Ctedra: Bioqumica y

Nutricin
Prctica de Laboratorio N
Determinacin de Calcio y
Fsforo
Profesor: Dra.
!o: "e#undo.
Lima$Per%
&'()
Informe de Laboratorio de Bioqumica N
Determinacin de Calcio y Fsforo
I. OBJ!I"O#
Conocer los valores normales de calcio y fsforo en la sangre.
Aprender las tcnicas apropiadas para encontrar estos valores.
II. $%&CO !'&ICO

CLC*+ ,Ca-
.lemento qumico secundario que se encuentra en el medio interno
de los or#anismos como in ,Ca- o formando /arte de otras
mol0culas1 en al#unos seres 2i2os se 3alla /reci/itado en forma de
esqueleto interno o e4terno. Los iones de calcio act%an de cofactor en
muc3as reacciones en5imticas6 inter2iene en el metabolismo del
#luc#eno6 7unto al 8 y N re#ulan la contraccin muscular. .l
/orcenta7e de calcio en los or#anismos es 2ariable y de/ende de las
es/ecies6 /ero /or t0rmino medio re/resenta el &69:; en el con7unto
de los seres 2i2os1 en los 2e#etales6 solo re/resenta el '6''<;.
"u smbolo es Ca.
Caractersticas principales:
.l calcio es un metal alcalinot0rreo blando6 maleable y d%ctil que arde
con llama ro7a formando 4ido de calcio y nitruro. Las su/er=cies
recientes son de color blanco /lateado /ero /alidecen r/idamente
tornndose le2emente amarillentas e4/uestas al aire y en %ltima
instancia #rises o blancas /or la formacin del 3idr4ido al reaccionar
con la 3umedad ambiental. >eacciona 2iolentamente con el a#ua
/ara formar el 3idr4ido Ca,+?-
&
des/rendiendo 3idr#eno.
Funciones:
Pro2ee ri#ide5 y fortale5a a 3uesos6 dientes y encas.
yuda en la re#ularidad de la frecuencia cardaca6 y en la
transmisin de im/ulsos ner2iosos.
Pre2iene enfermedades cardio2asculares6 ya que disminuye los
ni2eles de colesterol en san#re.
Pre2iene los calambres en la musculatura cor/oral6 debido a
que el m%sculo utili5a el calcio /ara reali5ar sus mo2imientos y
contracciones.
.s fundamental /ara que la san#re coa#ule adecuadamente.
.s /re2enti2o ante enfermedades como el cncer.
Contribuye a reducir la tensin arterial en /ersonas con
3i/ertensin arterial.
Pre2iene la osteo/orosis ,/0rdida de masa sea-.
.s acti2ador de diferentes en5imas.
@antiene la /ermeabilidad de las membranas celulares.
.s un coadyu2ante de la acti2idad neuromuscular.
@antiene la /iel sana.
.n la si#uiente tabla se menciona la cantidad de mili#ramos ,m#- de
calcio /resente en una /orcin de alimentos
Alimento Porcin Calcio
(mg.)
Queso (cheddar, mozzarella,
provolone)
('' #r. <)'
Ricota, descremada ( ta5a ,&:'#r- A<'
Yogur , descremado &)' #r. 9(:
Sardinas en aceite (con espinas) ('' #r. )B&
Yogur con frutas, descremado &)' #r. )9:
eche, descremada ( ta5a &C'
eche , entera ( ta5a &<A
!orotos o semillas de so"a, cocidos ( ta5a ,(B'
#r.-
&A'
almendras ('' #r. &:'
#spinaca, cocida, sin sal ( ta5a ,(B'
#r.-
&9:
$ofu, s%lido, con sulfato de calcio ('' #r. &')
&ar'anzos, cocidos ('' #r. ()9
Yema de huevo ('' #r. ()'
(vellanas, pistachos (''# (&'
)ueces ('' #r. C'
*r%coli, cocido, ( ta5a ,(:'
#r.-
A&
Yema de huevo ( #rande (<
Cantidades recomendadas de calcio en la dieta:
#dad
Cantidad de calcio
+ue se re+uiere en la
ingesta diaria
.ntre los C y los (B ()'' m#.
.ntre los (C y los :' (''' m#.
@ayor de :' (&'' m#.
.st embara5ada o lactando
,menor de (B a!os-
()'' m#.
.st embara5ada o lactando
,mayor de (B a!os-
(''' m#.
limentos con mayor contenido de calcio
Productos lcteos
Frutos secos
"ardinas y las anc3oas
Le#umbres y 2e#etales 2erdes oscuros ,es/inaca6 acel#a6
broccoli-.
FD"F+>+ ,P-
.lemento qumico de n%mero atmico (: y smbolo !. .s un no metal
multi2alente /erteneciente al #ru/o del nitr#eno ,Eru/o (: ,F-:
nitro#enoideos- que se encuentra en la naturale5a combinado en
fosfatos inor#nicos y en or#anismos 2i2os /ero nunca en estado
nati2o. .s muy reacti2o y se o4ida es/ontneamente en contacto con
el o4#eno atmosf0rico emitiendo lu56 dando nombre al fenmeno de
la fosforescencia.
Caractersticas principales
.l fsforo com%n es un slido ceroso de color blanco con un
caracterstico olor desa#radable6 /ero /uro es incoloro. .ste no metal
es insoluble en a#ua6 y se o4ida es/ontneamente en /resencia de
aire formando /ent4ido de fsforo6 /or lo que se almacena
sumer#ido en a#ua.
.4isten 2arias formas alotr/icas del fsforo siendo las ms comunes
el fsforo blanco y el ro7o1 ambos formando estructuras tetra0dricas
de cuatro tomos. .l fsforo blanco6 e4tremadamente t4ico e
inGamable /resenta dos formas6 alfa y beta6 con una tem/eratura de
transicin de $)6B HC1 e4/uesto a la lu5 solar o al calor ,)''HC- se
transforma en fsforo ro7o en reaccin e4ot0rmica. Iste es ms
estable y menos 2oltil y t4ico que el blanco y es el que se
encuentra normalmente en los laboratorios y con el que se fabrican
las cerillas. .l fsforo ne#ro /resenta una estructura similar al #ra=to
y conduce la electricidad6 es el ms denso de los otros dos estados y
no se inGama.
El fsforo y el calcio se encuentran en equilibrio en el organismo, ya que la abundancia
o la carencia de uno afecta la capacidad de absorber el otro. El exceso de fsforo,
produce menor asimilacin de calcio. Se ha comprobado que la ingestin frecuente de
anticidos genera una falta de este macromineral en el organismo
III. C(#!ION%&IO
Calcio
,-. /mportancia del calcio en el meta'olismo %seo-
Jres son las /rinci/ales 3ormonas sist0micas que re#ulan las
acti2idades de formacin y reabsorcin seas1 3ormona /aratiroidea
,PJ?-6 calcitonina ,CJ- y 2itamina D acti2a K(6&:,+?-
&
D
)
L.
Jodas ellas /artici/an en el mantenimiento de la constancia de la
concentracin /lasmtica de calcio1 /ara ello6 no solo e7ercen su
accin sobre el 3ueso6 sino tambi0n sobre el intestino y el ri!n.
.4isten tambi0n otras 3ormonas que /artici/an6 en menor medida6 en
la re#ulacin del metabolismo seo y de la 3omeostasis del calcio y el
fosfato: #lucocorticoides6 /0/tido relacionado con la PJ? ,PJ?
/r
-6
/0/tido relacionado con el #en de la calcitonina ,CE>P-6 estr#enos6
/rolactina6 3ormonas tiroideas6 insulina6 3ormona del crecimiento
,E?-6 *EF$* y otros factores de crecimiento.
La !$0 ,Parat3ormona- se secreta /or las #lndulas /aratiroideas y
es im/ortante /ara el mantenimiento de la calcemia. .sta 3ormona
aumenta la resorcin sea6 aumenta la reabsorcin tubular renal de
calcio6 y aumenta la absorcin intestinal de calcio estimulando la
sntesis renal de (6&:$2itamina D1 /or lo tanto aumenta la calcemia.
"u secrecin aumenta cuando desciende la calcemia y disminuye
cuando esta aumenta.
La 1itamina 2 es /roducida /rinci/almente /or la /iel. .n la /iel se
sinteti5a /or la accin de la lu5 solar sobre el <$de3idrocolesterol1
/ero debe transformarse en (6&:$2itamina D6 /ara e7ercer acti2idad
biol#ica. .sta transformacin se /roduce /rinci/almente en el ri!n
/or estmulo de la PJ?. Produce un aumento en la absorcin intestinal
de calcio6 manteniendo los ni2eles normales de calcemia
contribuyendo a la normal minerali5acin del 3ueso.
La Calcitonina es una 3ormona secretada /or las c0lulas C de la
#lndula tiroides. "u secrecin se estimula /or 2arios factores6 entre
ellos el aumento de la calcemia. "us efectos /redominantes son el
descenso de la resorcin sea y de la reabsorcin tubular renal de
calcio.
+tras 3ormonas act%an sobre el metabolismo del calcio y del 3ueso6
como los esteroides #onadales y su/rarrenales6 la tiro4ina6 la insulina
y la 3ormona del crecimiento6 aunque6 a diferencia de las 3ormonas
calciotro/as6 su secrecin no de/ende /rinci/almente de la
concentracin e4tracelular de calcio.
La concentracin de las 3ormonas que re#ulan el metabolismo del
calcio determina la direccin del recambio seo6 /ero los factores
locales modulan el efecto =nal y6 a su 2e56 modi=can la concentracin
de las 3ormonas y la res/uesta biol#ica a ni2el de los osteoblastos y
los osteoclastos.
3-. Factores +ue regulan el meta'olismo del calcio-
Factores +ue favorecen la a'sorci%n:
Fitamina D: La forma acti2a de la 2itamina D es determinante
en la asimilacin de este mineral. "i est /resente en las
cantidades adecuadas fa2orece la absorcin del calcio.
Ba7o consumo de calcio: La cantidad de calcio absorbido /or el
or#anismo ser menor cuando lo consumimos de una sola 2e5
en #randes cantidades. .s /referible tomarlo en dosis menores
durante el da as se fa2orecer la absorcin. No se recomienda
tomar ms de :'' m# de calcio de una sola 2e5.
Ba7o ni2el san#uneo de calcio: "i el ni2el de calcio en san#re
ba7a6 se acti2a una 3ormona6 la /aratiroidea que estimula la
con2ersin de la 2itamina D en el ri!n a su forma acti2a
fa2oreciendo la absorcin intestinal de calcio.
.7ercicio moderado: Fa2orece la asimilacin del calcio.
.dad: La absorcin del calcio es de alrededor del A' ; en
infantes y ni!os ya que el or#anismo necesita el calcio /ara el
desarrollo normal de 3uesos y dientes.
Factores +ue afectan la a'sorci%n de calcio
La correcta absorcin del calcio es fundamental ya que e4isten
factores que la fa2orecen y otros que la im/iden.
La absorcin de calcio se re=ere a la cantidad de calcio que es
absorbida desde el tracto di#esti2o 3acia nuestra circulacin
san#unea.
Factores +ue impiden la a'sorci%n:
.7ercicio 2i#oroso: Di=culta la absorcin de calcio
.dad: La absorcin de calcio disminuye durante la adulte5 en un
(:$&';. Por ello las recomendaciones diarias aumentan /ara
com/ensar.
Fsforo ,en e4ceso-: Las bebidas #aseosas con alto contenido
en fsforo no resultan bene=ciosas. .s de #ran /reocu/acin
3oy en da que ms all que las #aseosas conten#an alto
contenido en fsforo6 la lec3e sea reem/la5ada /or las mismas
ocasionado la carencia de calcio entre los ni!os y adolescentes.
@a#nesio y fsforo ,en e4ceso-: La absorcin de estos dos
minerales tambi0n requieren de 2itamina D. /or ellos si se
consumen en e4ceso6 3abr menor cantidad de 2itamina D
dis/onible /ara que el calcio se absorba.
Minc: Consumido en e4ceso tambi0n obstaculi5a la correcta
absorcin de calcio
lco3ol: >educe la absorcin intestinal de calcio. *n3ibe ciertas
en5imas en el 3#ado que con2ierten a la 2itamina D en su
forma acti2a reduciendo as la absorcin.
Cafena: .l caf0 tomado en alta cantidades /uede aumentar la
e4crecin de calcio y disminuir la absorcin. Nna ta5a de caf0
causa una /0rdida de calcio de &$) m# que es fcilmente
com/ensada a#re#ndole ( cuc3arada de lec3e. .l consumo
moderado de cafena ,( ta5a de caf0 o & ta5as de te /or da-
tiene muy /ocos efectos ne#ati2os siem/re y cuando la in#esta
de calcio sea la adecuada.
?ierro: "i consumimos calcio 7unto con 3ierro6 ambos com/iten
en la absorcin6 as que el efecto de ambos se 2e muy reducido.
Con2iene no me5clarlos.
Protenas y sodio: medida que aumentamos la cantidad de sal
y /rotenas a nuestra dieta6 aumenta la cantidad de calcio que
se e4creta.
Ocido o4lico: Presente en almendras6 so7a6 cacao6 es/inacas y
acel#as6 se une al calcio de esos alimentos6 y forman un
com/uesto muy difcil de ser absorbido /or el intestino. La
absorcin de calcio de otros alimentos que sean consumidos en
la misma comida no se 2er afectada. .stos alimentos que
contienen cido o4lico resultan /er7udiciales6 siem/re y cuando
su consumo se realice en cantidades ele2adas.
Fitatos: l i#ual que el cido o4lico se une al calcio en el
intestino im/idiendo su absorcin. diferencia del anterior6 los
=tatos se unen al calcio de otros alimentos que se consumen en
la misma comida im/idiendo su absorcin. "e encuentran en
cereales inte#rales.
Dieta rica en #rasas y a5%cares: aumenta la eliminacin del
calcio.
4-. #ntidades clnicas en casos de alteraciones en las
concentraciones de calcio-
Falores normales
Los 2alores normales 2an de B.B a ('.< m#Pdl en adultos6 y de (' a (&
m#Pdl en ni!os. Los ran#os de los 2alores normales /ueden 2ariar
li#eramente entre diferentes laboratorios.
>esultados anormales
Los ni2eles /or encima de lo normal /ueden indicar:
?i/er/aratiroidismo
Jumor metastsico de 3ueso
"ndrome de lec3e y alcalinos
@ieloma m%lti/le
.nfermedad de Pa#et
"arcoidosis
Jumores que /roducen una sustancia similar a la PJ?
,3ormona /aratiroidea-
*nto4icacin /or 2itamina D
*n#esta e4cesi2a de calcio
*nmo2ili5acin /rolon#ada
?i/ertiroidismo ,acti2idad e4cesi2a de la #lndula
tiroides-
.nfermedad de ddison ,acti2idad de=ciente de la
#lndula su/rarrenal-
Diur0ticos tia5dicos
Litio
F*?P"*D
Los ni2eles /or deba7o de lo normal /ueden indicar:
?i/o/aratiroidismo
@alabsorcin ,absorcin inadecuada de los nutrientes del
tracto intestinal-
+steomalacia
Pancreatitis
*nsu=ciencia renal
>aquitismo y de=ciencia de 2itamina D
.nfermedad 3e/tica ,disminucin de la /roduccin de
alb%mina-
@a#nesio s0rico ba7o
?*P.>CLC.@*
.l aumento del calcio s0rico se asocia a #ran morbilidad y es
causa de mortalidad6 sobre todo si no se dia#nstica y se trata a
tiem/o y adecuadamente. La 3i/ercalcemia es secundaria a un
incremento en la resorcin sea o en la absorcin intestinal de
calcio.
Causas:
?i/er2itaminosis
?i/ercalcemia neonatal
limentacin /arenteral
?i/ercalcemia /or medicamentos:
mino=lina
.str#enos y tamo4ifeno
?i/er2itaminosis
*nsu=ciencia renal crnica
Nso de sales de calcio
Des/u0s de tras/lante renal
La 3i/ercalcemia se /resenta cuando la entrada de calcio a la san#re
es mayor que su 2elocidad de salida. La absorcin de calcio del
intestino y ms frecuentemente6 la mo2ili5acin de calcio del 3ueso
3acia la san#re6 son tan #randes6 que e4ceden la ca/acidad del ri!n
/ara eliminarlo o del esqueleto /ara de/ositarlo en la fase mineral
sea. .n otras ocasiones6 la entrada normal de calcio a la san#re
conduce a 3i/ercalcemia6 debido a que estn limitadas la ca/acidad
de minerali5acin del 3ueso6 la e4crecin renal de calcio o ambas.
?*P+CLC.@*
@ientras la 3i/ocalcemia le2e suele ser asintomtica6 la
3i/ocalcemia #ra2e se caracteri5a /or arritmias cardiacas y
tetania con /arestesia de las manos6 /ies y labios.
Los trastornos 3i/ocalc0micos se /ueden di2idir en: De=ciencia
/rimaria de PJ? o de calcitriol e 3i/o2itaminosis D.
.l mecanismo de accin de la PJ? en sus r#anos blanco
de/ende del calcitriol1 /or lo tanto6 la 3i/ocalcemia que ocurre en
ausencia de calcitriol se /resenta a /esar que los ni2eles de PJ?
sean normales o altos.
.n el 3i/o/aratiroidismo6 la ausencia de PJ? reduce la sntesis de
la (6&: di3idro4i D) y em/eora la 3i/ocalcemia asociada.
Fosforo
,-. /mportancia del fosforo en el meta'olismo %seo-
La funcin del fsforo en relacin con los 3uesos es sobre todo de
sostenimiento6 ya que este mineral entra en la constitucin del
fosfato triclcico. "e 3alla tambi0n el fsforo en los cartla#os
articulares6 sos/ec3ndose que al#unos reumatismos crnicos son
debidos a falta de fsforo. .l fsforo se encuentra i#ualmente en
combinacin or#nica formando la osteina6 sustancia fundamental del
te7ido seo
3-. Factores +ue regulan el meta'olismo del fosforo-
4-. #ntidades clnicas en casos de alteraciones en las
concentraciones de fosforo-
Qa que el fsforo se encuentra en la mayora de los alimentos6 la
carencia de este mineral es muy rara.
Falores normales
Los 2alores normales 2an de &6: a 96: m#Pdl en adultos y de ) a A
m#Pdl en ni!os. Los ran#os de estos 2alores normales /ueden 2ariar
li#eramente entre diferentes laboratorios.
>esultados anormales
Los ni2eles /or encima de lo normal /ueden indicar:
@etstasis sea
?i/ocalcemia
?i/o/aratiroidismo
umento de la in#esta de fsforo en la dieta o /or 2a *F
.nfermedad 3e/tica
*nsu=ciencia renal
"arcoidosis
Los ni2eles /or deba7o de lo normal /ueden indicar:
Cetoacidosis diab0tica
?i/ercalcemia
?i/erinsulinismo
?i/er/aratiroidismo
*n#esta inadecuada de P+9 o 2itamina D en la dieta que
ocasiona raquitismo ,en la ni!e5- u osteomalacia ,adulte5-
Control )ormonal
!os niveles de Ca
""
y #$% son controlados por #&', (,)*+dihidroxi vitamina ,. !a
(,)*+dihidroxi vitamina , aumenta la absorcin de calcio y fosfato en el intestino,
mientras que la #&'-
Aumenta el calcio y la liberacin de #$% del hueso
,isminuye la prdida de calcio y aumenta la prdida de #$% en la orina
Aumenta la conversin de )*+hidroxi vitamina , a (,)*+dihidroxi
vitamina , en los ri.ones.
I". *%&! +*&I$N!%L
Determinacin del Calcio s,rico
(.$ Fundamento
Para la si#uiente /rctica se reali5 el m0todo colorim0trico de Falter.
Ntili5ando CFC ,cresolftalena com/le4ona-6 la cual reacciona con el
Ca
RR
y el @#
RR
en medio alcalino fuerte1 formando un com/uesto
coloreado. La interferencia del @#
RR
es eliminada con B$
3idro4oquinona.
&.$ J0cnica
"e reali5an las si#uientes me5clas:
Reactivos Standar
d
2esconocid
o
Reactivo ((Cp5)
:' l 67 l
Reactivo *
('u8er)
4-6 ml 4-6 ml
"e debe determinar los BLNC+" *NJ.>N+" ,B" y BD- /ara
controlar tra5as de Ca
R&
que no son de la muestra
Leer la absorbancia de los & tubos contra blanco de a#ua
destilada a :<' nm.
Lue#o6 a#re#ar los si#uientes com/onentes:
Soluciones Standard 2esconocido
Standard
&' l
.
9uestra (suero) .
37 l
@e5clar inmediatamente.
*ncubar /or (' minutos a JH ambiente.
Leer a :<' nm.
Los 2alores de absorbancia de estos tubos sern: " y D
). $ Clculos:
" $ B" S " corre#ido
D $ B@ S D corre#ida
KCaL ,m#Pdl- S D corre#ida 4 (' m#P dl
" corre#ida
9.$Falores re#ferenciales:dultos: B6: $('6: m#Pdl
:.$>esultados:
B" S '.C9:
BD S '.C&<
" S (.:9B
D S (.9):
" corre#ido S " $ B" S '.A')
D corre#ido S D $ BD S '.:'B
De la frmula:
KCaL ,m#Pdl- S '.:'B 4 (' m#Pdl
'.A')
KCaL ,m#Pdl- S B.9 m#Pdl
A. $ *nter/retacin de resultados:
"e obtu2o como resultado del e4/erimento un 2alor deba7o de los
ran#os referenciales /ara el calcio6 /ero esta diferencia no indicara
que el /aciente tiene 3i/ocalcemia6 ya que esta diferencia se
considerara dentro de los 2alores normales.
Determinacin del fsforo inor-.nico en suero
(.$ Fundamento
.l fsforo inor#nico reacciona en medio acido con el @+L*BDJ+
formando F+"F+@+L*BDJ+ que es reducido /or el C*D+
"C+>B*C+ a MNL D. @+L*BD.N+6 desarrollndose un color en
medio arsenitoPcitrato. .l arsenito se combina con el e4ceso de
molibdato /ara im/edir su reaccin con fosfatos liberados
/osteriormente con esteres lbiles.
&.$ J0cnica
"e reali5an las si#uientes me5clas:
Reactivos *lanco Standard 2esconocido
9uestra
(suero)
$$$ $$$
37 l
Standard $$$
&' l
...
Reactivo,
(9:/*2($:)
, ml , ml , ml
@e5clar /or a#itacin sua2e.
*ncubar a )<C /or )' se#undos m4. & minutos. #re#ar:
Reactivo3
((C/2:
(SC:R*/C:)
, ml , ml , ml
@e5clar /or a#itacin sua2e.
*ncubar a )<C /or )' se#undos m4. & minutos. #re#ar:
Reactivo 4
((RS#)/C:;C/$R(
$:)
, ml , ml , ml
@e5clar /or in2ersin.
los (' minutos retirar del ba!o mara
Leer entre A&'$A:' nm.
). $ Clculos:
KPiL,m#Pdl- S D 4 9 m#P dl
"
9. $ Falor referencial: dultos: &6: T 96: m#Pdl
Ni!os: 9.' T A.: m#Pdl
:.$>esultados:
B S '.')<
" S '.'B'
D S '.'A&
" corre#ido S " $ B S '.'9)
D corre#ido S D $ B S '.'A
De la frmula:
KPiL,m#Pdl- S '.'A 4 9 m#Pdl
'.'9)
KPiL,m#Pdl- S &.)& m#Pdl
A. $ *nter/retacin de resultados:
"e obtu2o como resultado del e4/erimento un 2alor deba7o de los
ran#os referenciales /ara el fosforo inor#nico6 /ero esta diferencia
no indicara que el /aciente tiene
". CONCL(#ION#.
.s necesario saber si 3ubo al#%n error en el
/rocedimiento o si los materiales no estaban en /timo
estado antes de 3acer un dia#nstico6 ya que esto nos
/uedo conlle2ar a un resultado errneo.
"I. BIBLIO/&%F0%
ND.>"+N U C+C8QN.6 Vumica clnica6 *nteramericana
@C EraW$ ?ill6 @04ico6 (CC:6 /a#. <9 $C&
@ars3all6 X. Y. (CC:. Clinical C3emistry6 )rd ed. @osby6
London.
?eaney6 >. P.6 et al. Calcium6 dairy /roducts and
osteo/orosis. Y m Coll Nutr. &''' /r1 (C ,& "u//l-:B)"$CC".
Baron Y6 Beac3 @6 @andel Y6 2an "tolZ >6 ?aile >6 "andler >6
>ot3stein >6 "ummers >6 "no2er D6 BecZ E6 Bond Y6
Ereenber# . ,(CCC-. [Calcium su//lements for t3e
/re2ention of colorectal adenomas. Calcium Poly/ Pre2ention
"tudy Erou/[. N .n#l Y @ed )9' ,&-: ('($<.