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TRABAJO PRCTICO N 4: CINTICA ENZIMTICA II

FUNDAMENTOS TERICOS
LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Y SU DEPENDENCIA CON LAS CONCENTRACIONES DE
SUSTRATO Y ENZIMA
Recordemos que las reacciones catalizadas por enzimas pueden ser expresadas como:
De acuerdo a la ecuacin (2) la velo!"#" !$!!#l %Vo& de una reaccin catalizada por enzimas
estara determinada por la desaparicin del ES y, por lo tanto, es proporcional a su concentracin:
Sin embaro, !2 y "ES# son di$ciles de determinar directamente por lo que %ic&aelis y %enten
deri'aron la ecuacin (() en t)rminos de otras 'ariables que pueden ser medidas
experimentalmente:
El e$ecto de la velo!"#" al 'ariar la concentracin de sustrato "S#, mientras se mantiene constante
la concentracin de enzima "E#, se obser'a en la siuiente r*$ica:
En la Figura 1 obser'amos que a ba+as "S#, V' incrementa casi linealmente con el incremento de la
"S# %(&) , concentraciones mayores de sustrato, los incrementos de 'elocidad inicial en respuesta a
los incrementos de la concentracin de sustrato son cada 'ez menores %*&) -inalmente alcanzamos
un punto donde los aumentos de 'elocidad son despreciables $rente a los incrementos de S. En
este momento decimos que la reaccin enzim*tica tiende a velo!"#" +,-!+# %.&. /a cur'a es una
&ip)rbola rectanular que pasa por el orien y, cuyas asntotas son "S# 0 12m y 3o 0 3m*x.
/as constantes en la ecuacin (4) son V+,- y /+. /a V+,- depende 5nicamente de la concentracin
de enzima y /+ es independiente de la concentracin de enzima y de la concentracin de sustrato.
/+ se de$ine (en la deduccin de la ecuacin 6 y 2) como el cociente entre la suma de las
constantes de disociacin del comple+o "ES# y las constantes de $ormacin de dic&o comple+o.
Si consideramos en la ecuacin de %ic&aelis1%enten que Vo es iual a (0* V+,- (ecuacin 7), se
E + S [ E S ] ( 1 ) [ E S ] E + P ( 2 )
k
1
k
- 1
k
2
k
- 2
k + k
=
k
- 1 2
1
K
m
( 5 )
1
2
3
[S]
V
o
V
mx
-K
m
Figura 1: Efecto del sustrato sobre la velocdad de u!a
reacc"! e!#mtca
V = k [ E S ]
o 2
( 3 )
[ S ]
V =
+ [ S ]
V
K
m a x
m
o
( 4 )
2
deduce que /+ es num)ricamente iual a la concentracin de sustrato necesaria para alcanzar la
mitad de la 'elocidad m*xima (ecuacin 8) y por eso se expresa en unidades de sustrato.
El conocimiento de /+ nos indica la #1!$!"#" "e l# e$2!+# 3o4 5$ "e6e4+!$#"o 75764#6o. 9uanto
menor es 2m mayor es la a$inidad de la enzima por el sustrato. El c*lculo de 2m se utiliza, por
e+emplo, para comparar la a$inidad de una misma enzima por sustratos di$erentes o de enzimas
di$erentes por un mismo sustrato (Figura 2).
El conocimiento de V+,- nos da in$ormacin sobre la cantidad
de enzima presente ya que la 3m*x es directamente
proporcional a la concentracin de enzima.
, medida que aumenta la concentracin de enzima aumenta
el comple+o "ES# y por lo tanto aumenta la 'elocidad de la
reaccin (Figura 3). 9uando se traba+a con concentraciones
de sustrato saturantes, toda la enzima est* $ormando el
comple+o "ES# y el aumento de la 'elocidad es proporcional al
aumento de la concentracin de enzima, es decir que estamos
traba+ando en condiciones de 3m*x. Si la concentracin de
sustrato de+a de ser saturante el aumento de la acti'idad de+a
de ser proporcional, y la 'elocidad de+a de ser m*xima (Figura
3).
:eniendo en cuenta estas consideraciones, cuando se necesita conocer la #$6!"#" "e e$2!+#
presente en una muestra se recurre a la 'elocidad de la reaccin enzim*tica que cataliza, en
condiciones saturantes de sustrato (V+,-). 9abe aclarar que los !its comerciales est*n dise;ados para
medir acti'idad enzim*tica dentro de un rano de concentracin de enzima. Si la concentracin de
enzima es demasiado alta, puede suceder que la concentracin de sustrato de+e de ser saturante y en
esos casos lo correcto es diluir la muestra problema y lueo repetir la medicin.
FORMAS DE E8PRESAR LA ACTIVIDAD ENZIMTICA
/a #6!v!"#" "e 5$# e$2!+# se puede expresar en t)rminos de unidades de enzima o unidades
internacionales %UI&) /a <= (recomendada por la <nin =nternacional de >ioqumica) de cualquier
enzima es la cantidad de enzima que cataliza la con'ersin de un micromol de sustrato en un
minuto (?mol@min). /a #6!v!"#" e73e91!# es el n5mero de unidades internacionales de enzima
por miliramo de protena (UI0+: "e 34o6e9$#).
,simismo, es 5til de$inir una o$76#$6e "e velo!"#" :e$e4#l; <#6, para describir la 'elocidad
V
m a x
V [ S ]
=
2 K + [ S ]
m a x
m
K + [ S ] = 2 [ S ] K = 2 [ S ] - [ S ]
m m
( 6 )
V
max
V
2
mx

[S]
Sustrato 1
E!#ma$
Sustrato 1$
Sustrato 2$

%lucosa
fructosa
Hexoquinasa
S
u
strato 2
V
max
V
2
mx
[S]
E!#ma 1
E!#ma 2
Sustrato
$
$
$ %lucosa
K = &'1 m(
K = 1& m(
Hexoquinasa
Glucoquinasa
m1
m2
E!#ma 1
E!
#m
a 2
V
o
V
o
K
m1
K
m2
K
m1
Figura 2: )urvas de sustrato* +A,-!a e!#ma co! dos sustratos* +B,.os e!#mas co! el msmo sustrato*
(A)
(B)
[Enzima]
V
o
Figura 3: Efecto de la co!ce!trac"! de e!#ma e! u!a
reacc"! e!#mtca
3
limitante de cualquier reaccin enzim*tica a saturacin. En una reaccin mic&aeliana !cat0 3m*x@
"Et#. /a !cat, denominada tambi)n $=+e4o "e 4e#+>!o, es una constante de 'elocidad de primer
orden con unidades de tiempos in'ersos y es equi'alente al n5mero de mol)culas de sustrato
con'ertidas en producto en una unidad de tiempo, por una sola mol)cula de enzima, cuando la
misma est* saturada de sustrato.
3m*x es proporcional a la "Et#. Entonces, 3m*x 0 cte. x "Et#. Dic&a cte. es !cat 0 3m*x @ "Et#
MTODOS ?RFICOS PARA LA DETERMINACIN DE LAS CONSTANTES CINTICAS DE LAS
ENZIMAS
Di'ersos m)todos &an sido propuestos para determinar 2m y 3m*x en $orma r*$ica: Aanes1 Bool$,
Eadie1Ao$stee, /ineCea'er1>ur!, etc. :odos ellos se basan en modi$icaciones de la ecuacin de
%ic&aelis1%enten para que responda a la ecuacin de una recta.
%D:EDE DE /, DE>/E =F3ERS, (/ineCea'er1>ur!)
=n'irtiendo y reordenando la ecuacin de %ic&aelis1%enten se obtiene la ecuacin de una recta:
,l ra$icar 6@3o en $uncin de 6@"S# se obtiene la Figura 4B. De la interseccin de la recta con la
ordenada se obtiene 6@3m*x y de la interseccin de la recta con la abscisa se obtiene G6@2m.
/a 'enta+a del uso del m)todo de la doble recproca respecto a los otros m)todos r*$icos radica en
la determinacin m*s precisa de 3m*x y como 'eremos m*s adelante ser* de utilidad en el an*lisis
de la in&ibicin enzim*tica.
En la actualidad se usan m)todos de reresin no lineal que est*n disponibles en di'ersos
proramas para H9, los que por aproximaciones matem*ticas sucesi'as (iteraciones) encuentran
los 'alores de los par*metros cin)ticos. 9abe aclarar que todas las t)cnicas de c*lculo por m)todos
r*$icos son menos precisas que los m)todos de reresin no lineal.
IN@IBICIN ENZIMTICA
/os in&ibidores de enzimas son mol)culas que inter$ieren con la cat*lisis disminuyendo la 'elocidad
de las reacciones. 3arias sustancias pueden in&ibir la acti'idad enzim*tica, tales como: an*loos de
sustratos, toxinas, droas, comple+os met*licos, anticoaulantes, etc.
/os estudios sobre in&ibicin enzim*tica nos dan in$ormacin sobre las 'as metablicas, una 'isin
acerca de los mecanismos de accin de droas y toxinas, y una me+or comprensin de los
mecanismos de las reacciones enzim*ticas. /a determinacin de 2m y 3m*x tiene ran importancia y
utilidad al traba+ar con in&ibidores, pues en base a los 'alores obtenidos se puede determinar la
presencia y tipo de in&ibidor.
1 1

K 1
= + x
V V V [ S ]
m
o m a x m a x
+ / ,
V
max
V
2
max

[S]
1
[S]
1
V
max
(A) (B)
V
max
Pe!de!te =
Vo
1
V
o
K
m
1
K
m
K
m
Figura 4: )urvas de sustrato* +A, 0e1rese!tac"! de la ecuac"! de (c2aels-(e!te! +213bola recta!%ular,*
+B, 0e1rese!tac"! l!eal de 4!e5eaver-6urk +doble rec71roca,*
8
/os in&ibidores de enzimas se di'iden en dos clases: re'ersibles e irre'ersibles.
INHIBIDORES REVERSIBLES
1- INHIBICIN COMPETITIVA
<n in&ibidor competiti'o, compite con el sustrato por el sitio acti'o de la enzima e impide la unin
del sustrato.
/os in&ibidores competiti'os son, $recuentemente, compuestos que se parecen estructuralmente al
sustrato y que se combinan con la enzima $ormando el comple+o "EI#. Debido a que el in&ibidor se
une de manera re'ersible a la enzima, se puede cambiar el sentido de la competicin en $a'or del
sustrato simplemente a;adiendo m*s sustrato. 9uando &ay su$iciente sustrato se minimiza la
probabilidad de que se $i+e una mol)cula de in&ibidor por lo que la reaccin muestra la misma 3m*x
que la reaccin sin in&ibidor, pero 2m aumenta en presencia del in&ibidor (2Im) (Figura 5).
2- INHIBICIN NO COMPETITIVA
<n in&ibidor no competiti'o es el que se $i+a a un sitio distinto del que se $i+a el sustrato. /a $i+acin
del in&ibidor puede o no bloquear la $i+acin del sustrato, pero si este 5ltimo se une al sitio acti'o
no se puede trans$ormar a H o lo &ace a menor 'elocidad. El in&ibidor disminuye de manera
e$ecti'a la concentracin de enzima acti'a por lo que disminuye la 3m*x aparente (3Im*x).
-recuentemente el e$ecto sobre 2m es nulo (Figura 6).
3- INHIBICIN ACOMPETITIVA
En este caso el in&ibidor se une al comple+o "ES#, con lo cual el 'alor de 2m disminuye (como si la
enzima tu'iera m*s a$inidad por el S). :ambi)n disminuye la 3m*x ya que el comple+o "SEI# es
inacti'o (Figura 7).
V
2
m a x

[ S ]
1
[ S ]
1
V
m a x
( A ) ( B )
V 9
m a x
V
m a x
V 9
m a x
1
V
o 1
V
o
K
m

2
V 9
m a x
1
K
m
F i g u r a 1 0 : E f e c t o d e u ! ! 2 b d o r e ! u ! a r e a c c " ! e ! # m t c a * + , ) u r v a d e s u s t r a t o e ! 1 r e s e ! c a
: e ! a u s e ! c a d e l ! 2 b d o r * + o b l e r e c 7 1 r o c a *
n o c o m p e t i t i v o A
B ) D e ! 1 r e s e ! c a : e ! a u s e ! c a d e l ! 2 b d o r
Figura 6:
V
m a x
V
2
m a x

[ S ]
1
[ S ]
1
V
m a x
( A ) ( B )
K 9
m
V o
1
V o
K
m
1
K 9
m
1
K
m
F i g u r a 9 : E f e c t o d e u ! ! 2 b d o r e ! u ! a r e a c c " ! e ! # m t c a * + , ) u r v a d e s u s t r a t o e ! 1 r e s e ! c a
: e ! a u s e ! c a d e l ! 2 b d o r * + . o b l e r e c 7 1 r o c a *
c o m p e t i t i v o A
B ) e ! 1 r e s e ! c a : e ! a u s e ! c a d e l ! 2 b d o r
Figura 5:
;
INHIBIDORES IRREVERSIBLES
9on el uso de !$A!>!"o4e7 !44eve47!>le7 es $recuente la $ormacin de 5$ e$l#e ov#le$6e entre
un in&ibidor y la enzima. /os in&ibidores irre'ersibles son muy 5tiles para estudiar los mecanismos
de reaccin. Estos +uean un papel central en los m)todos modernos para obtener nue'os aentes
$armac)uticos, proceso que se denomina dise;o racional de $*rmacos. Debido a que el in&ibidor se
&a dise;ado para una enzima espec$ica y no es reacti'o &asta que se encuentre en el sitio acti'o
de la enzima, los $*rmacos basados en este m)todo son con $recuencia muy e$ecti'os y tienen
pocos e$ectos secundarios.
MB6o"o o$6!$5o 3#4# l# "e6e4+!$#!C$ "e #6!v!"#" e$2!+,6!#
/os m)todos utilizados para determinar las acti'idades enzim*ticas pueden ser de dos tipos: los
m)todos P5$6o F!$#l (como el utilizado &asta aqu) y los m)todos Co$6!$5o7)
<n +B6o"o o$6!$5o para la determinacin de la acti'idad de una enzima consiste en la lectura
de muc&os puntos de datos primarios (podra ser absorbancia o $luorescencia) durante el tiempo
que dura la determinacin. Si el sustrato o producto de la reaccin no presentan absorbancia o
$luorescencia $*cilmente detectable se emplean reacciones acopladas a la reaccin enzim*tica a
determinar. Se utiliza el producto de la reaccin como sustrato de una seunda reaccin
JacopladaK que producir* un cambio que se puede monitorear $*cilmente en un espectro$otmetro.
, menudo la reaccin acoplada tambi)n est* catalizada por una enzima. Esta reaccin no debe
ser limitante de la 'elocidad, lo que se lora areando una ran cantidad de la enzima que
cataliza la reaccin acoplada, para que todo el producto $ormado por la primera reaccin sea
consumido en la reaccin acoplada inmediatamente despu)s de su $ormacin.
En la mayora de los casos las reacciones enzim*ticas se acoplan a una seunda reaccin en la
que inter'iene una enzima que tiene como co$actor
al F,D
L
o al F,DA. 9omo resultado de estas
reacciones acopladas la concentracin de F,DA
ir* disminuyendo o aumentando en $uncin del
tiempo, en $orma proporcional a la aparicin del
producto de la primera reaccin.
F,DA L A
L
F,D
L
L 2A
L
L 2 e
1
El co$actor tiene un espectro de absorcin
di$erente en su $orma oxidada (F,D
L
) o en su
$orma reducida (F,DA) ('er Figura ). /a
concentracin de F,DA se puede determinar
espectro$otom)tricamente siuiendo el cambio de
absorbancia a (4M nm. Figura 8. Es1ectro de absorc"! del <=.
+
: <=.>*
V
2
m a x

[ S ]
1
[ S ]
1
V
m a x
( A ) ( B )
V
m a x
V 9
m a x
1
V
o
1
V
o
K
m
K 9
m

2
V 9
m a x
V 9
m a x
1
K
m
1
K 9
m
F i g u r a 1 1 : E f e c t o d e u ! ! 2 b d o r e ! u ! a r e a c c " ! e ! # m t c a * + , ) u r v a d e s u s t r a t o e ! 1 r e s e ! c a
: e ! a u s e ! c a d e l ! 2 b d o r * + o b l e r e c 7 1 r o c a *
a c o m p e t i t i v o A
B ) D e ! 1 r e s e ! c a : e ! a u s e ! c a d e l ! 2 b d o r
Figura 7:
22M 27M (MM (4M (NM
M
2
M
4
M
7
M
N
M
6MM
F,D
L
F,DA L A
L
,
b s

/onitud de onda
(nm)
?
O>De6!vo7 "el T4#>#Do P4,6!o:
(& Determinar las o$76#$6e7 !$B6!#7, V+,- E /+, de la ureasa de so+a.
*& ,nalizar el e$ecto de !$A!>!"o4e7 sobre las o$76#$6e7 !$B6!#7 de la ureasa de so+a.
.& %edir la acti'idad enzim*tica de ureasa por un +B6o"o o$6!$5o.
PARTE EXPERIMENTAL
IMPORTANTE: repasar todos los conceptos del prctico N!" #$in%tica En&i'tica I( ) los
resultados o*tenidos ) discutidos en el la*oratorio+ Traer delantal, papel 'ili'etrado,
calculadora, 'arcador indele*le para tu*os, lpi&, re-la, ) -o'a de *orrar a la clase de
la*oratorio+
1& De6e4+!$#!C$ "e o$76#$6e7 !$B6!#7 "e l# 54e#7# "e 7oD#
/a acti'idad de ureasa de so+a se determinar* con distintas concentraciones de sustrato por el
m)todo de 35$6o 1!$#l ensayado en el pr*ctico anterior (repasar los $undamentos del m)todo y los
ensayos realizados).
El siuiente protocolo experimental se seuir* para determinar las 'elocidades iniciales para
di$erentes concentraciones de sustrato, utilizando para ello la "E#, el pA, la temperatura y el tiempo
de incubacin considerados m*s adecuados se5n los resultados del pr*ctico anterior.
$ur.a de sustrato
:<>E <RE,
O m%
BUFFER
3@: F
ENZIMA
"!l ))))))))
I$5>#4
.F
o
C
Reacti'o
,
Reacti'o
>
=ncubar
(8
o
9
,bs.
O4M nm
> 11111111 M,N ml M,2 ml (' P 2 ml 2 ml 2M P
6 M,6 ml M,8 ml Q Q Q Q Q
2 M,2 ml M,7 ml Q Q Q Q Q
( M,( ml M,O ml Q Q Q Q Q
4 M,4 ml M,4 ml Q Q Q Q Q
O M,O ml M,( ml Q Q Q Q Q
7 M,7 ml M,2 ml Q Q Q Q Q
8 M,8 ml M,6 ml Q Q Q Q Q
9alcular la concentracin de urea en cada tubo teniendo en cuenta la concentracin de la
solucin de traba+o de urea (O m%) y las diluciones realizadas.
9alcular los moles de producto $ormado con las absorbancias obtenidas, usando la cur'a
patrn para amonaco ('er Rua :HF (). Di'idiendo estos 'alores en el tiempo de incubacin,
obtener los 'alores de 'elocidad inicial ( 3o ).
Rra$icar 3o en $uncin de la concentracin de sustrato.
9alcular las in'ersas de 3o y "S# y determinar las constantes cin)ticas con el m)todo r*$ico de
/ineCea'er1>ur! (doble in'ersa).
2& De6e4+!$#!C$ "e o$76#$6e7 !$B6!#7 "e l# 54e#7# "e 7oD# e$ 34e7e$!# "e
!$A!>!"o4e7
Hara ello se realizar*n cur'as de sustrato en presencia de distintos in&ibidores de la enzima.
/os in&ibidores usados ser*n:
C!"rur" #$ %ua&i#i&a' Solucin 2M m% en bu$$er $os$ato1citrato 6M m%, pA 8
%!i(i&a' Solucin 2M m% en bu$$er $os$ato1citrato 6M m%, pA 8
CuC!2' Solucin 6 % en *cido clor&drico 6M m%
> <
2
> <
2
) = < >
G u a n i d i n a
< > - ) > - ) @ @ >

2 2
G l i c i n a
A
C54v#7 "e 75764#6o e$ 34e7e$!# "e I$A!>!"o4e7
:<>E <RE,
O m%
I$A!>!"o4
8 +M
BUFFER
3@: F
ENZIMA
"!l 8
I$5>#4
.F
o
C
Reacti'o
,
Reacti'o
>
=ncubar
(8
o
9
,bs.
O4M nm
> 11111111 M,6 ml M,8 ml M,2 ml (' P 2 ml 2 ml 2M P
6 M,6 ml Q M,7 ml Q Q Q Q Q
2 M,2 ml Q M,O ml Q Q Q Q Q
( M,( ml Q M,4 ml Q Q Q Q Q
4 M,4 ml Q M,( ml Q Q Q Q Q
O M,O ml Q M,2 ml Q Q Q Q Q
7 M,7 ml Q M,6 ml Q Q Q Q Q
8 M,8 ml Q M ml Q Q Q Q Q
9alcular las 3o y las "S# se5n se indica en el apartado anterior. Rra$icar.
Determinar las constantes cin)ticas en presencia de los in&ibidores, aplicando el m)todo de
/ineCea'er1>ur!. Determinar el tipo de in&ibicin en cada caso comparando los 'alores de las
constantes en presencia y ausencia de los in&ibidores.
3) F5$"#+e$6o7 "el +B6o"o o$6!$5o 3#4# l# "e6e4+!$#!C$ "e l# #6!v!"#" "e
54e#7#
/a determinacin de la acti'idad de ureasa se basa en el siuiente esquema de reaccin:
ur$a)a
urea L A2E 2 FA( L 9E2
%!*H
FA( L F,DA L A
L
L 21oxolutarato /1lutamato L F,D
L
L A2E
/a acti'idad de la ureasa es proporcional al consumo de F,DA, que se siue por disminucin de
la absorbancia a (4M nm.
PROCEDIMIENTO
#& De6e4+!$#!C$ "e l# #6!v!"#" "e 54e#7#) (G /le'ar a cero el espectro$otmetro con un blanco
de aua destilada. Equilibrar los reacti'os a la temperatura de traba+o ((8S9). *G En una cubeta
colocar 6 ml de Reacti.o de Tra*a/o y medir la abs. (4M nm. .G ,rear 2M l de sustrato, mezclar
inmediatamente y disparar simult*neamente un cronmetro. 4G :omar una lectura de absorbancia
inmediatamente (:M) y continuar tomando los 'alores de absorbancia cada 6 min durante 6M min.
HG Rra$icar los 'alores de absorbancia en $uncin del tiempo y calcular la 3o a partir de la
pendiente, usando el coe$iciente de extincin mmolar del F,DA (F,DA: 7,22 m%
16
cm
16
).
9omparar y discutir las 'enta+as y des'enta+as de este procedimiento con respecto al m)todo de
35$6o 1!$#l para la determinacin de acti'idad de la ureasa de so+a (por cuanti$icacin de
amonaco $ormado) utilizado en los :raba+os Hr*cticos FS ( y 4.
>& E1e6o "e !$A!>!"o4e7) Se sabe que los anticoaulantes que contienen $luoruros in&iben la
accin de la ureasa. Hrobaremos el e$ecto in&ibitorio del mismo repitiendo una reaccin como la de
#& en la que se area 6MM m% Fa- antes del areado de urea. 9omparar con la reaccin no
in&ibida mediante r*$icos y num)ricamente.
Re#6!vo7 (almacenar en re$rierador (216MS9) &asta la $ec&a de 'encimiento):
+u),ra,": solucin de urea 6O m%.
Bu--$r: solucin de bu$$er Roods 6MM mmol@l, pA 8,T.
.i"-i!i/a#": 'iales conteniendo 21oxolutarato, F,DA, ureasa y lutamato des&idroenasa
(RlDA).
Hara preparar el Reacti.o de Tra*a/o disol'er el contenido de un 'ial de !i"-i!i/a#" en un $rasco de
0u--$r. %ezclar sua'emente por in'ersin &asta disolucin completa, e'itando la $ormacin de
espuma, y $ec&ar. <na 'ez preparado el Reacti.o de Tra*a/o es estable (M das en re$rierador (2
a 6MS9). El Reacti.o de Tra*a/o se deteriora y debe descartarse cuando las lecturas de
,bsorbancia a (4M nm contra aua son in$eriores a 6.
El m)todo cin)tico continuo que ensayamos en el pr*ctico es una adaptacin del que se utiliza en los laboratorios de an*lisis clnicos para la
determinacin de urea en suero o plasma (<rea (i&1,i(a AA. Biener /aboratorios S,=9. Riobamba 2T44, 2MMM, Rosario, ,r. CCC.Ciener1
lab.com.ar).