la presencia de glucgeno mediante la
tcnica de PAS, es tratar los cortes con la enzima diastasa o alfa-amilasa. Estas enzimas despolimerizan
el glucgeno formando azcares pequeos que son extrados con el agua de lavado luego de aplicar las
enzimas. Una disminucin o negatividad de la reaccin de PAS luego de este tratamiento indica
claramente la presencia de glucgeno (Sheenan y Hrapchak, 1980, Spicer, 1992). Tambin existen otras
tcnicas que permiten detectar la presencia de glucgeno en cortes de parafina. La ms utilizada es
el carmn de Best (mecanismo emprico). Es selectiva para el glucgeno, aunque tambin puede teir
suavemente glicoconjugados neutros y fibrina (Bancroft y Stevens, 1990).
Es til aclarar que los depsitos de glucgeno intracelulares son fcilmente reconocibles en cortes
ultrafinos a nivel de microscopa electrnica.
e) Azcares neutros versus azcares cidos: desde el ao 1973 Liao y col. (citados por Pearse, 1985) han
demostrado que disminuyendo la concentracin del cido peridico puede oxidarse en forma especfica
los residuos de cido silico de los glicoconjugados. Estos residuos son muy comunes en las
glicoprotenas (Pearse, 1985) y se ha demostrado que reaccionan ms rpido a la oxidacin con el
peridico que los glicoles de las hexosas, 6-deoxyhexosas o n-acetylhexosaminas de los azcares neutros
(Volz et al., 1987a). La tcnica de Volz y col. (1987a) es un excelente mtodo para la oxidacin selectiva
de cidos silicos tisulares con el periodato. Presumiblemente la selectividad a los residuos de cido
silico de la modificacin del PAS realizada por Volz y col., se deba a un incremento en el grado de
oxidacin de los residuos de silico producido por una disminucin del pH y la baja concentracin de
peridico del agente utilizado. A su vez, ocurrira una disminucin en la tasa de oxidacin de los
azcares neutros lo cual produce una concentracin insuficiente de grupos aldehdos capaces de ofrecer
reaccin visible del reactivo de Schiff (Volz, et al., 1987a).

En algunas glicoprotenas cidas, los carbonos 7, 8 9 de los residuos de cido silico pueden hallarse
acetilados (Pearse, 1985) y por lo tanto no ser reactivos a la tcnica de PAS ni a la modificacin de la
misma realizada por Vols y col.. Mediante la saponificacin con hidrxido de potasio pueden
desacetilarse y hacerse PAS reactivos (Culling et al., 1974). Por lo tanto un aumento de la reaccin de
PAS luego de la saponificacin puede indicar la presencia de cido silico acetilado (con O-acyl steres).
No debe descartarse la posibilidad que dicho aumento se deba tambin a la desacetilacin de grupos 1-2
glicol de los azucares neutros (Pearse, 1985). Una forma de reconocer la presencia de cidos silicos
totales incluyendo los grupos que pueden estar acetilados es sometiendo los cortes a saponificacin
(remocin de los acetilos) y luego realizar la tcnica de Volz y col. (1987a). De forma similar puede
reconocerse la presencia de azcares neutros, bloqueando la reaccin del cido silico. Las etapas
fundamentales son las siguientes (Volz et al., 1987b): I-saponificacin con hidrxido de potasio
(eliminamos los acetilos presentes en los residuos 1-2 glicol y en el cido silico), II-oxidacin peridica
selectiva segn Volz y col. (1987a) (oxidamos a aldehdos, slo los oxhidrilos de los residuos de cido
silico), III-reducir mediante la utilizacin del borohidruro de sodio los aldehdos producidos en la
oxidacin anterior a alcoholes, IV-realizamos la tcnica de PAS (de esta forma slo reaccionarn los
oxhidrilos vecinos de los residuos 1-2 glicol de los azcares neutros, ya que los oxhidrilos del cido
silico fueron transformados a alcoholes por el borohidruro de sodio y por lo tanto no son PAS
reactivos).
El resultado positivo puede indicar la presencia de algunos glicanos (polisacridos) como el glucgeno o
de glicoconjugados. Los glicoconjugados (hidratos de carbono unidos a otras molculas que no son
carbohidratos) incluyen a las glicoprotenas, proteoglicanos y a los glicolpidos (Spicer, 1992). Se ha
demostrado que con tiempos de oxidacin normales el PAS no reacciona con los glicosaminoglicanos
(polisacridos) ni con proteoglicanos (Pearse, 1985; Spicer, 1992). Por lo tanto, la positividad del PAS
se debe, en parte, a la presencia de glicoprotenas (neutras o levemente cidas ) y de glucgeno. A su
vez, slo algunas glicoprotenas neutras son PAS positivas (Pearse, 1985). La reaccin se debe a las
hexosas presentes en las glicoprotenas ya que las hexosaminas y cidos hexurnicos parecen no
contribuir en la reaccin (Pearse, 1985).
Los aminoglicoles presentes en los residuos amino terminales de la serina y treonina de protenas son
susceptibles a reaccionar con el PAS pero generalmente no estn presentes en gran cantidad para
contribuir significativamente a la tincin (Spicer et al, 1961). Entre otras sustancias PAS positivas
pueden detectarse protenas ricas en residuos de cistena (Pearse, 1985). A nivel extracelular las
glicoprotenas de la membrana basal, las fibras reticulares, las fibras colgenas y ciertas sustancias
hialinas son tambin PAS positivas (Sheehan y Hrapchak, 1980).
Los glicolpidos, fosfolpidos y algunos pigmentos de naturaleza lipdica como el ceroide son PAS
positivos. Tambin lo son los lpidos insaturados (Sheehan y Hrapchak, 1980).
Es importante destacar que las diferencias de intensidad de la reaccin del PAS de diferentes
estructuras en distintos trabajos pueden deberse a varias causas:
a- El fijador utilizado (Sheenan y Hrapchak, 1980). b- La tcnica de PAS utilizada (Pearse, 1985). Por
lo tanto, no creemos que cuantificar la tcnica de PAS sea de importancia, pero s lo es el hecho de que
una estructura dada sea o no PAS positiva. Es til analizar las diferencias en intensidades de la
reaccin, slo si la misma ha sido sometida a diferentes controles o si los tejidos han sido tratados de
igual forma.
Sin lugar a dudas es clara la necesidad de realizar otras tcnicas con el fin de cualificar los resultados PAS
positivos. Por ejemplo:
a) Tcnica de PAS sin oxidacin previa: permite asegurar que todos los productos PAS positivos son el
resultado de una oxidacin previa. Por lo tanto se debe realizar un control sin la oxidacin previa con el
cido peridico (Martoja y Martoja-Pierson, 1970).
b) Deteccin de lpidos en cortes de parafina: en general los lpidos son arrastrados por los solventes
durante la inclusin en parafina. Sin embargo, no debe descartarse el hecho de que se puedan teir
lpidos insolubles como algunos glicolpidos, fosfolpidos y lpidos insaturados (Spicer, 1992). Los
lpidos son extrados -segn Bancroft y Stevens 1990- si se tratan las secciones con una mezcla de
cloroformo y metanol o con acetona caliente. La bromacin previa a la tcnica de PAS puede utilizarse
para bloquear los grupos etilnicos PAS reactivos de los lpidos insaturados (Cohn, 1955). La reaccin
de Schiff con cido perfrmico para la deteccin de lpidos insaturados (Sheehan y Hrapchak, 1980) es
muy til si a la vez se realiza un control negativo con bromacin.
Para detectar la presencia de lpidos insolubles en cortes de parafina son tiles las tcnicas de Negro-
Sudan B para cortes de parafina (Pearse, 1985), Klver-Barrera (1953) para detectar fosfolpidos y
glicolpidos -como ganglisidos y cerebrsidos- (Pearse, 1985) y la reaccin modificada de Bruckner
(Pearse, 1985) para detectar glicolpidos.

c) Comprobacin de grupos 1-2 glicol: segn Martoja y Martoja-Pierson (1970) es indispensable la
comprobacin, mediante la reaccin de la acetilacin reversible, de que el carcter PAS positivo de una
estructura se debe nicamente a las funciones 1-2 glicol. Segn este autor este punto es verificado
mediante el bloqueo reversible de las funciones 1-2 glicol por acetilacin con actico anhidro y piridina
anhidra. Al acetilarse los hidroxilos vecinos, el cido peridico no puede actuar y los hidratos de
carbono oxidables dan PAS negativos. Mediante la saponificacin (desacetilacin) con hidrxido de
potasio se restaura la PAS positividad de dichas estructuras. Segn Hale (citado por Pearse, 1985) la
acetilacin bloquea todas las sustancias posiblemente PAS positivas y la desacetilacin restaura su
actividad. Para Pearse (1985) esta reaccin carece de fines prcticos, aunque en su libro de
histoqumica (apndice 15, de la parte primera) menciona la tcnica sealando que la reaccin negativa
luego de la acetilacin indica la presencia de grupos 1-2 glicol.
d) Presencia de glucgeno: El mtodo ms til para identificar la presencia de glucgeno mediante la
tcnica de PAS, es tratar los cortes con la enzima diastasa o alfa-amilasa. Estas enzimas despolimerizan
el glucgeno formando azcares pequeos que son extrados con el agua de lavado luego de aplicar las
enzimas. Una disminucin o negatividad de la reaccin de PAS luego de este tratamiento indica
claramente la presencia de glucgeno (Sheenan y Hrapchak, 1980, Spicer, 1992). Tambin existen otras
tcnicas que permiten detectar la presencia de glucgeno en cortes de parafina. La ms utilizada es
el carmn de Best (mecanismo emprico). Es selectiva para el glucgeno, aunque tambin puede teir
suavemente glicoconjugados neutros y fibrina (Bancroft y Stevens, 1990).
Es til aclarar que los depsitos de glucgeno intracelulares son fcilmente reconocibles en cortes
ultrafinos a nivel de microscopa electrnica.
e) Azcares neutros versus azcares cidos: desde el ao 1973 Liao y col. (citados por Pearse, 1985) han
demostrado que disminuyendo la concentracin del cido peridico puede oxidarse en forma especfica
los residuos de cido silico de los glicoconjugados. Estos residuos son muy comunes en las
glicoprotenas (Pearse, 1985) y se ha demostrado que reaccionan ms rpido a la oxidacin con el
peridico que los glicoles de las hexosas, 6-deoxyhexosas o n-acetylhexosaminas de los azcares neutros
(Volz et al., 1987a). La tcnica de Volz y col. (1987a) es un excelente mtodo para la oxidacin selectiva
de cidos silicos tisulares con el periodato. Presumiblemente la selectividad a los residuos de cido
silico de la modificacin del PAS realizada por Volz y col., se deba a un incremento en el grado de
oxidacin de los residuos de silico producido por una disminucin del pH y la baja concentracin de
peridico del agente utilizado. A su vez, ocurrira una disminucin en la tasa de oxidacin de los
azcares neutros lo cual produce una concentracin insuficiente de grupos aldehdos capaces de ofrecer
reaccin visible del reactivo de Schiff (Volz, et al., 1987a).

En algunas glicoprotenas cidas, los carbonos 7, 8 9 de los residuos de cido silico pueden hallarse
acetilados (Pearse, 1985) y por lo tanto no ser reactivos a la tcnica de PAS ni a la modificacin de la
misma realizada por Vols y col.. Mediante la saponificacin con hidrxido de potasio pueden
desacetilarse y hacerse PAS reactivos (Culling et al., 1974). Por lo tanto un aumento de la reaccin de
PAS luego de la saponificacin puede indicar la presencia de cido silico acetilado (con O-acyl steres).
No debe descartarse la posibilidad que dicho aumento se deba tambin a la desacetilacin de grupos 1-2
glicol de los azucares neutros (Pearse, 1985). Una forma de reconocer la presencia de cidos silicos
totales incluyendo los grupos que pueden estar acetilados es sometiendo los cortes a saponificacin
(remocin de los acetilos) y luego realizar la tcnica de Volz y col. (1987a). De forma similar puede
reconocerse la presencia de azcares neutros, bloqueando la reaccin del cido silico. Las etapas
fundamentales son las siguientes (Volz et al., 1987b): I-saponificacin con hidrxido de potasio
(eliminamos los acetilos presentes en los residuos 1-2 glicol y en el cido silico), II-oxidacin peridica
selectiva segn Volz y col. (1987a) (oxidamos a aldehdos, slo los oxhidrilos de los residuos de cido
silico), III-reducir mediante la utilizacin del borohidruro de sodio los aldehdos producidos en la
oxidacin anterior a alcoholes, IV-realizamos la tcnica de PAS (de esta forma slo reaccionarn los
oxhidrilos vecinos de los residuos 1-2 glicol de los azcares neutros, ya que los oxhidrilos del cido
silico fueron transformados a alcoholes por el borohidruro de sodio y por lo tanto no son PAS
reactivos).
3) UTILIZACION DE LA TECNICA DE PAS JUNTO CON EL AZUL ALCIAN.
Esta tcnica puede diferenciar fcilmente la presencia de glicoconjugados y cidos y neutros en un
mismo preparado (Bancroft y Stevens, 1990). Consiste en una primera tincin con el azul alcin a pH
2,5, seguida de la tcnica de PAS. El uso en primer lugar del azul alcin permite colorear los
glicoconjugados y glicosaminoglicanos cidos. Los glicoconjugados cidos que puedan reaccionar con el
PAS aparentemente son bloqueados por el azul alcin. Por lo tanto, la posterior utilizacin del PAS slo
reaccionar con los glicoconjugados neutros (Bancroft y Stevens, 1990). Segn Spicer (1992) pueden
reaccionar tambin glicoprotenas con hexosas PAS reactivas y grupos aninicos alcin reactivos. La
interpretacin de los resultados es la siguiente (Spicer, 1992):
PAS+, azul alcin- (color rojo o rosado): ha sido interpretado como indicador de glicoprotenas
neutras (raramente glicolpidos insolubles).
PAS+, azul alcin+ (el color depender de la entidad dominante y puede variar del azul
prpura, hacia el prpura o al violeta): glicoprotenas cidas o una mezcla de glicoprotenas
cidas y neutras o una mezcla de glicoprotenas cidas y neutras ms glicosaminoglicanos.
PAS-, Azul alcin+ (color azul): se juzgan como glicosaminoglicanos y glicoprotenas cidas
libres de hexosas PAS reactivas. Tambin debe considerarse aqu la presencia de glicoprotenas
cidas con hexosas bloqueadas por la unin del alcin a la macromolcula (Bancroft y Stevens,
1990).



Los grupos cromforos son los grupos funcionales de la molcula responsables de la absorcin.
Principalmente son: dobles y triples enlaces carbono-carbono, sistemas aromticos, grupo
carbonilo, imino (C=N), diazo (N=N), nitro y enlaces C-Y (Y es un tomo con pares libres).
Los grupos auxocromos son sustituyentes del cromforo y alteran max y/o max. Son auxocromos
los grupos metilo, halgenos, hidroxi, alcoxi, amino.
Los grupos auxocromo tienen los siguientes efectos sobre los cromforos:
Desplazamiento batocrmico. La absorcin del cromforo se desplaza hacia mayores longitudes de
onda.
Desplazamiento hipsocrmico. La absoricin del cromforo se desplaza hacia menores logitudes de
onda.
Efecto hipsocrmico. Aumenta max, presentando la banda mayor intensidad.
Efecto hipocrmico. Disminuye max, disminuyendo la intensidad de absorcin.