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Manual

Procedimientos de
Bioseguridad en P3
Unidad de
Investigacin Mdica
IMSS-Zacatecas


INDICE
Justificacin
Marco Legal
Medidas de Bioseguridad en el Manejo de Muestras Mycobacterium tubercolosis
A. INTRODUCCION
B. PERSONAL
C. CONDICIONES GENERALES DEL LABORATORIO P3
D. PROCEDIMIENTO PARA CONTENER UN DERRAME INFECTOCONTAGIOSO
E. MEDIDAS DE CONTROL EN CASO DE ACCIDENTE
PROTOCOLOS DE LABORATORIO
A. ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS CLINICAS PARA EL DIAGNSTICO DE MTB.
B. DESCONTAMINACIN DE MUESTRAS PARA CULTIVO DE Mycobacterium tuberculosis.
C. LAMINILLAS PARA BACILOSCOPIA
D. INOCULACION DE MUESTRA DE SEDIMENTO
E. TINCIN DE LAMINILLAS
F. ALMACENAMIENTO DE SEDIMENTOS DE MX DE EXPECTORACION
G. IDENTIFICACIN DE Mycobacterium tuberculosis
I.CARACTERISTICAS TAXONOMICAS.
a. Morfologa Colonial.
b. Morfologa Celular.
II.- CARACTERISTICAS FISIOLGICAS.
a. Acumulacin de niacina.
b. Reduccin de nitratos a nitritos.
c. Actividad de Catalasa: Mtb presenta TERMOLABILIDAD POSITIVA.


H. ALMACENAMIENTO DE SEMILLAS DE Mtb
I. DESPARAFINIZACIN DE TEJIDOS INCLUIDOS
J. EXTRACCIN DE DNA
a) Con Lisozima y CTAB.
b) Con perlas y fenol absoluto.
c) Con DNAzol.

K. INFECCIN DE LAS CLULAS A549.
L. DETERMINACIN DE CRECIMIENTO INTRACELULAR DE MTB EN CLULAS
EPITELIALES A549 (KILLING).
M. EXTRACCIN DE RNA DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, MEDIANTE TRIZOL.
N. OBTENCIN DE EXTRACTO PROTECO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS.
a) Preparacin del medio PBY. Siembra de M.Tuberculosis en medio PBY.
b) Obtencin de Mtb stock de trabajo. Siembra de M.Tuberculosis en medio PBY. Obtencin de Mtb
stock de trabajo.
c) Siembra de M.Tuberculosis en medio PBY.
d) Dilisis de protenas utilizando membranas de celulosa.
e) Concentracin de protenas.
f) Determinacin de protenas por el mtodo de Lowry.










Justificacin.
En el trabajo de laboratorio dentro de nuestra institucin se manejan diferentes tipos
de agentes biolgicos y materiales peligrosos, muchos de los cuales implican un riesgo
para el personal, los estudiantes o el ambiente.
Por esta razn el personal que hace trabajo en el Cuarto de Contencin de la Unidad
de Investigacin Medica en Zacatecas del Instituto Mexicano del Seguro Social debe
conocer acerca de la peligrosidad y riesgo en esta rea de trabajo, as como saber qu
medidas de proteccin se deben emplear para prevenir y reducir dicho riesgo.
Esta situacin se encuentra regulada en las disposiciones sanitarias de nuestro pas
(leyes, reglamentos y normas), las cuales establecen evitar ciertas conductas y seguir
otras para lograr un manejo seguro a fin de prevenir riesgos, lo cual permite a su vez
fijar lmites de exposicin y brindar alternativas de tratamiento y disposicin final
para reducir su volumen y peligrosidad.
Finalmente se complementan dichas disposiciones regulatorias, con los manuales, las
guas, lineamientos, procedimientos y mtodos de buenas prcticas de manejo de los
residuos peligrosos, as como la divulgacin de informacin, la educacin y la
capacitacin de quienes los manejan.
Derivado de lo anterior y en apego a la normatividad sanitaria se implementa el
presente MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE SEGURIDAD BIOLOGICA EN EL
AREA DE P3 DE LAUNIDAD DE INVESTIGACION MEDICA IMSS-ZACATECAS.




















Marco Legal

El presente Manual se elabora de conformidad con el siguiente marco legal:
1. Ley General de Salud.
2. Ley General del Equilibrio Ecolgico y Proteccin al Ambiente
3. NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Proteccin ambiental -
Salud ambiental - Residuos peligrosos biolgico-infecciosos - Clasificacin y
especificaciones de manejo.
4. NORMA Oficial Mexicana NOM-197-SSA1-2000, Que establece los requisitos
mnimos de infraestructura y equipamiento de hospitales y consultorios de atencin
mdica especializada.
5. NORMA Oficial Mexicana NOM-166-SSA1-1997, Para la organizacin y
funcionamiento de los laboratorios clnicos. 6. NORMA Oficial Mexicana NOM-52-
ECOL-1993, Que establece las caractersticas de los residuos peligrosos, el listado de
los mismos y los lmites que hacen a un residuo peligroso por su toxicidad al ambiente.
7. REGLAMENTO de la Ley General de Salud en Materia de investigacin para la
Salud.-Publicado en el Diario Oficial de la Federacin de fecha 23 de diciembre de
1986.
8. REGLAMENTO de la Ley General de Salud en materia de Prestacin de Servicios de
Atencin Mdica. Publicado en el Diario Oficial de la Federacin de fecha 29 de abril
de 1986.
9. REGLAMENTO de la Ley Federal de Seguridad, Higiene y Medio Ambiente de
Trabajo.- Publicado en el Diario Oficial de la Federacin de fecha 21 de enero de
1997.









Medidas de Bioseguridad en el Manejo de Muestras Mycobacterium
tubercolosis.

INTRODUCCION:
Para realizar el diagnstico bacteriolgico de la tuberculosis, el riesgo de infeccin
para el personal de laboratorio es tres veces mayor que para aquellos que no trabajan
con este agente infeccioso (Centres for Diseases Control and Prevenction and
Nacional Institutes of Health U. S.A). La va ms importante para adquirir la infeccin
es la respiratoria y se necesita una dosis muy baja de bacilos de Mycobacterium
tuberculosis (MTB) para infectar al humano (DL50%<10 bacilos). Adems, los cuidados
deben ser mayores considerando que los bacilos tuberculosos pueden sobrevivir en
frotis fijados al calor y pueden transportarse en los aerosoles producidos al preparar
cortes congelados o durante la manipulacin de los cultivos.
Las medidas de seguridad en el laboratorio son un conjunto de buenas prcticas
que deben realizarse rutinariamente. Cada tcnica debe ser realizada
meticulosamente, usando apropiadamente cada rea del laboratorio, eligiendo para ello
los equipos especficos. Es muy importante que la respuesta del personal del
laboratorio a situaciones accidentales, que ponen en riesgo la seguridad de todo el
personal, inicie desde un uso apropiado de los materiales de proteccin como batas,
mascarillas, guantes, etc. As, es fundamental que al trmino de cualquier tcnica o
experimento, el personal involucrado realice todas las medidas de limpieza del rea de
trabajo en la que realizo dichas actividades, con el objeto de evitar la probable
contaminacin del ambiente de trabajo.






PERSONAL
a) Antes de incorporarse al laboratorio, todo el personal debe someterse a un examen
medico as como a una prueba de la tuberculina con PPD. Para aquellas personas que
han trabajado previamente con MTB, esta prueba normalmente es positiva. Si la
reaccin drmica es negativa, estos individuos deben vacunarse con BCG, y
comprobarse su reactividad antes de ser admitidos al laboratorio.
b) El personal debe recibir un adiestramiento tcnico que incluya una meticulosa
enseanza sobre las medidas de seguridad personal, manejo de cultivos, tcnicas
rutinarias de laboratorio, desecho de material infectocontagioso, etc.
c) Una vez al ao se realizar una radiografa de trax conservando las placas en un
archivo, para ir verificando la salud del personal.
d) Utilizar siempre overoles o bata larga, preferentemente que se cierre por la
espalda. La bata debe ser esterilizada antes de lavarse y ser de uso exclusivo.
e) Utilizar cubre-bocas con filtros respiradores XN95













CONDICIONES GENERALES CON LAS QUE DEBE CONTAR EL
LABORATORIO
1.- rea:
a) El laboratorio debe ser una rea de circulacin restringida y contar todos los
avisos de advertencia y emergencia en las puertas de acceso.
b) El lugar de trabajo debe estar siempre limpio, con fcil acceso y contar con
buena iluminacin.
c) Las paredes y pisos deben ser lisos y de fcil lavado y deben limpiarse todos
los das. Para evitar aerosoles y accidentes, no debe barrerse en seco ni
encerarse.
d) Se recomienda la instalacin de lmparas de luz ultravioleta en las reas de
cultivo de MTB, las cuales deben estar encendidas por un tiempo mnimo de 15
min al trmino del trabajo. Estas lmparas deben limpiarse semanalmente con
alcohol al 70 %.
e) Las reas de cultivo y manipulacin de MTB deben contar con las siguientes
condiciones:
1.- Ubicarse en un sitio alejado de la puerta o en sitios donde no haya
corrientes de aire.
2.- Contener solo los equipos y elementos necesarios. Antes de trasladar
cualquier equipo a otra rea o para su reparacin deber descontaminarse
adecuadamente, siguiendo las reglas descritas para un cuarto de bioseguridad
biolgica nivel 3 (BSL-3 anexo).
3.- Se debe descontaminar el gabinete de seguridad antes y despus de cada
sesin de trabajo con fenol al 5% o cresol al 3% y despus con etanol al 70%.
(Si hubo algn derrame durante el trabajo en el interior del gabinete de
seguridad tapar con una gasa y verter fenol al 5% hasta empapar
perfectamente, cerrar el gabinete, dejando actuar al desinfectante por lo
menos 30 minutos).
a) Utilizar siempre trajes y/o bata larga, preferentemente que esta se cierre
por la espalda. Si estos no son desechables deben ser esterilizados antes
de lavarse y ser de uso exclusivo.
b) Utilizar cubre boca con filtros XN95.


PROCEDIMIENTO PARA CONTENER UN DERRAME
INFECTOCONTAGIOSO
c) Elementos solidos
d) Elementos punzocortantes
e) Elementos lquidos. En caso de accidente por derrame vaciar en esta zona
en forma concntrica fenol al 5%, cubrir con papel o paos absorbentes
mojandolos perfectamente con la misma solucin desinfectante y dejarlo
actuar durante 30 minutos como mnimo antes de limpiar el rea.

f) OPERACIONES DE MAYOR RIESGO:
Siempre se realizan dentro del gabinete o cabina de bioseguridad.
1.- Destape de los envases que contienen la muestra.
2.- Transferencia de suspensiones de bacilos por medio de pipeta.
3.- Apertura de camisas de centrifugacin
4.-Decantacin de lquidos despus de la centrifugacin en contenedores
5.- Apertura de tubos despus de centrifugacin, agitacin y/o bortexeo.

MEDIDAS DE CONTROL EN CASO DE ACCIDENTE
1.- En caso de accidente despus de aplicar las medidas de contencin indicadas avisar
de inmediato al personal responsable del P3 (Biologa Leonor Enciso Moreno, Tcnico
Investigador A 80), registrar la fecha, e identificar al personal que participo y el
material involucrado.
2.- Accidentes ms comunes y que hacer cuando se presenten:
a) Rotura o volcadura de frascos con muestras de suspensiones bacilares o con
cultivos inoculados.- Cubrir con fenol al 5% el material y el rea contaminada, dejarlo
actuar durante 30 minutos. Recoger los restos con pinzas, colocarlos en un recipiente
adecuado, esterilizarlos en autoclave o incinerarlos.
b) Rotura o abertura accidental de tubos en la centrifuga, desconectar la centrifuga,
mantenerla cerrada durante 10 minutos despus de haber parado completamente,
rociar la parte interior de la centrifuga con fenol al 5%, agregando mayor cantidad al
tubo roto, tapar y dejar actuar la solucin de fenol durante 30 minutos. Tomar con
pinzas el tubo y las camisas y colocarlos en un recipiente, limpiar el interior de la
centrifuga con gasas impregnadas con fenol al 5%, desechar los restos en el mismo
recipiente y esterilizarlos en autoclave.
Proceder de la misma forma si el accidente ocurre durante la agitacin mecnica, en el
homogenizador de tejidos, agitador o vrtex.
c) Accidente por inoculacin directa.- Lavar la zona inoculada con agua y jabn y enviar
al accidentado al mdico.
















ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS CLINICAS PARA EL
DIAGNSTICO DE MTB.
Tipos de muestras:
1) Muestras de esputo
2) Muestras de Esputo inducido.
3) Aspiracin gstrica (enfermos que no pueden expectorar).
4) Lavado bronquial.
5) Aspiracin transtraqueal.
6) Liquido cefalorraqudeo.
7) Liquido peritoneal.
Algunos tipos de muestras se obtienen de pacientes hospitalizados. Todos los tipos
de materiales (expectoraciones y aspirados) se obtienen a primera hora de la
maana.
Se recomienda (OMS) bciloscopia en tres muestras de esputo para el diagnstico
de Tb pulmonar, la mejor muestra para el diagnstico es el esputo y debe
colectarse para facilitar su manejo bajo las siguientes condiciones:
Colectar en recipientes limpios y desechables de boca ancha y tapa de rosca,
deben sellarse y empacarse para evitar derrames y roturas. De preferencia se
deben obtener las tres muestras de das consecutivos, las muestras se deben de
enviar cuanto antes al laboratorio o bien refrigerarse sin dejar pasar mucho
tiempo.
El paciente se debe de enjuagar bien la boca antes de obtener el esputo, para que
este libre de alimentos o drogas orales. Se debe recoger solo el material exudativo
obtenido de los pulmones despus de una tos profunda, no deber dar descarga
nasofarngea ni saliva.
La posibilidad de aislar Mtb aumenta si la muestra se procesa el mismo da.



DESCONTAMINACIN DE MUESTRAS PARA CULTIVO DE
Mycobacterium tuberculosis.

PROCESO DE DIGESTION, DESCONTAMINACION Y LAMINILLAS PARA
BACILOSCOPIA DE LAS MUESTRAS DE EXPECTORACIN.

1.- Despus de limpiar y desinfectar la campana de flujo laminar o gabinete de
seguridad biolgica introducir todo el material a utilizar limpiando con etanol al 70% y
encender UV durante 5 minutos.
2.- Introducir las muestras, mezclar el contenido de cada una con un palillo y hacer un
frotis o extendido delgado de 2 cm de largo X 1cm de ancho en el centro de un
portaobjetos (previamente rotulado en la parte inferior con el numero de folio,
numero de mx, fecha y persona que lo hace), pasar por la flama tres veces para secar
y agregar unas gotas de metanol sobre la muestra para fijar y despus teir*.
3.- Trasvasar el resto de la mx a tubos Falcn de 50ml, previamente rotulados. Las
muestras con volumen mayor a 5ml se centrifugan (3000 rpm/15min), y se decantan
hasta un volumen aproximado de 5ml, si la consistencia de la mx no permite la
decantacin por el moco se separa en dos o mas tubos con 10ml mximo cada uno. (A
partir de este momento el proceso debe de ser continuo, para no daar las
micobacterias).
4.- Para control de calidad de reactivos, dividir con un marcador en 8 espacios cajas
petri con medio gelosa-sangre e identificar 2 espacios para cada reactivo uno de inicio
y otro de final de uso. Al empezar a usar cada recipiente con reactivo tomar con ayuda
de una pipeta de transferencia una gota y depositarla en el espacio correspondiente,
cuando se termine de usar o bien antes de que se termine el contenido tomar otra
gota y depositarla en el espacio correspondiente a final.
5.- Agregar con respecto a la cantidad de la muestra, un volumen igual de solucin
Citrato de Sodio-Hidrxido de sodio y N-cistena (ver apndice preparacin de
reactivos).
6.- Dentro de la campana y verificando que los tubos estn perfectamente cerrados
agitar vigorosamente en vrtex durante 20 segundos, repetir agitacin en forma
similar despus de 5 minutos y repetir cada 5 minutos dos veces ms, todo a
temperatura ambiente.
7.- Agregar Buffer de fosfatos hasta completar un volumen aproximado de 45 ml.
8.- Agitar hasta formar un remolino en toda la muestra.
9.- Centrifugar 3000 rpm/20minutos, (las camisas de la centrifuga solo se abren
dentro de la campana de flujo).
10.- Decantar con cuidado hasta un volumen mnimo, evitando la perdida del botn de
sedimento.
11.- Resuspender la pastilla bortexeando ligeramente, tomar una gota y depositarla en
un portaobjetos (previamente identificado con los datos correspondientes) y dejar
secar, una vez seco agregar 2 gotas de metanol para fijar dejar secar y despus
teir*.
12.- Checar el pH de la muestra resuspendida con ayuda de papel tornasol.
13.- Ajustar pH a neutralidad, aadiendo Buffer Fosfatos hasta completar mximo 3
mL, si no se ajusta el pH con este volumen, realizar un lavado ms, repetir el
procedimiento hasta obtener pH neutro.
14.- Etiquetar (Folio, numero de muestra, fecha e iniciales de quien lo procesa) tubos
con medio Lwestein Jensen (LJ) y/o 7H9.
15.- Aadir antibiticos (PANTA) 0.1 mL para LJ y 0.8 mL para medio liquido (MIGIT,
7H9, etc.)
16.- Inocular 0.5ml de muestra de sedimento a cada tubo LJ 7H9 y una gota en el
espacio que corresponda a cada muestra en las cajas petri con gelosa sangre (GS).
18.- Las placas GS se incuban a 37 C/48hrs.
19.- Incubar LJ con la tapa semiabierta y 7H9 bien serrados en incubar a 37 C por
ocho semanas, revisar cada semana para visualizar crecimiento y detectar positivos,
de las muestras de expectoracin cuyos cultivos presenten crecimiento antes de 7
das, se volvern a descontaminar y resembrar, de los sedimentos de cultivos de 10
das sin crecimiento, se harn alcuotas de 1.5 mL en criotubos que se pondrn a -20C
durante una noche y despus se guardaran hasta su uso a -80C.
*Preparar laminillas para Tinciones
Las laminillas secas previamente fijadas con metanol se colocan sobre una plancha a
80C durante 1 min. Antes de teir.
TINCIN DE LAMINILLAS
Auramina-Rodamina
a) Colocar las laminillas en un bastidor en la tarja y agregar colorante auramina-
rodamina cubriendo la zona donde esta la muestra, dejar pasar 15 minutos.
b) Lavar con agua corriente y escurrir.
c) Agregar alcohol cido para rodaminas por 3 min. Lavar con agua corriente y
escurrir.
d) Agregar Permanganato de Potasio durante 3 min. Lavar con agua corriente.
e) Observar al microscopio de fluorescencia.
Las laminillas pueden almacenarse por 30 das en oscuridad. Estas laminillas pueden
teirse tambin por Ziehl Neelsen (ZN) para confirmar.
Ziehl Neelsen (ZN).
a) Colocar las laminillas en un bastidor en la tarja y agregar colorante Fucsina
cubriendo todo el portaobjetos
b) Calentar a emisin de vapores durante 5 minutos, lavar con agua corriente y
escurrir
c) Decolorar con alcohol cido durante 2 minutos, lavar y escurrir
d) Agregar azul de metileno cubriendo todo el portaobjetos por 1 minutos, lavar y
secar.














ALMACENAMIENTO DE SEDIMENTOS DE MX DE
EXPECTORACION
A.- Se rotulan 2 tubos tapa de rosca 2 ml, para cada mx de sedimento (original y
replica), los datos son: folio, fecha de proceso y nombre de quien realiza el
procedimiento.
Nota: En la tapa para su almacenamiento se anotara el nmero consecutivo que
corresponda, en el tubo replica se anotara una R antes de este nmero.
Se rotula un tubo falcn de 15 ml por cada mx en el cual se recupera el sobrenadante
para su congelacin.
B.- Procedimiento: Se realiza en P3 en campana de flujo laminar.
1.-Centrifugar los tubos falcn que contienen los sedimentos 3000 rpm durante 15
min.
2.- Se recuperan los sobrenadantes con pipeta de transferencia evitando formar
aerosoles, en tubos falcn de 15 ml previamente rotulados, tomando cuidado de no
perder la pastilla. Los tubos se guardan a -20C durante 24 hrs, pasado este tiempo se
guardan a -70 C hasta su uso.
3.- Agregar 2 ml de TE 1X estril, resuspender la pastilla hasta homogenizar.
4.- Tomar 1 ml de mx para cada tubo, original y replica previamente rotulado.
5.- Los tubos se guardan en la caja segn corresponda (previamente rotulada como
original y replica) a -20C durante 24 hrs, pasado este tiempo se guardan a -70 C
hasta su uso.






IDENTIFICACIN DE Mycobacterium tuberculosis
I.- CARACTERISTICAS TAXONOMICAS.
1.- Morfologa Colonial
Medio de Lwestein-Jensen: Colonias tpicas blancas a color crema, de aspecto
rugoso a seco, con el tiempo toman forma de coliflor. Se desarrollan en la superficie
del medio y el sitio en que se implantan no cambia de color. El crecimiento es eugnico.
2.- Morfologa Celular
Bcilos de longitud mediana que miden 2 a 6 x 0.3 m. Generalmente sen de
forma generalmente curva. En cultivo forman cordones serpentinos, que tienden a ser
extensos.
II.- CARACTERISTICAS FISIOLGICAS.
a.- Acumulacin de niacina: Es POSITIVA para Mtb, pero tambin para M.
simiae y algunas cepas de M. marinum y M. chelonae, ya que todas comparten la
ausencia de la encima que convierte la niacina en niacinaribonucletido.
Procedimiento:
1.- Se toma un tubo del problema con abundantes colonias de no menos de
cuatro semanas de desarrollo y se agrega 1mL de agua destilada estril.
2.- Simultneamente se disponen los testigos: Cultivo POSITIVO Mtb y Tubo
con medio solo.
3.- El medio se rompe con el asa a fin de facilitar la difusin de la niacina. Se
deja inclinado a temperatura ambiente durante 15 min.
4 .- El tubo se coloca en posicin vertical y se extrae el lquido con una pipeta de
trasferencia se pasa a un tubo limpio y se agregan 0.5 mL de una solucin de bromuro
de cianogeno y 0.5 mL de una solucin de anilina.
5.- La presencia de una coloracin amarilla significa presencia de niacina.
6.- Al final de la prueba debe agregarse a los tubos una solucin de hidrxido de
sodio, ya que el bromuro de ciangeno en presencia de cido, se convierte en cido
cianhidrico que es muy txico.
b.- Reduccin de nitratos a nitritos: Es POSITIVA para Mtb, pero tambin para
M. kansasii, M. zsulgai y M. fortuitum.
Prueba de Virtanen:
Algunas micobacterias utilizan nitratos como fuente de nitrgeno, reemplazando a las
sales de amonio.
Sustrato: Nitrato de sodio M/100 en amortiguador de fosfatos M/45, pH 7
NaNO3 0.085 g
KH2PO4 0.117 g
Na2HPO4 12 H2O 0.485 g
gua destilada 100 mL
Los reactivos deben estar recientemente preparados y conservados en
refrigeracin en oscuridad.
Testigos:
POSITIVO: Mtb
NEGATIVO: Solo reactivos
1.- Colocar de 3 a 4 gotas de agua destilada en 3 tubos de 16 x 125 mm con tapa
de rosca.
2.- Introducir un asa bien cargada de bcilos en cada tubo y homogenizar bien.
3.- Agregar dos mL del sustrato . Agitar e incubar a 37 C durante dos horas.
4.- Agregar una gota de solucin A (HCl 1:1 Agua destilada) y agitar con la mano.
5.- Adicionar dos gotas de Sulfanilamida al 0.2 %.
6.- Aadir dos gotas de Clorhidrato de n-naftiletilendiamina al 0.1 %.
Si se desarrolla color rojo, la prueba es positiva. El color puede variar desde
rosa a rojo intenso (de 1+ a 5+). Se debe comparar el color con el tubo
testigo que es el negativo.
c.- Actividad de Catalasa: Mtb presenta TERMOLABILIDAD POSITIVA, pero
tambin ocurre en M. bovis y M. gastri.
Todas las micobacterias , excepto las mutantes isoniacida-resistentes de Mtb
M. gastri, sintetizan catalasa. En Mtb y M. bovis, la enzima es termolabil.
Prueba de la actividad de la catalasa a temperatura ambiente y a 68 C
Reactivos:
i) Solucin amortiguadora de fosfatos M/15 pH 7
solucion A: Fosfato disdico M/15. Disolver en un matraz volumtrico 9.47 g de
Na2HPO4 12 H2O en agua destilada y aforar a 1000mL.
Solucion B: Fosfato monopotsico M/15. disolver en un matraz volumtrico 9.07
g de KH2PO4 en agua destilada y aforar a 1000 mL.
Mezclar 61.1 mL de la solucin A con 38.9 mL de B y ajustar el pH.
ii) Perxido de hidrogeno al 30 %. Conservar en refrigeracin en oscuridad.
iii) Solucin acuosa de Tween 80 al 10%. Calentar ligeramente el agua para
lograr mejor disolucin. Conservar en refrigeracin.
1.- En tubos de 12x100 mL, agregar 0.5 mL de la solucin amortiguadora (pH7).
Emplear dos tubos por cada cepa.
2.- Agregar a cada uno una asada cargada de colonias. Dejar uno a temperatura
ambiente y el otro tubo en bao mara a 68 C por 20 minutos.
3.- Dejar enfriar a temperatura ambiente.
4.- Preparar (en el momento de ser usada) una mezcla 1:1 de la solucin acuosa
de Tween y perxido de hidrogeno, agregar 0.5 mL de esta solucin a cada tubo.
Testigos:
POSITIVO: Cultivo Mtb por duplicado uno a temperatura ambiente y el otro a 68 C.
Cultivo. M. fortuitum o M. phlei (son positivas a temperatura ambiente y
68 C).
NEGATIVO: Solo reactivos.
La formacin de burbujas en la superficie, se considera como resultado positivo. Si no
hay burbujas se deja en observacin durante 20 min.







ALMACENAMIENTO DE SEMILLAS DE Mtb
1.- Sembrar en medio 7H9 suplementado con OADC al 10% e incubar a 37 C de 10 a
14 das.
2.- Tomar 1 ml y medir D.O. a 600 nm, tiene que ser de 0.14 a 0.2 (factor de
conversin 1 D.O. = 1X10 clulas), los cultivos que no alcancen este valor se regresan a
incubar.
3.- Transferir a un tubo falcn 10 ml para centrifugar a 2700 rpm durante 15 min.
4.- Desechar sobrenadante, agregar 2 ml de medio, homogenizar y repartir el volumen
en 2 tubos eppendorf de 2ml tapn de rosca que contengan 200 ul de glicerol estril.
5.- Congelar a -20C durante 24 hrs, pasado este tiempo se guardan a -70 C hasta su
uso.
























DESPARAFINIZACIN DE TEJIDOS INCLUIDOS EN
PARAFINA
1.- Realizar un corte al bloque de parafina, para obtener solamente tejido, colocarlo en
una caja de Petri e incubar en horno a 80C durante 35 min.
2.-Separar el tejido de la base de parafina y colocarlo en un tubo eppendorf.
3.- Tomar 50 mg de tejido y colocarlo en un tubo limpio.
4.- Agregar 1 ml de Xileno, mezclar por inversin y vortexiar por 2 min.
5.- Centrifugar a 14000 rpm 5 min y repetir 2 veces ms, removiendo el sobrenadante
por pipeteo.
6.- Agregar 1 ml de etanol absoluto, agitar en Vortex durante 2 min.
7.- Centrifugar a 13000 rpm 5 min y retirar el sobrenadante.
8.- Agregar 1 ml de etanol 96%, agitar en Vortex durante 2 min.
9.- Centrifugar a 13000 rpm 5 min y retirar el sobrenadante.
10.- Agregar 1 ml de etanol 80%, agitar en Vortex durante 2 min.
11.- Centrifugar a 13000 rpm 5 min y retirar el sobrenadante.
12.- Agregar 1 ml de etanol 70%, agitar en Vortex durante 2 min.
13.- Centrifugar a 13000 rpm 5 min y retirar el sobrenadante.
14.- Pasar el tejido a un nuevo vial, secar en termomix por evaporacin a 37C durante
20 min.





Extraccin de DNA
A partir de cultivos de Lwenstein-Jensen con Lisozima y CTAB .
1.- Tomar con la ayuda de un aplicador de madera de 1 a 2 colonias bien crecidas de
MTB.
2.- Depositarlas en un eppendorf de 2mL que contiene 500 uL de TE 1X (10 mM Tris -
1mM EDTA, pH= 8.0).
3.- Resuspender e inactivar en bao Mara a 80 por 30 minutos.
4.- Adicionar 50 uL de Lisozima (10 mg/mL).
5.- Incubar a 37 C por 18-24 horas para lisar la pared celular.
6.- Agregar una mezcla de 70 L de SDS (10%) y 5 L de Proteinasa K (10 mg/mL).
7.- Dejar a 65 C por 15 minutos.
8.- Adicionar 100 L de NaCl 5M y 100 L de CTAB-NaCl (4.1% NaCl/ 10% CTAB) para
deshacer los complejos de lpidos y protenas.
9.- Agregar 750 L de cloroformo-alcohol isoamlico (24:1).
10.- Centrifugar a 12 000 rpm por 10 minutos (para la separacin de fases).
11.- Transferir la fase acuosa a un tubo limpio y estril.
12.- Adicionar 10 L de RNAsa e incubar por una hora a 37 C.
13.- Precipitar el DNA agregando 450 L de isopropanol.
14.- Mezclar bien e incubar por un mnimo de 2 horas a -20 C.
15.- Centrifugar a 12 000 rpm por 30 minutos.
16.- Descartar el sobrenadante.
17.- Lavar el sedimento agregando 500 L de etanol al 70 % fro.
18.- Dejar secar la pastilla a temperatura ambiente.
19.- Finalmente el DNA se resuspende en agua desionizada estril (el volumen
corresponder al tamao de la pastilla de 30 a 50 L), se deja solubilizar a 4C toda la
noche.
20.-Para confirmar la integridad del DNA correr una alcuota en un gel de agarosa al
0.8%, el resto se guarda a -20 C hasta su uso.

Extraccin con perlas
I.-A partir de cultivos Lwenstein-Jensen con fenol absoluto.
1.- Tomar con la ayuda de un aplicador de madera algunas colonias de MTB.
2.- Depositarlas en un eppendorf de 2mL que contiene 500 L de perlas de vidrio
siliconizadas y 600 L de TE 1X (10 mM Tris - 1mM EDTA, pH= 8.0).
3.- Resuspender e inactivar en bao Mara a 80 por 30 minutos.
4.- Agregar 300 L de Fenol absoluto
5.- Agitar vigorosamente en vortex durante 1 minuto
6.- Transferir la mezcla, sin perlas, a un tubo eppendorf de 1.5 mL
7.- Centrifugar a 13,000 rpm por 5 min.
8.- Recuperar la fase acuosa en otro tubo.
9.- Adicionar un volumen de fenol: cloroformo y mezclar vigorosamente,
aproximadamente15 seg.
10.- Centrifugar a 13,000 rpm durante 10 min.
11.- Recuperar el sobrenadante y adicionar un volumen de cloroformo.
12.- Mezclar vigorosamente, aproximadamente 15 seg.
13.- Centrifugar a 13,000 rpm durante 10 min.
14.- Recuperar la fase acuosa.
15.- Adicionar 220L de etanol 95 % mas 30uL acetato de sodio 3M.
16.- Mezclarlo muy bien manualmente.
17.- Precipitar a -40C durante 15 min.
18.- Centrifugar a 13,000 rpm durante 10 min.
17.- Retirar el sobrenadante con pipeta y lavar con 100 L de etanol al 70%.
18.- Centrifugar a 13,000 rpm durante 10 min.
19.- Retirar el etanol con pipeta y dejar secar.
20.- Resuspender la pastilla en 50 L de agua desionizada estril.
II.-A partir de muestras sin digestin, cultivos y tejidos con DNAzol para
diagnostico presuntivo de Tuberculosis.
Tipo de muestra:
Expectoracin directa, sedimentos, LCR (Liquido cefaloraquideo), LP (Liquido
Peritoneal), etc.
1. Preparar tubos tapn de rosca de 2mL con 300 uL de Perlas siliconizadas de
0.1mm (BSP Cat. 11079101), esterilizar y secar perfectamente.
2. Rotular 4 tubos tapn de rosca 2 mL para cada muestra, agregar 500uL de
DNAzol a c/u.
a) Tubo 1 agregar 500uL de mx.
b) Tubo2 agregar 500uL de mx y se agrega una concentracin conocida de
mycobacterias (H37Rv) previamente inactivadas a -80C, para verificar que no hay
factores de inhibicin de reaccin de PCR.
* c) Tubo 3 agrear 500uL de TE (Control negativo).
* d) Tubo 4 agrear 500uL de suspensin bacteriana de H37Rv previamente
inactivada (Control positivo).
Nota: El control positivo se procesa despus de hacer la extraccin de las muestras
para evitar contaminacin.
3. Rompimiento mecnico con vortex (velocidad mxima del vortex), 5 ciclos de 30
seg c/u con intervalos de enfriamiento de 1 min.
4. Dar un Spin con la Centrifuga a 14 000 rpm para recolectar todo el material.
5. Recuperar el sobrenadante y colocarlo en un microtubo previamente marcado.
Realizarlo con puntas de 200 evitando acarrear perlas.
6. Agregar 500 l de cloroformo-alcohol isoamlico (24-1) para generar fases.
7. Vortexiar 30 seg. Centrifugar a 13 000 rpm por 10 min.
8. Retirar fase acuosa y colocarla en un microtubo previamente marcado.
9. Luego para precipitar el DNA agregar 1 vol. de Isopropanol a cada uno de los
microtubos con los sobrenadantes recuperados (mantener en hielo seco).
10. Dejar precipitando por 1 hr a -80C.
11. Centrifugar a 14 000 rpm por 15 min a 4C (si se realiza a 13 000 rpm dejar 20
min).
12. Descartar el sobrenadante sin tocar la pastilla de DNA (Con puntas de 200).
13. Lavar la pastilla con 100l de etanol al 70% frio. Dejando caer el etanol
alrededor del microtubo.
14. Centrifugar a 14 000 rpm por 10 min (si se realiza a 13 000 rpm dejar 15 min)
15. Descartar sobrenadante con una micropipeta de 200l.
16. Dejar secar perfectamente.
17. Resuspender en 35l de agua estril, mezclar suavemente y dejar en hielo o a
4C mnimo 1 hora.

* Por cada ciclo de extraccin se llevara un control negativo y otro positivo en el que
se colocara 500 l de TE en lugar de muestra y 500 uL de suspensin bacteriana de
37Rv respectivamente.

MX DE TEJIDO:
1.- En un tubo de 2 ml con tapn de rosca colocar 300 ul de perlas de vidrio
siliconizadas.
2.- Agregar 25 mg de tejido en pequeos cortes.
3.- Agregar 500 l de DNAzol.
4.-Agitar con Mini Beed-beater durante 4 ciclos de 20 seg. Alternando cada ciclo con
enfriamiento en hielo durante 1 min.
5.- Centrifugar por un min a 14000 rpm.
6.- Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y estril.
7.- Agregar 500l de etanol absoluto y dejar precipitando durante 20 min en hielo.
8.- Centrifugar 15 min a 14000 rpm a 4C y decantar el sobrenadante.
9.-Agregar 500 l de etanol al 75%, centrifugar 10 min a 13000 rpm.
10.- Decantar y dejar secar durante 20 min a temperatura ambiente.
11.- Agregar 30 l de TE 1X a cada mx, homogenizar suavemente y dar un spin.
12.- Cuantificar en nanodrop.














Infeccin de las clulas A549.
Material
Cajas de cultivo de 25 cm
2
.
Placas de 24 pozos.
Cmara de Neubauer.
Tubo eppendorf de 1.6 ml.
Pipeta de 1000 l, 200 l y 20 l.
Perlas de cristal de 5 mm.
Medio DMEM al 5% SFB.
Medio DMEM al 1% SFB.
Medio DMEM.
Tripsina.
Azul de tripn.

Procedimiento
Crecimiento de lneas celulares.
Clulas epiteliales pertenecientes a la lnea celular A549, se cultivaran en cajas de 25
cm
2
con medio DMEM 10% de SFB. Se incubarn a 37C con 5% de CO
2
hasta alcanzar
95% de confluencia, se tripsinizaran y se contara viabilidad. Posteriormente se
colocaran 500000 clulas en cada pozo en placas de 24 pozos para su posterior
adhesin con medio DMEM al 5% SFB, se incubarn a 37C con 5% de CO
2
durante 18
horas.

Infeccin de lneas celulares A549 con las diversas cepas Mycobacterium
tuberculosis.
Los viales con la concentracin final de las diferentes cepas de Mtb (H37Rv, H37Ra,
Beijing, Beijing 4P, MDR y 5186) y la cepa de S. aureus; se centrifugaran durante 5
minutos a 5000 rpm, se les eliminara el sobrenadante y se les agregara 1mL DMEM al
1% de SFB. Se agregaran 3 perlas de cristal de 5mm, se mezclaran con vortex durante
5 min, se centrifugaran 2 min a 800 rpm. Se recolectara el sobrenadante y se pasara a
otro vial (medio infectante).
Despus, se proceder a realizar la infeccin en la lnea celular A549 como se indica
en el cuadro:
MOI Cantidad RPMI 1%SFB
(*)
Cantidad Medio infectante
(*)
Total
S. aureus 150:1 1000 l
H37Rv 5:1 1000 l
10:1 1000 l
H37Ra 5:1 1000 l
10:1 1000 l
Beijing 5:1 1000 l
10:1 1000 l
Beijing 4P 5:1 1000 l
10:1 1000 l
MDR 5:1 1000 l
10:1 1000 l
5186 5:1 1000 l
10:1 1000 l
(*) Estas columnas se completan al realizar los clculos de MOI segn la concentracin de S.
aureus o de las cepas de MB, respectivamente.

Despus de realizada la infeccin se incubaran a 37C con 5% de CO
2
durante 2 horas,
una vez transcurrido el tiempo se lava tres veces la placa con pipeta agregando 500 l
de DMEM, sin tocar el fondo del pozo; esto se realizara para remover las bacterias no
fagocitadas.
Una vez realizados los lavados se incubaran nuevamente a 37C con 5% de CO
2
hasta
dejar transcurrir los tiempos de infeccin; es decir se completen las 18 horas. Para
cada condicin se realizar lo siguientes:
Al pozo 1 y 2 se les agregara 1mL de trizol, se pasaran a tubos eppendor y se
guardaran a -20C para su posterior extraccin (continuar con protocolo de
extraccin de RNA, mediante Trizol).
Mientras que al pozo 3 y 4 de la misma condicin se proceder con la
determinacin de crecimiento intracelular KILLING.











Determinacin de crecimiento intracelular de Mtb en
clulas epiteliales A549 (Killing).

Material

Tubos de polipropileno de 14mL fondo U
Tubos de polipropileno de 50mL
Tubos de polipropileno de 5mL
Placas para cultivo de 96 pozos, fondo U.

Pipetas serolgicas de 5 y10mL


Micropipetas de volumen variable


Reactivos

Suero humano descomplementado y filtrado.
RPMI 1640
7H9 (medio liquido)
7H10 agar
Mycobacterium tuberculosis
Mtb H37Ra

Mycobacterium tuberculosis
Mtb H37Rv

Dodecil-Sulfato de Sodio (SDS)
Albmina Srica Bovina (BSA)
ADC
OADC
Glicerol
Asparagina
Agua desionizada
Gentamicina
Glutamina

Preparacin de soluciones y reactivos.

1. RPMI 10% PHS.
Agregar 5mL de suero humano descomplementado a 45mL de medio RPMI-1640
suplementado con 50 g/mL de sulfato de gentamicina y 200 mM L-glutamina.

2. RPMI 30% PHS (Mezcla para infectar).
Agregar 15mL de suero humano descomplementado a 35mL de medio RPMI-1640
suplementado con 50 g/mL de sulfato de gentamicina, 200 mM L-glutamina.

3. 7H9 medio lquido.
Mezclar en una botella de 500 mL 1.88 g de agar 7H9 en polvo, 1.6 mL de glicerol, y
400 mL de agua desionizada. Agitar.
Esterilizar en autoclave por 15 min a 121C. Enfriar a 50C aproximadamente.
Agregar 40 ml de ADC. Filtrar con membrana de 0.22 m, guardar a 4C.

4. 7H10 agar (placas para cultivo de Mtb).
497 mL de agua desionizada
11.4 g de 7H10 agar
6 mL de glicerol
2.5g de asparagina
60 mL de OADC

1. Colocar un matraz de 1000 mL que contiene 497 mL de agua desionizada en
agitacin con calor.
2. Agregar poco a poco el agar, glicerol y asparagina, disolver los reactivos hasta
que el agar tome un color verde claro opaco.
3. Poner el agar en el horno de microondas y calentar poco a poco, sin dejar que
hierva, se saca y se agita con la mano muy suavemente, este procedimiento se
repite hasta que cambie de color verde claro opaco a verde botella translcido.
Tener cuidado al sacar, el agar puede estar muy caliente y desbordarse de la
botella.
4. Hacer tapones con algodn y gasa para tapar los matraces y poner una bolsa
para esterilizar sobre la boca de los matraces. Sellar la bolsa con cinta testigo.
5. Llevar el agar al Laboratorio de Microbiologa para esterilizar, en autoclave
durante 15 min a 121 C.
6. Enfriar un poco a temperatura ambiente o con agua, aproximadamente a 40 o
50 C (no mucho porque puede empezar a gelificar).
7. Meter el matraz a la campana y destapar, agregar 60 mL de OADC filtrndolo
con jeringa y filtro de pirinola de 0.22 m. Agitar suavemente.
8. Colocar en la campana las placas petri abiertas con cuidado de mantener la
esterilidad de ellas (Guardar las bolsitas de las placas dentro de la campana
para su uso posterior).
9. Tomar el agar con pipeta de 50 mL y llenar las placas con 8 o 10 mL cada una,
dejar gelificar y enfriar en la campana aproximadamente 30 min. Tapar las
placas y apilar de 8 en 8, sellar con cinta testigo.
10. Guardar de nuevo en sus bolsitas, poner la fecha en que se hicieron. Colocar las
placas en un contenedor.
11. Para el control de contaminacin colocar todas las placas en la incubadora (del
pasillo) a 37C durante 24 horas.
12. Al da siguiente sacar, dejar enfriar a temperatura ambiente y guardar en
refrigeracin 37C.

5. Dodecil-Sulfato de Sodio (SDS) al 0.1%
Pesar 10 mg de SDS y disolver en 10 ml de agua desionizada. Hacer alcuotas de
1ml y guardar en congelacin.

6. 7H9 con Albmina Srica Bovina (BSA) al 20%
Pesar 2g de BSA y disolver en 8 ml de medio lquido 7H9. Hacer alcuotas de 1ml y
guardar en congelacin.
Procedimiento
A) Infeccin y crecimiento intracelular de Mtb EpCs in vitro.
1. Despus de lavar tres veces la placa despus de dos horas de infeccin para
remover las bacterias no internalizadas, dejar transcurrir los tiempos requeridos para
cada experimento de acuerdo al diseo y objetivos planteados (como lo indica el
protocolo de infeccin).

Nota: En los mismos tiempos se pueden recolectar los sobrenadantes de los cultivos
para la determinacin de citocinas u otras protenas de inters.

B) Obtencin de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC). (Killing)
1. Cumplido el tiempo de incubacin de acuerdo al diseo experimental, lisar las
clulas adicionando 50 l de Dodecil-Sulfato de Sodio (SDS) al 0.1% durante 10 min a
temperatura ambiente.

2. Neutralizar la accin del SDS adicionando 50 l medio 7H9 con Albmina Srica
Bovina (BSA) al 20%.

3. De las bacterias obtenidas en la lisis celular, hacer 4 diluciones seriales (1:10) para
cada condicin de la siguiente manera:

a) Preparar 4 tubos de polipropileno o eppendorf de 1.5 mL con 900 l de medio 7H9
por cada pozo de la placa de cultivo. Marcar como tubo 1, 2, 3 y 4.
b) Tomar los 100 l de cada pozo y aadirlos al tubo 1.
c) Mezclar bien en vrtex, tomar 100 l y transferirlos al tubo 2 y as sucesivamente
hasta el tubo 4.

4. Tomar 10 l de cada dilucin y sembrar por triplicado en cajas Petri con agar 7H10
Middlebrook.

5. Incubar 21 das a 37C en 5% CO
2
.

6. Sacar las placas de la incubadora y contar las colonias con lupa. Promediar el nmero
de colonias contadas en los triplicados de la dilucin que lo permita.

7. Multiplicar el promedio de colonias X la dilucin X 100 (microlitros ajustados a ml).
Los resultados se reportan en Unidades Formadoras de Colonias/ml.














Extraccin de RNA de Mycobacterium tuberculosis,
mediante Trizol.

Material:
Viales de Mtb.
Tubo eppendorf de 1.6 ml y 0.6 ml.
Pipeta 1000 l, 200 l.
Puntas estriles.
Gasas.
Guantes.
Vortex.
Hielo seco.

Procedimiento.
1. Encender la campana de flujo laminar 15 min antes de comenzar a
trabajar.
2. Colocar un campo en el rea donde se trabajar.
3. Colocar dentro de la campana el material apropiadamente limpio.
4. A partir del vial de Mtb se colocaron 200 l del cultivo en un tubo
eppendorf de 1.6 ml,
5. Posteriormente se centrifuga durante 5 min a 14000 rpm.
6. Se pipetea el sobrenadante y se procesa inmediatamente para RNA.
7. Agregar 400 l de Trizol por cada 200 l de Mtb.
(Los pasos siguientes se pueden realizar fuera del cuarto de contencin).
8. Homogenizar en vortex y mantener durante 5 min a temperatura
ambiente.
9. Agregar 40 l de mezclar cloroformo-alcohol isoamlico (49:1) y
homogenizar en vortex.
10. Centrifugar 15 min a 14000rpm a 4C.
11. Transferir la fase acuosa a otro tubo eppendorf de 0.6 ml, se recupera
aproximadamente 400ul.
12. Agregar 100 l de isopropanol fro, mezclar y dejar 30 min a -70C (30
min en hielo seco).
13. Centrifugar 10min a 14000 rpm a 4C.
14. Eliminar el sobrenadante y lavar el RNA precipitado con 150 l de etanol
fro al 75%. Mezclar por inmersin.
15. Centrifugar 10min a 14000 rpm a 4C.
16. Dejar secar el RNA a -65C.
17. Resuspenderlo en agua de DEPC.

















Obtencin de extracto proteco de Mycobacterium
tuberculosis

1. Preparacin del medio PBY.
Material

-Mycobacterium tuberculosis H
37
Ra ATCC #25177 y/o Mycobacterium
tuberculosis
H
37
Rv ATCC # 25618
-Mdio de Voges-Proskawer-Beck modificado por Youmans (PBY)

MEDIO PBY
Composicin:

Asparagina 37.8 mM, (Difco cat.No 0144-17-8)...............................
................................. 5 g
Fosfato monobsico de potasio KH
2
PO
4
22.04mM (Baker Mexico Cat.
3246).............. 5 g
Sulfato de potasio K
3
SO
4
2.8mM (Baker Mex Cat. 3278) ...........................................
0.5 g
Citrato de sdio.2H
2
O 2.3mM (Baker Mex. Cat 3646-01)
.......................................0.68 g
Cloruro de Magnsio 6H
2
O 1.5 mM (Baker Mex. Cat 5833).........................................
0.302 g
Glycerol 684mM (Baker Mex. Cat. 2136-02)
...............................................................50 ml

Pesar las cantidades indicadas. Disolver en 750 ml de agua desionizada,
Ajustar el pH a 6.8. Aforar a 1 litro.
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 10 Lb.
Poner en estufa a 37C por 24 hr. Para control de esterilidad
Guardar en refrigerador a 4C si no se utiliza inmediatamente.

*De 100 ml de PBY se obtienen aproximadamente 0.4 g de bacterias.
2. Siembra de M.Tuberculosis en medio PBY.
Material:
-Viales de MTB H
37
Ra Stock 1 se encuentra el ultracongelador # 2
-Matraces Erlenmeyer de 2 L Estriles y con tapn de gasa, cubiertas con papel
aluminio.
Nota: Los matraces y frascos no se deben lavar con detergente, uso exclusivo para
cultivo de MTB.
-Medio PBY Estril
-Pipetas estriles, guantes, campo de trabajo
-Estufa a 37C
-Campana de Flujo Laminar.
Nota: Se debe trabajar bajo condiciones de seguridad nivel 3.

Procedimiento

1.- Encender la campana de flujo laminar (motor y UV) 15 minutos antes de
comenzar a trabajar
2.- Colocar un campo (azul, por el lado del material absorberte) en el rea donde se
trabajar
3.- Colocar el material, frascos, pipetas, y rotular apropiadamente.
4.- Vestir, bata azul, careta, (cepa H
37
RV), doble par de guantes, tener listo alcohol,
cloro y gasas.
5.- En cada matraz se pondrn 700 ml de medio PBY
6.- Se utilizara un vial de MTB de aproximadamente 1x10
8
/ml por frasco de medio.
7.- El vial de MTB se agita con vortex para disgregar las bacterias.
8.- Con una pipeta se toman las bacterias y se depositan lentamente en las
paredes del matraz con PBY, de tal manera que queden la mayora pegadas al vidrio.
Se tapa el matraz y se lleva con mucho cuidado a la estufa de 37C.
NOTA: Evitar que las bacterias se vayan al fondo del matraz.
9.- Al colocar el matraz en la estufa se inclina para permitir que las bacterias se
incorporen a la superficie del medio.
10.- Incubar: 21 das. Checar cada tercer da el crecimiento micobacteriano, en
caso de sospecha de contaminacin realizar un frotis.







3. Obtencin de Mtb stock de trabajo.
Material

- Equipo de filtracin estril (matraz para vaco y filtro de vidrio)
Guardadas en cajones laboratorio 2
- Filtros estriles de papel: pre-
(Esterilizarlos individualmente previo a la cosecha, envueltos en papel aluminio)
- PMSF (Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride) 20 mg/ml de etanol* (inhibidor
enzimtico)
Sigma Cat.P-7626, se localiza en cuarto de balanza

Crecimiento de MTB sobre la
superficie del medio
Masa bacteriana MTB
Extracto soluble de MTB

- Sulfato de amonio (NH
4
)
2
SO4 JT Baker Cat. 0793 en cuarto de balanzas
- Medio PBY
- PBS Cambrex, Cat. 17-516Q
- Tubos de 50 ml Falcon 2070
*Llevar con mucho cuidado los matraces a la campana para no romper el crecimiento
de la Mycobacteria de la superficie y se vaya al fondo.

Procedimiento
Condiciones de Seguridad nivel 2 3 para H37RV

1.- Poner un campo azul sobre el rea de trabajo.
2.- Meter el equipo de filtracin y montarlo adecuadamente al vaco. (Colocar como
primer filtro el pre-filtro al equipo.)
3.- Colocar los matraces de los cultivos con cuidado dentro de la campana de flujo
laminar.
4.- Proceder a verter con mucho cuidado el contenido lquido del cultivo de MTB,
haciendo a un lado la masa bacteriana formada en la superficie.
5.- Recuperar la masa bacteriana (MTb), agregando un poco de medio PBY y
guardar en tubos de 50 ml. Rotularlos y sellar con papel parafilm. Guardar a -20C
6.- El liquido filtrado (Extracto soluble de MTB) se pasa a travs de una membrana
de 0.22m (equipo de filtracin).
7.- Agregar PMSF [20 mg/ml], 5l por de ml filtrado. (Para inhibicin enzimtica)
8.- Para precipitar las protenas del extracto soluble de MTB se agrega sulfato de
amonio 40 g/100 ml de extracto (Esto se puede hacer en un vaso de precipitado de
2 L y se coloca un agitador magntico (mosca). Colocar sobre una plancha de
agitacin y llevarlo al cuarto fro (4C). Dejar hasta precipitacin completa de
protenas**. (Overnight).











4. Dilisis de protenas utilizando membranas de celulosa.
Material:
- Spectra/Por 2 Membrane, MWCO 12-14000 cat.132676 en cajn del cuarto de
balanzas
*utilizar el tamao que convenga
- Cordel o hilo
- PBS 10X y realizar dilucin 1X
- Agua caliente
- Pipetas 10 y 50ml
- Vaso de precipitado de 2L

Procedimiento:
Preparacin de las membranas de dilisis (TUBOS)
Nota: Usar guantes para manipular las membranas de celulosa.
1.- Cortar membranas de 30 cm de largo aproximadamente.
2.- Remojar las membranas en agua caliente por 5 min. Para que se suavicen y poder
manipular.
3.- Sellar un extremo de la membrana con cordel o hilo.
4.- Verificar con agua estril, que no haya fuga. Desechar el agua.
5.- Introducir con la ayuda de una pipeta el extracto soluble precipitado
6.- Sellar fuertemente el otro extremo de la membrana con cordel.
7.- Introducir las membranas (tubos) en una solucin de PBS a 4oC y con agitacin
(realizar en el cuarto frio).
8.- Cambiar el PBS 1X por lo menos 3 veces durante el periodo de Dializado (24 h
aproxr)
en este procedimiento las membranas tubos aumentaran su tamao.


5. Concentracin de protenas.

1.- Detener la dilisis y concentrar por deshidratacin en el cuarto frio.
2.- La concentracin de protenas en los tubos se vigilar las siguientes 72 hrs.
3.- Su volumen ir disminuyendo aproximadamente a la mitad de su tamao inicial.
4.- Una vez terminada la concentracin, se desmontan los tubos y se procede a
realizar alcuotas del concentrado (500l c/u) y se guardar en una caja
debidamente rotulada, para almacenarse a -20C.

Posteriormente se determinara la concentracin de protenas por el
mtodo de Lowry y se realizaran Electroforesis y transferencia en caso
de as requerirse.








6. Determinacin de protenas por el mtodo de Lowry.

Reactivos:
-Carbonato de sdio Na
2
CO
3
( JT Baker Cat. 3602 em cuarto de balanzas)
-Hidrxido de sodio NaOH ( Merck Cat. 50257 r en cuarto de balanzas )
-Tartrato de sdio Na
2
C
4
H
4
O
6
.2H
2
O ( JT Baker Cat. 3930 en cuarto de balanzas )
-Sulfato cprico CuSO
4
(JT Baker Cat. 1841 en cuarto de balanzas )
-Reactivo de Fenol Folin Ciocalteu (Sigma, en gaveta amarilla )
-BSA (Albmina Srica Bovina) ( Calbiochem, Cat.126593 en Refri 2)
-Solucin de carbonato de sodio Na
2
CO
3
al 2% en NaOH 0.1N

-Solucin A: 50 ml de la solucin de Na
2
CO
3
al 2% en NaOH 0.1N .5ml
0.5ml de tartrato de sodio al 2%(solucin acuosa) 50
ul
0.5ml de sulfato cuprico CuSO
4
al 1% (solucin acuosa) 50
ul

-Solucin B: Reactivo de Fenol Folin-Ciacolteu diluido 1:2 en agua
destilada.
Nota: Solucin A y Solucin B se preparan en el momento,

-Solucin estndar de protenas 0.1 mg/ml (BSA)
Pesar 1 mg de BSA y disolver en 10 ml de agua destilada (dejar reposar hasta que
se
disuelva sola para que no haga espuma )

NaOH 0.1 N
PM de NaOH = 40 gr/mol
0.1N= 4 gr de NaOH en 1 L de agua desionizada

Na
2
CO
3
al 2% en NaOH
Preparar 100 ml
Pesar 2 gr de Na
2
CO
3
y disolver en 100 ml de NaOH 0.1N

*guardar en refrigerador 4C

Tartrato de Sodio al 2%
Pesar 0.2 gr de tartrato de sodio y disolver en 10 ml de agua destilada.
*guardar en refrigerador 4C cubiertos con papel aluminio y rotulados

Sulfato cprico CuSO
4
al 1%
Pesar 0.1 gr de sulfato cprico y disolver en 10 ml de agua destilada
*guardar en refrigerador 4C cubiertos con papel aluminio y rotulados








CURVA
Columna 1 y 2 ocuparan la curva (duplicado)


Conc.
g/ml
BSA
0.1mg/ml
l
H
2
O
(l)
Sol.A
(l)
m
e
z
c
l
a
r

y

r
e
p
o
s
a
r

10 min
Sol.B
(l)
m
e
z
c
l
a
r

y

r
e
p
o
s
a
r

30 min a
2 hr
0 0 25 75 7.5
20 5 20 75 7.5
40 10 15 75 7.5
60 15 10 75 7.5
80 20 5 75 7.5
100 25 0 75 7.5
muestra 25 0 75 75

Leer a 500nm (492 en el lector de ELISA)
Blanco A1






CURVA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12




TRATAMIENTO Y DISCUSIN DE LOS RESULTADOS

1.-Obtener la curva de calibrado representando en ordenadas las absorbancias de
los tubos frente a la concentracin (o cantidad) de protena en cada tubo, que
previamente se calcula a partir de los datos de la tabla.

2.- Determinar la concentracin de protenas en la muestra problema,
expresando el resultado en mg/ml (tener en cuenta las dilucio
nes realizadas).
A 0 0
B 20 20
C 40 40
D 60 60 M U E S T R A S
E 80 80
F 100 100
G
H