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Microbiological Issues in Process Equipment Cleaning Validation

Problemas microbiolgicos en la validacin de limpieza de equipos de
proceso.
Part I: Basic Issues
Parte I: Problemas bsicos
Destin LeBlanc
Cleaning Validation Technologies

Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter Vol. 15 (10)
http://www.microbiologyforum.org/PMFNews/PMFNews.15.10.0910.pdf


About the Author
Destin LeBlanc has over 25 years of Technical Service and Product
Development experience in specialty chemicals and medical technologies, the
last ten of which have been involved with various aspects of cleaning and
cleaning validation in pharmaceutical and medical device manufacturing. These
include years with STERIS Corporation at their Cleaning and Microbial Control
Technology Center in St. Louis, and with Calgon Vestal as part of Merck & Co.,
Inc. and then as part of Bristol-Myers Squibb. At the end of 2000 he took early
retirement to go into full time consulting as Cleaning Validation Technologies.
Acerca del Autor
Destin LeBlanc tiene cerca de 25 aos de experiencia en Servicio Tcnico y
desarrollo de productos en especialidad qumica y tecnologa mdica, de los
cuales los ltimos diez se ha involucrado con varios aspectos de limpieza y
validacin de limpieza en la manufactura de farmacuticosy dispositivos
mdicos. Estos incluyen aos con STERIS Corporation y su centro de
Tecnologa de limpieza y control microbiolgico. En St. Louis, y con Calgon
Vestal como parte de Merck & Co., Inc. Y despus como parte de Bristol Myers
Squibb. A fines del 2000 el tom la jubilicacin anticipada para irse de tiempo
completo a consulta como Cleaning Validation Technologies.

Since 1990, he has specialized in pharmaceutical cleaning validation, and has
written and lectured internationally on cleaning validation, both as part of
technical symposia as well as on-site company training. He has worked with
both large and small pharmaceutical companies on various aspects of cleaning
and cleaning validation.
Desde 1990, se ha especializado en validacin de limpieza farmacutica y ha
escrito y ledo internacionalmente sobre validacin de limpieza, ya sea como
parte de simposium tcnicos o como entrenamiento en sitio en empresas. Ha
trabajado con empresas farmacuticas grandes y pequeas sobre varios
aspectos de limpieza y validacin de limpieza.

2

He brings a unique perspective because of his expertise in effective design of
cleaning processes as well as validation of those processes.
El tiene una perspectiva nica debido a su experiencia en diseo efectivo de
procesos de limpieza as como la validacin de esos procesos.


The focus of this article is on microbial issues for the cleaning of process
equipment productcontact surfaces. This emphasis is distinct from cleaning
and related validation activities that are done for cleanroom surfaces. Each of
these areas (cleaning of process equipment and cleaning of cleanroom
surfaces) has a distinct technical and regulatory focus, even though both are
concerned ultimately about the same things protecting the safety, efficacy,
and quality of manufactured drug products. Furthermore, while microbiological
concerns may extend to endotoxins, molds, yeasts, viruses and prions, the
focus of this discussion will be on bacteria.
El enfoque de este artculo es sobre los problemas microbiolgicos para la
limpieza de la superficie en contacto con el producto de los equipos de
proceso. Este nfasis es distinto de la limpieza y actividades relacionadas a la
validacin que se hacen para superficies de cuartos limpios. Cada una de esas
reas (limpieza de los equipos de proceso y limpieza de las superficies de
cuartos limpios) tienen un enfoque regulatorio y tcnico distinto, aunque ambos
a final de cuentas se refieren a la misma cosa proteger la seguridad, eficacia
y calidad de los medicamentos fabricados. Por otra parte, mientras que las
preocupaciones microbiolgicas se pueden extender a endotoxinas, hongos,
levaduras, virus y priones, el enfoque de esta discusin ser sobre bacterias.


Regulatory basis
While process equipment cleaning validation (which I will just call cleaning
validation) is not specifically mentioned in the FDAs written GMPs, since the
early 1990s it has been considered a necessary consequence of what is given
in CFR part 211.67. (1) The rationale has probably been How can cleaning
processes be considered adequate unless they are validated (or continually
verified)? Cleaning validation has traditionally focused on the three PQ
(Process Qualification) runs that are performed as a protocol. (2, 3) With the
recent FDA process validation draft guidance, the definition of process
validation (and presumably cleaning validation) is expanding to also include
design and development of the cleaning process as well as maintenance of the
validated state after completion of the PQ runs. (4)
Bases regulatorias
Si bien la validacin de limpieza de los equipos de proceso (lo cual llamar
validacin de limpieza) no se menciona especficamente en las GMPs
escritas de la FDA, desde 1990 se ha considerado como una consecuencia
necesaria de lo que se dice en el CFR parte 211.67 (1). La razn
probablemente ha sido Cmo puede un proceso de limpieza considerarse
adecuado a menos que est validado (o continumanete verificado)? La
validacin de limpieza tradicionalmente se ha enfocado sobre las tres corridas
PQ (Calificacin del proceso) que se realizan como un protocolo (2, 3). Con el
reciente borrador de validacin de proceso de la FDA, la definicin de
validacin de proceso (y presumiblemente validacin de limpieza) se expande
3

para tambin incluir diseo y desarrollo de los procesos de limpieza as como
tambin el mantenimiento del estado validado despus completar las corridas
PQ (4).

Microbial issues for cleaning validation were not necessarily emphasized in the
beginning. In fact the earliest guidance document (the 1993 FDA guidance)
states that the guide is intended to cover equipment cleaning for chemical
residues only. (5) That said, in the same document microbiological aspects are
discussed in terms related to the clean hold time, in that There should be some
evidence that routine cleaning and storage of equipment does not allow
microbial proliferation. In the PIC/S guidance issued later, there are explicit
statements that control of potential microbial contaminants is a part of cleaning
validation. (6) However, that document also focuses on microbial issues related
to the clean hold time. In any case, both for sterile and non-sterile drug
manufacture, addressing the issue of control of bioburden by the cleaning and
storage procedures has become a standard expectation for a cleaning
validation program.
Los problemas microbiolgicos para validacin de limpieza no necesariamente
se enfatizaron en el principio. De hecho, en los primeros documentos (la gua
de 1993 de la FDA) declara que la gua est destinada a cubrir la limpieza de
equipo para residuos qumicos solamente (5). Dicho esto, en el mismo
documento los aspectos microbiolgicos se discuten en trminos relacionados
a el clean hold time, en que Debe haber alguna evidencia de que la ruitna de
limpieza y almacenamiento de equipo no permite la proliferacin microbiana.
En la gua PIC/S emitida despus, hay declaraciones explcitas de que el
control de posibles contaminantes microbianos es parte de una validacin de
limpieza (6). Sin embargo, este documento tambin se enfoca en problemas
microbiolgicos relacionados al clean hold time. En cualquier caso, ya sea
fabricacin etril o no estril, el abordar los problemas de control de la carga
microbiana mediante los procedimientos de la limpieza y almacenamiento ha
llegado a ser una expectativa estndar para un programa de validacin de
limpieza.


Control measures
Control measures for bioburden in a manufactured product may include the
following:
Medidas de control
Las medidas de control para la carga microbiana en un producto fabricado
puede incluir lo siguiente:

Limiting bioburden in raw materials
- Limitar la carga microbiana en materias primas

Limiting bioburden in packaging components
- Limitar la carga microbiana en materiales de empaque

Limiting bioburden in the manufacturing environment
- Limitar la carga microbiana en el medio ambiente de fabricacin

4

Limiting bioburden on manufacturing equipment product-contact surfaces
- Limitar la carga microbiana sobre las superficies en contacto con el
producto del equipo.


It is the latter that is the focus of cleaning validation.
En esto ltimo se enfoca la validacin de limpieza.

Basic ways of controlling bioburden on equipment surfaces include the cleaning
process itself, a separate sanitizing step after the cleaning process, drying of
the equipment following cleaning, and storage of equipment so as not to allow
recontamination with bioburden.
Las formas bsicas de controlar la carga microbiana sobre la superficie de los
equipos incluye el proceso de limpieza en si mismo, un paso por separado de
sanitizacin despus del proceso de limpieza, secado del equipo limpio, y
almacenamiento de equipo de tal forma que no permita la recontaminacin con
carga microbiana.

How can the cleaning process itself be related to microbial control? Many of the
factors in a typical cleaning process are factors that are hostile to survival of
microorganisms. Those factors include a high temperature (60C) and pH
extremes (Ph 11.5). Some cleaning procedures involve the use of sodium
hypochlorite which, in addition to oxidation of soils to produce smaller, more
wter soluble residues, is also a well know biocide. In addition, good cleaning
involving surfactants can assist in the physical removal of bacteria, including
bacterial spores, from equipment surfaces. An effective cleaning process also
reduces potential nutrients, which if left on surfaces following cleaning, can lead
to more significant bioburden proliferation if equipment is stored in a wet state.
Cmo puede el proceso de limpieza por si mismo relacionarse al control
microbiolgico? Muchos de los factores en un proceso de limpieza tpico son
factores que son hostiles para la sobrevivencia de los microorganismos. Esos
factores incluyen alta temperatura (> 60C) y pH extremos (pH > 11.5). Algunos
procedimientos de limpieza involucran el uso de hipoclorito el cual en adicin a
la oxidacin de la suciedad para producir residuos ms pequeos y solubles en
agua, es tambin un buen conocido biocida. Adems, una buena limpieza
involucra surfactantes que pueden ayudar en la remocin fsica de bacterias,
incluyendo esporas, de la superficie de los equipos. Un proceso de limpieza
efectivo tambin reduce nutrientes potenciales, los cuales dejados en la
superficie limpia puede conducir a la proliferacin de carga microbiana si el
equipo se almacena hmedo.

Separate sanitizing steps following the cleaning process are not very common
in equipment cleaning processes, particularly if the cleaning process involves
cleaning with hot, aqueous alkaline cleaning solutions. Remember that sterility
is not expected, because a typical final rinse will involve either purified water or
WFI, neither of which is sterile. The need for a separate sanitizing step can be
evaluated during the design/development phase of the cleaning validation
process. Even if there is adequate control by the cleaning process itself, a
separate sanitizing step may be used as part of a belt and suspenders
approach. However, if the sanitizer has nonvolatile components, then a rinse
5

may be required following its use, and testing for residues of that sanitizer may
be appropriate. Separate sanitizer steps are more common in situations where
the cleaning process involves a neutral pH cleaner at ambient temperature,
particularly for manual cleaning of disassembled parts. In such cases the most
common sanitizer used is 70% isopropanol (IPA). One additional advantage of
IPA as a sanitizer (in addition to reducing bioburden) is that it also serves as a
final polishing rinse to further reduce residues of drug product. A second
additional advantage is that the IPA application may serve to dry the equipment,
which reduces the possibility of bioburden proliferation on storage of cleaned
equipment.
Los pasos por separado de la sanitizacin despus del proceso de limpieza no
son muy comunes en los procesos de limpieza de los equipos, particularmente
si el proceso de limpieza involucra limpieza con agua caliente, soluciones
acuosas de limpieza alcalinas. Recuerde que que no se espera esterilidad,
debido a que el tpico enjuague final involucrar agua purificada o WFI, de las
cuales ninguna es estril. La necesidad para un paso por separado de la
sanitizacin puede evaluarse durante la fase de diseo/desarrollo del proceso
de validacin de limpieza. An si hay controles adecuados mediante el mismo
proceso de limpieza, un paso por separado de sanitizacin puede usarse como
parte de un enfoque cinturn y tirantes. Sin embargo, si el sanitizante tiene
componentes no voltiles, entonces puede requerirse un enjuague despus de
su uso, y pruebas para residuos de que el sanitizante puede ser apropiado. Los
pasos por separado de la sanitizacin son ms comunes en situaciones donde
los procesos de limpieza involucran limpiadores de pH neutros a temperatura
ambiente, particularmente para limpieza manual de partes desensambladas. En
tales casos el sanitizante ms comn usado es isopropanol al 70% (IPA). Una
ventaja adicional del IPA como un sanitizante (adems de reducir la carga
microbiana) es que tambin sirve como un enjuague pulidor final para reducir
an ms los residuos del medicamento. Una segunda ventaja adicional es que
la aplicacin del IPA puede servir para secar el equipo, lo cual reduce la
posibilidad de la proliferacin de la carga microbiana en el almacenamiento del
equipo limpio.


Setting limits
A key point in any cleaning validation program is to set appropriate limits for
bioburden for the cleaning process. How limits are set for residues of active
ingredients and cleaning agents is fairly well established. (7, 8) Those same
carryover principles can be used to establish acceptance criteria for bioburden
in a cleaning validation protocol. (9) That type of calculation involves input data
on the bioburden limit in the next manufactured product, the batch size of the
next manufactured product, and the shared product contact surface area. This
will result in a limit expressed as CFU/cm2. However, an additional factor
should be added to further reduce the calculated surface limit because only part
of the bioburden in the next product will come from cleaned equipment surfaces
(other sources of bioburden in the next manufactured product include the
bioburden of the raw materials, for example). A typical factor for most situations
where the raw materials are not of natural origin is 0.1 (one-tenth).
Estableciendo lmites
6

Un punto clave en cualquier programa de validacin de limpieza es establecer
lmites apropiados para la carga microbiana en el proceso de limpieza. El como
se establecen los lmites para residuos de ingredientes activos y agentes de
limpieza est bien establecido (7, 8). Esos mismos principios de remanente
pueden usarse para establecer el criterio de aceptacin para la carga
microbiana en un protocolo de validacin de limpieza (9). Ese tipo de clculos
involucra datos obtenidos sobre el lmite de la carga microbiana paras el
siguiente producto fabricado, y la superficie compartida en contacto con el
producto. Esto resultar en un lmite expresado como UFC/cm. Sin embargo,
se debe sumarr un factor adicional para adems reducir el lmite de la
superficie calculada debido a que solo parte de la carga microbiana en el
siguiente producto vendr de la superficie del equipo limpiado (otras fuentes de
carga microbiana en el siguiente producto incluye la carga microbiana de las
materias primas , por ejemplo). Un factor tpico para muchas situaciones donde
la materia prima no son de origen natural es 0.1 (una dcima).

When such carryover calculations are done, the result is usually a value 50
CFU/cm
2
(or 1250 CFU per contact plate area of 25 cm2). Such a level is
considerably above what can be accurately enumerated for that surface area.
Such a level is also considerably below what can be achieved in a relatively well
designed cleaning process involving cleaning use of hot alkaline cleaning
solutions. For that reason, most companies will set limits considerably lower
than what a carryover calculation would allow. Limit values of 1 or 2 CFU/cm
2

(25 CFU/ 25cm
2
to 50 CFU/25 cm
2
) are typically used for surface sampling. (10,
11, 12) Limits set that way are typically specified in a companys cleaning
validation master plan as industry standard practice.
Cuando se realizan tales clculos para el remanente, el resultado usualmente
es un valor >50 UFC/cm (o > 1250 UFC/por plato de contacto con un rea de
25 cm). Tal nivel se considera superior de lo que se puede enumerar
exactamente para esta rea superficial. Tal nivel tambin se considera por
debajo de lo que se puede realizar en un proceso de limpieza relativamente
bien diseado involucrando el uso de soluciones de limpieza alcalinas y
calientes. Por esta razn, muchas compaas establecern lmites
considerablemente ms bajos de lo que el clculo para el remanente permitira.
Los valores lmites de 1 o 2 UFC/cm (25 UFC/25cm a 50 UFC/25 cm) son
usados tpicamente para muestreo de superficies (10, 11, 12). Los lmites se
establecen de tal forma que son especificados tpicamente en en los planes
maestros de validacin de compaas como prcticas estndar de la industria.

For rinse sampling (as in a CIP rinse), a carryover calculation can also be done.
These calculations generally result in values significantly above values typically
used for Purified Water (PW) - 100 CFU/mL. Therefore, companies involved in
non-sterile manufacture will typically establish rinse limits at that level.
Para muestreo por enjuague (como un enjuague CIP), se puede realizar
tambin un cclulo para el remanente. Estos clculos generalmente resultan en
valores significativamente arriba de los usados para agua purificada 100
UFC/mL. Por lo tanto, las compaas involucradas en fabricacin no estril
establecern tpicamente niveles a ese nivel.

7

How are limits for sterile manufacturing different? If we focus on aseptic
processing, where much of the equipment is steamed-in-place (SIPed), one
might argue that the level of bioburden left after cleaning is not relevant; the
steaming process is validated to handle a significantly larger number of
microorganisms, including bacterial spores (not likely to be present following
water processing).
Cmo son de diferentes los lmites para la fabricacin de estriles? Si nos
centramos en el proceso aseptico, donde mucho del equipo es vaporizado en
sitio (SIPed) uno puede argumentar que el nivel de la carga microbiana dejada
despus de la limpieza no es relevante, el proceso de vaporizacin es validado
para manejar un gran nmero de microorganismos, incluyendo esporas
bacterianas (no como las que se presentan en el proceso del agua).

While the rationale for this argument can be appreciated, as a practical matter
most companies in aseptic processing will set limits similar to how they are set
in non-sterile manufacturing. One reason for this approach is that those levels
of 1-2 CFU/cm
2
are readily achievable, and gross bioburden levels would not be
consistent with cGMPs. A second reason is that if the bioburden is a gram
negative, an SIP process may adequately deal with the bioburden, but not the
endotoxin which is released as a consequence of cell wall disruption. Therefore,
companies involved in aseptic processing will actually set surface sampling
bioburden limits (after cleaning but before a SIP process) at the same level (or
even slightly higher) as is done for non-sterile manufacturing because of the
subsequent SIP process.
Si bien la justificacin de este argumento se puede apreciar, en la prctica la
mayora de las empresas en el proceso asptico establecern lmites similares
a como ellos los establecieron en la fabricacin de no estriles. Una razn para
este enfoque es que los niveles de 1-2 UFC/cm son fcilmente realizables y el
grueso de la carga microbiana no sera consistente con las cGMPs. Una
segunda razn es que si la carga microbiana es un gram negativo, un proceso
SIP puede ser adecuado para la carga microbiana, pero no para las
endotoxinas las cuales se liberan como consecuencia del rompimiento de la
pared celular. Por lo tanto, las empresas dedicadas en el proceso aseptico
estableceran lmites de carga microbiana en la superficie de muestreo
(despus de la limpieza pero no antes del proceso SIP) al mismo nivel (o an
ligeramente ms alto) como se hace para la fabricacin de no estriles debido
al siguiente proceso SIP.

For rinse samples, companies involved in aseptic processing could conceivably
set rinse limits at the WFI limits (10 CFU/100 mL) because the final rinse
usually involves a WFI rinse. A rationale for not doing this is that the WFI limit is
the limit for the water in the recirculating WFI loop. As soon as it is removed
from that loop and passed through equipment, there is not necessarily an
expectation that it maintains that value. For this reason, some companies will
set rinse limits at a value intermdiate between the PW and WFI values, such
as 100 CFU/100 mL or 1000 CFU/100 mL. Again, bioburden at these levels is
readily dealt with by typical SIP processes.
Para las muestras de enjuague, las empresas involucradas en el proceso
aseptico posiblemente podran establecer lmites de enjuague en los lmites del
WFI (10 UFC/100 mL) debido a que el enjuague final usualmente involucra un
8

enjuague con WFI. Una razn para no hacer esto es que el lmite de WFI es el
lmite para el agua en el loop de recirculacin de WFI. Tan pronto como esta se
remueve de este loop y a pasa a travs del equipo, no hay necesidad de
esperar que se mantenga este valor. Por esta razn, algunas compaas
establecern lmites de enjuague en un valor intermedio entre los valores del
PW y el WFI tales como 100 UFC/100 mL o 1000 UFC/100 mL. Otra vez, la
carga microbiana a esos niveles es fcilmente tratable con los procesos tpicos
de SIP.

Some microbiologists with cleanroom experience might view these limits as
extremely high. Values such as 25 or 50 CFU per 25 cm2 are well above action
or alert levels typically set for cleanroom surfaces. So, shouldnt bioburden on
equipment product-contact surfaces be more stringent than on cleanroom
surfaces, which are not direct productcontact surfaces? One reason such a
comparison is not valid is that values for process equipment cleaning validation
protocol are true limits; if exceeded, the cleaning process fails, and equipment
so cleaned should not be used for GMP manufacturing.
Algunos microbilogos con experiencia en cuartos limpios pueden ver este
lmite como extremadamente alto. Los valores tales como 25 o 50 UFC/ 25cm
estn por arriba de los niveles de aleta tpicamente establecidos para
superficies de cuartos limpios. Por lo tanto, no debera la carga microbiana en
la superficie en contacto con el producto ser ms extrica que en las superficies,
las cuales no son superficies en contacto directo con el producto? Una razn
de que tal comparacin no es vlida es que los valores en el protocolo para la
validacin de limpieza de los equipos de proceso son lmites verdaderos; si son
excedidos, el proceso de limpieza falla, y el equipo as limpiado no debe usarse
para faricacin GMP.

The values used for cleanroom environmental monitoring are action levels or
alert levels.
Los valores usados para el monitoreo ambiental de cuartos limpios son niveles
de accin o niveles de alerta.

If exceeded, an investigation is done to find out what the effect on manufactured
product is. Exceeding an action or alert level is not necessarily a failure. A
second reason is that the analysis is comparing two different things. Since
cleanrooms are typically associated with aseptic manufacture, a more valid
comparison is the bioburden level on the product contact surfaces after the SIP
process, not the bioburden after the cleaning process. When focusing on
aseptic processing involving a SIP process for the equipment, then it is truly the
case that the bioburden on the equipment product contact surfaces is held to a
more stringent criterion than bioburden on non-product-contact environmental
surfaces.
Si se exceden, se realiza una investigacin para encontrar cual es el efecto
sobre el producto fabricado. El exceder un nivel de accin o alerta no
necesariamente es una falla. Una segunda razn es que el anlisis compara
dos diferentes cosas. Ya que los cuartos limpios son tpicamente asociados con
fabricacin aseptica, una comparacin ms vlida es el nivel de carga
microbiana sobre la superficie en contacto con el producto despus del proceso
SIP, no la carga microbiana despus del proceso de limpieza. Cuando nos
9

centramos sobre procesos aseptciso involucrando un proceso SIP para el
equipo, entonces esto es cierto el caso de que la carga microbiana sobre la
superficie en contacto con el producto del equipo se mantiene a un criterio ms
estricto que la carga microbiana sobre las superficies del ambiente que no
estn en contacto con el producto.


Objectionable organisms
An additional criterion for bioburden control in process equipment cleaning
validation is the absence of objectionable organisms. The FDA (13) has listed
factors that determine whether an organism is objectionable. Those factors
include the species, the number (level), the dosage form, intended use, patient
population, and route of administration.
Organismos Objetables
Un criterio adicional para el control de carga microbiana en la validacin de
limpieza del equipo de proceso es la ausencia de organismos objetables. La
FDA (13) ha enlistado factores que determinan si un organismo es objetable.
Esos factores incluyen especies, el nmero (nivel), la forma de dosis, uso
entendido pacientes y ruta de administracin.

Objectionable criteria include effects on patient safety, but may also include
effects on product stability, container/closure integrity, and bioavailability of the
active ingredient. The criteria for what is objectionable should be specified or
referenced in a cleaning validation protocol.
Los criterios objetables incluyen efectos sobre la seguridad del paciente, pero
tambin incluye efectos sobre la estabilidad del producto, envase/integridad del
cierre, y la biodisponibilidad del principio activo. El criterio para lo que es
objetable debe especificarse o referenciarse en un protocolo de validacin de
limpieza.

Identification of objectionable organisms may include specific culturing
techniques to eliminate the possibility of a certain classification (such as
coliforms).
La identificacin de organismos objetables puede incluir tcnicas especficas de
cultivo para eliminar la posibilidad de una cierta clasificacin (tal como
coliformes).

Other approaches are to identify every colony down to a genus and/or species
level. Some companies will identify all colonies found in a cleaning validation
protocol. The reason for this is that they have systems set up to routinely
perform identification in a detailed way. That data then serves as a valuable
database or baseline in case there are problems in the future. Other companies
may only try to identify organisms if the total count is above a certain threshold
(that threshold being less than the acceptance limit). Of course, in a failure of a
protocol for exceeding the bioburden limit, identification of species should be
considered as part of the investigation to determine the cause of the failure.

Otros enfoques son identificar cada colonia hasta un nivel de gnero y/o
especie. Algunas compaas identificarn todas las colonias encontradas en un
protocolo de validacin de limpieza. La razn para esto es que ellas tienen
10

sistemas establecidos para realizar la identificacin rutinaria en una forma
detallada. Los datos entonces sirven como una base de datos evaluable o lnea
base en caso de que haya problemas en el futuro. Otras empresas slo pueden
tratar de identificar organismos si la cuenta total est por arriba de cierto umbral
(este umbral debe ser menor que el lmite de aceptacin). Claro, en la falla de
un protocolo excediendo el lmite de la carga microbiana, la identificacin de
especies debe considerarse como parte de la investigacin para determinar la
causa de la falla.

Sampling and testing methods
The sampling and analytical methods used for cleaning validation are the typical
procedures used by microbiological laboratories. (14) Those methods include
membrane filtration for water samples, contact plates for surface sampling, and
swab sampling with desorption and a pour plate or spread plate count. In
general, provided these methods are approved microbiological laboratory
method, no additional method validation is required.
Mtodos de muestreo y anlisis
Los mtodos analticos y de muestreo usados para la validacin de limpieza
son procedimientos tpicamente usados por los laboratorios de microbiologa
(14). esos mtodos incluyen filtracin por membrana para muestras de agua,
placas de contacto para muestreos de superficie, y muestreo con hisopos con
desorcin y vertido sobre una placa o espreado sobre una placa de conteo. En
general, siempre que esos mtodos sean mtodos aprobados por el laboratorio
microbiolgico, no se requiere validacin adicional del mtodo.


Sampling recovery
It is well recognized that recovery from surfaces in microbiological testing is
highly variable and is generally not very high. Part of the reason for this is the
variability of microbiological enumeration.
Recobro del muestreo
Es bien conocido que el recobro de superficies en pruebas microbiolgicas es
altamente variable y generalmente no es muy alta. Parte de la razn para esto
es la variabilidad del conteo microbiano.

For example, USP <1111> specifies that a limit of 10
2
CFU means less than
200 CFU. (15) While such a description mystifies most analytical chemists, it is
readily accepted by microbiologists because conventional microbial procedures
measure colony forming units (which may be comprised of multiple cells), and
not necessarily individual cells.
Por ejemplo, la USP <1111> especifica que un lmite de 10
2
de UFC significa
menos de 200 UFC (15). Si bien esta descripcin mistifica la mayora de los
qumicos analistas, es fcilmente aceptable por microbilogos debido a que los
procedimientos microbiolgicos convencionales miden unidades formadoras
de colonia (la cual puede componenerse de varias clulas) y no
necesariamente de clulas individuales.

A second reason is that recovery studies as they are typically done for chemical
residues are difficult to perform for microbial residues. (16) Spiking an incoulum
onto a surface and allowing it to dry prior to performing a swab or contact plate
11

sampling will result in a variable level of baseline bioburden. This is due to
drying of the incoulum, which causes a reduction of viable vegetative
organisms.
Una segunda razn es que los estudios de recobro tal como se hacen para
residuos qumicos son difciles de realizar para residuos microbianos (16).
Spikear sobre una superficie y permitir que se seque antes de realizar el
muestreo por hisopado o con placa de contacto resultar en un nivel variable
de la lnea base de la carga microbiana. Esto es debido al secado, lo cual
causa una reduccin de organismos viables vegetativos.

This effect can be reduced to some extent by performing exhaustive sampling
(similar to what is done for bioburden levels for medical device sterilization).
Este efecto puede reducirse en cierta medida, realizando un muestreo
exhaustivo (similar a lo que se hace para la carga microbiana para la
esterilizacin de dispositivos mdicos).

Exhaustive sampling involves spiking the surface, allowing the incoulum to dry,
and then swabbing the surface multiple times with separate swabs that are
individually enumerated. The recovery of the swabbing procedure then
becomes the bioburden of the first swab as a percent of the total bioburden
from the sum of all swabs. While this technique helps with swab sampling, it is
probably not practical for contact plate sampling because of the transfer of
media to the sampled surface. Another technique used to get around this issue
is to spike bacterial spores; with spores the issue of death on drying is not
present.
El muestreo exhaustivo involucra spikear la superficie, permitiendo que se
seque el inculo, y entonces hisopear la superficie varias veces con hisopos
separados que se enumeran individualmente. El recobro del procedimiento de
hisopado llega a ser entonces en la carga microbiana del primer hisopo como
un porcentaje de la carga microbiana de la suma de todos los hisopos. Si bien
esta tcnica ayuda con el muestreo de hisopos, es probable que no sea
prctico para muestreo con placas de contacto debido a la transferencia del
medio a la superficie muestreada. Otra tcnica usada para solucionar este
problea es spikear esporas; con las esporas, no se presenta el problema de
muerte por desecacin.

However, the use of spores brings up a third issue involving what organism(s)
to spike. Are recoveries going to be the same for all species? Is the recovery for
a spore former the same whether it is in the vegetative state or spore state?
Sin embargo, el uso de esporas plantea un tercer problema involucrando que
organismos spikear. Los recobros sern lo mismo para todas las especies?
Es el recobro para esporas el mismo si est en estado vegetativo o estado de
espora?

It should be noted that recovery discussed here is not the same as recovery in
USP <1227>. (17)
Debe observar que el recobro aqu discutido no es el mismo recobro en l
aUSP <1227> (17).

12

That recovery is dealing with things such as adequate neutralizers in the
recovery medium (and a 70% recovery is the minimum acceptable). The
recovery discussed here is recovery from surfaces in the sampling process.
Ese recobro se ocupa de cosas tales como neutralizantes adecuados en el
medio de recobro (y un recobro de 70% es el mnimo aceptable). El recobro
aqu discutido es el recobro de superficies en el proceso de muestreo.

As a general rule for process equipment cleaning validation, studies involving
bioburden recovery from surfaces are not done. In a risk-based approach, the
concerns from unacceptable levels of product contamination due to low
bioburden recoveries (10%-30%) is acceptable in situations where bioburden
limits are typically set on criteria that are much more stringent than what would
be aceptable by a carryover calculation. While manufacturers would like to have
a more scientific rationale for not doing recovery studies (or would like to have
clearly established and acceptable procedures for doing recovery studies), this
risk-based rationale is probably the best and most appropriate at this time.
Como una regla general para la validacin de limpieza de equipos de proceso,
los estudios involucrando recobro de las superficies no se realiza. N un enfoque
basado en el riesgo, las preocupaciones respecto de los niveles inaceptables
de contaminacin del producto debido a la baja recuperacin de la carga
microbiana (10% - 30%) es aceptable en situaciones donde los lmites de la
carga microbiana se establecen sobre criterios que son mucho ms estrictos de
lo que sera aceptable para un calculo para el remanente (carryover). Mientras
que a los fabricantes les gustara tener una razn ms cientfica por no hacer
los estudios de recobro (o les gustara tener procedimientos claramente
establecidos para hacer estudios de recobro), este razonamiento basado en el
riesgo es probablemente lo mejor y lo ms apropiado en este momento.


(Note: Part II of this article will continue with a focus on microbial control issues
in clean hold time studies.)
(Nota: La parte II de este artculo continuar con un enfoque sobre problemas
de control microbiolgico en estudios de clean hold time).

References
1. 21 CFR Part 211, Current Good Manufacturing Practice for Finished
Pharmaceuticals, U.S. Food and Drug Administration, Washington, D.C., U.S.
Government Printing Office, Updated April 1, 2005.

2. Guide to Inspections of Validation of Cleaning Practices, U.S. Food and Drug
Administration, Washington, D.C., U.S. Government Printing Office, July 1993.

3. Recommendations on Validation Master Plan, Installation and Operational
Qualification, Non-Sterile Process Validation Cleaning Validation,
Pharmaceutical Inspection Convention Pharmaceutical Inspection Co-Operation
Scheme (PIC/S), (2004), Document PI 006-3, Geneva, Switzerland, September
15, 2007.

4. Guidance for Industry: Process Validation: General Principles and Practices,
U.S. Food and Drug Administration, November 2008.
13


5. Guide to Inspections of Validation of Cleaning Practices, U.S. Food and Drug
Administration, Washington, D.C., U.S. Government Printing Office, July 1993.

6. Recommendations on Validation Master Plan, Installation and Operational
Qualification, Non-Sterile Process Validation Cleaning Validation,
Pharmaceutical Inspection Convention Pharmaceutical Inspection Co-Operation
Scheme (PIC/S), (2004), Document PI 006-3, Geneva, Switzerland, September
15, 2007.

7. DA LeBlanc. Establishing Scientifically Justified Acceptance Criteria of
Finished Drug Products. Pharmaceutical Technology 19:5, pp. 136-148
(October 1998)

8. DA LeBlanc, Setting Dose Limits without Dosing Information, Chapter 9 in
Cleaning Validation: Practical Compliance Solutions for Pharmaceutical
Manufacturing, PDA, Bethesda, Maryland, 2006, pp. 45-47.

9. DA LeBlanc, Equipment Cleaning Validation: Microbial Control Issues.
Journal of Validation Technology 8:4, 40-46 (August 2002).

10. SE Docherty. Establishing Microbial Cleaning Limits for Non-sterile
Manufacturing Equipment. Pharmaceutical Engineering 19:3, pp. 36-40
(May/June 1999).

11. AM Cundell. Microbial Monitoring. Presented at the 4th IIR Cleaning
Validation Conference, October 20-22, 1997.

12. DA LeBlanc, Equipment Cleaning Validation: Microbial Control Issues.
Journal of Validation Technology 8:4, 40-46 (August 2002).

13. Human Drug CGMP Notes, March 1998. US FDA.

14. S. Sutton, Surface Sampling Methods for Bioburden, PMF Newsletter, vol.
14 (6), pp. 9-11 (June 2008).
15. USP Chapter <1111>, Microbiological Examination of Nonsterile Products:
Acceptance Criteria for Pharmaceutical Preparations and Substances for
Pharmaceutical Use, United States Pharmacopeial Convention, USP Rockville,
MD.

16. S Sutton, Validation of Microbial Recovery from Surfaces. PMF
Newsletter, vol. 13 (10), pp. 4-5+ (October 2007).

17. USP Chapter <1227>, Validation of Microbial Recovery from
Pharmaceutical Articles, United States Pharmacopeial Convention, Rockville,
MD, 2006.


14

Microbiological Issues in Process Equipment Cleaning
Validation

Part II: Clean Hold Studies

PMF NEWSLETTER
Volume 15, Number 12 December, 2009

http://www.microbiologyforum.org/PMFNews/PMFNews.15.12.0912.pdf


Destin LeBlanc
Cleaning Validation Technologies



This is the second part of a discussion of microbial issues for the cleaning of
process equipment product-contact surfaces. (1) This emphasis for this
second part is a discussion of microbial issues in clean hold time studies.
Esta es la segunda parte de una discusin de problemas microbiolgicos para
la limpieza de superficies en contacto con el producto de equipos de proceso
(1).

Clean hold deals with the time between the end of the cleaning process and
the start of the next use of that cleaned equipment.
Clean hold se refiere al tiempo entre el final del proceso de limpieza y el inicio
del siguiente uso del equipo limpio.

That next use may be manufacture of a product, but may include a SIP (steam
in place) process to sterilize or sanitize the equipment. Concerns about storage
conditions are related to possible recontamination of the equipment, including
recontamination by micro-organisms. Therefore, the clean hold time is
concerned about the hold time under defined storage conditions.
El siguiente uso puede ser fabricar un producto, pero puede incluir un proceso
SIP (Stem in place) para esterilizar o sanitizar el equipo. Las preocupaciones
sobre las condiciones de almacenamiento se relacionan a la posible
recontaminacin del equipo incluyendo recontaminacin por microorganismos.
Por lo tanto, el clean hold time se refiere al tiempo que se mantiene bajo
condiciones de almacenamiento definidas.


Regulatory background
The regulatory basis of addressing the clean hold time is apparent from the
FDA cleaning validation guidance:

There should be some evidence that routine cleaning and storage of
equipment does not allow microbial proliferation. For example, equipment
should be dried before storage, and under no circumstances should stagnant
water be allowed to remain in equipment subsequent to cleaning operations.(2)

Antecedentes regulatorios
15

Las base regulatorias de abordar el clean hold time se desprende de la gua de
validacin de limpieza de la FDA:

Debe existir evidencia de que la limpieza de rutina y almacenamiento de los
equipos no permita proliferacin microbiana. Por ejemplo, el equipo debe
secarse antes de almacenarse, y bajo ninguna circunstancia debe permitirse
que se quede agua estancada en el equipo despus de las operaciones de
limpieza (2).

This concern is also reflected in the PIC/S recommendations for cleaning
validation:
Esta preocupacin se refleja tambin en las recomendadiones de la PIC/S para
validacin de limpieza:

The period and when appropriate, conditions of storage of equipment and
the time between cleaning and equipment reuse, should form part of the
validation of cleaning procedures. This is to provide confidence that routine
cleaning and storage of equipment does not allow microbial proliferation.
El perodo y cuando sea apropiadado, condiciones almacenamiento del
equipo y el tiempo entre la limpieza y el reuso del equipo deben formar parte
de los procedimientos de la validacin de limpieza. Esto es para proveer
confianza de que la limpieza de rutina y el almacenamiento del equipo no
permiten la proliferacin microbiana.

In general, equipment should be stored dry, and under no circumstances should
stagnant water be allowed to remain in equipment subsequent to cleaning
operations. (3)
En general, el equipo debe almacenarse seco, y bajo ninguna circunstancia
debe permitirse que se quede agua estancada en el equipo despus de las
operaciones de limpieza (3).

In both these documents, the major concern is bioburden proliferation during
storage (during the clean hold time). It should be noted that there may be other
concerns from manufacturers, such as recontamination from other sources
(particles, for example) that may also be addressed in a clean hold study.
However, the major concern is generally bioburden proliferation.
En ambos documentos, la mayor preocupacin es la proliferacin de la carga
microbiana durante el almacenamiento (durante el clean hold time). Debe
observarse que puede haber otras preocupaciones de los fabricantes, tal como
recontaminacin de otras fuentes (partculas, por ejemplo) que puede tambin
ser abordadas en un estudio de hold time. Sin embargo, la mayor preocupacin
es generalmente la proliferacin de la carga microbiana.


Bioburden proliferation
For bioburden proliferation in a clean hold study, bioburden is measured at the
beginning of the storage time (which is also the end of the cleaning process)
and at the end of the storage time (which is also the beginning of the next use).
Proliferacin de la carga microbiana
16

Para la proliferacin de la carga microbiana en un estudio de hold time, la carga
microbiana se mide al inicio del tiempo de almacenamiento ( el cual es tambin
el final del proceso de limpieza) y al final del tiempo de almacenamiento (el cual
es tambin e inicio del siguiente uso).

A clean hold study generally follows validation of the cleaning process itself,
because the initial storage state or condition depends on the cleaning process
used. The variables that affect possible changes in bioburden include the initial
storage state (including initial bioburden, the initial organic nutrient load, and the
presence of water, particularly pooled water), the time of storage, the
temperatura of storage, and protection from external recontamination.
Un estudio de clean hold generalmente sigue a la validacin del proceso de
limpieza, debido a que el estado o condicin inicial de almacenamiento
depende del proceso de limpieza usado. Las variables que afectan los posbiles
cambios en la carga microbiana incluyen el estado inicial del almacenamiento
(incluyendo la carga microbiana inicial, la carga inicial de nutrientes orgnicos,
y la presencia de agua, particularmente el agua estancada), el tiempo de
almacenamiento, la temperatura de almacenamiento, y la proteccin de
recontaminacin externa.


Protocol strategies
Some companies may include the validation of the clean hold time as part of an
overall protocol, including the cleaning process validation. That is, one protocol
is executed which measure residues at the end of the cleaning process. Among
those residues is bioburden.
Estrategias del protocolo
Algunas empresas pueden incluir la validacin del clean hold time como parte
de un protocolo general, incluyendo la validacin del proceso de limpieza. Esto
es, un protocolo se ejecuta el cual mide residuos al final del proceso de
limpieza. Entre esos residuos est la carga microbiana.

That bioburden at the end of the cleaning process provides an assurance that
the cleaning process produces acceptable level of bioburden. See Part I
(October 2009 PMF Newsletter) for a discussion of setting bioburden limits at
the end of the cleaning process. Those values at the end of the cleaning
process are also the baseline (time = 0) for measuring bioburden proliferation
during the clean hold time.
La carga microbiana al final del proceso de limpieza provee una seguridad de
que los procesos de limpieza producen un nivel aceptable de carga microbiana.
Ver la parte I (Octubre 2009 PMF Newsletter) para una discusin de
establecimiento de lmites de carga microbiana el final del proceso de limpieza.
Esos valores al final del proceso de limpieza son tambin la lnea base (time 0
0) para la medicin de proliferacin de la carga microbiana durante el clean
hold time.

Following a maximum allowed storage time (under specified storage conditions,
such as location), bioburden is measured again to determine whether bioburden
proliferation occurred.
17

Despus de un tiempo mximo permitido de almacenamiento (bajo condiciones
de almacenamiento especificas, tales como la ubicacin), la carga microbiana
se mide otra vez para determinar si ocurri proliferacin de la carga microbiana.

Some companies will separate the clean hold validation protocol from the
cleaning process validation protocol.
Algunas empresas separarn la validacin del clean hold del protocolo de
validacin del proceso de limpieza.

This can be either a separation by using two protocols, but still having the clean
hold protocol immediately follow the cleaning process validation protocol such
that the data collected at the end of the cleaning process also serves as the
data for the beginning of the clean hold protocol. In other cases, the two
protocols can be separate in time, such the baseline data for the clean hold
study is developed apart from the data at the end of the cleaning process
validation protocol.
Esto puede ser una separacin mediante el uso de dos protocolos, pero an
teniendo el protocolo del clean hold inmediatamente siguiendo al protocolo de
validacin del proceso de limpieza de tal forma que los datos colectados al final
del proceso de limpieza tambin sirven como datos para el inicio del protocolo
del clean hold. En otros casos, los dos protocolos pueden ser separados en
tiempo, de tal forma que los datos de la lnea base para el estudio del clean
hold se desarrolle aparte de los datos al final del protocolo de validacin del
proceso de limpieza.

Setting limits
The key question for a clean hold study is how to set appropriate limits for
microbial or bioburden proliferation.
Estableciendo lmites.
La cuestin clave para un estudio de clean hold es como establecer lmites
apropiados para la proliferacin de carga microbiana o microbiolgica.

The main issue is to prevent significant proliferation, and not just any change.
El principal problema es prevenir una proliferacin significativa y no slo
cualquier cambio.

One element in determining significant proliferation is the issue of bioburden
enumeration (discussed in Part I). Doubling or even tripling of enumerated
bioburden is not considered significant. Generally, a one log increase in
bioburden would be considered significant. That is, even though the bioburden
acceptance limit at the end of the cleaning process was 1 CFU/cm
2
, that value
could be has high as 10 CFU/cm
2
and still be aceptable after the hold time.
Un elemento en determinar una proliferacin significativa es el problema dl
conteo de la carga microbiana (discutida en la Parte I). La duplicacin o
triplicacin de la carga microbiana contada no se considera significativa.
Generalmente, el incremento de un logaritmo en la carga microbiana pudiera
considerarse significativa. Es decir, aunque el lmite de aceptacin de la carga
microbiana al final del proceso de limpieza fue de 1 UFC/cm, este valor puede
ser tan alto como 10 UFC/cm y an ser aceptable despus del hold time.

18

While it might seem there is an inconsistency here, remember in Part I that the
limit of (for example) 1 CFU/cm
2
was not based on a carryover calculation. It
was based on what was should be achievable by cleaning with hot, aqueous
alkaline cleaning solutions. Therefore, it is considerably below what would be
acceptable for contamination of the next product. Therefore, an acceptance
criterion of no more than (NMT) a one log increase in bioburden is reasonable
to consider for a clean hold study.
Aunque podra parecer que hay una inconsistencia aqu, recuerdo que en la
parte I que el lmite de (por ejemplo) 1 UFC/cm no se bas sobre clculos del
remanente (carryover). Se bas sobre lo que se debe alcanzar con soluciones
alcalinas de limpieza calientes. Por lo tanto, es muy inferior a lo que sera
aceptable para la contaminacin del siguiente producto. Por lo tanto, un criterio
de aceptacin de no ms que (NMT, por No More Than) un incremento de un
logaritmo en la carga microbiana es razonable para considerarlo para un
estudio de clean hold.

However, a criterion of no more than a one log increase is difficult to apply
when the swab results come back all zeros. (Lets ignore for now how that data
should actually be reported.) There is no such value as a log of zero. For that
reason, it is reasonable to allow no more than the original acceptance limit in
the cleaning validation protocol. If that is the case, then an additional criterion
can be NMT 1 CFU/cm
2
(for example).
Sin embargo, un criterio de no ms que el incremento de un logaritmo es difcil
de aplicar cuando los resultados del hisopo son todos cero. (Ignoremos por
ahora la forma en que los datos deben reportarse). No hay un valor como
logaritmo de cero. Por esta razn, es razonable permitir no ms que el lmite
de aceptacin original en el protocolo de validacin de limpieza. Si este es el
caso, entonces un criterio adicional puede ser NMT 1 UFC/cm (por ejemplo).

These two criteria can be combined by establishing an acceptance criterion of
the less stringent of NMT 1 CFU/cm2 and NMT one log increase. For
example, if the acceptance limit at the end of cleaning was 25 CFU per 25 cm
2
,
and if the measured bioburden value at the end of cleaning is 5 CFU per swab
of 25 cm
2
, then after the clean hold time, the acceptance criterion would be the
less stringent of 50 CFU per 25 cm
2
(a one log increase) and 25 CFU per 25
cm
2
(the original specification after cleaning). The less stringent of the two is the
higher value, or 50 CFU per 25 cm
2
. On the other hand, if the acceptance limit
at the end of cleaning was 25 CFU per 25 cm
2
, and if the measured bioburden
value at the end of cleaning is 1 CFU per swab of 25 cm
2
, then after the clean
hold time, the acceptance criterion would be the less stringent of 10 CFU per 25
cm2 (a one log increase) and 25 CFU per 25 cm
2
(the original specification after
cleaning). The less stringent of these two is the higher value, or 25 CFU per 25
cm
2
.
Estos dos criterios pueden combinarse mediante el establecimiento de un
criterio de aceptacin de el menos estricto de NMT 1 UFC/cm y NMT el
incremento de un logaritmo. Por ejemplo, si el lmite de aceptacin el final de
la limpieza fue de 25 UFC/cm, y si el valor medido de la carga microbiana al
final de la limpieza fue de 5 UFC por hisopado de 25 cm, entonces despus
del clean hold time, el criterio de aceptacin sera el menos estricto de 50 UFC
/cm (el incremento de un logaritmo) y 25 UFC/cm (la especificacin original
19

despus de la limpieza. El menos estricto de los dos es el valor ms alto, o 500
UFC /cm. Por otro lado, si el lmite de aceptacin al final de la limpieza fue de
25 UFC/cm, y si el valor medido de la carga microbiana al final de la limpieza
fue de 1 UFC por hisopado de 25 cm, entonces despus del clean hold time, el
criterio de aceptacipn sera el menos estricto de 10 UFC/cm (el incremento
de un logaritmo) y 25 UFC/25cm (la especificacin original despus de la
limpieza). El menos estricto de esos dos valores es el valor ms alto, o 25 UFC/
25cm.

Sampling issues
If multiple swab sites (or contact plate sites) are sampled for a given equipment
item, it probably is not appropriate to average sites and then compare the
average value after the clean hold time to the average value before the clean
hold time. In such cases, sampling after the clean hold time should be with sites
adjacent to the sites sampled for the beginning of the clean hold times.
Comparisons then should be made for comparable sites, that is, for those
adjacent sites.
Problemas de muestreo
Si varios sitios son muestreados por hisopo (o placas de contacto) para un
equipo dado, probablemente no es apropiado promediar sitios y entonces
comparar el valor promedio despus del clean hold time contra el valor
promedio antes del clean hold time. En tales casos, el muestreo despus del
clean hold time debe ser en sitios adyacentes a los sitios muestreados al inicio
del clean hold time. Las comparaciones deben hacerse entonces para sitios
comparables, esto es, para esos sitios adyacentes.

Problems also arise in clean hold studies when rinse sampling is done for
bioburden measurement. One of two types of rinse sampling may be performed.
If the initial (time = zero) bioburden rinse sample is a grab sample of the final
process, then the rinse sample after the clean hold time should be an ambient
temperature rinse. If a hot water rinse were to be used, then any proliferation of
bioburden during the clean hold time may be masked by the killing effect of the
hot rinse. If a sufficient quantity of ambient temperature water is not readily
available, this approach may be problematic.
Los problemas tambin surgen en estudios de clean hold time cuando se
realiza el muestreo por enjuague para la medicin de la carga microbiana. Uno
de los dos tipos de muestreo por enjaugue puede realizarse. Si la carga
microbiana inicial (tiempo = cero) de la muestra de enjuague es una muestra
tomada del proceso final, entonces la muestra de enjuague despus del clean
hold time debe ser un enjuague a temperatura ambiente. Si se uso un
enjuague con agua caliente, entonces cualquier proliferacin de la carga
microbiana durante el clean hold time puede ser enmascarado por el efecto
letal del enjuague con agua caliente. Si no est disponible la suficiente cantidad
de agua a temperatura ambiente, este enfoque puede ser problemtico.

The other type of rinse used is a separate sampling rinse. That is, for the initial
bioburden determination the process rinse is completed and is then followed by
a rinse solely for sampling purposes. If this separate sampling rinse is used,
then the same issue with hot water rinsing arises if the separate rinse sample
20

is with hot water, the data relating to proliferation may be distorted due to the
biocidal effect of the temperature. Another consideration is that if a separate
sampling rinse is used at the end of the cleaning process, then it is no longer
possible to use the data from a sampling rinse after storage of the cleaned
equipment for that manufacturing run. The reason for this is that using such a
separate sampling rinse is an additional step which distorts the nature of the
cleaned equipment during storage. The purpose of the clean hold study is to
measure bioburden change following the normal cleaning process, not following
the use of a separate sampling rinse (which is only used for the validation
protocol). In this case, one production run must be used to develop the initial
(time = zero) data, and then a separate manufacturing run must be used to
develop the data for the burden at the end of the storage period.
El otro tipo de enjuague usado es un muestreo de enjuague separado. Esto es,
para la determinacin inicial de la carga microbiana se completa el proceso de
enjuague y entonces se realiza un enjuague solo para propsitos de muestreo.
Si este muestreo de enjuague separado se usa, entonces surge el mismo
problema que con el agua caliente si el enjuague separado es con agua
caliente, los datos relacionados a la proliferacin pueden distorsionarse debido
al efecto biocida de la temperatura. Otra consideracin es que si un muestreo
de enjuague separado se usa al final del proceso de limpieza, entonces ya no
es posible utilizar los datos del muestreo por enjuague despus del
almacenamiento del equipo limpio para esa corrida de fabricacin. La razn
para esto es que usando el muestreo por enjuague separado es un paso
adicional el cual distorsiona la naturaleza del equipo limpio durante el
almacenamiento. El propsito del estudio del clean hold es medir el cambio de
la carga microbiana siguiendo el proceso normal de limpieza, no siguiendo el
uso de un muestreo de enjuague separado (el cual se usa solo para el
protocolo de validacin). En este caso, se debe usar una corrida de produccin
para desarrollar los datos iniciales (tiempo =cero), y entonces se debe usar una
corrida de fabricacin separada para desarrollar los datos para la carga al final
del perodo de almacenamiento.


While not an ideal situation, it is a required constraint if a separate sampling
rinse is used for measuring bioburden.
Aunque no es una situacin ideal, es una restriccin necesaria se se usa un
muestreo por enjuague separado para la medicin de la carga microbiana.

When establishing a clean hold time by use of a protocol, it is best to establish a
goal and measure for the presence of proliferation only at the end of that time
period. Sampling at various intervals to determine the maximum acceptable
time can present problems in terms inadvertent contamination of surfaces
during swab or contact plate sampling at the intermediate times, thus resulting
in false failures at later time periods. In addition, rinse sampling at intermediate
times cannot be performed for one manufacturing run only. For rinse sampling
at multiple times, a separate run must be used for each time period.

If such studies involving testing at multiple time points are performed, they are
best done as part of the design/development phase of validation.
21

Cuando se establece un clean hold time mediante el uso de un protocolo es
mejor establecer una meta y medir la presencia de proliferacin slo al final de
ese perodo de tiempo. El muestreo en varios intervalos para determinar el
tiempo mximo aceptable puede presentar problemas en trminos de
contaminacin inadvertida de las superficies durante el muestreo con hisopo o
placas de contacto en los tiempos intermedios, resultando as en falsos fallos
en perodos de tiempos mas tarde. Adems, el muestreo por enjuague en
tiempos intermedios no se puede realizar para una sola corrida de fabricacin.
Para el muestreo por enjuague en multiples perodos de tiempo, se debe usar
corridas separadas para cada perodo de tiempo.


Objectionable organisms
Identification of organisms and exclusion of objectionable organisms may also
be utilized in a clean hold study. The principles used for the cleaning validation
protocol (See Part I, PMF Newsletter, vol., no., pages, date) will also apply
here. However, if there is no significant proliferation, there may be little rationale
for identification beyond what was done at the end of cleaning. On the other
hand, if there is significant proliferation (i.e., a failure of the clean hold protocol),
then identification is certainly appropriate as part of the investigation to
determine the cause of the failure.
Organismos Objetables
La identificacin de organismos y la exclusin de organismos objetables puede
utilizarse tambin en un estudio de clean hold. Los principios usados para el
protocolo de validacin de limpieza (ver la Parte I en October 2009 PMF
Newsletter) tambin aplicarn aqu. Sin embargo, si no hay proliferacin
significativa, puede haber pocas razones para la identificacin ms all de lo
que se hizo al final de la limpieza. Por otro lado, si hay proliferacin
significativa, (por ejemplo, una falla del protocolo del clean hold), entonces la
identificacin ciertamente es apropaida como parte de la investigacin para
detrminar la causa de la falla.

Endotoxins
If endotoxin is measured for a cleaning validation protocol for sterile
manufacturing, it is not necessary to include endotoxin measurement as part of
the clean hold protocol. The rationale for this is that excessive endotoxin is only
likely to be a problem if there is also significant microbial proliferation. That is,
the protocol is likely to fail for endotoxin only if there is also a failure for
bioburden. In addition, failure for endotoxin will only occur if the bioburden
proliferation involves gran negative bacteria. While it is theoretically possible for
a gram negative to proliferate and then die (thus resulting in no bioburden
proliferation detected at the end of the storage time, but with excessive
endotoxin), such a scenario is not likely.
Endotoxinas
Si se miden endotoxinas para un protocolo de validacin de limpieza para
fabricacin estril, no es necesario incluir la medicin de endotoxinas como
parte del protocolo del clean hold. La razn para esto es que solo es probable
que el exceso de endotoxinas sea un problema si tambin hay proliferacin
microbiana significativa. Es decir, es probable que falle el protocolo para
endotoxinas slo si tambin falla para la carga microbiana. Adems, la falla
22

para endotoxinas slo ocurrir si la proliferacin de carga microbiana involucra
bacterias gran negativas. Si bien es tericamente posible para que un gran
negative prolifere y entonces muera (este resultado no es proliferacin de carga
microbiana detectada al final del tiempo de almacenamiento, pero con excesiva
endotoxina) tal escenario no es probable.


Alternative to a formal protocol
An approach utilized by some companies is to avoid formal clean hold studies
by providing assurance that the equipment is dry at the beginning of the hold
time.
Alternativa a un protocolo formal
Un enfoque utilizado por algunas empresas es evitar estudios formales de
clean hold proveyendo seguridad de que el equipo est seco el inicio y al final
del hold time.

This is consistent with the FDAs statement in their cleaning validation
guidance:
Esto es consistente con lo declarado por la FDA en su gua sobre validacin de
limpieza:

This consists largely of preventive measures rather than removal of
contamination once it has occurred.
Esto consiste en gran parte de las medidas preventivas en lugar de eliminar la
contaminacin una vez que ha ocurrido.

There should be some evidence that routine cleaning and storage of equipment
does not allow microbial proliferation. For example, equipment should be dried
before storage, and under no circumstances should stagnant water be allowed
to remain in equipment subsequent to cleaning operations. (4)
Debe haber alguna evidencia de que la limpieza de rutina y almacenamiento
del equipo no permite proliferacin microbiana. Por ejemplo, el equipo debe
secarse antes de almacenarse, y bjo ninguna circunstancia debe permitirse que
parmanezca agua estancada despus de las operaciones de limpieza (4).

In other words, the major issue is one of preventive actions to make sure that
the equipment is dry. It is a well accepted scientific principle that bioburden will
not prolifrate on clean, dry surfaces. Assurance of dryness can be done by
proper design of fixed equipment to assist in adequate drainage, proper
placement of items cleaned out of place to assist in adequate drainage, use of a
hot water final rinse, use of hot air following the final rinse, and/or use of an
alcohol wipe or rinse following the final water rinse. In addition, it should be
established that dry surfaces do not become wet following initiation of the clean
hold time. For example, if vessels cleaned by a CIP process are closed up
before returning to ambient temperature, moist heated air may condense water
in parts of the equipment, possibly allowing microbial proliferation.
En otras palabras, la cuestin principal es una de las acciones preventivas para
asegurarse que el equipo est limpio. Es un principio cientfico bien aceptado
que la carga microbiana no prolifera en superficies limpias y secas. El
asegurarse de la sequedad puede hacerse por un diseo adecuado del equipo
23

fijo para ayudar en el drenaje adecuado, la correcta ubicacin de los elementos
limpios fuera del lugar para ayudar en el drenaje adecuado, el uso de un
enjuague final con agua caliente, el uso de agua caliente tras el enjuague final
y /o el yuso de un wipe con alcohol o enjuague despus del enjuague final con
agua. Adems, se debe establecer que las superficies secas no se mojen tras
el inicio del clean hold time. Por ejemplo, si los recipientes limpiados mediante
un proceso CIP se cierran antes de retornar a la temperatura ambiente, la
humeda del aire calentado puede condensar el agua en partes del equipo,
posiblemente permitiendo proliferacin microbiana.


References
1. See PMF Newsletter 15:10, pp. 2-9 (October 2009) for Part I.

2. Guide to Inspections of Validation of Cleaning Practices, U.S. Food and Drug
Administration, Washington, D.C., U.S. Government Printing Office, July 1993.

3. Recommendations on Validation Master Plan, Installation and Operational
Qualification, Non-Sterile Process Validation Cleaning Validation,
Pharmaceutical Inspection Convention Pharmaceutical Inspection Co-Operation
Scheme (PIC/S), Document PI 006-3, Geneva, Switzerland, September 15,
2007.

4. Guide to Inspections of Validation of Cleaning Practices, U.S. Food and Drug
Administration, Washington, D.C., U.S. Government Printing Office, July 1993.