laboratorios de microbiologa para estudiar la actividad de
los antimicrobianos, frente a los microorganismos respon- sables de las infecciones, es la prueba que se realiza para determinar la susceptibilidad respecto a la sensibilidad o resistencia de una bacteria a un grupo de antibiticos. Mediante un antibiograma se puede establecer que trata- miento ser el ms adecuado para el tratamiento de un paciente afectado por una infeccin por las bacterias que se estn estudiando en este caso se aplic para las bacte- rias E.coli., Pseudomona, Bacillus, Serratia, Proteus y Staphylococcus. La realizacin de esta prueba implica, cultivar el microorganismo en este caso se utiliz Pseu- domona como incgnita en un medio que contiene un determinado sustrato, mediante la siembra en csped del microorganismo problema, posteriormente se realiz la colocacin de los discos antibiticos los cuales contenan Cloranfenicol, Eritromicina, Tetraciclina, Nitrofurantoina, Nalidxico, Gentamicina a una concentracin teraputica y un control de Metanol. Posteriormente se Incubaron y se midi los halos de inhibicin. Para este proceso se midi con regla el punto donde las bacterias no pudieron reproducirse. El Cloranfenicol y Tetraciclina fueron los antibiticos de amplio espectro que presentaron ms am- plios halos de inhibicin.
INTRODUCCIN El antibiograma es la prueba microbiolgica que se reali- za para determinar la susceptibilidad de una bacteria a un grupo de antibiticos. Las tcnicas de antibiograma son las utilizadas en el labo- ratorio de microbiologa para estudiar la actividad de los antimicrobianos frente a los microorganismos responsa- bles de las infecciones, se considera como antimicrobiana cualquier sustancia con capacidad de matar o al menos de inhibir el crecimiento de los microorganismos y que sea susceptible para la utilizacin como tratamiento en los pacientes. Los antibiticos pueden ser de origen natural, sinttico o semisinttico. A pesar de toda la estandariza- cin y su aplicacin con los mejores controles de calidad establecidos cada infeccin y cada paciente no pueden ser estandarizados, al hacer la extrapolacin al organismo vivo del binomio microorganismo-antimicrobiano.
Figura 1. Antibiograma realizado a la Pseudomona aeru- ginosa
El antibiograma ha sido objeto de descrdito por parte de los clnicos, siendo muchos de los errores imputables, no solo al antibiograma y su ejecutor sino tambin a errores en el conocimiento farmacolgico clnico y a la mala interpretacin de los resultados. Los elementos ms ade- cuados que debemos tener presentes para asegurar una terapia antimicrobiana exitosa son la respuesta clnica del paciente sometido a un determinado tratamiento y la demostracin por cultivos repetidos, que el microorga- nismo ha sido eliminado -cura bacteriolgica-o que an persiste fallo bacteriolgico. Desafortunadamente una cura bacteriolgica no siempre asegura una cura clnica satisfactoria. No obstante esto ltimo, diversos estudios han demostrado una buena co- rrelacin entre las pruebas de sensibilidad in vitro y los resultados de la terapia clnica.Se enfatiza que los resulta- dos de las pruebas de sensibilidad antimicrobiana son guas para el clinico y no una garanta de que un agente antimicrobiano ser efectivo en la terapia. La sensibilidad de un organismo a determinados antimi- crobianos ha sido definida como la menor concentracin del antimicrobiano en microgramo/mL que evita el cre- cimiento invitro del microbio y se refiere como la concen- tracin mnima inhibitoria (CMI). (1 2) La utilizacin de antibiticos supuso un avance enorme en la esperanza de vida de las personas que padecan procesos infecciosos, aunque desgraciadamente tambin supuso un aumento en los niveles de resistencia antibiti- ca. El antibiograma tiene cuatro utilidades principales: La utilidad bsica del antibiograma es la instauracin de un tratamiento antibitico correcto al paciente. Es necesa- rio conocer si el microorganismo responsable de la infec- cin posee mecanismos que le confieran inmunidad frente a algn antibitico para no incluirlo como terapia. En cuanto al tratamiento el antibiograma no slo es necesario en la instauracin, tambin resulta til en el seguimiento e incluso en la confirmacin de tratamientos empricos. En ocasiones la enfermedad infecciosa resulta grave y se comienza el tratamiento antes de conocer los datos de sensibilidad de la cepa. El antibiograma tiene que confir- mar, o en su caso corregir el tratamiento. Otra aplicacin de las tcnicas de estudio de resistencia es la epidemiolo- ga. Es necesario detectar el aumento de los niveles de resistencia en los aislamientos clnicos para tomar medi- das correctoras. Por otro lado tambin puede tener utilidad diagnstica porque el perfil de resistencia puede en algn caso orien- tar en la identificacin bacteriana. El cloranfenicol es un Aero frmaco trmicamente esta- ble, efectivo frente a un amplio espectro de microorga- nismos, en especial estafilococus, pero debido a sus serios efectos secundarios (dao a la mdula sea, incluyendo anemia aplsica) en humanos, su uso se limita a infeccio- nes muy graves, como la fiebre tifoidea.
El cloranfenicol es estable en soluciones neutras y cidas, pero al llegar al pH 10 el frmaco es inactivado. Es mode- radamente soluble en agua, ms soluble en alcohol y ter. Las soluciones a 37 C se deterioran paulatinamente con una vida media de 6 meses. Existe una versin del anti- bitico que en vez de ser palmitato es succinato sdico de cloranfenicol. Es resistente a temperaturas de esteriliza- cin lo cual es muy comn en laboratorios microbiolgi- cos. Tanto el palmitato como el succinato de cloranfenicol deben ser hidrolizados a cloranfenicol en el organismo antes que pueda ejercer su accin antibacteriana. El anti- bitico inhibe la sntesis de protenas bloqueando la acti- vidad de la enzima peptidil transferasa al unirse a la subunidad 50S del ribosoma evitando la formacin del enlace peptdico. (4) La Eritromicina se ha usado desde esa poca para el tra- tamiento de infecciones del tracto respiratorio superior, la piel y tejidos blandos causados por organismos suscepti- bles (principalmente cocos Gram positivos), y especial- mente en pacientes alrgicos a las penicilinas. La Eritromicina es el medicamento de eleccin para el tratamiento de infecciones por M. pneumoniae, Legio- nella pneumophila, difteria, coqueluche, conjuntivitis o neumona por Chlamydia trachomatis y angiomatosis bacilar. La eritromicina inhibe la sntesis de protenas en la bacte- ria al unirse a la subunidad 50S del ribosoma bacteriano. Esta unin inhibe la actividad de la peptidil transferasa, interfiriendo con la traslocacin de los aminocidos du- rante la traduccin y ensamblaje de las protenas. Segn la dosis administrada y el organismo sobre el que acte, la eritromicina tiene efectos bacteriostticos o bactericidas. (3) Las tetraciclinas constituyen un grupo de antibiticos, unos naturales y otros obtenidos por semisntesis, que abarcan un amplio espectro en su actividad antimicrobia- na. Qumicamente son derivados de la naftacenocar- boxamida policclica, ncleo tetracclico, de donde deriva el nombre del grupo. Las tetraciclinas naturales se extraen de las bacterias del gnero Actinomyces. De Streptomyces aurofaciens se extraen la clortetraciclina y la demetilclortetraciclina, de Streptomyces rimosus se extrae la oxitetraciclina, y la tetraciclina, representante genrico del grupo, se puede extraer del Streptomyces viridifaciens, aunque tambin se puede obtener de forma semisinttica. Una caracterstica comn al grupo es su carcter anfotrico, que le permite formar sales tanto con cidos como con bases, utilizndo- se usualmente los clorhidratos solubles. Presentan fluorescencia a la luz ultravioleta y tienen la capacidad de quelar metales di o trivalentes, como el calcio, manganeso, o magnesio. (5) Actan fundamentalmente como bacteriostticos a las dosis habituales, aunque resultan bactericidas a altas dosis, generalmente txicas. Actan por varios mecanis- mos: Desacoplan la fosforilacin oxidativa de las bacte- rias. Provocan una inhibicin de la sntesis protica en el ribosoma de la bacteria. Actan inhibiendo la sntesis proteica al unirse a la subunidad 30 S del ribosoma y no permitir la unin del cido ribonuclico de Transferencia (tRNA) a este, ni el transporte de aminocidos hasta la subunidad 50 S. Existe tambin evidencia preliminar que sugiere que las tetraciclinas alteran la membrana cito- plasmtica de organismos susceptibles, permitiendo la salida de componentes intracelulares. [5]
Las resistencias bacterianas a las tetraciclinas son de aparicin lenta, aunque mucho ms rpida si se utiliza por va tpica. El mecanismo bacteriano implicado puede ser mediante plsmido, lo que explica la reticencia a usar las tetracilinas en el mbito hospitalario, para evitar la apari- cin de resistencias simultneas a varios antibiticos. Existen resitencias cruzadas entre los miembros del gru- po. (6) Esta recomendado para Bacterias gram positivas: Strepto- coccus, Diplococcus, Clostridium. Bacterias gram negativas: Neisseria, Brucellas, Haemop- hilus, Shigella, Escherichia coli, Bordetella, Klebsiella, Vibrio y Pasteurella, Espiroquetas, algunos protozoos: Entamoeba, Actinomyces, Rickettsia. Este espectro explica su utilizacin en las siguientes pato- logas, entre otras:Infecciones de la piel: Acn, roscea. Infecciones urogenitales: Gonococia, sfilis. Infecciones gastrointestinales: Disentera, clera, amebiasis, lcera gstrica, infecciones periodontales. Infecciones respirato- rias: Faringoamigdalitis, bronquitis y algunas formas de neumona atpica. Otras infecciones: Fiebre recurrente, fiebre Q, tifus exantemtico, tifus endmico, actinomico- sis, brucelosis. Hay que tener en cuenta que aunque in vitro su actividad es ms amplia, in vivo nos encontramos con otros muchos antibiticos que pueden resultar ms efectivos o con me- nos efectos adversos que las tetraciclinas, por lo que stas quedan relegadas a antibitico de segunda eleccin, cuan- do fallan los de primera eleccin. La nitrofurantona es un frmaco utilizado en la profilaxis y el tratamiento de las infecciones urinarias no complica- das. Es activa contra la mayora de bacterias gram positi- vas y gram negativas. A pesar de que las sulfamidas y otros antibacterianos suelen ser los tratamientos de prime- ra eleccin para las infecciones del tracto urinario, la nitrofurantona se emplea habitualmente con fines preven- tivos y en tratamientos de supresin a largo plazo. La nitrofurantona es en realidad un profrmaco que la propia bacteria activa mediante flavoprotenas como la nitrofurano reductasa que reducen la molcula para obte- ner sustancias intermedias que alteran los ribosomas y otras macromolculas bacterianas. Como resultado, el frmaco interfiere en varias rutas enzimticas vinculadas a la respiracin celular, el metabolismo glucdico y la sntesis de protenas, ADN, ARN y la pared bacteriana. Esta accin simultnea sobre tres procesos distintos puede explicar la dificultad de las bacterias atacadas para desa- rrollar resistencias. Tiene un efecto bacteriosttico o bac- tericida dependiendo de la concentracin empleada y del organismo infectante. Acta sobre bacterias gram positivas y gram negativas, mostrndose ms eficaz con estas ltimas, especialmente cuando se trata de especies pertenecientes a la familia de las enterobactericeas. Tambin ha probado ser eficaz frente a Corynebacterium, estafilococos y espectrococos,
tanto del grupo D como viridans. No tiene actividad ante Pseudomonas, Serratia y Providencia.(7) El cido nalidxico es un antibitico del grupo de las quinolonas, activa en contra de Gram negativas. A con- centraciones menores acta como bacteriosttico, es de- cir, inhibe el crecimiento y reproduccin bacteriana, sin matar el organismo. A concentraciones ms elevadas acta como bactericida, es decir, mata la bacteria en vez de simplemente inhibir su reproduccin. El cido nalidxico selectiva y reversiblemente bloquea la replicacin del ADN bacteriano, por medio de la inhibi- cin de una subunidad de la enzima girasa del ADN indu- ciendo la formacin de un complejo enzimtico ineficaz. Sus acciones tambin pueden causar que el empaqueta- miento ultratorcional del ADN se vea relajado, causando inestabilidad en las molculas genticas. La gentamicina es un aminoglucsido. Se emplea como antibitico para erradicar infecciones en el ojo contra bacterias sensibles. Tambin sirve para tratar diversas enfermedades graves de piel, pulmn, estmago, vas urinarias y sangre, as como heridas cutneas. Su uso est indicado cuando la administracin de otros antibiticos menos potentes haya sido ineficaz. Debido a su gran toxicidad y a los mltiples efectos secundarios, ha de evitarse su uso si no es estrictamente necesario. Se con- centran en odo y rin, por lo tanto tienen efectos otol- gicos y nefrotxicos. Su mecanismo de accin consiste en interferir en la snte- sis normal de protenas, originando protenas no funciona- les en microorganismos susceptibles. Para ejercer su accin deben ingresar en la clula bacte- riana. Esto ocurre en 2 etapas por un mecanismo de trans- porte activo. En la primera fase, el ingreso a la clula depende del potencial transmembrana generado por el metabolismo aerobio. La segunda fase es de ingreso ace- lerado, y se ve favorecida por la unin previa del amino- glucsido al ribosoma bacteriano. Ciertas condiciones que reducen el potencial elctrico de la membrana como la anaerobiosis o el bajo pH del medio, disminuyen el ingre- so de estos compuestos al citoplasma bacteriano. Una vez dentro de la clula, los aminoglucsidos se unen de manera irreversible a la subunidad 30S del ribosoma bacteriano. Esta unin interfiere con la elongacin de la cadena peptdica. Tambin causan lecturas incorrectas del cdigo gentico formndose protenas anmalas. Algunas de estas son protenas de membrana y el resultado es la formacin de canales que permiten el ingreso de ms drogas a la clula. Es activo contra Gram negativas, especialmente Esche- richia coli, especies de Proteus (indol-positivo e indol- negativo), Pseudomonas aeruginosa, especies de Klebsie- lla, Enterobacter, Serratia, Citrobacter, y especies de Staphylococcus (coagulasa-positiva y coagulasa-negativa, incluyendo cepas resistentes a penicilina y meticilina). Los anaerobios, tales como Bacteroides o Clostridium, y la mayora de las especies de Streptococcus suelen ser resistentes a los aminoglucsidos. (7)
MTODOS El mtodo cientfico empleado para la elaboracin de un antibiograma fue el proporcionado segn la Ctedra de Qumica Orgnica y Bioqumica. UNA. Costa Rica, 2011.
RESULTADOS Conforme se realizaron los antibiogramas a las diferentes bacterias se determin que: E. coli: Es sensible al cloranfenicol, tetraciclina y genta- micina, por el contrario la eritromicina, nitrofurantona y cido nalidixico poseen resistencia sobre la bacteria. Pseudomona Aeruginosa: Es sensible al cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina, nitrofurantona, cido nalidxico y gentamicina. Bacilos: Es sensible al cloranfenicol, eritromicina, cido nalidxico y gentamicina, por el contrario es resistente a la tetraciclina y nitrofurantona. Serratia: Es sensible al cloranfenicol, eritromicina, tetra- ciclina, nitrofurantona y gentamicina, por el contrario el cido nalidixico posee resistencia sobre la bacteria. Proteus: Es sensible al cloranfenicol, eritromicina, tetraci- clina, nitrofurantona y gentamicina. En el caso del cido nalidixico es intermedio Staphiloccocus: Es sensible a la eritromicina y gentamici- na, por el contrario el cido nalidixico posee resistencia sobre la bacteria y el cloranfenicol y nitrofurantona tienen un efecto intermedio.
TABLAS Y GRFICOS Tabla 1. Resultados obtenidos al realizar un antibiograma de las diferentes bacterias, para la medicin de los halos de inhibicin en mm.
Clo- ranfe- nicol Eritro tro- mici- na Te- traci- clina Nitro- furan- tona Na- lidi- xico Gen- tami- cina Met ano l E. coli (1) 15 - 15 - 13 18 - E. coli 20 - 20 7 13 25 -
Tabla 2. Resistencia y sensibilidad de las bacterias estu- diadas con respecto a los antibiticos utilizados. Antibitico E. co li Pseudo- mona aerugino- sa Baci- los Se- rratia Pro- teus Staphilo- cocus Cloranfeni- col S S S S S I Eritromici- na R S S S S S Tetracicli- na R/ S S R S S S Nitrofuran- tona R S R S S I cido Nalidixico R S S R I R Gentamici- na S S S S S S
DISCUSIN DE RESULTADOS
Todas las enterobacterias de inters clnico, con excep- cin muy posiblemente de la proteus mirabilis son porta- doras de una betalactamasa cromosmica natural. Este es uno de los principales mecanismos de resistencia en los Gram negativos, la enzima responsable por la resistencia a la betalactamasa es la AmpC, la cual es codificada por el mismo gen. Esta es una de las razones del porque la E. coli, Bacilos, Serratia, proteus y Staphilococus son resis- tentes a diferentes antibiticos utilizados. Otro factor que explica la resistencia de las bacterias a ciertos antibiticos utilizados, es la resistencia por baja permeabilidad de la membrana externa, esto se debe a que la protena OprD la cual funciona como canal de entrada de los aminocidos bsicos, presenta una deficiencia, la deficiencia de la protena hace que una betalactamasa cromosomal se exprese. (8) Las bacterias Gram negativas en su mayora son resisten- tes a la tetraciclina, debido a las OprD que pueden expor- tar al antibacteriano hacia afuera de la bacteria tan rpido como cuando es transportado dentro de la clula bacteria- na, la resistencia a este antibitico, sin embargo se obser- va que todas las gram negativas dieron como resultado sensibilidad al antibitico, caso contrario con las gram positivas como Bacilos y Staphilococus, que dieron resis- tencia al antibitico, muy posiblemente la la concentra- cin de la protena en las bacterias era alta, por lo que la capacidad de penetrar al interior de la bacteria es alta y las bacterias no lograron exportar el antibacteriano hacia el exterior. La Pseudomona es una de las bacterias, gram negativas, implicado en infecciones nosocomiales, causando infec- ciones de vas respiratorias, urinarias, oculares, entre otros, y con facilidad desarrola mutaciones cromosmicas y adquiere material gentico que le da resistencia a com- puestos, donde influyen todos los mecanismos de resis- tencia bacteriana, aun as se observa que de todas las bacterias estudiadas fue la que presento sensibilidad a todos los antibiticos. (8) Respecto al cloranfenicol y tetracilina son de amplio espectro ya que altera los ribosomas, alterando la trans- cripcin dando como resultado la detencin del proceso de snteisis. Entre los otros factores que intervienen en los resultados del antibiograma, se encuentran el pH, ya que la sensibi- lidad de las pruebas est estandarizada a pH fisiolgico, ya que existen varios antibiticos que poseen un amplio rango de pH, aun as otro actan mejor en pH bsico o cido. Tambin los cationes de calcio y magnesio, ya que si el medio est deficiente de estos cationes, aumentar la permeabilidad de la pared celular a estos antibiticos, produciendo altas o bajas concentraciones mnimas inhi- bitorias, dando falsos sensibles. El tamao del inculo tiene gran importancia puesto que si es pequeo las bacte- rias resistentes pueden no quedar incluidas. Por otro lado, se encuentra la inactivacin enzimtica de los beta- lactmicos, estas enzimas estn siempre expresadas en algunas bacterias, pero mayormente van a ser inducidas por la presencia del antibitico, la bacteria puede morir antes de que la enzima pueda reproducirse para destruir el antibitico, sin embargo existe un gran nmero de cepas capaz de producir la enzima y destruir el antibitico, por lo que puede resultar una falsa sensibilidad nivel del anti- biograma por no poner el inculo adecuado. (9)
CONCLUSIONES Para realizar una correcta realizacin e interpretacin de un antibiograma, se debe incubar a 37 C entre 20 y 24h en una atmsfera aerobia o rica en CO 2 , dependiendo de la bacteria, el inoculo debe de ser de cierta concentracin puesto que si es mayor o menor se pueden dar falsos niveles de resistencia o sensibilidad, los antibiticos utili- zados deben de tener una concentracin establecida, estar
en buenas condiciones, de no ser as pueden las cepas sensibles pueden dar cierta resistencia. Para la prescripcin correcta de un antibitico se debe tomar en cuenta la naturaleza del proceso infeccioso, la historia clnica del paciente, el mecanismo de accin del antibitico, la toxicidad, las posibles sensibilizaciones del paciente y la va de administracin, recordando que la resistencia de las bacterias es el principal obstculo para la eficacia del antibitico. Al conocer el comportamiento de las diferentes bacterias, y en estas haya un cambio se debe volver a investigar por medio de pruebas confirmatorias si todava son sensibles al antibitico y probar otros antibiticos como alternativa.
REFERENCIAS
1 Drmaso D y col. Antibiticos y Quimioterpicos Antibacte- rianos Uso Clnico. Espaa, Laboratorios Beecham S, A. 1984 pp 65.
2 Low DE. Laboratory Procedures and Magnagement of Antimicrobial therapy . Korene, .Antimicrobial Therapy in Infants and Childrery. New York. 1 9 8 8 : pp 3
3 Avendao, Carmen; Lpez Introduccin a la qumica far- macetica 2 edicin. Madrid: McGraw-Hill/Interamericana de Espaa. 2001 pp. 568-572.
4 Chloromycetin, a New Antibiotic from a Soil Actinomycete. Autores: J. Ehrlich; Q.R. Bartz; R.M. Smith; D.A. Joslyn y P.R. Burkholder; Revista Science, pp 417. 1947.
5 Lorenzo Velzquez et al.: Farmacologa y su proyeccin a la clnica. 13 ed. Ed. Oteo. 1976, pp. 966
6 Drobnic, L., Salv, J.A.,Curso sobre antibioticoterapia. Ruan, S.A. 1980, pp. 225
7 Departamento Tcnico del Consejo General de Colegios Oficiales de Farmacuticos. Catlogo de medicamentos. Madrid: Consejo General de Colegios Oficiales de Farmacu- ticos. pp. 1636-1637
8M.C Gamero Delgado, et all. Sensibilidad y resistencia de Pseudomonas aeruginosa a los antimicrobianos. Revista espaola de quimioterapia; Vol 20 (N 2). 2007
9Sanchz J., Feris J. Antibiogramas: utilidad y limitaciones. Arch Dom Ped; Vol 34 ( N 2)
ANEXOS
Figura 2. Antibiograma realizado a la Pseudomona Ae- ruginosa, con Cloranfenicol, Eritromicina, Tetraciclina, Nitrofurantona, cido nalidixixo y gentamicina como antibiticos.