AGITACION, AIREACION,

ESTERILIZACIN E
INSTRUMENTACIN
AIREACIN -TRANSFERENCIA
DE OXIGENO
Baja solubilidad del O
2
en agua (7 mg/l a 35C)
+
Los microorganismos usan solamente el O
2
disuelto
+
El O
2
es un macronutriente (10
-4
M)
El O
2
debe ser suministrado permanentemente tratando que las
burbujas queden temporalmente retenidas en el seno del lquido
para que el O
2
se transfiera a la fase lquida.
MAYOR
TRANSFERENCIA DE
O
2
MAYOR TIEMPO DE
RETENCIN DE LAS
BURBUJAS
Transporte de Oxgeno en un cultivo microbiano
Formas de suministrar O
2
en un cultivo
Sistemas aireados con agitacin mecnica
sin agitacin mecnica
-tanque agitado
-air lift
-erlenmeyer
1. Difusin del seno del gas a la interfase gas-lquido.
2. Transporte por la pared de la burbuja
3. Movimiento a travs de la interfase G-L
4. Transporte convectivo en el seno del lquido
5. Difusin a travs de la pelicula estancada (interfase L-S)
6. Transporte a travs de la membrana
7. Difusin intracelular hacia el sitio de la reaccin qumica
8. Transporte y reaccin qumica
Transferencia de oxgeno - Modelo de la pelcula o pelcula estancada
Transporte de los compuestos en un cultivo ocurre por el movimiento del fluido
y por difusin ( gradiente de concentracin)
Transferencia G-L . Modelo de la pelcula
P
O2
= H . C*
Ley de Henry
(solubilidad de un gas)
dx
dC
D NO = 2
Ley de Fick
Flujo por difusin
No
2
: moles O
2
/rea / tiempo (densidad de flujo de propiedad, en este caso
transporte de oxigeno)
D: coeficiente de difusin del O
2
dCO
2
/dx: gradiente de concentracin que impulsa la transferencia
Fase gaseosa
X
C*
C
L
Seno de la fase lquida
PO
2
L
Pelcula lquida estanca
La resistencia ms importante
es atravesar la interfase G-L
Transferencia G-L . Modelo de la pelcula
2 2
( * )
L
O O
C C
N D
L

=
2
( * )
O L L
N K C C =
Si C
L
< C*
K
L
=D
O2
/L
K
L
=coeficiente de transferencia de materia
K
L
a coeficiente volumtrico de transferencia de O
2
depende de la
difusividad (D) del oxgeno en el medio y la turbulencia del lquido (L).
Unidades: [h-1].
moles O2/rea / tiempo
Si se utiliza el coeficiente global k
L
y se expresa la velocidad de transferencia de oxigeno
por unidad de volumen de reactor N
O
2
la ecuacin se transforma en:
a: Relacin rea interfacial/volumen del reactor (m interfase/m reactor)
( ) * '
2
C C a k N
L L O
=
El valor de K
L
a est directamente relacionado con la eficiencia
de un biorreactor para transferir oxgeno.
- La concentracin de oxgeno C
L
en el seno del lquido aumenta
hasta alcanzar el valor de C*, de modo que la transferencia de O
2
hacia el seno del lquido (NO
2
) se anula cuando C*=C
L,
cuando se
anula el gradiente.
- Para que la transferencia de oxgeno no se anule, el O
2
debe ser
permanentemente consumido ya sea por un microorganismo o una
reaccin qumica.
) * (
2
L
O
C C a K N L =
K
L
a se determina globalmente
Unidades: [h-1]
Transferencia G-L . Modelo de la pelcula
Resumiendo
Mtodos de determinacin k
L
a
Para la adecuada operacin de un fermentador se hace
necesario conocer el valor del coeficiente volumtrico de
transferencia de O2
Estimado mediante
Correlaciones
k
L
a
Medicin de los flujos de
Oxgeno
k
L
= f (S
c
, S
n
, G
R
)
k
L
a a = f (D
32
, H)
Titulacin * Oxidacin de sulfito de
sodio
Eliminacin del O
2
* Mtodo Dinmico.
Balances de masa * Medicin Directa con
analizador de O
2
Demanda de Oxigeno: rO
2
= dC
L
/ dt = X. qO
2
Transferencia de Oxigeno: NO
2
= dC
L
/ dt = K
L
a (C* -C
L
)
La transferencia debe ser mayor que la demanda
para evitar limitacin de oxigeno.
Cmo aumentar la transferencia de oxgeno?
1- Aumentando el KLa
Condiciones de operacin (caudal de aire, agitacin, etc.)
Diseo del reactor (paletas, baffles)
Reologa del cultivo
2- Aumentando la fuerza impulsora
Aumentar C*
TRANSFERENCIA (NO2) - DEMANDA (rO2)
( ) *
/
C C a k
Y
X
L L
O X
X
=

FACTORES QUE AFECTAN LA TRANSFERENCIA DE O2

K
L
a= D.a
L
Estado de agitacin
(agitacin aireacin)
Re=(nD
2
)/
n=rpm
D=dimetro de las paletas
=densidad
=viscosidad
A > agitacin < L >K
L
a
Antiespumantes > L <K
l
a
Detergentes >L <K
L
a, pero >a >K
l
a
Sustancias orgnicas
Presin
C*= H*PO
2
>P >C*
Temperatura
>T < C*
>T >D
10C-40C: predomina >D, aum.
NO
2
>40C: predomina < C*, dismin. NO
2
KLa (C*-C)
N
O2
=K
L
a (C*-CL)
AGITACIN
La capacidad de un agitador de transmitir potencia al
lquido depende de
AGITACIN
Objetivos
Mantener homognea una
solucin
Mantener solidos en
suspensin.
Mejorar la transferencia
de calor y masa
Transferir
potencia al liquido
Tipo de agitador utilizado
Geometra del agitador
Frecuencia de agitacin
Geometra del reactor
Caractersticas del fluido (densidad,
viscosidad)
En la figura, se presentan distintos tipos de impulsores, utilizados
frecuentemente en fermentadores industriales.
Turbina de disco
(Rushton)
Turbina de palas
planas
Turbina de hlice
El flujo creado es radial, el porcentaje de
turbulencia es elevado y el consumo de
energa importante. Su utilizacin queda
reservada a aplicaciones especficas.
El flujo generado por este tipo de mvil
es predominantemente axial con un
componente radial. Es empleado para la
puesta en suspensin o favorecer el
intercambio trmico en medios no
viscosos.
Mviles clsicos utilizados para el
mantenimiento en suspensin de slidos,
homogeneizacin, emulsin. Tienen un
porcentaje de turbulencia medio. Por
razones de peso, slo se utilizan estos
mviles en pequeo dimetro y funcionan, a
menudo, a gran velocidad (transmisin
directa desde el motor).
La potencia absorbida durante la agitacin de un sistema puede
representarse a travs de mdulos adimensionales, como es el numero de
potencia, definido para sistemas agitados no aireados.
P = potencia transmitida en la agitacin (W)
N = frecuencia de agitacin (rps o s
-1
)
= densidad del lquido (kg/m
3
)
= viscosidad del lquido (kg/m.s)
g = aceleracin de la gravedad (m/s
2
)
D
i
= dimetro del agitador (m)
H
L
= altura de la columna lquida (m)
D
T
= dimetro del tanque (m)
W
B
= ancho del bafle (m)
C = distancia del agitador al fondo del reactor (m)
W
i
= altura de la paleta de la turbina (m)
|
|
.
|

\
|
= ,... , , ,
2 2
5 3
i
B
i
T
i
L i i
i
D
W
D
D
,
D
H
g
D N ND
f
D N
P

|
|
.
|

\
|
= ,... , , ,
Re
i
B
i
T
i
L
Fr P
D
W
D
D
,
D
H
N N f N
Fr
z x
P
N bN N Re =
Las relaciones geomtricas del tanque, impulsor y elementos de
agitacin estticos (pantallas deflectoras) utilizados de forma
estndar en los tanques de fermentacin industriales se resumen
a continuacin.
En la figura observamos las curvas de potencia para los tres tipos de impulsores, en
la cual hay definida 3 zonas: Re inferiores a 10 (rgimen laminar), donde el numero
de potencia disminuye con el Reynolds (x = -1), con lo cual la potencia suministrada
al fluido (P) puede relacionarse con la variables de operacin segn:
X
P
b N Re =
3 2
2 5 3 5 3
Re
D N b P
ND
b
D N
P
N
b
D N
P
i i
P
i

=
= = =
Para Re comprendidos entre 10 y 1000, se tiene una zona de
transicin, donde la forma de las curvas depende de la geometra
del tanque, adems de las condiciones de operacin.
Para Re superiores a 10000, zona turbulenta, la influencia del
numero de Reynolds sobre el nmero de potencia es despreciable,
obtenindose curvas planas (x=0). La potencia depender de:
En fermentadores de grandes dimensiones es necesario colocar
mas de un impulsor para conseguir una buena mezcla y absorcin
del oxigeno, la distancia de separacin entre impulsores se sita
entre una y dos veces el dimetro del impulsor. En cuanto a la
potencia absorbida se ha visto que esta es directamente
proporcional al numero de impulsores.
5 3
D N b P =
Agitacin en sistemas aireados
Cuando se introduce aire en un medio liquido previamente agitado hay una
reduccin instantnea de las necesidades de la potencia necesaria para su agitacin. La
disminucin se debe principalmente a que los valores de la densidad y la viscosidad de la
fase liquida disminuyen aparentemente, especialmente en las zonas prximas al
impulsor, debido a la aparicin de burbujas.
Uno de los parmetros caractersticos de los sistemas aireados es el hold up o
retencin de la fase de gas (g)
El fluido es una dispersin de burbujas, entonces el sistema se comportara como un
liquido con una densidad g menor que la del liquido , que se puede relacionar segn:
l g
g
g
V V
V
+
= c
( )
( )
5 3
1
1
D N
P
N
P
P
g
P
g
g g
g g

c
=
= =
= Mtodo para calcular la
disminucin de la potencia debida
a la aireacin. Este mtodo
depende de todas las variables que
alteren el hold up: velocidad de
agitacin, diseo del impulsor y
burbujeador, tamao de la
burbuja, caudal de gas, viscosidad,
etc.
Para estimar las necesidades de potencia en sistemas aireados se define un
modulo adimensional: numero de aireacin (Na), el valor de este modulo nos
indica el grado de dispersin de las burbujas en los alrededores del impulsor.
La relacin entre la potencia absorbida expresada en funcin del numero
de potencia (Np) y el numero de aireacin (Na) puede obtenerse en
correlaciones empricas como la representada en la figura.
3
2
ND
Q
ND
D
Q
N
g
g
a
= =
Velocidad superficial del gas
Velocidad tangencial en el
extremo del impulsor
Ejercicios
1. Se considera un tanque de fermentacin de 1 metro de dimetro,
equipado con una turbina de disco. El tanque dispone de pantallas
deflectoras y las proporciones geomtricas de los diferentes elementos se
corresponden a las detalladas en la figura de las relaciones geomtricas
del tanque, impulsor y elementos de agitacin estticos. Para un proceso
concreto se establece la utilizacin de un medio de cultivo con una
densidad de 1.100 kg/m3, y una viscosidad de 0.01 kg/ms. Las
condiciones de operacin vienen fijadas por un caudal de aireacin de
0.7 vvm (volmenes de aire por volumen de fermentador y minuto) y
una velocidad de agitacin de 250 rpm. Calcular los requerimientos de
potencia del sistema sin aireacin, la potencia para el sistema aireado y
la retencin de gas (g).
2. Calcular los requerimientos de potencia, con y sin aireacin, para un
tanque agitado de 1.5 m de dimetro, que contiene agua a una altura
de 1.5 m, esta equipado con una turbina Rushton de 6 palas cuyo
dimetro es 0.5 m, las pala tienen las siguientes dimensiones: 0.25 m
de largo y 0.2 m de ancho y con una velocidad de rotacin de 180
rpm. El aire es suministrado al tanque a una velocidad de 0.6 m/min.
La viscosidad del agua es 0.001 kg/ms y la densidad es 1000 kg/m
ESTERILIZACIN
La esterilizacin de un medio o un ambiente es una operacin destinada a eliminar
todas las formas vivas, ya sea destruyndolas o removindolas. La esterilizacin busca
evitar los efectos adversos de la presencia de organismos extraos al proceso
biotecnolgico (contaminantes), los que podran:
a) Consumir nutrientes, rebajando el rendimiento
b) Producir sustancias inhibitorias al proceso o perjudiciales a la separacin del
producto
c) Formar compuestos que descomponen el producto
Un proceso tpico de fermentaciones es susceptible de contaminarse de muchas
maneras, pero se consideran los siguientes elementos como los mas crticos:
1. El medio de cultivo
2. El inoculo y el proceso de inoculacin
3. El suministro de aire
4. La adicin de nutrientes, antiespumantes, etc., durante el proceso
5. El fermentador en si mismo
La destruccin de microorganismos depende de variables como:
Caractersticas del contaminante (formacin de esporas, termo resistencia, clulas
vegetativas, etc.)
Estado fisiolgico
Temperatura
pH
Destruccin
Mtodos para destruir, separar o inactivar la actividad
microbiana
Qumicos
Radiacin
Calor
Mecnica
Filtracin
Centrifugacin
Refrigeracin
Secado
Reduccin del contenido de agua
Esterilizacin de sistemas acuosos
Esterilizacin del aire Filtracin
Calor
Cloracin
Separacin
Inhibicin
ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVO
El proceso mas difundido de esterilizacin de medios de cultivo es la esterilizacin
por calor hmedo. Las formas mas resistentes de contaminacin microbianas son las
esporas de bacterias. En ambiente seco, su destruccin por calor exige temperaturas
del orden de 160 a 170 C por hasta dos horas y en ambiente hmedo (vapor
saturado) a 121C se necesitan cerca de 20 minutos.
Resistencia relativa al calor hmedo: Endoesporas >>> Clulas de bacterias de E. coli
Cuanto mayor la humedad, mas baja es la temperatura de desnaturalizacin de las
protenas Menor grado de hidratacin mayor es la resistencia de la protena a
coagular
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 10 20 30 40 50 60
T coagulacin
% de Humedad
T

C
o
a
g
u
l
a
c
i

n
Cintica de Destruccin de Microorganismos por calor
Segn se ha observado experimentalmente, la destruccin de los m.o por
calor es semejante a una reaccin qumica de primer orden, donde la tasa
de reaccin es proporcional a la poblacin viable presente, situacin
expresada por la ecuacin:
N/No es la fraccin de organismos viables que sobreviven despus del
tratamiento por calor durante el tiempo t y k = constante de velocidad de
destruccin, depende del m.o y del medio y es funcin de la temperatura.
kt
No
N
kN
dt
dN
=
=

ln
N: nmero de microorganismos
viables
t: tiempo del tratamiento
k: constante de velocidad
(constante de muerte trmica)
N/No
Curva de destruccin trmica de clulas
de E. coli a varias temperaturas
10
-1
2 4 6
10
-2
1
10
-3
10
-4
8
60C
58C
56C
54C
Tiempo (min)
Curva de destruccin trmica de
esporas de B. stearothermophilus a
varias temperaturas
10
-1
5 10 15
10
-2
1
10
-3
10
-4
20
121C 116C
110C
105C
N/No
Tiempo (min)
Tiempo de Reduccin Decimal
Es usual utilizar otro parmetro en vez de k. Es el denominado tiempo de
reduccin decimal representado por D y es definido como el tiempo necesario
para reducir la poblacin a un decimo del valor inicial. La relacin entre D y k
se puede obtener a partir de la ecuacin N=N
0
exp (-kt), con N
0
= 10 y N= 1
da:
D = 2.303
k
donde D se expresa generalmente en minutos
Tiempo de muerte trmica
Tiempo requerido para eliminar una poblacin celular.
F = n*D
n= Nmero de ciclos log para eliminar una determinada poblacin celular.
D = Tiempo de reduccin decimal.
FILTRACION A TRAVES DE LECHO FIBROSO
Los filtros de material fibroso son rellenos con: lana de algodn, lana de vidrio o lana
de escorias, y a travs de ellos circula el aire a ser esterilizado.
Las partculas solidas de microorganismos contenidas en el aire quedan retenidas sobre
las fibras a medida que este se desplaza.
Una partcula puede ser retenida por la fibras a travs de 3 mecanismos: impacto
inercial, interceptacin y difusin y la predominancia de cada uno de ellos depende
de la velocidad superficial lineal del aire a travs del filtro.
Para un filtro de largo L en el cual entran N
0
y salen N esporas de microorganismo, la
ecuacin de diseo es
N
N
L L
0
90
log =
ESTERILIZACION DE AIRE
FILTRACION A TRAVES DE MEMBRANAS MICROPOROSAS
Se trata de filtros hechos de membranas porosas y los materiales mas utilizados
son esteres de celulosa, polmeros de vinilo, poliamida y tefln. Las
membranas son instaladas en cartuchos cuya utilizacin es bastante practica.
Ellas tienen un espesor muy reducido (cerca de 100 m) y elevada porosidad
(de 70 a 80%) extremadamente uniforme, lo que permite obtener flujos
aceptables.
Los filtros de membrana micro porosa son filtros absolutos, ya que el dimetro de
sus poros (que varan entre 0.2 y 0.5 m) es inferior al dimetro del material
a retener (clulas vegetativas y esporas).
Las membranas utilizadas por sus caractersticas hidrofbicas pueden ser
esterilizadas con vapor.
Debido a la mayor cada de presin, propia de este tipo de filtro, es necesario
operar con una combinacin optima de etapas y tamaos para asegurar la
solucin mas econmica.
INSTRUMENTACIN
Caractersticas de la instrumentacin
utilizada en bioprocesos
Resistir procesos de esterilizacin, normalmente mediante el uso
de vapor (1.2 atm y 121C).
Tienen que poder ser usadas en medios de turbidez elevada.
Ser insensibles a la adsorcin de protenas y al crecimiento celular
sobre ellas o bien estar protegidas para evitar estos fenmenos.
Poseer una alta resistencia a fuerzas mecnicas y a posibles
erosiones por parte de partculas solidas.
Especificidad con respecto al parmetro que se desea medir y
deteccin, en muchos casos, de bajas concentraciones de los analitos.
Reproducibilidad o repetitividad del anlisis, lo que puede suponer
la realizacin de recalibraciones del equipo mediante la inyeccin de
patrones de analito a analizar.
Los tiempos de respuesta deben de ser cortos.
Facilidad de comunicar el equipo para transmitir y procesar la
seal de medida.
Una primera clasificacin de la manera de realizar la medida en
un proceso biotecnolgico es en funcin de cmo y donde se realiza
esta.
Discontinuo (off-line)
En lnea (on-line)
In situ (in-line)
Implican la toma de muestra y su
posterior tratamiento y anlisis.
La instrumentacin analtica se encuentra
fuera del bioreactor, se necesita de un
equipo de toma de muestras que
proporcione una corriente con biomasa o
libre de la misma. A continuacin se
dispone de un equipo de anlisis
automtico que proporcione la medida en
un periodo de tiempo relativamente corto.
El sensor analtico se encuentra en el
interior del bioreactor en contacto con el
medio de cultivo. Es limitada a
caractersticas fisicoqumicas del proceso y
no al anlisis de sustratos o productos.
Esquema de las posibilidades de instrumentacin en un
bioreactor
El paso previo para la aplicacin de muchas de las tcnicas
analticas es la disponibilidad de una muestra en lnea, libre o no
de biomasa.
Equipos de Toma de Muestra
Las dos funciones bsicas del equipo de toma de muestras son el transporte
de la solucin que contiene el analito a analizar hasta el sensor y el
mantenimiento de las condiciones de esterilidad.
Directos
El mas utilizado a escala de laboratorio es una bomba peristltica conectada
a un tubo recolector proveniente del bioreactor. Esta muestra generalmente
no es recirculada al bioreactor y suele utilizarse para determinar parmetros
relacionados con la biomasa.
Indirectos
El objetivo es obtener una muestra del bioreactor libre de biomasa y
partculas en suspensin que pueda interferir en el posterior anlisis, lo que se
consigue mediante la utilizacin de membranas.
La eleccin de un sistema apropiado de toma de muestras para el anlisis
determinado de un analito depender de las caractersticas del medio de
fermentacin, del riesgo de contaminacin del bioproceso y de la sensibilidad
del microorganismo a las limitaciones de oxigeno y fuerzas de cizallamiento.
Sensores de parmetros fsicos y qumicos
Sensores de parmetros fsicos
Los principales parmetros fsicos que tienen influencia en el comportamiento
celular y que estn disponibles para su monitoreo en lnea son: la
temperatura, la presin, la potencia y velocidad de agitacin, la viscosidad,
los caudales de lquidos y gases, la deteccin de espumas y el contenido del
reactor.
Un termopar: diferencia de temperatura
Un tacmetro es un dispositivo para medir la
velocidad de giro de un eje. Revoluciones por
minuto (RPM).
Detecciones de
interfaces
gas/espuma y
espuma/lquido.
Sensores de parmetros qumicos
pH:
pO2:
CO2 disuelto:
nodo y
ctodo
Potencial redox:
Anlisis de Sustratos y productos
Debido a la gran variedad de sustratos y productos analizados, los
equipos analticos que se pueden acoplar para la deteccin de
estas sustancias son muy variados.
Equipos para el anlisis de sustratos y productos
Equipos para anlisis de biomasa y caractersticas
celulares
Mtodos espectrofotomtricos
Auto analizadores
Cromatografa liquida de al resolucin (HPLC)
Cromatografa de gases (GC)
Cromatografa liquida de protenas (FPLC)
Cromatografas
Anlisis por inyeccin de flujo (FIA)
Anlisis inmunolgico por inyeccin de flujo (FIIA)
Biosensores
Biosensores
Es una herramienta o sistema analtico compuesto por un material
biolgico inmovilizado, en ntimo contacto con un sistema transductor
adecuado que convierta la seal bioqumica en una seal elctrica
cuantificable.
En un biosensor, una enzima o un microorganismo completo, lleva a cabo
una reaccin biolgica y los productos de la reaccin se transducen a
seales elctricas, las cuales se convierten a valores de concentracin del
sustrato.