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Unversité de Metz

IUT Thionville-Yutz
S1M1 - Mathématiques

Doc S3 – Dénombrements sur gélose – Partie II

Cas de plusieurs déterminations indépendantes d’un même échantillon


Si, à partir d’un même échantillon, k séries de dilutions indépendantes sont réalisées, elles
permettront d’obtenir k déterminations de la densité microbienne de l’échantillon selon :
rij
j
i vij
j

Aussi, la moyenne de toutes les observations disponibles demeure le meilleur estimateur de la


densité moyenne de l’échantillon. En général, elle est très proche de celle calculée sur la base
d’un plus faible nombre d’observations.
Cependant, l’IC associé à cette estimation moyenne est fortement réduit si l’on peut
considérer, pour un risque statistique donné (souvent, = 0.05), que les k estimations sont
équivalentes.

Comparaison des k déterminations indépendantes (loi du Chi-deux (


Il s’agit donc tout d’abord de comparer entre elles les k observations réalisées, grâce à un test
du 2.
Nous réalisons donc un test d’hypothèse, avec :
- pour hypothèse nulle : les k observations sont équivalentes et statistiquement égales à
leur valeur moyenne ;
- hypothèse alternative : au moins 2 des k observations ne sont pas équivalentes,
et ce, en choisissant le niveau de risque de première espèce ( : risque d’accepter à tord
l’hypothèse nulle).

La statistique du correspond à la somme des différences (au carré) entre les observations
(e.g. nombre de colonies) et une valeur théorique, le tout rapportée à cette valeur théorique,
selon :
(Obsi Théo) 2
2 i
Théo
Ici, c’est la valeur moyenne des k observations (e.g. nombres de colonies) qui est prise pour
valeur théorique.

La valeur de cette statistique est alors comparée à la valeur d’une variable qui suit la loi du 2
pour (k-1) degrés de liberté (ddl). (cf. Table du 2)
Si la statistique calculée demeure inférieure à la valeur tabulée ( 2(1- ; k-1)), alors l’hypothèse
nulle n’est pas rejetée et, autour de la valeur moyenne ( ), l’estimation bénéficie d’un IC
réduit, selon :

Linf/ sup r u(1 ) . r


avec u(1- ) : valeur d’une variable qui suit une loi N(0 ; 1).

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Si les k observations ne peuvent, au niveau de risque choisi, être considérées comme
équivalentes, alors il sera toujours possible de proposer la valeur moyenne comme valeur
centrale de l’estimation, mais l’IC associé ne pourra être réduit ; par prudence, il correspondra
au plus grand des k IC calculés.

L’estimation finale est obtenue en tenant compte des volumes ensemencés et des facteurs de
dilution.

Remarque importante : le calcul de la statistique du test de comparaison, comme la formule


donnant les bornes de l’IC, sont alimentés par les valeurs des évènements dénombrés (e.g.
nombre de colonies) ou rij, et non par les déterminations volumiques ou rij / vij.
L’idée est que la variable aléatoire est le nombre d’évènements dénombrés (e.g. les colonies),
et que la variabilité ne porte pas sur les dilutions réalisées, supposées parfaites.

L’adoption d’une technique de calcul erronée peut ainsi être décelée par le fait que les mêmes
valeurs d’UFC, associées à une dilution de référence différente, fourniraient des estimations
dont les IC varieraient fortement en fonction du niveau de dilution considéré, ce qui est
absurde.

Exemple de calcul (3 déterminations indépendantes)


Soit un second exemple de dénombrement bactérien en UFC/mL, pour lequel 3 séries
indépendantes (A, B, C) d’un même échantillon ont été réalisées et ensemencées (3 BdP /
niveau de dilution ; 0.1 mL / BdP).

Réplicat (i) A B C vj
Dilution (j) UFC (vi) UFC (vi) UFC (vi)
10^(-5) 420 (1) 380 (1) 370 (1) 3x1
10^(-6) 42 (0.1) 32 (0.1) 41 (0.1) 3 x 0,1
10^(-7) 1 (0.01) 5 (0.01) 2 (0.01) 3 x 0,01
rj 463 417 413 \ 3,33
1293 \

La moyenne des 3 séries d’observations vaut : rij / 3 = (463+417+413) / 3 = 1293 / 3 = 431.


Cette valeur est utilisée comme valeur théorique dans le calcul de la statistique du test de
comparaison.
2
La comparaison des 3 résultats indépendants requiert le calcul de la statistique du , réalisé à
partir des observations ( rj). Cette statistique vaut ici :
[(463-431)2 + (417-431)2 + (413-431)2] / 431 = (1024 + 196 + 324) / 431 = 3.58

Or, 3.58 < 2(0.95 ; 2)) = 5.99


L’hypothèse nulle (les 3 déterminations sont équivalentes) au seuil de 5%, n’est pas rejetée.

L’estimation de la densité bactérienne de l’échantillon vaut donc :


= (1293 / 3,33) x 105 x 10 = 3,87 x 108 UFC/mL
Li = (1293 – 1.96 x (1293)0.5) / 3,33 x 105 x 10 = 3,66 x 108 UFC/mL
Ls = (1293 + 1.96 x (1293) 0.5) / 3.33 x 105 x 10 = 4,08 x 108 UFC/mL

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ou encore :
= 3,87 (3,66 ; 4,08) x 108 UFC/mL

Hétérogénéité du milieu
Les milieux prélevés présentent souvent une hétérogénéité de la distribution, dans l’espace et
dans le temps, des entités microbiennes.
Si la répartition au hasard des micro-organismes dans le milieu (Fig. 1.I) est souvent une
condition tacitement admise pour appliquer des formules de dénombrement quantitatif, la
réalité peut d’autant mieux ressembler à la Fig. 1.II que les conditions environnementales
permettent souvent une agrégation des micro-organismes entre eux ou une adsorption de
ceux-ci sur support (particules en suspension, conduites…)

Or, en reprenant Maul 1991, cette hétérogénéité du milieu est l’un des facteurs ayant un
impact majeur sur la détermination de la densité microbienne d’un échantillon, avec :
 la densité microbienne réelle du milieu
 la méthode de quantification utilisée
 la taille de l’échantillon
 l’hétérogénéité du milieu.

Reprenons les cas extrêmes de la Fig. 1 (Maul 1991) :

I : répartition au hasard des micro- II : micro-organismes tous agrégés


organismes dans l’échantillon

Imaginons maintenant qu’il y ait 150 micro-organismes répartis dans les 100 cases.
Dans les 2 cas, la densité microbienne moyenne du milieu est la même : 150/100 = 1.5 / unité
de volume.

Supposons que l’on réalise 10 prélèvements (10 cases) au hasard.


Les résultats obtenus sont par exemple :
cas I : 2, 0, 2, 2, 2, 5, 0, 0, 1, 2
cas II : 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0

Appelons Ri la variable aléatoire (VA) dont la réalisation est le nombre de micro-organismes


contenus dans le prélèvement i (ici, i = 1, 2,…10).
Appelons alors R la VA associée au nombre total de micro-organismes dénombrés dans
n
l’échantillon de taille N=150 : R Ri
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Dans le cas II, les seules réalisations possibles pour la VA Ri valent 0 (dans 99% des cas) et
150 (dans 1% des cas). On écrit ainsi :
P(Ri = 0) = 0.99
P(Ri = 150) = 0.01
Dans le cas I (répartition homogène), la VA Ri peut prendre différentes valeurs entre 0 et un
nombre < 150.
L’étude des phénomènes aléatoires a par ailleurs permis de montrer que la distribution des
réalisations de cette VA suit un certain modèle, décrit par la loi binomiale, selon B(N, v/V).
Cette loi décrit la distribution de la chance d’obtenir une détection positive de micro-
organismes dans un petit volume v (ici, v = 1 case) issu d’un grand volume V (ici, V = 100
cases) contenant N micro-organismes (ici, N = 150).
Aussi, comme v/V est petit (v/V < 0.1) et que N est assez grand (N > 50), la loi B(N, v/V)
peut être approximée par une loi de Poisson, P(Nv/V) = P( v), avec = N/V : estimation de
la densité microbienne moyenne de l’échantillon complet.
Ainsi, la probabilité d’observer r micro-organismes dans le prélèvement i, soit P(Ri = r) vaut,
selon le modèle de la loi de Poisson :
P(R i r) e (- v) ( v) r / r!
De plus, pour Ri VA indépendantes (dénombrements indépendants), la probabilité de la
n
réalisation de R Ri est le produit des probabilités individuelles, et elle s’écrit :
1
n
P( R r) P ( Ri r)
i 1
Aussi, pour = N/V =150/100 =1.5, il vient en particulier que la probabilité de détecter moins
de un (P(R=0)) ou au moins un (P(R≥1)) micro-organisme, en fonction du nombre de
prélèvements (correspondant à un petit volume v d’une case) est estimé comme suit, dans le
cas d’une répartition homogène (cas I) ou non (cas II) :
n=1 n=5 n = 25 n = 298
P(R=0) P(R≥1) P(R=0) P(R≥1) P(R=0) P(R≥1) P(R=0) P(R≥1)
Cas I 0.22 0.78 6.E(-4) 1.00 0.00 1.00 0.00 1.00
Cas II 0.99 0.01 0.95 0.05 0.78 0.22 0.05 0.95

Ce qui montre que, pour une densité microbienne non nulle dans le milieu,
 le risque ne de pas détecter de micro-organisme diminue fortement lorsque la taille de
l’échantillon (le nombre de prélèvements) augmente ;
 dans le cas d’un milieu pas du tout homogène, il faudrait réaliser près de 300
prélèvements pour avoir 95% de chance de détecter au moins un micro-organisme.

Référence
Maul A. (1991) Echantillonnage et inférence statistique, in : Virologie des milieux hydriques,
L. Schwartzbrod (Coord.), Tec&Doc – Lavoisier, Paris, pp. 35-69.

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