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Staphylococcus aureus

Resistente a la Meticilina
(MRSA) : Aspectos de
Laboratorio
Lic. TM JUAN C. RIVEROS QUINTANA
Sir Alexander Fleming
1881-1955
Saint Mary Hospital in London
Penicillium notatum
Staphylococcus aureus
British Journal of Experimental Pathology
1928
Sir Ernst Boris Chain
( 1906-1979 )
Baron Howard Walter Florey
(1898-1968)
12 Febrero 1941: Polica de Oxford
Evolucin de la Resistencia
1940 - Penicilinasa enzima capaz de destruir la Penicilina ident. en Bacterias.
1945 - Mas de 20% de S. aureus en Hosp. producen penicilinasas
1957 - Rollinson y Batchelor, logran identificar el ncleo de las penicilinas, el
cido 6-aminopenicilnico.
1958 - Se introduce la Vancomicina raramente usado.
1959 - Se introduce la Meticilina .
1961 - Resistencia a la Meticilina MRSA.
1983 - Primer aislamiento de Enterococcus Resistencia a la Penicilina.
1987 - R a vancomicina en Enterococcus spp.
1996 - Emergencia de S. aureus GISA
1999 - Primera descripcin SARM-CO
2002 - Primera descripcin VRSA
2001 - Resistencia a Linezolid (mutacin ribosmica)
2005 - Resistencia a Daptomicina
2007 - Resistencia a Linezolid (plasmdica, gen cfr)
2010 - E. faecium beta-lactamasa + policlonal
2011 - SARM: nuevo gen mecC
2011 - Enterococos: 9 tipos de operones van
Tendencia de la Resistencia en Cocos Gram
Positivos. USA 1980-2003
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1975 1980 1985 1990 1995 2000
%

d
e

R
e
s
i
s
t
e
n
c
i
a

1997
MRSE = 80%
MRSA = 52-55%
PNSDP = 35%
VRE = 17-20%
VISA
VRSA (2002)
Jones AM et al, ICAAC 2003, Abstr K-1389; Edmond M et.al. CID
1999; MMWR 1997;46:624-36; TSN, 2003
Staphylococcus aureus
Es la principal especie patgena de su
gnero, y es causa comn de
infecciones diversas, tanto de origen
comunitario como hospitalario.
Mas de 33 factores de virulencia. Se
clasifican en enzimas, super-
antgenos, toxinas formadoras de
poros.

Dominio: Bacteria
Filo: Firmicutes
Clase: Bacilli
Orden: Bacillales
Familia: Staphylococcaceae
Gnero: Staphylococcus

Staphylococcus aureus
Actualmente, su inters se
debe a su elevada frecuencia
de aislamiento y cepas
resistentes a Meticilina
(SAMR), una de las causas
principales de brotes de
infeccin nosocomial.
Se han descrito aislados con
resistencia a todos los
antimicrobianos utilizados.


Pared Bacteriana de un Gram (+)

Pared Bacteriana
Mecanismo de accin de antibiticos - lctamicos
en Staphylococcus aureus
Mecanismo de accin de antibiticos - lctamicos
en Staphylococcus aureus
Mecanismo de accin de antibiticos - lctamicos
en Staphylococcus aureus
Surgimiento de Resistencia a la
Penicilina en Staphylococcus spp.

Staphylococcus aureus Penicilina 2014
Oxacilina (CIM) No DD
Penicilina
Cefoxitina (Rep. a Oxacilina).
Ceftarolina
Vancomicina
Teicoplanina
Daptomicina
Gentamicina
Amikacina
Kanamicina
Netilmicina
Tobramicina
Azitromicina o claritromcina o
Eritromicina
Telitromicina
Diritromicina


Tetraciclina
Doxiciclina
Minociclina
Ciprofloxacina or levofloxacina or
Ofloxacina Moxifloxacina
Lomefloxacina , Norfloxacina ,
Enoxacina , Grepafloxacina
Eparfloxacina, Fleroxacina
Nitrofurantoina
Clindamicina
Trimethoprim- sulfamethoxazol
Sulfonamidas
Trimethoprima
Cloramfenicol
Rifampicina
Quinupristina- dalfopristina
Linezolid
Staphylococcus spp. M100 S24 CLSI 2014
Antibiticos que se utilizan para estudio de sensibilidad
En Estafilococos se debe utilizar el disco
penicilina para determinar la sensibilidad a
Penicilinas lbiles a penicilinasas.

Quienes son ?: Ampicilina, Amoxicilina,
Azlocilina, Carbenicilina, Mezlocilina, Piperacilina
y Ticarcilina .
La sensibilidad a Penicilina implica sensibilidad
a todos los -lactmicos.
Resistencia a las penicilinas por produccin de
-lactamasas
Fenmeno de tolerancia
que afecta a todos los
- lctamicos

Resistencia por alteracin de
protenas fijadoras de
penicilina PBP
Produccin de PBPs
modificadas (MOD-SA) con
menor afinidad por los atb -
lactmicos
Staphylococcus
aureus presenta
cuatro
mecanismos
Inactivacin enzimtica
por -lactamasas
(Penicilinasas)

Mecanismo de resistencia de Staphylococcus aureus
a los antibiticos - lctamicos
La historia..
> 90 % de estafilococos "R a la Penicilina , La
penicilina raramente considerada para el tratamiento
para infecciones por StaphylococcusPero podra
considerarse para terapia Prolongada en infecciones
(Endocarditis, Osteomielitis) .

X
Recomendaciones segn
CLSI 2014 M100-S24
PUNTOS DE CORTE PARA PENICILINA
Zona (mm) MIC (g/ml)
S I R S I R
29 - 28 0.12 - 0.25

Resistencia a las penicilinas por produccin de
betalactamasas
Las -lactamasas son enzimas bacterianas capaces de hidrolizar
el enlace amida del anillo - lactmico de las penicilinas,
cefalosporinas y otros antimicrobianos betalactmicos, dando
lugar a compuestos sin actividad antibacteriana.

Resistencia a las penicilinas por produccin de
betalactamasas


Resistencia a las penicilinas por produccin de
betalactamasas


Resistencia a las penicilinas por produccin de
betalactamasas

Cefinase

Estafilococos: produccin de Penicilinasa
Para su deteccin se
pueden utilizar discos
impregnados con una
cefalosporina cromognica
(nitrocefin) que al
hidrolizarse en presencia
de la betalactamasa
experimenta un cambio en
su estructura, lo que
resulta en un producto
coloreado (naranja-rojo).

Oxacilina
(inducible)
Subcultivo en agar sangre, agar
Muller Hinton.
Colocar Disco de Oxacilina,
Cefoxitina.
Incubar toda la noche.
Test a partir de la zona periferica.
Beta- lactamasa Positivo : Rojo
Resistencia a Penicilina.
Rojo Amarillo
Estafilococos: produccin de Penicilinasa
Staphylococcus spp. Penicilina M100 S24 CLSI 2014
PENICILINA = SENSIBLE
BETALACTAMASA
NEGATIVO
Staphylococcus spp. Penicilina M100 S24 CLSI 2014
PUNTOS DE CORTE PARA PENICILINA
Zona (mm) MIC (g/ml)
S I R S I R
29 - 28 0.12 - 0.25
PENICILINA = SENSIBLE
BETALACTAMASA
NEGATIVO
Staphylococcus spp. Penicilina M100 S24 CLSI 2014
PUNTOS DE CORTE PARA PENICILINA
Zona (mm) MIC (g/ml)
S I R S I R
29 - 28 0.12 - 0.25
PENICILINA = SENSIBLE
BETALACTAMASA
NEGATIVO
Staphylococcus spp. Penicilina M100 S24 CLSI 2014
PUNTOS DE CORTE PARA PENICILINA
Zona (mm) MIC (g/ml)
S I R S I R
29 - 28 0.12 - 0.25
CMI : 0.064 ug/ml
Staphylococcus aureus Meticilino
Resistente
Segn Centers for Disease Control (CDC), en 1974,
las infecciones de MRSA se consideraron el 2% del
nmero total de infecciones Staphylococcus, en
22% para 1995, y 63% para el 2004.
La evolucin de la resistencia en estafilococos a los
antibioticos - lactamicos es un proceso dinmico
en curso , provocada por la presin selectiva ,
ejercida por los antibioticos.
Surgimiento de MRSA

gen mec A
Resistencia a
Todos los -
Lactamicos
(Excepcin
Ceftarolina)
PBP 2a
Usualmente ligada a
RESISTENCIA a
AMINOGLUCSIDOS,
MACRLIDOS,
QUINOLONAS,
Cloranfenicol,
Tetraciclina,
Trimetoprima/
sulfametoxazol
Staphylococcus spp. METICILINO-RESISTENTES
ORIGEN CROMOSOMICO
La multiresistencia puede ser un marcador de
meticilino resistencia
Staphylococcus aureus Meticilino Resistente
Staphylococcus aureus Meticilino Resistente
Organizacin molecular del SCCmec
Basic structures of
representative SCCmec
elements.
International Working Group on
the Classification of
Staphylococcal Cassette
Chromosome Elements (IWG-
SCC) et al. Antimicrob. Agents
Chemother. 2009;53:4961-4967
SARMA-AH suele llevar SCCmec
ms grandes (tipos I, II y III),
mientras que SARM-AC tiene
casetes ms pequeos (SCCmec
tipos IV, V y VII)
Diferencias entre H-MRSA y CA-MRSA
PVL secretion and assembly on PMN membrane
PMN cytolysis
PVL-mediated lysis and tissue necrosis
PVL-mediated lysis and tissue necrosis
PVL apoptosis
PVL-mediated necrosis?

Staphylococcus aureus Meticilino Resistente
2014
Staphylococcus aureus Meticilino
Resistente
CLSI estandariz la difusin con disco de
cefoxitina (FOX) para predecir MR en
S. aureus (SAU) y SCN (M100S14)
Se proponen puntos de corte de CIM de
cefoxitin para predecir mecA en S. aureus
y S. lugdunensis (M100S18). Aun no se
han establecido para SCN. 2014
Elimina puntos de corte de oxacilina
por Disco Difusion para Estafilococos
coagulasa negativo
CLSI
2004
2008
2009
2014
Staphylococcus aureus Meticilino
Resistente
Si se evalan FOX y OXA para S. aureus o S.
lugdunensis, y el resultado de alguna de las
pruebas es resistente, el MO debera
informarse como oxacilino resistente .
Para Staphylococcus resistentes a oxacilina,
informe como resistente a penicilina o no
informe .
Se elimin el disco de oxacilina del mtodo
de difusin para evaluar MR en el Grupo
S. aureus y S. lugdunensis
CLSI
2010
2012
2013

Resistencia a la meticilina (oxacilina):
homognea y heterognea.

PBP 1,2,4
homognea
Este aislamiento es meticilino sensible, porque la
sensibilidad a cefoxitin descarta la presencia del gen mecA.
La utilizacion del disco de cefoxitin es util y se prefiere su
uso en vez de oxacilina para detectar la resistencia a
oxacilina mediada por el gen mecA.
Se usa en reemplazo de Oxacilina , sus halos de
inhibicin se relacionan con la presencia o ausencia
del gen mecA , mejor que con otros mtodo.

No est influenciado decisivamente por variaciones de
inculo, temperatura o medios de cultivo utilizados.
Los bordes son ntidos, son de fcil lectura.
los resultados no parecen estar afectados, en la misma
extensin que los discos de oxacilina, por la
hiperproduccin de penicilinasa, que da lugar a
pequeos halos de inhibicin.
Resistencia a las penicilinas por produccin de
-lactamasas


Mtodos de Laboratorio para la detencin de la resistencia oxacilina


X
Test de Screening: Placa de OXA 6g/ml
S. aureus
Medio: MHA + 4% NaCl
6 g/ml OXA
Inculo: 0.5 Mc. Farland.
*Vol. de Inculo: 1 l (NCCLS 2001)
Incubacin: 35
0
C, 24 hs
Resultado: > 1 colonia = Resistente
Control de Calidad: S. aureus ATCC 29213 (control negativo),
S. aureus ATCC 43300 (control positivo)

*J. Clin. Microbiol. 2001.39:3781-3784
NO sirve para SCN
Screening Oxa 6g/ml
Sau ATCC 29213
Control (-)
Sau ATCC 43300
Control (+)
Cepa
clnica (+)
Cepa
clnica (-)
SENSIBILIDAD: 95-100%
ESPECIFICIDAD: 100%
Hospital de Nios Ricardo Gutierrez
CLSI 2012 M 100 S 22
Staphylococcus M100 S23 (2013)Eliminacin
de TODOS los puntos de corte para Beta-
lactmicos diferentes a Oxacilina, Cefoxitin ,
Penicilina y Ceftaroline.
Staphylococcus M100 S24 (2014): No hay
Modificaciones.
Que Beta Lactmicos debemos reportar?
-lactamicos ahora disponibles para Staphylococcus
spp 2014
Oxacilina: Solamente MIC . Representa a las Penicilinas estables a
Penicilinasas : Ejem. Oxacilina, dicloxacilina, cloxacilina.
Cefoxitin: Disco difusin y MIC para S.aureus y S. lugdunensis
Disco difusin en SCoN excepto S . Lugdunensis.
Representa a Oxacilina para tamizaje in vitro.(mejor
deteccin de R Mediado por gen mecA ).
Penicilina G: Disco difusin y MIC. Representa las Penicilinas
sensibles a Penicilinasa. Ejem. Penicilina G/Ampicilina.
Ceftaroline : Para uso en S . aureus , incluyendo a MRSA. Cefalosporina
Anti-MRSA.

Por qu el CLSI removi los puntos de corte
para Beta-Lactmicos
Utilizando Cefoxitin/Penicilina/Oxa, es SUFICIENTE
para predecir la actividad de los Beta-lactamicos
CLINICAMENTE EFECTIVOS para tratar MRSA.
Necesidad de separar los Beta-lactamicos con
actividad Anti-MRSA, de los grupos lbiles a este
mecanismo de R.
Los puntos de corte que fueron removidos, no tenan
estudios que soportaran su utilidad clnica.
Algunas molculas beta-lactamicas eran MENOS
AFINES que otras. Ejem.: Ceftazidime.

mecA , MecB , MecC refleja el orden cronolgico de su descubrimiento.
En una vigilancia que estamos realizando en
nuestro hospital de infecciones en piel y
partes blandas en la emergencia slo pudimos
documentar un caso sospechoso de infeccin
por SAMR-AC en el ao 2010 en una paciente
mujer peruana que provena de Ecuador.
Si bien SAMR-AC no es todava un problema de
salud en el Per, dado el comportamiento
epidmico que ha tenido en otras regiones
Acta Med Per 28(2) 2011
SCCmec
Staphylococcus spp: RESISTENCIA A
MACRLIDOS-LINCOSAMIDAS-
ESTREPTOGRAMINAS
Ribosomas
Estructura del ribosoma en procariotas Estructura del ribosoma en eucariotas
ARNr o ARN Ribosmico
Staphylococcus spp: RESISTENCIA A MACRLIDOS-
LINCOSAMIDAS-ESTREPTOGRAMINAS


Eritromicina (un macrlido) y Clindamicina (una licosamida)
representan dos clases distintas de agentes antimicrobianos que
inhiben la sntesis proteica por unin a la subunidad ribosomal 50S
bacteriana.
En estafilococos la resistencia a ambos agentes antimicrobianos
puede ocurrir a travs de la metilacin del sitio blanco ribosomal.
Tal resistencia es tpicamente mediada por los genes erm.
La resistencia inducible a Clindamicina se puede detectar por el
mtodo de difusin, colocando un disco de Clindamicina (2 ug) a
15-26 mm de distancia del borde de un disco de Eritromicina (15
ug) (o a 20 mm de centro a centro).

Luego de la incubacin, los organismos que NO muestren
achatamiento del halo de clindamicina en las proximidades
del disco de eritromicina (denominado D-Test) debern
ser informados como sensibles a clindamicina (D-Test
negativo).
En los organismos que presenten achatamiento en la zona
adyacente al disco de eritromicina, este efecto estara
indicando RESISTENCIA INDUCIBLE A CLINDAMICINA. Estos
aislamientos deberan ser informados como resistentes a
clindamicina (D-Test positivo)

La resistencia a macrlidos tambin puede ocurrir por
eflujo, en este caso mediada por los genes msrA.
(D-Test negativo).


E 15: Disco de ERY de 15 g; DA 2: disco de CLI de 2 g
Zonas de inhibicin en la
categora sensible para
ERY y CLI
Eri
S
Da
S
Fenotipo de Resistencia :
Ninguno
E 15: Disco de ERY de 15 g; DA 2: disco de CLI de 2 g
Zonas de inhibicin en
la categora sensible
para CLI

Eflujo



Eri
R
Da
S

La resistencia a macrlidos tambin puede
ocurrir por eflujo, en este caso mediada por
los genes msrA.
Fenotipo de Resistencia :
MSB
(D-Test positivo)
E 15: Disco de ERY de 15 g; DA 2: disco de CLI de 2 g
Achatamiento del halo de CLI en la
proximidad del disco de ERY

Metilacin ribosomal

Eri
R
Da
R
Fenotipo de Resistencia :
iMLSB (inducible)
(D-Test positivo)
E 15: Disco de ERY de 15 g; DA 2: disco de CLI de 2 g
Achatamiento del halo de CLI
en la proximidad del disco de
ERY y crecimiento de pequeas
colonias intrahalo entre ambos
discos
Metilacin ribosomal

Eri
R
Da
R
Fenotipo de Resistencia :
iMLSB (inducible)
No hay halos de
inhibicin
E 15: Disco de ERY de 15 g; DA 2: disco de CLI de 2 g
Metilacin ribosomal

Eri
R
Da
R
Fenotipo de Resistencia :
cMLSB (constitutivo)
En 1997, fue aislada en
Japon, la primera cepa
clnica de Staphylococcus
aureus VISA (Vancomycin
Intermediate S. aureus )
por el Prof. Keiichi
Hiramatsu, da Univesidad
Juntendo en Tkio.
VISA (Vancomycin Intermediate S. aureus)
Potenciales Factores de Riesgo
para VISA y Hetero VISA
Enfermedad de base
MRSA recurrente
Tto. con VAN prolongado (6-18 sem.) en 3-6
meses previos a la infeccin
Los VISA provienen de MRSA pre-existentes
en el paciente.
Bases moleculares de la resistencia a glicopptidos en
Staphylococcus spp
VISA
Diferente a Enterococcus spp.
Biosntesis de pared y rutas
metablicas alteradas
Engrosamiento de la pared
Reducido entrecruzamiento
del PG Muroppidos no
amidados (L-Ala-D-Glu-L-Lys-D-
Ala-D-Ala)
Mayor cantidad de PBP2 y
PBP2a .
No fueron detectadas por test
de difusin con VAN (10 g).
CIM VAN : 4 - 8 g/ml
VRSA
Semejante a Enterococcus spp.
(adquisicin genes van)
Staphylococcus M100 S24 (2014)
VISA (Vancomycin Intermediate S. aureus)
GISA (Glycopeptide Intermediate S. aureus
CIM VAN : 4 - 8 g/ml
VISA Staphylococcus M100 S24 (2014)
VISA (Vancomycin Intermediate S. aureus)

CIM VAN : 4 - 8 g/ml

MECANISMO DE RESISTENCIA
PROPUESTO


TRAMPAS DE AFINIDAD


VAN se unira a Falsos
Targets en la pared celular en
lugar de unirse a sus Targets
Reales
Resistencia a glicopptidos VISA
X
2009 Se elimin la difusin para VAN en SAU
y SCN (M100S19)
VRSA: CIM > 32 g/ml
S. aureus : RESISTENCIA A VANCOMICINA
(VRSA)
DETECCION DE VISA y VRSA
Etest - GRD
Inculo 0,5 Mac Farland en MHB
Mueller Hinton con sangre de carnero 5%
Lectura 24 hrs (si + reportar)
Lectura final 48 hrs
GDR +: CMI Va y/o Teico 8 ug/ml

GISA: GDR + y Etest Va 4 ug/ml
hGISA: GDR + y Etest Va < 4 ug/ml