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Bioqumica:
Un estudio prctico de las biomolculas











Patricia Cullar Mata
Universidad de Guanajuato

Luis Felipe Padilla Vaca
Universidad de Guanajuato














Universidad de Guanajuato



2



















Bioqumica: Un Estudio
Prctico de las Biomolculas


Universidad de Guanajuato
Lascurin de Retana No. 5
C. P. 36000
Guanajuato, Gto., Mxico

Impreso en Mxico

ISBN:



Revisin Tcnica
Q. Fernando de Jess Amzquita Lpez
Facultad de Qumica, Universidad de Guanajuato









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PRCTICA 1
AISLAMIENTO DE LACTOSA

OBJETIVO
Obtener un carbohidrato de origen natural atendiendo a sus propiedades fsico-qumicas, mediante
tcnicas sencillas de laboratorio.

FUNDAMENTO
La lactosa O--D-galactopyranosyl-(14)-D-glucopyranose o azcar de la leche se encuentra
naturalmente en la leche en un rango de concentracin entre 0 y 7%, dependiendo de la especie. Los nios
tienen la enzima intestinal -D-galactosidasa o lactasa que hidroliza la lactosa para que sus componentes
puedan ser absorbidos hacia la sangre. La mayora de los adultos, en cambio, tienen un bajo nivel de esta
enzima. Por ello, la lactosa se mueve sin hidrolizarse por el tracto intestinal hasta el colon donde su
fermentacin bacteriana produce grandes cantidades de CO2, H2 y cidos orgnicos irritantes. El resultado
es la difundida intolerancia a la lactosa en la edad adulta.
La lactosa se recupera del suero restante en la leche despus de precipitar y remover las protenas. El
carbono anomrico libre de su residuo de glucosa lo hace un azcar reductor. Bajo hidrlisis del enlace
glicosdico la lactosa produce una molcula de glucosa y una de galactosa.

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO
Probeta de 100 mL,
Termmetro,
Agitador de vidrio,
Embudo Bchner,
Embudo de vidrio,
Parrilla de calentamiento,
Dos matraces Kitasato de 250 mL con trampa de vaco,
Bomba de vaco,
Manguera de ltex,
Vaso de precipitados de 250 mL,
Vidrio de reloj,
Papel filtro,
Adicionalmente: cada equipo aportar gasas





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REACTIVOS EMPLEADOS
Leche descremada en polvo,
Carbonato de Calcio,
Acido actico al 10% (V/V),
Etanol al 96% (V/V),
Agua destilada

PROCEDIMIENTO
1. Coloca 25 g de polvo de leche descremada en un vaso de 250 mL.
2. Adiciona 75 mL de agua caliente y agita. Ajusta la temperatura de la mezcla a 50C.
3. Agrega 10 mL de solucin de cido actico al 10% (V/V) y agita la mezcla por 15 min para coagular
la casena. La precipitacin es completa cuando el color del lquido cambia de blanco lechoso a
amarillo transparente.
4. Remueve la casena precipitada filtrando la mezcla por gravedad a travs de cuatro capas de gasa
doblada. Colecta el filtrado en un matraz de 250 mL. Este lleva la lactosa.
5. Adiciona 2 gramos de CaCO3 en polvo, agtalo bien y hierve la suspensin por 10 minutos.
6. Agita y filtra a vaco esta suspensin sobre papel filtro en un embudo Bchner. Elimina el residuo
slido.
7. Transfiere el filtrado a un matraz de 250 mL y concntralo a un volumen de 30 mL aproximadamente,
por ebullicin en la parrilla elctrica. Evita proyecciones agitando frecuentemente.
8. Retralo de la fuente de calor y agrega 125 mL de etanol al 96% (V/V)
9. Agita la mezcla y fltrala nuevamente.
10. Transfiere el filtrado a un vaso de precipitados, tpalo y djalo en reposo durante 24 h.
11. Retira el sobrenadante por succin y entrgalo al maestro para su recoleccin. No lo viertas a la tarja
12. Colecta los cristales. Estos pueden ser lavados nuevamente con un poco de etanol al 96% (V/V).
Permite que se sequen.
13. Pesa los cristales obtenidos y calcula el rendimiento obtenido.
14. Conserva la lactosa obtenida para las prcticas posteriores.

INVESTIGACIN PREVIA
1. Cita dos propiedades fsicas y/o qumicas de los carbohidratos que permitan su separacin y su
purificacin.



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2. Qu porcentaje de carbohidratos totales y lactosa contiene la leche descremada que utilizars en esta
prctica?
3. Cul es el rendimiento terico esperado?
4. Explica a qu se le llama carbn anomrico e ilstralo con un esquema.

REFERENCIAS
Ault, Addison, Techniques and Experiments for Organic Chemistry. 6 Edicin. University Science
Books. 1998.
Nelson, David L. and Cox, Michael M. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4 Edicin. Ed.
Worth Publishers. 2004.

RESPUESTAS:



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PRCTICA 2
IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS

OBJETIVO
Comprobar las propiedades qumicas ms comunes de los azcares tales como solubilidad y poder
reductor.

FUNDAMENTO
Los carbohidratos son las biomolculas ms abundantes en la tierra. Cada ao, la fotosntesis convierte
ms de 100 000 billones de toneladas de CO2 y H2O a celulosa y otros productos de plantas. As tambin
algunos carbohidratos son alimentos bsicos en la dieta y la oxidacin de estas biomolculas es el camino
de obtencin de energa en la mayora de de clulas no fotosintticas.
Polmeros insolubles de carbohidratos sirven como elementos de estructura y proteccin en la pared
celular de bacterias, plantas y tejidos conectivos de animales. Otros polmeros lubrican articulaciones y
participan en el reconocimiento y adhesin entre clulas.
Los carbohidratos son predominantemente aldehdos o cetonas polihidroxclicos, o substancias que
producen dichos compuestos en hidrlisis. Varios, mas no todos los carbohidratos poseen la frmula
emprica (CH2O)n algunos tambin poseen N, P o S.

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO
Vasos de precipitados de 250 mL,
Parrilla elctrica,
Gradilla y tubos de ensayo,
Pinzas para tubo de ensayo,
Papel filtro,
Probetas de 10 y 100 mL,
Vidrio de reloj,
Esptula,
Agitadores o varilla de vidrio,
Embudo de vidrio,
Papel aluminio,
Pipetas Pasteur,
Bulbos de goma


REACTIVOS
Lactosa obtenida en la prctica anterior (prepara 2,0 mL al 2% en agua destilada),
Miel Karo natural,
Soluciones al 1% de glucosa, fructosa, galactosa, lactosa, sacarosa, D-ribulosa, almidn y miel
(2ml de cada solucin, por equipo)



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Reactivo de Benedict (citrato de sodio, carbonato de sodio anhidro, sulfato de cobre),
Solucin de yodo,
cido clorhdrico 1N (diluido),
cido sulfrico 1N (diludo),
Carbonato de sodio,
Agua destilada.

PROCEDIMIENTO
Preparacin del reactivo de Benedict (por grupo, no por equipo).
34.6 g de citrato de sodio y 20 g de carbonato de sodio anhidro se disuelven en 160 mL de agua
aplicando calor hasta disolucin. Enseguida se agrega lentamente y con agitacin, una solucin de
3,46 g de sulfato de cobre hidratado en 20 mL de agua. Afore a 200 mL con agua destilada (Para 4
equipos).
Preparacin de almidn al 1% (por grupo, no por equipo)
Pesa exactamente 1 g de almidn y mzclalo con 10 mL de agua fra en un vaso de precipitados.
Hierve 90 mL de agua por separado y aade a la solucin anterior agitando constantemente. Vuelve
a hervir la mezcla.

A. Identificacin de azcares reductores
a) Coloca 0,5 mL de cada una de las soluciones de azcar que preparaste en tubos de ensayo. Incluye la
solucin de lactosa que obtuviste en la sesin anterior.
b) Aade 0,5 mL de la solucin de Benedict a cada uno de ellos. Observa la formacin de color o
precipitado. Si en ninguno de ellos se forma, calienta el tubo de ensaye hasta ebullicin en un bao de
agua. La formacin de un precipitado rojo, amarillo o verde amarillento indica la presencia de un
azcar reductor.
c) Anota tus resultados en una tabla. Seala cules son reductores y cules no lo son.
d) Colecta los residuos en el frasco que te indique tu maestro. No los viertas a la tarja.

B. Identificacin de azcares no reductores
a) Toma nuevamente un mililitro de las soluciones de azcar no reductor, aquellas que dieron negativa
la prueba anterior. Aade 0,5 mL de HCl diluido a cada mililitro de la solucin de azcar. Calienta a
ebullicin en bao de agua durante 2 minutos.



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b) Enfra y aade carbonato de sodio en polvo para neutralizar el exceso de cido, esto es, aade una
pizca hasta que no se produzca efervescencia.
c) Determina azcares reductores mediante la prueba de Benedict. Si originariamente estaba presente un
azcar no reductor, deber observarse ahora un resultado positivo a esta prueba.
d) Colecta los residuos en el frasco anterior.

C. Identificacin de polisacridos
Los tres ms comunes son: celulosa, almidn y dextrinas.
a) Reaccin del yodo, para almidn y dextrinas. Colocar aproximadamente 1 mL de la solucin de
almidn y 1 mL de la solucin de miel en dos tubos de ensayo. Aade solucin de yodo gota a gota y
observa el cambio de color:
Para almidn, se produce un color negro azulado.
Para dextrinas, se produce un color marrn rojizo.
Colecta los residuos.
b) Reaccin del yodo, para celulosa. Aade una gota de cido sulfrico diluido a una pequea porcin
de la sustancia seca (celulosa o papel). A poca distancia en el mismo papel, aadir una gota de solucin
de yodo. Es prueba positiva para celulosa si se produce una lnea negro-azulada en la regin de
contacto entre los dos lquidos.

INVESTIGACIN PREVIA
1. Qu tipo de monosacridos son la glucosa, la fructosa y la galactosa? Representa su estructura
mediante la frmula de proyeccin de Fisher.
2. Qu es un azcar reductor? Cita ejemplos de uno y de un azcar no reductor.
3. Investiga dos reacciones qumicas para identificar el glucgeno.

REFERENCIAS:
Shriner, Ralph L., Hermann, Christine K.F., Morril, Terence C., Curtin, David Y., Fuson, Reynold C.
The systematic identification of organic compounds. 7Edicin. John Wiley & Sons, Inc. 1998.
Nelson, David L. and Cox, Michael M. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4Edicin. Worth
Publishers. 2004.




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RESPUESTAS:




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PRCTICA 3
CUANTIFICACIN DE AZCARES

OBJETIVO
Determinar la concentracin de azcar en la muestra de carbohidratos obtenida previamente, mediante
un mtodo espectrofotomtrico.

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO
20 tubos Eppendorf,
Gradilla para tubos Eppendorf,
Placas para ensayo de Elisa,
Micropipetas,
Puntas para micropipeta.
Matraz aforado de 10 mL,
Esptula,
Vrtex,
Guantes desechables

REACTIVOS EMPLEADOS
Solucin patrn de glucosa de 1 mg/ mL (10 mL),
Papel encerado,
Papel aluminio,
Acido sulfrico concentrado,
Fenol al 80% (V/V) en etanol absoluto (Utiliza guantes, el fenol produce quemaduras en la piel)
(1,5 mL por equipo),
Agua destilada

PROCEDIMIENTO
1. Prepara dos series de tubos Eppendorf como se indica en la siguiente tabla:
Tubo Sol. Patrn de
glucosa (L)
Agua (L) Glucosa (g)
1 0 200 0
2 5 195 5
3 10 190 10
4 20 180 20
5 50 150 50
6 100 100 100
7 150 50 150
8 200 0 200






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Con tu solucin de lactosa prepara tres tubos con diferentes
volmenes de la lactosa obtenida (preparada al 1% en agua):
Mnimo 1 L y mximo 100 L


2. Aade cuidadosamente a cada tubo 60 L de fenol al 80% (P/V) y 500 L de cido sulfrico
concentrado. La reaccin es exotrmica. Usa guantes y s precavido!
3. Cierra perfectamente cada tubo Eppendorf y agtalo vigorosamente en el vrtex.
4. Incbalos durante 30 min a temperatura ambiente.
5. Cuidadosamente coloca 200 L del contenido de cada tubo en cada pozo de una placa para ensayo
de ELISA.
6. Lee la absorbencia a 450 nm.
7. Colecta los residuos en el frasco que se te proporcionar.
8. Grafica los microgramos de glucosa contenidos en cada pozo contra la lectura de absorbancia
correspondiente y calcula la concentracin de glucosa presente en la solucin de lactosa que
preparaste.
9. Cules son las fuentes de error para esta determinacin? Enlista tus observaciones.


INVESTIGACIN PREVIA
1. Cul es el principio qumico de la determinacin de azcares de esta prctica?
2. Describe otro mtodo para cuantificar carbohidratos. Cita sus ventajas y desventajas en comparacin
con el propuesto en esta prctica.


REFERENCIAS
Lehman, John W. Operational Organic Chemistry. 3ed. Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ. 1999.
Ault, Addison. Techniques and Experiments for Organic Chemistry. 6ed. University Science Books.
1998.
Nelson, David L. and Cox, Michael M. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4Edicin. Worth
Publishers. 2004.




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RESPUESTAS:












































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PRCTICA 4
AISLAMIENTO DE TRIGLI CRIDOS

OBJETIVO
Obtener un lpido contenido en un producto vegetal mediante tcnicas de extraccin a reflujo en el
laboratorio.

FUNDAMENTO
La extraccin y subsiguiente fraccionamiento de los lpidos requiere el uso de disolventes orgnicos y
algunas tcnicas no comnmente usadas en la purificacin de molculas solubles en agua como los
carbohidratos. En general, las mezclas complejas de lpidos se separan segn sus diferencias en la
polaridad o la solubilidad de sus componentes en disolventes no polares. As, cidos, lcalis o incluso
enzimas hidrolticas altamente especficas como las fosfolipasas se emplean para hidrolizar lpidos que
contienen cidos grasos enlazados a steres o amidas. Actualmente, los lpidos son separados por
cromatografa de capa fina, de gas-lquido o por cromatografa lquida de alta resolucin o por sus siglas
en ingles HPLC (Cromatografa de Lquidos de Alta Resolucin). Los lpidos se identifican por su
conducta cromatogrfica o por espectrometra de masas.
Las semillas de plantas contienen cantidades substanciales de triglicridos, tristeres formados entre el
glicerol y tres molculas de cido graso. Aunque la mayora de los triglicridos encontrados en plantas son
mezclas que contienen varios residuos de cidos grasos, el triglicrido derivado de la nuez moscada
(Myristica fragans) contiene slo uno, el cido mirstico (cido tetradecanoico), lo cual facilita su extraccin.
En este experimento se aplicarn mtodos sencillos de laboratorio para extraer la miristina de las semillas
de nuez moscada con ter y luego se recristalizar la trimiristina cruda con acetona.

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO
Balanza
Matraz Erlenmeyer de 100 mL
Pipeta de 10 mL
Aparato de calentamiento a reflujo
Parrilla de calentamiento
Papel filtro
Embudo
Vasos de precipitados de 50 y de 250
mL
Campana de extraccin

REACTIVOS EMPLEADOS



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Nuez moscada,
Eter etlico,
Acetona,
Etanol al 96% (V/V).

PROCEDIMIENTO
1. Pesa 2,5 g de nuez moscada en polvo y colcala en un matraz Erlenmeyer de 100 mL.
2. Agrega 25 mL de ter etlico y calienta la mezcla suavemente bajo reflujo por 30 min sobre un bao
de agua caliente a 38C.
3. Filtra la mezcla por gravedad lavando el residuo de la nuez moscada sobre el filtro con un poco de
ter (1 mL) y el frasco con los residuos con 2 mL. Conserva el filtrado.
4. Lleva el filtrado a la campana de extraccin y evapora el ter con ligero calentamiento sobre un bao
de agua caliente a 38C, hasta concentrar el volumen a 15- 20 mL aproximadamente.
5. Enfra el residuo para lograr la cristalizacin del aceite.
6. Adiciona 25 mL de acetona al residuo en el frasco y calienta la mezcla hasta disolver el slido.
7. Transfiere la solucin an caliente a un vaso de precipitados de 50 mL y deja que la solucin se
enfre para lograr la cristalizacin a temperatura ambiente por 10 min.
8. Permite que se complete la cristalizacin colocando el vaso sobre un bao de hielo por otros 10 min.
9. Retira el solvente por succin y colcalo en el recipiente que se te indique. No lo viertas a la tarja.
10. Puedes recristalizar el producto aadiendo etanol al 96% V/V (10 mL por cada gramo del producto
obtenido).
11. Permite que se seque y calcula el porcentaje de recuperacin de la trimiristina obtenida de la nuez
moscada.

INVESTIGACIN PREVIA
1. Escribe la estructura del cido mirstico y del triglicrido trimiristina. Seala con colores las
subunidades que los constituyen.
2. Cita las principales propiedades fsicas y qumicas que deben de tenerse en cuenta en el aislamiento
de un lpido.
3. Ilustra con un esquema los procedimientos usados actualmente en la extraccin, separacin e
identificacin de lpidos celulares.

REFERENCIAS



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Lehman, John W. Operational Organic Chemistry. 3ed. Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ. 1999
Ault, Addison. Techniques and Experiments for Organic Chemistry. 6 ed. University Science Books. 1998
Nelson, David L. and Cox, Michael M. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4ed. Worth Publishers.
2004

RESPUESTAS:




























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PRCTICA 5
EXTRACCIN DE LPIDOS DE CEREBRO

OBJETIVO
Obtener los lpidos de la corteza cerebral y encfalo y fraccionarlos de acuerdo a su solubilidad en
diferentes solventes orgnicos.

FUNDAMENTO
El cerebro en la especie humana pesa 1,3 kg y es una masa de tejido gris rosceo compuesto por unos
100 000 millones de clulas nerviosas o neuronas, conectadas unas con otras y responsables del control
de todas las funciones mentales.
La corteza cerebral presenta una capa denominada sustancia gris, de unos 2 a 3mm de espesor, compuesta
por capas de clulas amielnicas (sin vaina de mielina) que cubren una sustancia interior de fibras mielnicas
(con vaina blanca), la sustancia blanca.
Los componentes tpicos del sistema nervioso son los lpidos, contenidos principalmente en los cilindro-
ejes de los nervios. El contenido total alcanza del 12 al 15% del peso fresco, aproximadamente la mitad
del peso seco. Para los distintos grupos de lpidos se han obtenido los siguientes valores (por ciento del
peso en fresco):
Fosftidos 6% , Cerebrsidos 2%, Esteroles 4%.
En la sustancia blanca. 9%, 4%, 1-2 %, respectivamente.
En la sustancia gris: 4%, 1%, 1-2%, respectivamente.
El colesterol se encuentra ampliamente distribuido en todas las clulas del organismo, pero especialmente
en las del tejido nervioso. Es el constituyente de mayor importancia en las membranas celulares y de las
lipoprotenas plasmticas. El nombre qumico es 3-hidroxi-5-6 colesteno. El hgado sintetiza ms o menos
el 10% del total en los seres humanos, el intestino cerca de 15% y la piel una gran porcin del resto.
Los fosfolpidos son lpidos complejos, contienen adems de cidos grasos y un alcohol, un residuo de
cido fosfrico; con frecuencia tienen bases nitrogenadas y otros sustituyentes. Por ejemplo, los
glicerofosfolpidos: donde el alcohol es el glicerol, y los esfingofosfolpidos, cuyo alcohol es la esfingosina.
Son los principales constituyentes lipdicos de las membranas.
Los glucolpidos complejos, lpidos que contienen un cido graso, esfingosina y carbohidratos. Los
glucolpidos estn distribuidos ampliamente en cada tejido del cuerpo, en particular en el tejido nervioso



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(en cerebro). Los glucolpidos principales en los tejidos animales son los glucoesfingolpidos. stos
contienen ceramida y uno o ms azcares. Los dos ms sencillos son la galactosiceramida y la
glucosilceramida.

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO
Un vaso de precipitados,
Cinco pipetas de plstico,
Tres pipetas Pasteur,
Cuatro tubos de centrfuga,
Una varilla de vidrio,
Una parrilla de calentamiento,
Una centrfuga.

REACTIVOS EMPLEADOS
2,5 g de cerebro de pollo,
Etanol,
Eter,
Acetona.

PROCEDIMIENTO
1. Pesa tres tubos de 15 mL, mrcalos como fraccin I, II y III.
2. Pesa en un papel aluminio 2,5 g de cerebro de pollo, pcalo y colcalo en un tubo de centrfuga,
adiciona, 1 mL de acetona por cada 0,5g de cerebro, homogeniza el tejido por un minuto y
centrifuga a 3 000 rpm. Decanta el sobrenadante en el tubo fraccin I, y aade al residuo 2 mL
de acetona y homogenizando nuevamente. Centrifuga y coloca el sobrenadante con la fraccin I.
Esta fraccin corresponde colesterol.
3. Deja el residuo a temperatura ambiente durante cinco minutos para evaporar la acetona.
4. Adiciona 3 mL de ter al residuo, centrifuga por 2 minutos a 3 000 rpm.
5. Coloca el sobrenadante en otro tubo de centrfuga con la leyenda fraccin II. sta contiene
fosfolpidos, nuevamente realiza una extraccin con ter y adiciona el sobrenadante a la fraccin
II.
6. Elimina los residuos de ter permitiendo su evaporacin a temperatura ambiente bajo la campana
de extraccin y adiciona 3 ml de etanol caliente al 95% (70
o
C aprox).
7. Agita y centrifuga durante 2 min a 3 000 rpm. Colecta el sobrenadante en el tubo de la fraccin
III, la cual corresponde a glucolpidos. Realiza nuevamente una extraccin con 3 mL de etanol.



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8. Calcula el volumen del residuo y agrega dos volmenes de acetona, homogeniza y centrifuga (2
min a 3 000 rpm). Coloca el sobrenadante con la fraccin I. Adiciona al residuo 3 mL de ter y
agita por 4 minutos.
9. Centrifuga (2 min a 3000 rpm) y coloca el sobrenadante en el tubo de la fraccin II (fosfolpidos).
Esta extraccin se repite dos veces ms y los sobrenadantes van al mismo tubo.
10. Cada tubo se evapora a sequedad sobre la parrilla. NO PERMITAS QUE LOS RESIDUOS SE
QUEMEN.
11. Pesa los tubos nuevamente y calcula la cantidad de producto obtenido en cada fraccin.

INVESTIGACIN PREVIA
1. Elabora una lista de disolventes orgnicos en orden de polaridad.
2. Qu son las constantes dielctricas?

REFERENCIAS
Stevens, Alan, Texto y Atlas de Histologa. Editorial Mosby/Doyma libros, 1995.
Mathews y Van Holde. Bioqumica. Editorial Mc Graw Hill-Interamericana. 2 Edicin, 2001.
Stauton W. Bioqumica Mdica. Edit. Interamericana, 1969.
Voet D. y J. Bioqumica. Edit. Omega, Espaa, 1992.

RESPUESTAS:













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PRCTICA 6
ANLISIS DE LPIDOS

OBJETIVO
Identificar compuestos lipdicos contenidos en diferentes muestras orgnicas utilizando un mtodo
cromatogrfico.

FUNDAMENTO
La cromatografa en capa delgada est basada en la separacin de una mezcla de compuestos que migran
a travs de un material adsorbente (fase estacionaria) con la ayuda de un disolvente (fase mvil) sobre un
soporte apropiado. La TLC (por sus siglas en ingles) se ha hecho muy popular debido a la sencillez con
que se preparan placas con capas uniformes de slica segn los dise Sthal (1964). En nuestros das, las
placas de TLC listas para usar son muy empleadas ya que ofrecen gran reproducibilidad y alta resolucin.
Existen varios tipos de fases estacionarias que permiten la separacin mediante particin, intercambio
inico, adsorcin o una combinacin de algunos de estos fenmenos. La adsorcin es el mecanismo ms
comn. En la TLC de adsorcin, la muestra es continuamente fraccionada mientras migra a travs de la
capa adsorbente. La competicin se da entre los sitios activos del adsorbente y el disolvente desarrollando
un fraccionamiento continuo. La porcin del material a separar se encuentra en la fase mvil y se
adsorber por las partculas del adsorbente. Como el proceso es continuo, varios de los componentes se
mueven a distancias diferentes, dependiendo de sus afinidades relativas por el adsorbente en comparacin
con la que tienen por el solvente. En general, los compuestos ms polares son retenidos por el adsorbente
mientras que los menos polares avanzas ms lejos. La polaridad del solvente afecta el movimiento de la
muestra sobre el adsorbente. La migracin de un compuesto en un sistema de TLC es descrita por su
valor de Rf (Valor de la distancia del frente de corrida medida desde el origen).

MATERIAL Y EQUIPO Y EQUIPO
Placas cromatogrficas,
Matraz Erlenmeyer,
Cuba de Cromatografa,
Guantes,
Lpiz
Jeringas desechables de 1 mL



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REACTIVOS EMPLEADOS
Cloroformo,
Metanol,
Estndares de fosfolpidos,
Yodo,
Solucin problema

PROCEDIMIENTO
1. Maneja las placas con cuidado. NO TOQUES LA PARTE BLANCA CON LOS DEDOS. Si hay
huellas, stas aparecern despus de que se expongan al vapor de yodo.
2. Marca la placa con un lpiz como se muestra enseguida:



3. Prepara 202 mL de la fase mvil (Hexano: ter: cido Actico, 60:40:1) en un matraz Erlenmeyer.
Mezcla y coloca aproximadamente 100 mL 150 mL dentro de la cuba de cromatografa. Tapa la cuba y
permite su saturacin mientras preparas la placa.
4. Con ayuda de una micropipeta coloca 1L - 2L de los fosfolpidos empleados como estndares sobre
la placa de cromatografa como se indica en la imagen. Asegrate de que la marca que quede no sea mayor
a 4 mm de dimetro. Permite que se seque por completo.
5. Despus de que las marcas se hayan secado, adiciona nuevamente otra cantidad de las muestras
utilizadas como estndares hasta que hayas colocado aproximadamente 10L de cada uno.
Estndares
Lpiz
1.5



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6. Tambin coloca 10 L de tu muestra problema como muestra la imagen.
7. Permite que se sequen las marcas. Asegrate de que el rea donde colocaste la muestra est por encima
del solvente. Coloca las placas en la cuba en posicin vertical para que comience la cromatografa.
8. Inmediatamente cierra la cuba y permite el corrimiento de la muestra durante 45 minutos.
9. Remueve la placa y djala secar sobre un papel dentro de la campana. Desecha el disolvente colocndolo
en un contenedor apropiado. Deja secar la placa dentro de la campana hasta que se seque.
10. Una vez que la placa est seca, colcala en la cuba saturada con yodo sublimado, tpala y permite el
revelado durante 10 minutos. Podrs observar las marcas amarillas de los lpidos.
11. Marca el contorno de las marcas con un lpiz. Realiza un calcado con papel albanene o toma una
foto para analizar tus resultados.

INVESTIGACIN PREVIA
1. Una mezcla de lpidos que contiene fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina,
esfingomielina, palmitato, n-tetradecanol, triacilglicerol y colesterol se aplica a una columna de slica
gel. La columna se lava con disolventes de polaridad creciente a) Que disolventes emplearas para
fluir estos lpidos? b) En qu orden esperas que los lpidos se vayan obteniendo en la salida de la
columna?
2. Cul es la utilidad de las fosfolipasas en la determinacin de la estructura de los lpidos?

REFERENCIAS
Nelson, David L. and Cox, Michael M. Principles of Biochemistry. 3 Ed. Worth Publishers, 2000.
http://www.protocol-online.org/

RESPUESTAS:










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PRCTICA 7
PROPIEDADES QUMICAS Y CARACTERIZACIN DE PROTENAS

OBJETIVO
Conocer algunas de las propiedades qumicas comunes a las protenas, especialmente aquellas por las
cuales las protenas pueden ser distinguidas unas de otras.

FUNDAMENTO
Existen veinte aminocidos en las protenas que varan en forma, tamao, carga y reactividad qumica.
Cada uno tiene al menos un codn en el cdigo gentico. Diecinueve de ellos son - aminocidos (esto
es, los grupos amino estn unidos al tomo de carbono adyacente al grupo carboxilo) con la frmula
general RCH (NH2)COOH, donde R es un grupo aliftico, aromtico o heterocclico. La nica excepcin
es prolina, el cual es un aminocido en el que el grupo amino est incorporado en un anillo de cinco
miembros. Con excepcin del aminocido ms sencillo, la glicina (R=H), los aminocidos encontrados
en las protenas contienen un tomo de carbono asimtrico, de aqu que son pticamente activos y tienen
la L-configuracin.
La combinacin de estos veinte aminocidos dentro de una protena es muy variada y por ello es bastante
difcil interpretar su comportamiento qumico. Para propsitos de identificacin, puede decirse que la
protena refleja las propiedades qumicas de los aminocidos que contiene. La mayora de las reacciones
coloridas de las protenas dependen de la presencia de un aminocido especfico en ellas.

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO
Gradilla y tubos de ensaye,
Parrilla elctrica,
Vaso de precipitados de 400 mL,
Pipetas Pasteur con bulbos de ltex,
Pipetas de plstico de 10mL y de 5 mL,
Matraces aforados de 100mL y 500 mL,
Gasa o algodn.

SOLUCIONES Y REACTIVOS EMPLEADOS
Sol. de albmina al 1%, sol. de gelatina al 1%, sol. de peptona al 1% (todas P/V),
Soluciones de tirosina, triptofano, fenilalanina, cistina y arginina al 0,5% (todas P/V),



23

Acido oxlico (sol. saturada),
NaOH conc.,
Acido actico glacial,
H2SO4 conc.,
Piridina,
BaCl2 al 5%, NaCl al 5%, HgCl2 al 5% (todas P/V),
Acetato bsico de plomo al 5% (todas P/V),
NaOH al 10% (V/V), CuSO4 al 0,5% (P/V), HNO3 conc, NH4OH conc.,
Ninhidrina al 0.1% en etanol (P/V),
(NH4)2SO4 slido y en solucin saturada,
Etanol al 96% (V/V),
Oxido rojo de mercurio,
Nitrato de sodio al 30%,
Magnesio metlico en polvo,
Regulador de acetatos pH 4.7,
Clara de huevo.

Reactivo de Millon. Aade 15 g de xido rojo de mercurio a una mezcla de 11,25 mL de HNO3 y 12,5
mL de agua. Cuando el xido se ha disuelto se aaden 12,5 mL de una solucin de nitrito de sodio al
30%. El reactivo de Millon contiene nitritos y nitratos mercricos.

Reactivo de Hopkins-Cole. Aade 5 g de magnesio en polvo a 10 mL de agua destilada. Adiciona
lentamente 125 mL de solucin fra y saturada de cido oxlico. La reaccin se produce con gran rapidez
y es sumamente exotrmica, por lo que el matraz debe enfriarse al chorro del agua mientras se aade el
cido. Agita suavemente y filtra para separar el oxalato de magnesio insoluble. Acidifica la solucin para
evitar la precipitacin durante el almacenamiento y afora a 500 mL con agua destilada.

Regulador de acetatos pH 4.7. Mezcla 1 L de cido actico 0,05 M (2,88 mL de cido actico glacial en
1 L de agua) con 1 L de acetato de sodio 0,05 M (6,8 g de acetato de sodio en 1 L de agua). Verifica el pH
y ajstalo si es necesario.

* Colecta todos los residuos de las pruebas realizadas en el frasco que se te indique. No los viertas
a la tarja.






24

PROCEDIMIENTO

I. REACCIONES COLORIDAS
1. Reaccin de Biuret. Prueba general para protenas y polipptidos de cadena no menor de tres unidades
de aminocidos. El valor principal de esta reaccin es seguir el proceso de una hidrlisis proteica, la cual
ser negativa cuando la hidrlisis sea completa.
A 1 mL de la solucin problema aade 1 mL de NaOH al 10% y de 3 a 5 gotas de solucin al 0,5% de
CuSO4. Mezcla bien y observa la formacin de un color violceo o precipitacin de hidrxido cprico. Si
el color de la reaccin de Biuret no se presenta enseguida, deja reposar la solucin de 10min a 15 min.
2. Reaccin xantoproteica. Esta reaccin es positiva, tanto para protenas en solucin como al estado
slido y es mucho ms sensible cuando estas se encuentran perfectamente secas. Esta reaccin depende
de la nitracin de anillos bencnicos activados, de aqu que la prueba resulta negativa para protenas que
no contienen aminocidos aromticos.
A 1 mL de las soluciones problema aade 1 mL de HNO3 concentrado y calienta. Permite que se enfre
la solucin. Estratifica cuidadosamente con NH4OH concentrado. Se desarrolla un color naranja en la
interfase.
3. Reaccin de Millon (para tirosina). El reactivo contiene una mezcla de nitritos y nitratos mercricos
y mercuriosos en cido ntrico concentrado.
A 1 mL de la solucin problema adiciona de 2 a 5 gotas del reactivo de Millon y calintalo en un bao de
agua. La cantidad de reactivo necesario es variable segn la naturaleza de la muestra. Se desarrolla un color
de rosa a naranja.
4. Reaccin para azufre de cistina y cistena.
A 1 mL de la solucin problema adiciona 1 mL de NaOH al 40% y calienta ligeramente. Adiciona de 3
gotas a 5 gotas de acetato de plomo y calienta nuevamente hasta ver que la solucin se oscurece. Anota
tus resultados en la tabla.
5. Reaccin de la ninhidrina. Es una reaccin caracterstica para grupos amino libres. A 1 mL de las
soluciones problema adiciona 5 gotas de piridina y 0,5 mL de solucin de ninhidrina. Calienta en un bao
de agua durante 10 min. Aparece un color azul o rojo debido a los grupos amino libres. La reaccin se
desarrolla mejor en solucin neutra. Si es necesario, mide el pH y ajstalo a 7 antes de adicionar la
ninhidrina.




25


6. Reaccin de Hopkins-Cole (para triptofano).
A 1 mL de las soluciones problema aade 5 gotas del reactivo de Hopkins-Cole (solucin de cido
glioxlico) y mezcla. Estratifica cuidadosamente con cido sulfrico concentrado procurando que se forme
el lmite bien definido entre ambos lquidos. Se formar un anillo violeta-rojizo en la interfase.
Biuret Xantoproteica Millon Cys Ninhidrina
Hopkins-
Cole
Gelatina
Peptona
Albmina
Tyr
Trp
Phe
Cis
Arg
Agua

II. REACCIONES DE PRECIPITACIN Y DESNATURALIZACIN
A. Con sulfato de amonio.
1. Coloca en un tubo de ensaye 4 mL de solucin de albmina fresca de huevo diluida 1:2 y 4 mL
de solucin saturada de sulfato de amonio. Agtala y fltrala. Qu sustancias constituyen el
precipitado?
2. Filtra la solucin. Disuelve el precipitado en 2 mL de agua destilada y realiza la prueba de Biuret
a esta solucin. Utiliza NaOH al 40% para hacer esta prueba ya que el lcali del reactivo se
consume con el sulfato de amonio formando amoniaco. Utiliza un control de agua destilada. Es
positiva o negativa la prueba de Biuret?
3. Repite la prueba con 1 mL del filtrado.
4. Aade sulfato de amonio slido a la solucin filtrada poco a poco hasta saturacin. Se forma
nuevamente el precipitado? Por qu?.



26

5. Filtra nuevamente la solucin. Disuelve el precipitado en 1 mL de agua destilada. Repite la prueba
de Biuret en la solucin filtrada y en el precipitado disuelto en agua. Cul di positiva la prueba,
la solucin o el precipitado? Qu sustancias forman el precipitado y cules la solucin? Cul es
tu conclusin y cmo interpretas tus resultados?

B. Con alcohol.
1. Prepara los tubos siguientes y compara los resultados que obtengas.

Tubo No. 1 Tubo No. 2 Tubo No. 3
Albmina de huevo diluda
1:4
1 mL 1 mL 1 mL
HCl 0.1 N 0,5 mL - -
NaOH 0.1 N - 0,5 mL -
Regulador de acetatos pH 4,7 - - 0,5 mL
Etanol al 96% 2 mL 2 mL 2 mL


C. Con metales pesados.
1. Adiciona 5 gotas de solucin de cloruro mercrico al 5% (P/V) a 1 mL de la solucin problema
de albmina de huevo (diluda 1:4). Observa el resultado.
2. Repite la prueba utilizando AgNO3 al 2% (P/V), acetato bsico de plomo al 5% (P/V), NaCl al
5% (P/V) y BaCl2 al 5% (P/V). Qu resultados obtienes? Cul es la conclusin y cmo
interpretas este fenmeno de precipitacin?

INVESTIGACIN PREVIA
1. Investiga el fundamento de cada una de las reacciones involucradas en la identificacin de
protenas en esta prctica.

REFERENCIAS:
Ault, Addison. Techniques and Experiments for Organic Chemistry. 6 Edicin. University Science Books.
1998
Nelson, David L. and Cox, Michael M. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4 Edicin. Ed. Worth
Publishers. 2004



27


RESPUESTAS:



28

PRCTICA 8
DETERMINACIN DE PROTENAS


OBJETIVO
Determinar la concentracin de protena en una solucin utilizando los mtodos de Folin-Ciocalteau,
microFolin- Ciocalteau y Bradford.

FUNDAMENTO
La determinacin de la concentracin precisa de protenas requiere de la hidrlisis cida de una porcin
de la muestra seguida del anlisis de aminocidos en el hidrolizado. Sin embargo, este mtodo emplea
mucho tiempo. En la prctica, generalmente no se necesita gran exactitud en la cuantificacin y por lo
mismo, se prefieren mtodos ms rpidos que dan resultados aceptables. La mayora son mtodos
colorimtricos donde una parte de la solucin de protenas reacciona con un reactivo que produce un
producto colorido. La cantidad de este producto colorido se mide espectrofotomtricamente y la cantidad
de color se relaciona con la cantidad de protena presente en la muestra mediante una calibracin
apropiada.
Ninguno de estos mtodos es absoluto, ya que el desarrollo del color es frecuentemente dependiente de
la composicin de aminocidos de las protenas. La presencia de grupos prostticos (por ejemplo,
carbohidratos), tambin influencia los ensayos colorimtricos.
Uno de los mtodos propuestos en esta prctica es el mtodo de Lowry y col (1951) (Folin-Ciocalteau),
mtodo razonablemente sensible que detecta hasta 10 g/cm
3
de protena y cuya sensibilidad es
moderadamente constante de una protena a otra. En la actualidad tiende a ser desplazado por otros ms
sensibles, pero su utilidad sigue vigente. Cuando se dispone de poca muestra, se puede utilizar el mtodo
micro, con el mismo fundamento pero con ligeras variaciones en el procedimiento para reducir el volumen
de muestra requerido en la determinacin.
Cuando el reactivo de Folin (una mezcla de tungstato de sodio, molibdato y fosfato) y la solucin de
sulfato de cobre se mezclan con la solucin de protenas, se produce un color azul-morado que puede ser
cuantificado por su absorbancia a 750 nm. Debe tenerse cuidado de no tener presentes compuestos que
interfieren con el ensayo (Tris, Pipes, HEPES o EDTA). El mtodo est basado en la reaccin de Biuret
y en la de Folin- Ciocalteau. En la primera los enlaces peptdicos reaccionan con el Cu
2+
bajo condiciones



29

alcalinas produciendo Cu
+1
, el cual reacciona con el reactivo de Folin. Esta ltima reaccin involucra la
reduccin de fosfomolibdotungstato a azul de heteropolimolibdeno por la oxidacin de aminocidos
aromticos, catalizada por el cobre. El fuerte color azul resultante es parcialmente dependiente del
contenido de triptofano y tirosina en la muestra.
Si se trata de protenas solubles, se prefiere usar el mtodo de Bradford, ya que requiere menos reactivos
y se realiza en menor tiempo.


MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO
Gradilla y tubos de ensayo,
Placas para ensayos de ELISA,
Vrtex,
Tubos para microcentrfuga
Micropipetas de 2, 50, 200 y 1000 uL,
Pipetas de 5 mL,
Espectrofotmetro y/o lector de ELISA.


REACTIVOS EMPLEADOS
Albmina srica de bovino 1 mg/ mL,
NaOH 1 M (15 mL por equipo), NaOH 0,1 M
Na2CO3 al 2% (P/V) (Solucin B: 150 mL por equipo),
Solucin de CuSO4 al 0,5% en citrato de sodio al 1% (P/V) (Solucin A: 3 mL por equipo)
Reactivo de Folin,
CuSO4 al 4% (P/V) en agua (30 uL por equipo),
Carbonato de sodio al 2% en NaOH 0.1 M (3 mL por equipo),
Tartrato de sodio y potasio al 2.5% (P/V) en agua (30uL por equipo),
Reactivo de Bradford
Agua destilada.




PROCEDIMIENTO I

1. Coloca 10 L de la muestra en tres tubos de ensayo y aade 500 L de NaOH 1 M, (6 h antes de la
determinacin, si es posible).
2. Para la curva de calibracin, prepara dos series de tubos con las siguientes concentraciones de
albmina srica de bovino:



30

Tubo
Solucin patrn
(1 mg/mL)
NaOH 1M
Incubar 10 min a
temperatura
ambiente
Agua destilada
0 0 L 500 L 500
1 10
500
490
2 25
500
475
3 50
500
450
4 75
500
425
5 100
500
400
6 150
500
350
7 200
500
300

3. Prepara una solucin 1:50 de la solucin A (0,5% de CuSO4 en citrato de sodio al 1% (P/V) en la
solucin B (Na2CO3 al 2% P/V) diluyendo 1 mL de A en 49 mL de B.
4. Agrega 5 mL del reactivo anterior a cada uno de los tubos de ensayo y agita los tubos
5. Incuba 10 min a temperatura ambiente
6. Agitando en el vrtex, aade 0,5 mL del reactivo de Folin diludo 1:1 en agua destilada a cada uno de
los tubos.
7. Incuba 30 minutos para que se desarrolle el color.
8. Toma la lectura de absorbancia a 750 nm.
9. Grafica absorbancia contra concentracin de albmina y determina el valor de protena de tu muestra.

Colecta todos los residuos de las pruebas realizadas en el frasco que se te indique. No los
viertas a la tarja.

Procedimiento II (Micro mtodo de Folin).
1. Coloca 1 L de la muestra en dos microtubos y aade 1 L de NaOH 0,1M (6 h antes de la
determinacin, si es posible).
2. En una placa de ELISA prepara tres curvas estndar con albmina srica de bovino (BSA), de 2,5 a
20 g. Afora a 20 L con agua o el amortiguador requerido.




31

Pozo Solucin patrn (1mg/mL) Agua destilada
0 0 L 20.0 L
1 2.5 17.5
2 5.0 15.0
3 10.0 10.0
4 15.0 5.0
5 20.0 0
6, 7, 8
1.0 (de la solucin
problema)
19.0

3. Prepara una solucin que contenga 10L de solucin de CuSO4 al 4% en agua (P/V) ms 10L de
solucin de tartrato de sodio y potasio al 2,5% (P/V) en agua y 1 mL de solucin de carbonato de
sodio al 2% en NaOH 0.1M
4. Agrega 100 L a cada pozo y mezcla perfectamente.
5. Incuba durante 10 min a temperatura ambiente
6. Agrega 20 L del reactivo de Folin diluido 1:1 en agua, a cada tubo y mezcla bien.
7. Incuba 30 min a temperatura ambiente
8. Lee la absorbancia a 680 nm en un lector de ELISA.
9. Reporta tus resultados incluyendo:
a) Grfica de absorbancia contra microgramos de protena
b) Concentracin de protena en tu muestra problema
* Colecta todos los residuos de las pruebas realizadas en el frasco que se te indique. No los viertas
a la tarja.

Procedimiento III (Mtodo de Bradford)
1. En cada microtubo o pozo agrega de 0 a 12 L de la solucin de albmina y afora a 12 L con
agua destilada. Realiza la serie por triplicado.
2. Adiciona 200 L del reactivo de Bradford a cada tubo/pozo.
3. Incuba 10 min a temperatura ambiente.
4. Mide la absorbencia a 595 nm.



32

5. Reporta tus resultados incluyendo:
a. Grfica de absorbancia contra microgramos de protena
b. Concentracin de protena en tu muestra problema

Pozo
Solucin patrn
(1 mg/mL)
Agua destilada
Reactivo de
Bradford
0 0 L 12 L 200 L
1 1 11 200
2 2 10 200
3 4 8 200
4 8 4 200
5 12 0 200
7 (problema)
5 (de la sol.
problema)
7 200


* Colecta todos los residuos en el frasco que se te indique. No los viertas a la tarja.


INVESTIGACIN PREVIA
1. Describe el fundamento, ventajas y lmites de deteccin de los mtodos empleados.


REFERENCIAS:
Lowry, O.H., Rosebrugh, J.F., Farr, A.L. y Randall, R.J. Protein measurement with the Folin Phenol reagent.
J. Biol. Chem. 1951. pp: 193, 265-275
Wilson, Keith & Walker, J. Protein structure, purification and characterization in "Principles and
Techniques of Practical Biochemistry". 5 Ed. Cambridge University Press.2000, Chapter 6.
Nelson, David L. and Cox, Michael M. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4 Edicin Worth
Publishers. 2004.
Bradford, M. Anal. Biochem.1976. pp: 72, 248.






33

RESPUESTAS:























34

PRCTICA 9
PURIFICACIN DE PROTENAS I: INTERCAMBIO INICO Y CROMATOGRAFA DE
EXCLUSIN

OBJETIVO
Ilustrar los mtodos generales que se utilizan en la extraccin y purificacin de protenas: centrifugacin,
cromatografa de intercambio inico y cromatografa de exclusin molecular.

FUNDAMENTO
Las protenas son esenciales para el mantenimiento de la viabilidad de los organismos vivos. Se subdividen
en varios grupos tales como: enzimas, transporte, almacenamiento, estructurales, anticuerpos y hormonas.
Ya que las clulas contienen miles de protenas de diferentes caractersticas, es necesario obtener una
preparacin pura de la protena en estudio para poder realizar el anlisis de sus propiedades y de su
funcin.
La primera etapa en cualquier procedimiento de purificacin es el rompimiento de las clulas para liberar
todos sus componentes en una solucin denominada extracto crudo u homogenado total. De ser
necesario se recurre a una centrifugacin diferencial para preparar fracciones subcelulares o para aislar
organelos especficos.
A continuacin el extracto se somete a un fraccionamiento que separa las protenas segn tamao o su
carga. Las etapas iniciales pueden incluir la solubilizacin de la protena con detergentes adecuados y la
precipitacin con sulfato de amonio. En algunos casos se emplea un procedimiento de dilisis para separar
las protenas pequeas y los solventes (sales).
Los mtodos ms poderosos para fraccionar protenas hacen uso de la cromatografa de columna, basada
en la diferencia que presentan las protenas en carga elctrica, tamao, afinidad de enlace y otras
propiedades. Este mtodo consta de una columna llena de un material slido poroso con las propiedades
qumicas apropiadas (fase estacionaria) y una solucin amortiguadora (fase mvil). La solucin que
contiene la protena se coloca en la parte superior de la columna a travs de la cual migrarn todos los
componentes. Las protenas llegarn al extremo inferior en diferentes tiempos segn sus propiedades.






35

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO
Columnas de vidrio y de plstico,
Tubos Eppendorf,
Tubos de ensaye,
Soporte y pinzas universales o pinzas
para bureta,
Micropipeta de 1 mL con puntas.

REACTIVOS EMPLEADOS
Amortiguador de equilibrio Tris-HCl 50 mM pH 8,0 (Intercambio aninico),
Amortiguador de elusin I (intercambio aninico: Tris-HCl 50 mM, NaCl 200 mM pH 8,0)
Amortiguador de elusin II (intercambio aninico: Tris-HCl 50 mM, NaCl 500 mM pH 8,0)
Amortiguador de equilibrio: Acetato de amonio 50 mM pH 5,0 (intercambio catinico),
Amortiguador de elusin I (intercambio catinico: Acetato de amonio 50 mM, NaCl 200 mM
pH 5,0),
Amortiguador de elusin II (intercambio catinico: Acetato de amonio 50 mM, NaCl 500 mM,
pH 5,0)
Resina G-75 G-100 (exclusin molecular),
Resina High S (intercambio catinico),
Resina High Q (intercambio aninico)

PROCEDIMIENTO
A. Intercambio inico
1. Coloca la resina de intercambio inico en las columnas de plstico hasta que el volumen de la
resina compactada alcance los 2,5 mL (aprox. 1 cm de altura), manteniendo siempre al menos 1
ml de agua por arriba del nivel de la resina (NO DEJES SECAR LA COLUMNA)
2. Lava la columna conteniendo la resina con 6 volmenes de amortiguador de equilibrio. Tris-HCl
50 mM pH 8,0 para la columna de intercambio aninico y Acetato de Amonio 50 mM pH 5,0
para la columna de intercambio catinico.
3. Aplica 200 L de muestra problema en 800 L del amortiguador de equilibrio en la parte superior
de la resina una vez que el amortiguador de equilibrio se encuentre al ras de la resina.
4. Deja que se incluya la muestra, aplica suavemente 8,5 mL de amortiguador de equilibrio y colecta
fracciones de 1 mL en microtubos (aproximadamente 10 tubos).
5. Aplica 8,5 mL de amortiguador de elusin I (intercambio aninico: Tris-HCl 50 mM, NaCl 200
mM pH 8,0; intercambio catinico: Acetato de amonio 50 mM, NaCl 200 mM pH 5.0) y colecta
fracciones de 1 mL.
6. Aplica 8,5 mL de amortiguador de elusin II (conteniendo 500 mM de NaCl) y colecta fracciones
de un mililitro.



36

7. Lava la columna con 8 volmenes de agua destilada y colecta la resina donde se te indique.
Almacnala a 4C
8. Lee las fracciones a 280 nm en un espectrofotmetro utilizando celdas de 1 mL.
9. Grafica el nmero de fraccin vs la Absorbencia

B. Exclusin molecular
1. Coloca la resina de exclusin molecular en las columnas de plstico hasta que el volumen de la
resina compactada alcance los 8,0 mL, manteniendo siempre al menos 1 mL de agua por arriba
del nivel de la resina (NO DEJES SECAR LA COLUMNA)
2. Lava la columna conteniendo la resina con 10 volmenes de amortiguador de equilibrio. Tris-
HCl 50 mM pH 8,0.
3. Aplica 150 L de muestra problema en la parte superior de la resina cuando el amortiguador de
equilibrio se encuentre al ras de la resina.
4. Deja que se incluya la muestra, aplica suavemente amortiguador de equilibrio y colecta
fracciones de 0,8 mL en tubos Eppendorf (aproximadamente 12 tubos).
5. Lava la columna con 3 volmenes de amortiguador de equilibrio conteniendo 0,5 M de NaCl.
6. Lava la columna con 3 volmenes de agua y colecta la resina donde se te indique. Almacnala a
4 C
7. Lee las fracciones a 280 nm en un espectrofotmetro utilizando celdas de 1 mL.
8. Grafica el nmero de fraccin vs la Absorbencia

INVESTIGACIN PREVIA
1. Describe en qu consiste el fraccionamiento celular y la centrifugacin diferencial sealando qu
fracciones celulares se obtienen en cada paso.
2. Explica en qu consiste la cromatografa de intercambio inico, la cromatografa de exclusin


REFERENCIAS:
Wilson, Keith & Walker, J. Protein structure, purification and characterization in "Principles and Techniques of
Practical Biochemistry". 5 Ed. Cambridge University Press.2000, Chapter 6.




37

RESPUESTAS:





38


OBJETIVO
Realizar una separacin electrofortica de protenas en un minigel de poliacrilamida segn el mtodo de
Laemmli y apreciar la migracin diferencial de las protenas segn su peso molecular.


FUNDAMENTO
La electroforesis sobre geles de SDS-poliacrilamida es el mtodo ms ampliamente empleado para el
anlisis cualitativo de protenas. Particularmente es til para monitorear la purificacin de una protena y,
ya que el mtodo esta basado en la separacin de las protenas segn su tamao, el mtodo puede ser
usado para determinar el peso molecular relativo de las protenas.
Antes de someterse a electroforesis, las protenas se hierven en una solucin que contiene SDS (CH3-
(CH2)10- CH2OSO3Na), -mercaptoetanol, azul de bromofenol y glicerol. El SDS es un detergente
aninico que se une fuertemente a las protenas y las desnaturaliza. El -mercaptoetanol reduce los
puentes disulfuro que mantienen su estructura terciaria. De esta manera, todas las protenas se abren y
quedan con una serie de molculas de SDS cargadas negativamente a lo largo de la cadena. El azul de
bromofenol permite el seguimiento de la migracin de las protenas a lo largo del gel, mientras que el
glicerol confiere densidad a las muestras para depositarse fcilmente en el pozo de carga.
Al aplicar corriente elctrica, las muestras pasan primeramente a un gel concentrador al 4%-5% de
poliacrilamida para que las protenas formen una banda definida y compacta antes de entrar al gel
separador. Una vez alcanzado el gel separador, los complejos SDS-protena cargados negativamente
continan movindose hacia el nodo y, ya que tienen la misma carga por unidad de longitud, viajan con
la misma velocidad en el gel separador bajo el campo elctrico aplicado. Sin embargo, las protenas se
separan conforme migran. Si la protena es pequea, fcilmente pasa a travs de los poros del gel mientras
que las protenas ms grandes son sucesivamente retenidas en la malla de la poliacrilamida.
Concluida la electroforesis, el gel se tie para observar las bandas de protena, estimar su peso molecular
y/o transferirse para su estudio e identificacin.

PRCTICA 10
ELECTROFORESIS DE PROTENAS



39

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO
Minicmara de electroforesis,
Fuente de poder,
Micropipetas y puntas,
Dos vasos de precipitados, de 100 y de
250 mL
Gradilla con tubos Eppendorf,
Pipeta Pasteur y bulbo de goma,
Guantes desechables

REACTIVOS
Acrilamida/Bisacrilamida 30% (P/V),
Tris 1.5 M pH 8,8,
Tris 0.5 M pH 6,8,
Agua desionizada,
SDS al 10% (V/V),
TEMED,
Persulfato de amonio al 10% (P/V),
Amortiguador de corrida: Tris
Glicina, Metanol,
Marcadores de PM,
Buffer de solubilizacin 2x (Tris-HCl
0,5 M pH 6,8, SDS 4%, glicerol al 20%,
2- mercaptoetanol al 10%, azul de
bromofenol al 0,016% P/V).
Azul de Comassie R-250 al 0,125%
(P/V) en metanol al 40% (V/V) / cido
actico al 10% (V/V)
Solucin para desteir: cido actico
10%, metanol al 40% V/V, en agua
Solucin para desteir: Acido actico al
7% (V/V), metanol al 5%(V/V), en
agua

PROCEDIMIENTO
1. Prepara la cmara de electroforesis como se indica. Cercirate de que no tiene fugas llenndola
con agua destilada.
2. En un vaso pequeo, realiza la siguiente mezcla:

Minigel separador (7.5% (P/V, 1,5 mm)
Acrilamida/ bisacrilamida al 30%
(P/V)
2,81 mL
Tris 1.5 M pH 8,8 2,85 mL
Agua destilada 5,4 mL

Agita suavemente el vaso y contina aadiendo:
SDS al 10% (P/V) 0,114 mL
TEMED 0,010 mL
Persulfato de amonio al 10% (P/V) 0,051 mL




40

3. Rpidamente coloca la mezcla en la cmara con ayuda de un embudo montado en una punta azul
de micropipeta o con una pipeta Pasteur.
4. Con una pipeta Pasteur, aade lentamente un poco de agua o n-butanol en la superficie y permite
que gelifique. Enjuaga con agua desionizada y escurre.
5. Prepara el minigel concentrador al 5% (P/V) de la misma manera con las siguientes soluciones:
Acrilamida/bisacrilamida
30%
634.5 L
Tris 0.5 M pH 6,8
960 L
Agua destilada
2 160 L
SDS al 10%
38,1 L
TEMED
4,5 L
Persulfato de amonio al
10%
20,25 L

6. Agita suavemente la solucin y vacala en la cmara.
7. Coloca el peine para formar los pozos evitando la formacin de burbujas.
8. Djalo gelificar por 30 min. Retira el peine y enjuaga los pozos con agua desionizada.
9. Coloca en un microtubo 30 L de la solucin de protenas y aade 15 L de BS 4X (Para tres
carriles, 90 L de la solucin con 45 del buffer 4x).
10. Colcalo en ebullicin durante 5 min.
11. En el primer pozo, coloca 8 L de marcadores de peso molecular
12. En los siguientes tres, coloca el volumen de la muestra como se te indique.
13. Permite la migracin de las protenas durante 30 min aproximadamente a 80 volts, y luego 1 h a
110 volts.
14. Desmonta el gel cuidadosamente y sumrgelo en el colorante azul de Comassie durante 15 min
15. Destelo en una solucin de metanol al 40% V/V y cido actico al 10% V/V durante una hora.
Posteriormente en metanol al 5% V/V, cido actico al 7% V/V hasta el da siguiente.

* Colecta todos los residuos en el frasco que se te indique, incluyendo los geles una vez que
realices el anlisis de resultados. No los viertas a la basura.



41


16. Si es posible, toma una fotografa con cmara digital, digitaliza la imagen o fotocpiala. Puedes
envolverlo cuidadosamente en papel autoadherente o en una mica protectora de plstico.
17. Llena la siguiente tabla, midiendo cuidadosamente la distancia recorrida (mm) por cada marcador,
desde origen al frente del gel.
Marcador (Alto PM, BIORAD) Peso molecular
log peso
molecular
Distancia recorrida
(mm)
Miosina 200 000
-galactosidasa 116 250
Fosforilasa b 97 400
Albmina de suero bovino 66 200
Ovoalbmina 45 000

18. Construye una grfica del logaritmo del peso molecular de cada marcador contra la distancia
recorrida por cada uno.
19. Determina el peso molecular de las dos bandas ms intensas del homogenado que sometiste a
electroforesis.

INVESTIGACIN PREVIA
1. Qu otros tipo de geles se utiliza para separar protenas? En qu consiste?
2. Investiga el rango de peso molecular de las protenas que puedes separar en un gel de
poliacrilamida al 7,5, al 12 y al 16%.


REFERENCIAS:
Laemmli, U.K, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T. Nature 1970.
pp: 227: 680-685.
Wilson, Keith & Walker, J. Protein structure, purification and characterization in "Principles and Techniques of
Practical Biochemistry". 5 Ed. Cambridge University Press.2000, Chapter 6.
Nelson, David L. and Cox, Michael M. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4 Ed Worth Publishers,
2004.



42

RESPUESTAS:



43


OBJETIVO
Determinar la presencia de actividad proteoltica en homogenados de Trichomonas vaginalis y Entamoeba
hystolitica sobre geles de poliacrilamida copolimerizados con gelatina

FUNDAMENTO
La actividad enzimtica puede ser determinada de diferentes formas, cada una con una aplicacin
diferente. Para una cintica enzimtica generalmente la reaccin se realiza en solucin utilizando un
sustrato cromognico pero no proporciona informacin sobre el peso molecular o punto isoelctrico de
la enzima o de diferentes formas enzimticas. Lo anterior puede ser solucionado revelando la actividad
enzimtica en geles de poliacrilamida donde la muestra generalmente se corre en condiciones
semidesnaturalizantes y posteriormente se renaturaliza para restaurar la actividad. Para la determinacin
de la actividad proteoltica en geles pueden utilizarse sustratos especficos (pptidos sintticos) o generales
(gelatina o hemoglobina).

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO
Minicmara de electroforesis,
Fuente de poder,
Micropipetas y puntas,
Gradilla con tubos Eppendorf,
Pipeta Pasteur y bulbo de ltex,
Guantes desechables.

REACTIVOS EMPLEADOS
Amortiguador de reaccin: Tris-HCl 50 mM pH 7,0
Acrilamida/Bisacrilamida 30% P/P,
Tris 1,5 M pH 8,8,
Tris 0,5 M pH 6,8,
Agua desionizada,
SDS al 10% P/V,
TEMED,
Persulfato de amonio al 10% P/V,
Glicina,
Metanol,
Acido actico,
Azul de Comassie R-250 al 0,125% en metanol al 40% / cido actico al 5% V/V,
PRCTICA 11
ACTIVIDAD ENZIMTICA EN GELES



44

Buffer de solubilizacin 2x (Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, SDS 4%, glicerol al 20%, 2- mercaptoetanol
al 10%, azul de bromofenol al 0,016%) V/V,
Buffer de solubilizacin sin 2- mercaptoetanol.

PROCEDIMIENTO
1. Prepara la cmara de electroforesis como se indica. Cercirate de que no tiene fugas llenndola con
agua destilada.
2. En un vaso pequeo, realiza la siguiente mezcla:

Para el minigel separador (10%):
Acrilamida/ bisacrilamida al 30%
(P/V)
3,33 mL
Tris 1,5 M pH 8,8 2,50 mL
Gelatina al 1% 1,0 mL
Agua destilada 3,02 mL

Agita suavemente el vaso y contina aadiendo:
SDS al 10%
100 L
TEMED
5 L
Persulfato de amonio al 10%
50 L

3. Rpidamente coloca la mezcla en la cmara con ayuda de una pipeta Pasteur.
4. Aade lentamente un poco de agua o n-butanol en la superficie y permite que gelifique. Enjuaga con
agua desionizada y escurre.
5. Prepara el minigel concentrador al 5% de la misma manera con las siguientes soluciones:
Acrilamida/bisacrilamida
30%
423 L
Tris 0.5 M pH 6.8
640 L
Agua destilada
1 440 L
SDS al 10%
25,4 L
TEMED
3,0L



45

Persulfato de amonio al
10%
13,5 L

6. Agita suavemente la solucin y vacala en la cmara.
7. Retira el peine y enjuaga los pozos con agua desionizada.
8. Coloca en cada pozo 5 a 10 L de la solucin de protenas ya preparada en amortiguador de carga,
que se te proporcionar.
9. Permite la migracin de las protenas durante aproximadamente 1 h a 110 volts, manteniendo la
cmara en hielo.
10. Desmonta el gel cuidadosamente y sumrgelo en una solucin de Tritn X-100 al 2,5% V/V, en
agua durante 45 min a 4 C
11. Lvalo dos veces con agua e incbalo en el amortiguador de reaccin (30 mL de PBS 1X con 50
L de -mercaptoetanol) a 37 C durante 30 min.
12. Lvalo dos veces con agua y telo con azul de Coomassie durante 15 min.
13. Destelo en una solucin de metanol al 40% V/V y cido actico al 10% V/V durante 15 min.
14. Si es posible, toma una fotografa en con cmara digital, digitaliza la imagen o fotocpialo. Puedes
envolverlo cuidadosamente en papel autoadherente o en una mica protectora de plstico.
15. Colecta los residuos en los frascos que se te indiquen.

INVESTIGACIN PREVIA
1. Que son las proteasas y cmo se clasifican?
2. Describe brevemente los diferentes mtodos para determinar actividad enzimtica en geles y en
tejidos.

REFERENCIAS:
Wilson, Keith & Walker, J. Protein structure, purification and characterization in "Principles and Techniques of
Practical Biochemistry". 5 Ed. Cambridge University Press.2000, Chapter 6.


RESPUESTAS:




46

PRCTI CA 12
CI NTI CA ENZI MTI CA


OBJETIVO
Llevar a cabo una reaccin enzimtica y evaluar el efecto de la concentracin de enzima e
inhibidores sobre la velocidad de reaccin y determinar los parmetros cinticos.

FUNDAMENTO
La velocidad de transformacin de los sustratos de una reaccin en los correspondientes productos,
mediante una enzima, es dependiente tanto de las concentraciones de la enzima como de los
sustratos. Normalmente, esa dependencia puede ser expresada matemticamente por la ecuacin
de Michaelis-Menten:
v= Vmax [S] / (Km + [S])

Esta ecuacin predice que la velocidad de formacin de producto es saturable con respecto al
sustrato, es decir, existe una concentracin de sustrato a partir del cual la v no aumenta de forma
significativa. La Vmax se denomina velocidad mxima, y depende de la concentracin de enzima
segn una relacin lineal:
Vmax = k2 [E]

La Km es un parmetro que depende de la afinidad de la enzima por el sustrato y que se denomina
constante de Michaelis. El clculo de los valores de constantes Vmax y Km se realiza mediante la
representacin de Lineweaver-Burk, que es en realidad la ecuacin de Michaelis-Menten en forma
doble recproca:
1/v = 1/Vmax + Km/Vmax [S]

La representacin de 1/v frente a 1/S da lugar a una lnea recta cuya ordenada en el origen es 1/Vmax
y cuya abscisa es -1/Km. La velocidad de reaccin se suele expresar en moles de producto formado
por minuto.

La velocidad de reaccin vara tambin con la presencia en el medio de determinados agentes
qumicos que reciben el nombre de moduladores o efectores. Existen varios tipos, y uno de los ms



47

frecuentes son los denominados inhibidores competitivos. Generalmente, stos son sustancias de
naturaleza anloga al sustrato y que pueden competir con l por el centro activo de la enzima. La
actividad cataltica de las enzimas depende estrictamente de la conformacin de la protena, es decir
de su estructura tridimensional. Por ello, los cambios conformacionales suelen ir asociados a
cambios en la eficacia cataltica de las enzimas. En muchos casos, estos cambios conformacionales
son reversibles y tienen un significado fisiolgico al permitir adaptar de forma transitoria la velocidad
de una reaccin a las necesidades de la clula. En otros casos, los cambios conformacionales son
irreversibles.

En esta prctica utilizaremos como modelo de enzima a una proteasas. Las proteasas son enzimas
ampliamente distribuidas en la naturaleza y cumplen una gran variedad de funciones de importancia
biolgica e industrial. Las proteasas hidrolizan el enlace peptdico de las protenas y de pptidos
naturales o sintticos.



MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO
Espectrofotmetro (lector de placas multipozo)
Placas multipozo
Tubos de 1.5 ml y gradillas
Termoblock,
Cronmetro
Pipetas automticas y puntas

REACTIVOS
Enzima: Tripsina
Sustrato: N-benzoil-arginina-p-nitroanilida (BApNA) 0.01M
Amortiguador de reaccin: Tris-HCl 0.1M pH 8
Amortiguador de acetatos 0.1M pH=5
Amortiguador de Tris-HCl 0.1M pH=10
Dimetilsulfxido (DMSO)










48

PROCEDIMIENTO

a) Efecto de la cantidad de enzima.
Colocar en una placa multipozos los siguientes componentes en el orden propuesto:

Pozo
Tris-HCl 0.1M pH 8
l
Sustrato (BApNA)
l
Enzima (Tripsina)
l
1
180 20 0
2
179 20 1
3
178 20 2
4
176 20 4
5
174 20 6
6
172 20 8
7
170 20 10
8
168 20 12

Inmediatamente despus de adicionar la enzima, colocar la placa multipozos en el lector de placas
y agitar por 5 segundos. Leer la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm cada 5 min durante
30 min. Con los valores obtenidos, representa la velocidad de aparicin de p-nitroanilina frente a la
cantidad de enzima. La absortividad molar de la p-nitroanilina es de 3 700 M
-1
cm
-1
a 475 nm.

b) Efecto de la concentracin de sustrato.
Colocar en una placa multipozos los siguientes componentes en el orden propuesto:

Pozo
Tris-HCl 0.1M pH 8
l
Sustrato (BApNA)
l
Enzima (Tripsina)
l
1
188 0 12
2
187 1 12
3
186 2 12
4
184 4 12
5
180 8 12
6
176 12 12
7
172 16 12
8
168 20 12
Determina la actividad como se indica en el apartado a).



49

c) Efecto del pH sobre la actividad enzimtica.
Colocar en una placa multipozos los siguientes componentes en el orden propuesto:

Pozo
Amortiguador de
diferente pH
l
Sustrato (BApNA)
l
Enzima (Tripsina)
l
1
180 pH=6 10 10
2
180 pH=8 10 10
3
180 pH=10 10 10

d) Efecto de un inhibidor sobre la actividad enzimtica.
Colocar en una placa multipozos los siguientes componentes en el orden propuesto:

Pozo
Tris-HCl 0.1M
pH 8
l
Sustrato
(BApNA)
l
Enzima
(Tripsina)
l
Inhibidor
(PMSF)
l
1
188 0 12

2
187 1 12

3
186 2 12

4
184 4 12

5
180 8 12

6
176 12 12

7
172 16 12

8
168 20 12


Determina la actividad como se indica en el apartado a). Utilizar los valores obtenidos, para
representar las velocidades de reaccin frente a la concentracin de sustrato de forma directa y en
forma doble recproca. Obtener los valores de Vmax y Km y el tipo de inhibicin.

INVESTIGACIN PREVIA
1. Explicar el significado de la constante de Michaelis- Menten
2. Explicar el efecto del aumento de la concentracin de sustrato y enzima sobre la velocidad de la
reaccin enzimtica
3. Qu efecto tiene el pH sobre la actividad enzimtica?
4. Qu son las proteasas y cmo se clasifican?



50

5. Describe brevemente los diferentes mtodos para determinar una actividad enzimtica.

REFERENCIAS:
Wilson, Keith & Walker, J. Protein structure, purification and characterization in "Principles and
Techniques of Practical Biochemistry". 5 Ed. Cambridge University Press.2000, Chapter 6.
Nelson, David L. and Cox, Michael M. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4 Ed Worth
Publishers. 2004


RESPUESTAS:









51

PRCTICA 13
AISLAMIENTO DE CIDOS NUCLEICOS

OBJETIVO
Aislar DNA plasmdico a partir de un cultivo de Escherichia coli que contiene el plsmido.

FUNDAMENTO
El uso de DNA para anlisis o manipulacin generalmente requiere que sea aislado en cierto grado de
pureza. El DNA se recupera rompiendo las clulas en la forma ms suave posible para evitar la
fragmentacin del DNA por dao mecnico. Esto se hace en presencia de la sal disdica del EDTA, el
cual quela el magnesio que requieren las desoxirribonucleasas, enzimas que degradan el DNA. Idealmente,
las paredes celulares, si estn presentes, deben ser digeridas enzimticamente (por ejemplo, usando
lisozima en el caso de bacterias) y la membrana celular puede solubilizarse usando detergente. Una
alternativa muy empleada es la lisis alcalina.
Despus de liberar los cidos nucleicos, el RNA puede removerse con ribonucleasa (RNasa), la cual se
trata previamente para inactivar cualquier Dnasa contaminante. La protena contaminante se remueve con
fenol equilibrado o con una mezcla de fenol-cloroformo, que desnaturalizar las protenas pero no los
cidos nucleicos.
La centrifugacin de la emulsin anterior produce dos fases, una orgnica inferior y una acuosa superior,
separadas por una interfase de protena desnaturalizada. La solucin acuosa se recupera y desproteiniza
repetidamente hasta que no se observe ningn material en la superficie. Finalmente, la preparacin de
DNA se mezcla con dos volmenes de etanol absoluto y el DNA se precipita en congelacin.
Cuando se requiere un alto grado de pureza, el DNA puede someterse a ultracentrifugacin por gradiente
de densidad a travs de cloruro de cesio, lo cual es particularmente til para la preparacin de DNA
plasmdico.
Para aislar RNA el procedimiento es similar, solo hay que considerar que el cido ribonucleico es muy
vulnerable a la accin de RNAsas presentes en todos los tipos celulares e incluso en los dedos. El material
utilizado debe ser tratado previamente contra RNasas y deben emplearse guantes. Generalmente se
emplean reactivos que contienen fuertes inhibidores de RNasas y desnaturalizantes de protena.

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO



52

Un tubo de ensayo estril con tapn
metlico,
Incubador bacteriano con agitacin,
Microtubos nuevos,
Centrfuga para tubos Eppendorf,
Micropipetas de 1000 L, 200 L y 20
L con puntas nuevas,
Vortex,
Hielo

REACTIVOS EMPLEADOS
Cultivo fresco de Escherichia coli con plsmido,
Medio LB lquido con el antibitico de seleccin para la bacteria empleada,
Medio GTE (100 L por equipo),
NaOH 10 N (100 L), SDS al 20% (250 L, agua destilada, 5 mL por equipo),
Solucin de acetato de potasio fro (60 mL de KAcO 5M, 11,5 mL cido actico 5 mM y 28.5
mL de agua) (150 L por equipo),
Solucin de fenol-cloroformo (250 L por equipo),
Etanol fro al 95% V/V (500 L por equipo),
Agua destilada o T10E (30 L por equipo).

Procedimiento I (Miniprep)
1. Crece la bacteria (Escherichia coli + plsmido) en un tubo de 18 mL con 3 mL de medio LB (Luria
Bertrani) con el antibitico indicado durante 5 h -18 h, en agitacin a 37C.
2. Distribuye el contenido en dos microtubos (Aprox.1,5 mL en cada uno) y centrifgalos durante 2 min
a 14000 x g. Remueve el sobrenadante y colcalo en el tubo de ensaye con un poco de cloralex.
3. Para realizar una lisis alcalina, resuspende el residuo en 100 L de medio GTE (glucosa 60mM, Tris-
HCl 125mM, EDTA 110mM, pH 8) agitando el tubo en el vrtex y tratando de evitar la formacin de
grumos.
4. Aade 200 L de NaOH 0.2N en SDS al 1% (recin preparada: 100 L de NaOH 10 N + 250 L SDS
al 20%, aforada a 5 mL con agua destilada).
5. Invierte suave y rpidamente el tubo 2 a 3 veces. NO USAR vrtex.
6. Incuba sobre hielo durante 5 min.
7. Adiciona 150 L de acetato de potasio fro (60 mL de KAcO 5M, 11,5 mL cido actico 5 mM y 28,5
mL de agua). Mezcla vigorosamente 4 veces e incuba sobre hielo durante 5 min.
10. Centrifuga 5 min a 14000 x g.
11. Transfiere el sobrenadante a un tubo nuevo y elimina el precipitado blanco.
12. Extrae en volmenes iguales de fenol-cloroformo (P.ej: 250 L/ 250 L).
13. Centrifuga 5 min y transfiere el sobrenadante a otro tubo.



53

14. Precipita con un volumen igual de etanol fro al 96% V/V. Agtalo en vrtex y refrigera por 10 min.
15. Centrifuga durante 15 min en la centrfuga Eppendorf y elimina el sobrenadante por succin a vaco
con una punta de micropipeta.
16. Lava el precipitado con etanol. Centrifuga nuevamente y elimina el sobrenadante como en el punto
anterior.
15. Seca el residuo al aire.
16. Resuspende el producto obtenido en agua o en T10E (30 L aprox.). Almacnalo a -20 C.

Procedimiento II. Miniprep por el mtodo cTAB
1. Crece la bacteria (E.coli + plsmido) en un tubo de 18 mL que contenga 3 mL de medio LB (Luria
Bertrani) con antibitico (ampicilina, 1 l de una solucin stock 25 mg/mL) durante 5h - 18h, en
agitacin a 37 C.
2. Distribuye el contenido en dos microtubos (1,5 mL por tubo) y centrifgalos durante 3 min a
14000 x g. Remueve el sobrenadante con una pipeta Pasteur o con una punta y viertelo en el tubo
d ensaye original, adiciona unas gotas de cloralex.
3. Resuspende el sedimento en 200 l de STET (sacarosa al 8%, EDTA 50 mM, Tris pH 8, 80 mM,
tritn X-100 0,1%) adicionado con 4 l de lisozima (50 mg/mL y 5 L de RNAsa (10 ug/uL).
Utiliza una micropipeta.
4. Incuba 15 min a temperatura ambiente.
5. Incuba 45 seg a 100 C
6. Centrfuga 10 min a 14 000g.
7. Desecha el sedimento con un palillo estril y aade 10 L de cTAB (bromuro de
hexadeciltrimetilamonio al 5% en agua). Este reactivo precipita a temperatura ambiente. Si se
observa alguna turbidez, calintalo a 37 C en un bao de agua antes de aadirlo).
8. Mezcla bien e incuba a temperatura ambiente durante 15 min.
9. Centrfuga 10 min a 14000 x g y elimina el sobrenadante.
10. Resuspende el sedimento en 300 L de NaCl 1,2 M. Agtalo en vrtex.
11. Aade 750 L de etanol puro. Mezcla en vrtex y deja reposar 15 min a temperatura ambiente.
12. Centrfuga 10 min a 14000 x g y elimina el sobrenadante
13. Lava el residuo con etanol al 70% V/V



54

14. Centrifuga nuevamente a 14000 x g y elimina el sobrenadante en tu frasco de residuos.
15. Resuspende en 15L -20 L de agua desionizada esterilizada.
16. Mantnlo a temperatura ambiente o refrigralo.

Preparacin del STET (100 mL)
8% de sacarosa 13 mL de sacarosa al 60%
50mM de EDTA 10 mL de EDTA 0,5mM
50mM de Tris pH 8 5 mL de Tris 1M
0,1% Tritn X-100 0,5 mL de Tritn X-100 al
20%
Agua 71,2 mL

Preparacin del STET: 200 L por tubo, 400 L por equipo
Lisozima: 4L por tubo, 8 L por equipo
cTAB: 10 l por tubo, 20 L por equipo
NaCl 1,2M: 300 L por tubo, 600 L por equipo

Procedimiento III. Por lisis alcalina.
1. Inocula 3 mL de medio LB/ampicilina (10 ug/mL) con la bacteria que lleva el plsmido (E. coli
+ pQSP2, vector que tiene el gen de una serin proteasa de 4,84 kb. (Fragmento de la proteasa:
1,44 kb). Incuba a 37C/ 200g.
2. Cosecha las bacterias de un cultivo de 14 h por centrifugacin a 13000 x g durante 1 min.
3. Elimina el medio al tubo de crecimiento con unas gotas de cloralex y seca la boca del tubo con un
pequeo trozo de papel absorbente.
4. Resuspende las clulas en 100 L de GTE (Glucosa 60 mM- Tris 125mM- EDTA 110mM, pH
8,0).
5. Adiciona 200L de SDS alcalino (NaOH 0,2N en SDS al 1%) y mezcla 7 veces por inversin.
Incuba en hielo durante 5 min.
6. Adiciona 150 L de AcNA 3M (acetato de sodio) e incuba en hielo durante 20 min.
7. Centrifuga 10 min a 13 000 x g.



55

8. Transfiere el sobrenadante a un tubo limpio y agrega 200 L de fenol y 200L de cloroformo.
Mezcla por inversin.
9. Centrifuga a 13 000 g durante 10 min
10. Transfiere la fase superior a un tubo limpio y agregar 2 volmenes de etanol absoluto. Mezcla por
inversin.
11. Centrifuga a 13 000 g durante 15 min
12. Elimina el sobrenadante y lava la pastilla 3 veces con 500 L de etanol al 80% centrifugando 3
min entre cada lavado.
13. Seca la pastilla durante 10 min y resuspende en agua o TE para disolver el DNA.

Todos los tubos microtubos utilizados colctalos en el bote que se te proporcionar. No los
tires a la basura.

INVESTIGACIN PREVIA
1. Cul es la diferencia en el aislamiento de DNA plasmdico y de DNA de clulas o tejidos?
2. Ilustra mediante un diagrama de flujo, las etapas involucradas en la extraccin de RNA de clulas
o tejidos, sealando los pasos cruciales del aislamiento.
3. Para qu se requiere un DNA puro? Qu usos tiene?

REFERENCIAS
Wilson, K. and Walker, J. Principles and Techniques of Practical Biochemistry. 5ed. Cambridge University
Press. 2000
Sambrook, Fritsch-Maniatis. Small-scale preparations of plasmid DNA. In Molecular Cloning. A laboratory
manual. Second edition. 1996
Nelson, David L. and Cox, Michael M. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4ed. Ed. Worth
Publishers. 2004.


RESPUESTAS






56





57

PRCTICA 14
ANLISIS Y CUANTIFICACIN DE CIDOS NUCLEICOS

OBJETIVO
Comprobar la integridad y calidad del DNA plasmdico obtenido de Escherichia coli mediante electroforesis
en un gel de agarosa.

FUNDAMENTO
Una forma de cuantificar el cido nucleico aislado es medir la absorbancia que presentan a 260 nm. La
concentracin de DNA se determina considerando que 1 unidad de absorbancia es igual a 50 g de DNA/
cm
3
:
50 x A260 = concentracin de DNA (g cm
-3
)

Si la relacin A260 / A280 es 1,8, la muestra est libre de contaminacin proteica (las protenas absorben
fuertemente a 280).
En el caso del RNA,
40 x A260 = concentracin de RNA (g cm
-3
)
y la relacin A260 / A280 ser igual a 2.0 si el RNA est libre de impurezas.

El anlisis del DNA para checar su pureza e integridad puede realizarse sobre geles de poliacrilamida o
geles de agarosa empleando el DNA obtenido y/o cortado con enzimas de restriccin especficas. Es
posible observar las bandas tindolas con bromuro de etidio. Este se intercala entre los pares de bases y
presenta una fuerte fluorescencia rojo-naranja cuando se ilumina con luz ultravioleta. Este mtodo es muy
conveniente pues requiere poco tiempo y cantidades muy pequeas de muestra. Los geles de agarosa
permiten el anlisis de molculas mayores a 100 pb.

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO
Cmara horizontal para geles de agarosa,
Matraz Erlenmeyer de 50 mL,
Micropipetas de 1000L, 200L y 20 L,
Tubos Eppendorf,
Fuente de poder,
Guantes desechables.




58

REACTIVOS EMPLEADOS
Agarosa,
TAE 1X (60 mL por cmara),
Solucin de bromuro de etidio,
Regulador de carga con azul de
bromofenol,
3 L de marcadores,
DNA control,
Enzima de restriccin y amortiguador
especficos.


PROCEDIMIENTO
A. Corte con enzimas de restriccin
1. Coloca 5 L del DNA plasmdico en un tubo Eppendorf, adiciona 2 L del amortiguador y 2 L
de la enzima.
2. Completa con agua destilada estril a un volumen de 20 L.
3. Incuba a 37 C durante 60 min.

B. Preparacin del gel de agarosa al 1%
1. Prepara una cmara horizontal para electroforesis en gel de agarosa.
2. En un matraz Erlenmeyer coloca 0,2 g de agarosa con 20 mL de TAE 1X y 1 L de bromuro de
etidio. Calintalo hasta disolucin y llena la cmara como se te indicar. Coloca el peine para
formar los pozos.
3. Djalo gelificar por 20 min.
4. Toma 3 L de tu muestra de DNA cortado y sin cortar en un microtubo y aade 3 L de buffer
de carga (0,6 mL de glicerol estril al 50%, 0,020 mL de TAE 50X, 0,380 mL de agua estril y una
pizca de azul de bromofenol).
5. Cuidadosamente coloca la muestra en un pozo del gel previamente preparado.
6. En otro pozo, coloca 3 L de marcadores.
7. Colecta las puntas que utilizaste en un bote de plstico. No las tires a la basura.
8. Corre las muestras a 95 V por 30 min. Podrs observar el frente de la corrida por la lnea del azul
de bromofenol.
9. Llvalo al procesador de imgenes y obsrvalo bajo iluminacin ultravioleta. Si es posible, toma
una foto o grbalo e identifica las bandas. Desecha el gel al frasco que se te proporcionar.

C. Cuantificacin de DNA



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1. Toma 10 L del DNA obtenido y colcalos en 1 ml T10E o agua destilada estril.
2. Realiza la lectura de absorbancia a 280 y a 260 nm
3. Utiliza la ecuacin correspondiente para conocer la concentracin de cido nucleico que obtuviste.
4. Calcula la pureza de tu muestra de DNA.

INVESTIGACIN PREVIA
1. Qu son las enzimas de restriccin?
2. Qu significa si no observas bandas de DNA en el gel de agarosa y obtienes lectura de
absorbancia de 1,8 ?
3. En qu consiste un Southern blott? Para qu sirve?

REFERENCIAS
Wilson, K. and Walker, J. Principles and Techniques of Practical Biochemistry. 5ed. Cambridge University
Press. 2000
Sambrook, Fritsch-Maniatis. Small-scale preparations of plasmid DNA. In Molecular Cloning. A laboratory
manual. Second edition. 1996
Nelson, David L. and Cox, Michael M. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4ed. Ed. Worth
Publishers. 2004.


RESPUESTAS



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Bioqumica: Un Estudio Prctico
De las Biomolculas

de: Patricia Cullar Mata
Luis Felipe Padilla Vaca



Se termin de imprimir en el mes
de diciembre de 2008 con un tiraje de 100 ejemplares.

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