UNIVERSIDAD DE CONCEPCION

FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES

GUIAS DE LABORATORIOS
CURSO MICROORGANISMOS Y AMBIENTE
I Semestre
2014
ACTIVIDADES DE LABORATORIO
PAUTA PARA LA ELABORACIN DEL INFORME ESCRITO
Informe de actividades prcticas
El informe de las actividades prcticas debe contener una introduccin, los principios
metodolgicos, resultados, anlisis de los mismos y la bibliografa consultada.
Su extensin no debe superar las cinco pginas escritas a espacio y medio con tamao
de letra 12 incluido bibliografa y iguras.
.
PAUTA DE EVALUACION ACTIVIDADES GRUPALES
!otas pruebas de laboratorio "promedio# $%&
'nforme escrito de actividades practicas (% &
!ota inal )ctividades *rupales 1%% &
+as evaluaciones de laboratorios se efectuaran si aviso previo y estarn relacionadas
con los aspectos tericos o metodolgicos de las actividades de laboratorio realizadas
en el prctico anterior a que se realizaran en la actividad prctica que se inicia.
Para aprobar la asignatura, los alumnos deben obtener nota igual o superior a 4.0
La nota de obtenida en las actividades grupales corresponde al 15 de la nota
final de la asignatura.
NOTA: LA ASISTENCIA A LAS ACTIVIDADES DE LABORATORIO ES
OBLIGATORIA Y SE REQUIERE 100 DE ASISTENCIA
2
INSTRUCCIONES GENERALES
1., +ea el prctico antes de llegar al laboratorio. -ome nota de las instrucciones .ue se
den en el laboratorio y pregunte, si tiene dudas, para clarificar el procedimiento a
seguir.
2., Concurra al laboratorio con delantal, apuntes de prcticos y lpi/ para marcar
vidrio, indeleble al agua.
0., +os instrumentos de siembra "asa de metal, pipetas 1asteur, etc.# se esterili/arn a
la llama antes y despu2s de usarlos.
$., 3 arque todos los tubos, placas, porta,ob4etos .ue use, con el nombre del
organismo, la fec5a u otra informacin necesaria.
6., -odo elemento usado "pipetas, porta,ob4etos, tubos, etc.# debe considerarse como
contaminado y debe colocarse en los recipientes destinados para este ob4eto. !7
S789E E+ 3ES7! :E -9)8);7.
(.,<uide el material de traba4o y traba4e ordenadamente, evitando los descuidos. !o se
lleve las manos a la boca ni a los o4os, como tampoco sa.ue fuera del laboratorio
material contaminado o cultivo bacterianos.
=., Efect>e todas las tinciones solamente en los lugares especialmente destinados para
este ob4eto.
?., +a siembra o el traspaso de cultivos se 5ar cuidadosamente evitando la
contaminacin del mesn de traba4os. Es conveniente desinfectar la /ona contaminada
mo4ndola con solucin de +ugol.
@., <ierre las llaves de agua y apague los mec5eros cuando no los est2 usando.
1%., )l terminar el traba4o de4e el mesn limpio y todos los >tiles en su lugar. +os
microscopios deben quedar limpios.
11., +ave sus manos al terminar su traba4o prctico.
12., !o est permitido fumar en el laboratorio.
10., <ual.uier accidente, por mnimo .ue sea debe ponerse en conocimiento del
docente a cargo del prctico.
0
PRINCIPALES HERRAMIENTAS DE TRABA1O BACTERIOLOGICO
1. 3ec5ero
Este sirve para esterili/ar la boca de tubos de ensayo, pipetas, portaob4etos, etc.
"flameando suavemente# y asas "calentando al ro4o#.
2. 1lacas de 1etri
)rtefactos de vidrio en los cuales se coloca una determinada cantidad de medio
de cultivo slido "con agar,agar#, 5asta completar una altura aproximada de $
mm. <onsta de una base y una tapa. :ebe mantenerse cerrada, excepto en los
breves momentos en .ue debe sembrarse el medio de cultivo.
0. 1ipetas 1asteur
Estn formadas por un tubo angosto "dimetro 6,( mm# de vidrio esterili/ado y
estirado 5asta sellar la punta. Sirve para trasladar material l.uido "gotas# o
bien, para diseminar siembras "acodando el extremo o formando un ArastrilloB
con 2ste#. :ebe romperse la punta y esterili/arse antes de ser utili/ada.
.
$. 1ipetas graduadas
Son las pipetas corrientes utili/adas en .umica .ue se envuelven en papel y se
esterili/an al 5orno 1asteur. )l desenvolverse, deben flamearse al mec5ero.
6. -ubo de ensayo
Se encuentran taponados con algodn no 5idrfilo o con tapas especiales
"metlicas o de plstico#. :ebe flamearse la boca del tubo despu2s de sacar la
tapa y antes de volverla a poner en posicin.
(. 3atraces
Son los matraces 5abituales .ue se encuentran taponados con algodn no
5idrfilo y esterili/ado al Corno 1asteur. -ambi2n debe flamearse la boca
despu2s de sacar la tapa y antes de volver a ponerla.
=. )sas
'nstrumentos .ue tienen alambre "nicrom# en la punta, en forma de agu4a "asa
recta# o con un pe.ueo crculo en el extremo "asa curva#. Sirven para efectuar
siembras bacterianas o para sembrar en profundidad "perforando el agar#. El asa
con crculo permite trasladar pe.ueas muestras de los cultivos.
?. 3icroscopio
En bacteriologa se emplea el ob4etivo $% para observaciones sin tincin "a
fresco# y el ob4etivo 1%% para observaciones por inmersin "colocando una gota
de aceite de cedro sobre la preparacin teida#.
El microscopio debe .uedar perfectamente limpio despu2s de finali/ada la
observacin correspondiente. 1ara ello, utilice un pao impregnado con xilol.
@. Estufa de cultivo
+as siembras efectuadas con bacterias o productos biolgicos en medios de
cultivo deben cultivarse en estufas .ue se encuentran a la temperatura apropiada.
Esta temperatura depende del tipo de microorganismo investigado. $
1%. 8ao 3ara
<onsiste en un receptculo con agua de la llave y .ue tiene una fuente de calor
para mantener una determinada temperatura. *eneralmente se 5ace 5ervir el
agua, por e4emplo, para fundir el agar en los tubos con medios de cultivo slido.
11. ;arra de anaerobiosis
Es un receptculo de plstico transparente con una tapa 5erm2tica para impedir
la entrada de aire a la cmara. :entro de la 4arra se colocan las placas sembradas
en medios de cultivo diseados para el aislamiento de bacterias anaerobias 4unto
con un sobre .uemador de C
2
y <7
2
, al cual se le adiciona agua, y se cierra la
4arra. El sobre contiene una pastilla de bro5idruro de sodio y otra con una
muestra de bicarbonato de sodio y cido ctrico. )l agregar agua se libera C
2
"a
partir del bro5idruro de sodio# y <7
2
, en una proporcin adecuada para obtener
un ambiente casi exento de oxgeno, y con 6,1%& de <7
2
. En la tapa de la
4arra se encuentra un catali/ador de esta reaccin "a base de paladio#.
)lternativamente, se puede usar un sobre .ue contiene solamente la pastilla con
bicarbonato de sodio y cido ctrico. <on esto se logra solamente un ambiente
con 6,1%& de <7
2
y ba4o contenido de oxgeno "bacterias microaerfilas#.
6
+aboratorio !D 1
'!-97:E<<'7! )+ +)879)-79'7 :E 8)<-E9'7+7*')
1., Se darn las explicaciones necesarias de las partes constitutivas del microscopio,
con especial referencia a los m2todos .ue se usan en bacteriologaF
a# Eso de cada tipo de ob4etivo y su rendimiento en la
observacin.
b# Ebicacin adecuada del condensador seg>n la t2cnica de
7bservacin, sea 2sta a fresco o por inmersin.
c# +impie/a del microscopio.
2., Se conocern cada uno de los materiales e instrumentos y su t2cnica de uso.
a# )sas de platino.
b# 1ipetas graduadas, pipetas 1asteur
c# 1lacas de 1etri
d# -ubos de ensayo
e# 3aterial de tincin
f# Estufas de cultivo
0., Se darn las nociones fundamentales acerca de la asepsia .ue re.uiere el traba4o
bacteriolgico, para evitar la contaminacin de los materiales en uso y de los cultivos,
y tambi2n evitar la posible infeccin del operador.
''., 78SE9G)<'7! :E 8)<-E9')S
.
-inciones simples
Estas tinciones se basan en la accin de un solo colorante sobre la c2lula
bacteriana, en tal forma .ue todas ellas presentarn el mismo color. 1or este motivo, se
emplean fundamentalmente para observar la forma y la agrupacin de las bacterias.
Trabajo PrcticoF
) partir de una muestra de agua y cultivos puros .ue se le entregar en el
laboratorio, prepare tinciones simples. -rate de establecer al examen microscpico, las
diferentes morfologas "formas esf2ricas, alargadas, etc.# y agrupaciones "en cadenas,
en racimos, en pares, t2tradas, etc.#.
a# prepare un 97-'S, .ue consiste en una delgada capa de bacterias distribuidas en la
superficie de un portaob4etos y fi4ado a 2l para .ue resista las diferentes etapas de la
tincin "adicin de colorantes, lavados, etc.#.
+a preparacin del frotis consiste enF
1., <olocar una gota de cultivo l.uido en un portaob4etos limpio o una gota de
emulsin si se tiene un cultivo en medio slido "ver observacin a fresco#. (
2., Extender este material cuidadosamente en una capa delgada.
0., :e4ar secar a temperatura ambiente o calentando suavemente a la llama del
mec5ero. Evite sobrecalentamiento.
$., i4ar la preparacin pasando rpidamente la cara del portaob4eto .ue lleva las
bacterias dos o tres veces por la llama del mec5ero, evitando carboni/arlas
por sobrecalentamiento. El frotis .ueda entonces listo para ser teido con la
coloracin deseada.
b# -incin
b# <ubra el frotis con el colorante .ue desea y por el tiempo correspondiente.
E4emploF Gioleta de genciana,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,16seg.
Safranina,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,2% seg
)/ul de metileno,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,0% seg.
c# +ave con agua de la llave ba4o un c5orro fino y suave para eliminar el
exceso de colorante.
d# Se.ue la preparacin colocando el portaob4eto entre dos capas de papel
absorbente sin frotarlo, o de4e secar a temperatura ambiente.
e# 7bserve la preparacin usando el ob4etivo de inmersin "1%% x#, colocando
sobre la preparacin una gota de aceite de cedro "inmersin#.
0., 7bservacin macroscpica de bacterias
+as bacterias pueden crecer sobre la superficie de medios de cultivo slido y
originar una estructura macroscpica caracterstica. Esta se conoce con el
nombre de A<7+7!') 8)<-E9')!)B y su forma y tamao es caracterstica
de cada especie.
Trabajo PrcticoF
) partir de la muestra de agua tome %.1 ml con una pipeta y distrib>yalo
5omog2neamente sobre la superficie de una placa con agar 92). 'ncube la placa a 26D<
por 2$ 5oras. En el prximolaboratorio anote sus observaciones.
'''., 78SE9G)<'7! :E 8)<-E9')S "<7!-'!E)<7! E!':): 19)<-'<) !D1
1., -inciones diferenciales
Estas tinciones permiten agrupar las bacterias de acuerdo con su afinidad por los
colorantes .ue se utili/an en ellas. )s, bacterias .ue .uedan teidas de diferente color
pertenecen a grupos tambi2n diferentes. +a importancia de estas tinciones,
especialmente la de *ram, es .ue existe cierta correlacin entre la afinidad tintorial de
la bacteria y otras propiedades, como por e4emplo la susceptibilidad o resistencia a =
determinados agentes antimicrobianos, basada en diferencias estructurales
principalmente a nivel de la pared bacteriana.
a# -incin de *ram "3odificacin de CucHer#
Emplea dos colorantes, violeta de genciana y safranina, con una etapa de decoloracin
intermedia. En esta forma las bacterias se clasifican en *ram positivas si retienen el
primer colorante y por lo tanto aparecen teidas de a/ul violeta, o en *ram negativas si
pierden el primer colorante en la etapa de decoloracin y se tien con el segundo
colorante, apareciendo a la observacin microscpica de color rosado o ro4o. Se debe
tener presente .ue existen bacterias .ue siendo *ram positivas, pueden ba4o algunas
condiciones, observarse como *ram negativas especialmente, cuando los frotis son
preparados con cultivos enve4ecidos. Podra Ud. explicar por que se produce este
fenmeno?
Trabajo prcticoF
) partir de las colonias .ue se desarrollaron en la placa .ue Ed. sembr en el prctico
anterior, realice esta tincin diferencial a a.uellas colonias .ue morfolgicamente son
diferentes. 1ara esto proceda de la siguiente maneraF
a# 1repare un frotis de cada una de las colonias diferentes.
b# Someta todos los frotis a la tincin de *ram, cuya secuencia es la
siguienteF
<olorear con violeta de genciana, o cristal violeta, al 1D durante (% segundos,
cuidando .ue el colorante cubra toda la preparacin.
Eliminar el exceso de colorantes y lavar rpidamente con agua, manteniendo el
portaob4etos en posicin inclinada.
<ubrir la preparacin con la solucin de *ram o +ugol, de4ndola actuar
durante (% segundos. +avar nuevamente con agua.
:ecolorar con alco5ol etlico @6& durante 0% segundos y lavar con agua
"etapa diferencial#. 'mportante respetar el tiempo.
<oloracin de fondo, o de contraste con safranina durante 2% segundos.
+avar con agua, secar y observar por inmersin.
+a fase de decoloracin con alco5ol constituye la etapa ms importante de la tincin de
*ram y en ella reside su carcter diferencial. ).uellas especies .ue retienen el colorante
se denominan *ram positivas y se observan de color a/ul, y a.uellas en .ue fue
arrastrado por el alco5ol, *ram negativas, y se observarn de color ro4o debido a .ue
captan el colorante de contraste. 7bserve por inmersin la morfologa, agrupacin y
afinidad tintorial de las bacterias .ue Ed. seleccion.
c# -incin de Iie5l,!eelsen "3odificacin de Jinyoun#
?
Esta tincin, al igual .ue la de *ram, emplea dos colorantesF +a fucsina y el a/ul de
metileno "o amarillo victoria#, con una decoloracin intermedia basada en el uso de un
decolorante en2rgico "alco5ol cido#. +as bacterias capaces de resistir esta decoloracin
y .ue, por lo tanto, se observan de color ro4o intenso se denominan alco5ol cido
resistente "))9#.+a importancia de esta tincin radica en .ue algunas bacterias alco5ol
cido resistentes son el agente causal de importantes enfermedades "tuberculosis, lepra#.
Trabajo prcticoF
7bserve las bacterias ))9 en un frotis .ue se 5a teido previamente. Caga la
observacin con el ob4etivo de inmersin.
2., -inciones especiales
Estas tinciones, cuyas t2cnicas son ms comple4as .ue las tinciones simples,
tienen por ob4eto destacar algunas de las partes constitutivas de la c2lula bacteriana.
<omo e4emplos se pueden citar las tinciones de n>cleo, flagelos, cpsulas, esporas, etc.
!o son, en general, de uso rutinario y encuentran su aplicacin en traba4os de
investigacin bacteriolgica.
Trabajo prcticoF En el laboratorio encontrar diferente frotis teidos con tinciones
especiales para observar las siguientes estructurasF
a# lagelos
b# Esporas
c# <psula
Etilice ob4etivo de inmersin para reali/ar sus observaciones.
+aboratorio !D 2
-E<!'<)S :E )'S+)3'E!-7 8)<-E9')!7
En la naturale/a los microorganismos se encuentran en comunidades ms o menos
comple4as. Son diversos los procedimientos existentes para el estudio de los
microorganismos. Ena t2cnica esencial en 3icrobiologa es la t2cnica de aislamiento
.ue permite la obtencin de cultivos puros, a partir de los cuales se pueden reali/ar
estudios sobre las propiedades de los microorganismos. En cultivo puro es a.uel .ue
tiene una sola clase de microorganismos.
1or aislamiento bacteriano se entiende la separacin en cultivos puros, las diferentes
bacterias .ue se encuentran en cultivos o productos polimicrobianos. En general, la
flora bacteriana de productos o ambientes naturales "agua, alimentos, suelo, etc.# y de
materiales patolgicos es 5eterog2nea y por lo tanto, el aislamiento constituye una
etapa fundamental para la gran mayora de los estudios bacteriolgicos.
Existen varias t2cnicas de aislamiento .ue pueden usarse en forma individual o en
combinacin, de las cuales las de uso ms corriente sonF
a# 1or diseminacin en superficie.
b# )islamiento en medios selectivos.
1., )islamiento por diseminacin en superficie
@
Trabajo prctico:
a# Siembre por diseminacin, en la superficie de una placa de agar tripticasa o
agar 9
2
), una muestra .ue contenga me/cla de bacterias. +a siembra por diseminacin
consiste en depositar una asada de muestra en la superficie del medio de cultivo, cerca
del borde de la placa, y desde ese punto recorrer el agar siguiendo un tra/ado
/ig/agueante lo ms numeroso posible utili/ando la mayor superficie del agar, con el
propsito de disminuir el contenido de bacterias en el instrumento de siembra y de esta
manera, obtener colonias aisladas. :urante esta operacin, tenga cuidado de no romper
el agar con el asa. Siga las instrucciones .ue le darn en el laboratorio.
b# 'ncube el cultivo a 0%D<.
2., )islamiento en medios selectivos
-raba4o prcticoF
a# Siembre la me/cla de g2rmenes en placas conteniendo medios selectivos
"agar 3c<onHeyK )gar <ristal GioletaK agar -elurito de J#. )l sembrar, 5galo por
diseminacin con el fin de obtener colonias aisladas e 'ncube el cultivo a 0%D<.
9ESE+-):7SF En el prximo laboratorio observe el desarrollo .ue
presentan los diferentes cultivos .ue 5a sembrado. 7bserve si logr colonias
aisladas y si 5ay de diferentes caractersticas macroscpicas. 1repare un frotis y
tincin de *ram de cada tipo de colonia. <ompare los resultados obtenidos con cada
una de las diferentes t2cnicas empleadas.
+aboratorio !D 0
:E-E93'!)<'7! :E +) 178+)<'7! 8)<-E9')!)
Eno de los problemas .ue se presenta en bacteriologa es determinar o estimar el
n>mero de bacterias viables y recuperables en cultivo, presentes en una poblacin
dada, sea ella la de un cultivo puro o la de una muestra de alimento, de suelo o de
agua.
:e los m2todos empleados, los ms utili/ados sonF
1., 32todo de dilucin seriada en tubos.
2., 32todo de recuento en placa por diseminacin en superficie
0., 32todo de recuento en placa por siembra de microgota .
$., :eterminacin de densidad ptica
1# 32todo de dilucin seriada en tubos, consiste en sembrar alcuotas de diluciones
sucesivas de la muestra, en tubos conteniendo medio l.uido 5asta .ue algunas de
estas siembras resulten sin desarrollo "negativas# debido a .ue la porcin sembrada,
por su nivel de dilucin, no contiene ninguna c2lula bacteriana viable. Este m2todo
permite obtener una estimacin de la poblacin bacteriana y su resultado esta
sustentado en principios estadsticos de probabilidades y por ello, se expresa como el
!>mero 3s 1robable de microorganismos presentes en la muestra original "!.3.1.#. 1%
2# 32todo de recuento en placa por diseminacin en superficie, consiste en sembrar
alcuotas, generalmente de %.1ml, de diluciones sucesivas en la superficie de agar,agar
con los re.uerimientos necesarios de nutrientes de manera .ue las bacterias .uedan
atrapadas y fi4as en el agar con el fin de .ue cada c2lula d2 origen a un crecimiento
macroscopico llamado Acolonia bacterianaB. <ontando el n>mero de colonias
desarrolladas en cada cultivo y de acuerdo con la dilucin utili/ada, con es posible
calcular el n>mero de bacterias viables presentes en la muestra anali/ada. El m2todo
de siembra por microgota es una modificacin del anterior, .ue consiste en depositar
en la superficie del agar alcuotas de 2%Ll de la muestra.
3) :eterminacin de densidad ptica, +as fases de crecimiento de una poblacin
bacteriana pueden determinarse midiendo la turbide/ del cultivo consiste en determinar
la :ensidad Mptica :7 a una longitud de onda especfica usualmente entre 6?% a
(2%nm. )un.ue dic5a turbide/ no es una medida directa y exacta del n>mero de c2lulas,
su incremento es indicativo del crecimiento bacteriano. 1ara esta determinacin, se
utili/a un espectrofotmetro, en el cual la lu/ a una longitud de onda previamente
definida, pasa a trav2s del cultivo bacteriano. ) medida .ue la concentracin celular
aumenta, el cultivo se 5ace ms turbio, y se reduce la cantidad de lu/ transmitida
consecuencia de la difraccin de la lu/ por parte de las c2lulas.
Trabajo prcticoF
En el laboratorio encontrar muestras de agua de la laguna de A+os 1atosB con una
poblacin aproximada de 1%
0
o ms bacterias por ml. :etermine la poblacin de la
muestra de agua mediante las siguientes t2cnicasF
1., 32todo de dilucin seriada en tubos
) partir de la muestra de agua, efect>e una serie de diluciones seriadas de 1% en 1%.
Efect>e los traspasos con pipetas esterili/adas a tubos conteniendo @ ml de agua
destilada est2ril. Efect>e las diluciones de acuerdo a las instrucciones del profesor de
prctico. Siembre las diluciones anteriores en series de tres tubos conteniendo medio
de cultivo l.uido, 3ar.ue las series de tubos con la dilucin correspondiente e
inc>belas a 0%D<, por 2$,$? 5oras. +ea los resultados en la -abla del !.3.1. +os
tubos positivos se presentan turbios a causa de crecimiento.
2., 32todo de recuento en placa por diseminacin en superficie
Etilice las mismas diluciones preparadas anteriormente y deposite %.1ml de ellas en la
superficie del agar, siguiendo las instrucciones de su profesor, distribuya la alcuota por
la superficie del agar
0., :eterminacin de densidad ptica :.7.F
En el laboratorio encontrara un matraces con cultivos de Eschericha coli de 1, 1% 2% y
$% 5ora de incubacin, de cada uno obtenga alcuotas de 1ml y dispngalos en una
cubeta de cuar/o para su lectura a (%%nm en el espectrofotmetro, siguiendo las
instrucciones de su instructor de practico. 1aralelamente, de cada cultivo efectu2
diluciones seriadas y siembre en la superficie de placas mediante el m2todo de la
AmicrogotaB siguiendo las indicaciones de su instructor.

En el laboratorio siguiente, analice los resultados obtenidos
11
NEncontr diferencias entre la estimacin de la poblacin bacteriana efectuado
mediante el m2todo de la microgota con la :7O
NPue consideraciones tiene el m2todo .ue permite estimar la poblacin bacteriana
mediante la :.7 con respecto al de la microgotaO

+aboartorio !D $
*E!E-'<) 8)<-E9')!) "3utacin#
1.- Deteccin de Mutantes
)islamiento de mutantes resistentes a los antibiticos.
En el laboratorio encontrar un cultivo l.uido de Bacillus subtillis .ue 5a sido
incubado por 2$ 5orasF

1roceda de la siguiente maneraF
1., )dicione una gota del cultivo a un tubo .ue contiene 2 ml de agua destilada est2ril.
2.,'mpregne una trula con esta suspensin bacteriana y siembre con ella toda la
superficie de una placa con agar "nutritivo o agar sangre#.
0.,<olo.ue un disco de papel filtro impregnado con rifampicina "6 Lg# y otro con
cloxacilina "6 Lg# en la superficie de esta placa.
$.,'mpregne la misma trula pero en el cultivo concentrado y siembre con ella toda la
superficie de una placa con agar nutritivo .ue contiene 6%ugQml de rifampicina.
'ncube las placas a 0=D< por $? 5oras.
Laboratorio de Mutacin ( continuacin)
7bserve el desarrollo de la cepa de Bacillus subtillis en la placa en la cual se coloc un
disco con rifampicina y otro con cloxacilina.
Si es .ue existe desarrollo de algunas colonias es interesante estudiar cules son sus
propiedades, en relacin con los antibiticos ensayados sobre la cepa salva4e. Esto es,
determinar si se 5a producido alg>n cambio en estas propiedades a causa del desarrollo
de la bacteria en presencia de rifampicina.
N<mo podra Ed. estudiar este cambio potencialO
'ntente disear una experiencia simple para demostrarlo, en base a las metodologas ya
empleadas en las clases prcticas anteriores.
Efect>e esta experiencia e incube la placa a 0=D< durante 2$ 5.
12
7bserve las placas con las cuales se efectu la experiencia para investigar cambios en
las propiedades de la cepa de Bacillus subtillis desarrollado en presencia de rifampicina,
en relacin a la cepa salva4e. <ompare estos resultados con los originales de la cepa,
antes de ser sembrada en el medio seleccionador.
)nalice las placas .ue sembr para caracteri/ar las trasnscon4ugantes
+aboartorio !D 6
*E!E-'<) 8)<-E9')!) "<on4ugacin#
.Transferencia de determinantes de resistencia a los antibiticos por conjugacin.
Se dispondr de un cultivo l.uido de E. coli J12 " )!
r
# " cepa receptora# en caldo
nutritivo y de la cepa E. coli -1= " -
r
, J
r
# " cepa dadora#.
2.1, <aracteri/acin de las cepas bacterianas dadora y receptora.
Siembre ambas cepas en la mitad de una plca con agar 3ac <onHey sin antibiticos.
)dicione una gota de cada cultivo a tubos .ue contiene 2 ml de agua destilada
Siembre con trulas una suspensin de las cepas dadora -1= y otra con la cepa
receptora J,12 en placas con agar tripticasa y luego deposite en su superficie discos
impregnados con tetraciclina, Hanamicina, ampicilina y cido nalidixico. 'ncube por
2$ 5oras a 0=D< y observe los 5alos de in5ibicin del crecimiento bacteriano en torno a
los discos con los antibiticos.
2.2.,<on4ugacin
Siembre $.6 ml de cultivo de E. coli J12 y %.6 ml de cultivo de E. coli -1= en un
matra/ .ue contiene 1% ml de caldo tripticasa. 'ncube a 0=D < por 1 5ora.
:iluya la me/cla bacteriana en agua destilada est2ril 5asta la dilucin 1%
,2
.
Siembre %.1 ml de la dilucin 1%
,2
en la superficie de las siguientes placasF
,agar 3ac <onHey con tetraciclina "26 LgQml# y cido nalidixico "6% LgQml#.
,agar 3ac <onHey con Hanamicina "0% LgQml# y cido nalidixico "6% LgQml#
,agar 3ac <onHey sin antibiticos. En este caso particular, la siembra debe efectuarse
de tal modo de obtener colonias aisladas "diseminacin en superficie# y se debe efectuar
las correspondientes diluciones para ello.
'ncube las placas a 0=D < por 2$ 5oras.
GENETICA BACTERIANA (Continuacin)
2. Transferencia de determinantes de resistencia a los antibiticos por
conjugacin.
2.1. 7bserve las placas en las cuales sembr el par con4ugante
10
NExiste desarrolloO
NEs 2ste confluente o en forma de colonias aisladasO
NSon las colonias similares a las de la cepa dadora o receptoraO
N1or .u2 se coloc cido nalidxico en ambas placasO
N1odra 5aberse sembrado en una placa adicional conteniendo cido nalidxico,
tetraciclina y HanamicinaO
NPu2 diferencia existe el proceso de mutacin y el de con4ugacin, en cuanto a los
determinantes de resistencia y su aparicin en las cepas resistentesO
2.1 <aracteri/acin de las cepas bacterianas transcon4ugantes
:esde cada una de las placas seleccionadoras eli4a dos o ms colonias y siembre en las
siguientes placasF
, agar 3ac <onHey con tetraciclina "26 ugQml#
, agar 3ac <onHey con Hanamicina "0% ugQml#
, agar 3ac <onHey con cido nalidxico "6% ugQml#
, agar 3ac <onHey sin antibiticos
'ncube las placas a 0=D< por 2$ 5oras.
NPu2 se pretende con esta experienciaO
<ompare estos los resultados con los obtenidos con la cepa dadora y receptora.
1$
+aboratorio !D (
:E-E93'!)<'M! :E +) <)+':): 8)<-E9'7+7*'<) :E+ )*E)
+as bacterias alctonas constituyen uno de los contaminantes biolgicos ms
importantes de los sistemas acuticos y su incorporacin a 2l se reali/a principalmente
por la descarga de desec5os dom2sticos a trav2s de los emisarios de alcantarillado.
+as bacterias de origen ent2rico, entre las cuales se encuentran especies patgenas para
el 5ombre, llegan a los ros y su presencia se eval>a mediante la deteccin de
microorganismos indicadores. Entre 2stos, Escherichia coli y Enterococcus son
utili/ados convencionalmente como indicadores de riesgo potencial de la presencia de
bacterias patgenas como Salmonella sp. y Shigella sp. y de otros patgenos intestinales
como virus y parsitos.
9e.uisitos bsicos para ser considerado un buen indicador de la calidad del agua
a# :ebe estar presente en presencia de patgenos
b# :ebe ser especifico para contaminacin fecal
c# :ebe ser capa/ de permanecer viable en el agua por mayor tiempo .ue el patgeno
d# :ebe ser detectable por m2todos simples y rpidos
El m2todo de tubos m>ltiples puede ser desarrollado sembrando series de cinco "6#
tubos o series de tres "0# tubos con 1%, 1 y %.1 ml respectivamente. Si la muestra se
sospec5a ms contaminada puede ser anali/ada utili/ando diferentes grados de dilucin
.ue tengan una progresin geom2trica de 1%. 1or e4emplo sembrar 1 o %.1 ml de una
dilucin 1F1% 1F1%%, 1F1%%%
1ara una muestra de agua la metodologa consiste enF
,1reparar una serie de 0 o de 6 de tubos con caldo lactosado con 1% ml de caldo con el
doble de la concentracin y una segunda serie con @ ml de caldo lactosado con una
concentracin normal o simple. En todos se debe incorporar una campana de vidrio y
tapar los tubos con algodn para luego esterili/ar en el autoclave durante 16 minutos a
12%R<.
, :isponer de igual n>mero de tubos con 1%ml de caldo bilis verde 8rillante con
concentracin normal o simple, ponga en todos los tubos una campana de vidrio, tape
los tubos con algodn y esterilice en el autoclave durante 16 minutos a 12%D<.
, :isponer de igual n>mero de tubos con 6 ml de caldo E< con concentracin normal o
simple, ponga en todos los tubos una campana de vidrio, tape los tubos con algodn y
esterilice en el autoclave durante 16 minutos a 12% R<.
Toma de muestraF
+a muestra debe ser tomada en frascos de vidrio est2riles con una capacidad mnima de
26% ml y transportadas al laboratorio en ca4as refrigeradas a $R< "sin congelar# y
procesadas entes de 6 5oras.
16
Trabajo prctico.
Procesamiento de la muestra:
a# 9otule adecuadamente los tubos con caldo lactosado. )gite el frasco con la
muestra y siembre as2pticamente 1% ml de muestra en la serie de 0 tubos con el
doble de la concentracin.
b# 'nocule 0 tubos con 1 ml y 0 tubos con %.1ml de la muestra en la serie de tubos
con concentracin normal e incube los tubos a 0=D< durante $? 5oras. 9egistre
el n>mero de tubos con desarrollo bacteriano positivos, a.uellos tubos con
turbide/ y con presencia de gas en la campana de vidrio. NOTA Se considera
desarrollo positivo cuando el volumen de gas corresponde a aproximadamente a
un tercio del volumen total de la campana.
c# ) partir de todos los tubos con desarrollo positivo traspase simultneamente
%.1ml o 2 asadas, a tubos con caldo bilis verde brillante 8G8 y a tubos con
caldo E<. 'ncube, durante $? 5, los tubos con 8G8 a 0=D< para coliformes
totales y a $$.6D< para coliformes fecales. 9egistre el n>mero de tubos positivos
e interprete en la tabla de n>mero ms probable.
ResultadosF 9egistre el n>mero de tubos con desarrollo bacteriano positivo, estos es
tubos con turbide/ y presencia de gas en la campana de vidrio. Se considera positivo
cuando el volumen de gas corresponde a aproximadamente un tercio del volumen total
de la campana.
Tabla Resumida del Nmero ms probable NMP/100ml (10-1-0.1)
000 <3 100 3,6 200 9,1 300 23
001 3,0 101 7,2 201 9,1 301 39
002 6,0 102 11 202 20 302 64
003 9,0 103 15 203 26 303 95
010 3,0 110 7,3 210 15 310 43
011 6,0 111 11 112 15 211 20
012 9,2 212 27 311 75 312 120
013 12 113 19 213 34 313 160
020 6,2 120 11 220 21 320 93
021 9,3 121 15 221 2 321 150
022 13 122 20 222 35 322 210
023 16 123 24 223 42 323 290
030 9,4 130 16 230 29 330 240
031 13 131 20 231 36 331 460
032 16 132 24 232 44 332 1100
033 19 133 29 233 53 333>1100
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