Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 1

C A P T U L O 2 . 8 . 9
ENFERMEDAD VESI CULAR PORCI NA
RESUMEN
La enfermedad vesicular porcina (EVP) es una enfermedad contagiosa de los cerdos causada por
un enterovirus que se caracteriza por la aparicin de vesculas en las bandas coronarias, en los las
pezuas y, ocasionalmente, en los labios, la lengua, el hocico y las ubres. Las cepas de la EVP
pueden variar en el grado de virulencia, y la enfermedad puede ser subclnica, leve o grave,
pudindose observar esta ltima slo cuando los cerdos estn alojados en locales con suelos
abrasivos, en condiciones de humedad. La importancia crucial de la EVP es la imposibilidad de
distinguirla clnicamente de la fiebre aftosa (FA), y debe asumirse que los brotes de la enfermedad
vesicular en cerdos corresponden a FA hasta que se investiguen mediante pruebas de laboratorio
y se demuestre lo contrario. Sin embargo, en los ltimos aos la infeccin subclnica ha sido la
manifestacin ms observada.
Identificacin del agente: En los cerdos en los que se aprecie la enfermedad vesicular, la
demostracin del antgeno vrico de la EVP mediante el enzimoinmunoensayo (ELISA) en una
muestra de material de una lesin o de fluido vesicular es suficiente para un diagnstico positivo.
Si la cantidad de material de una lesin enviada para el diagnstico no es suficiente (menos de
0,5 gramos) o si los resultados de las pruebas son negativos o no concluyentes, se puede utilizar
una prueba ms sensible, como la reaccin en cadena de la polimerasa de transcripcin inversa
(RT-PCR), o el aislamiento del virus (VI) en cultivos celulares porcinos. Si finalmente se produce
un efecto citoptico en alguno de los cultivos inoculados, la demostracin del antgeno vrico de la
EVP mediante la tcnica ELISA o por RT-PCR, ser suficiente para un diagnstico positivo. La
infeccin subclnica puede detectarse mediante un muestreo aleatorio de las heces procedentes
del suelo de la pocilga y la identificacin del genoma vrico de la EVP puede realizarse utilizando
RT-PCR o pruebas de identificacin del virus (VI).
Pruebas serolgicas: Las pruebas serolgicas sirven de ayuda para la confirmacin de casos
clnicos y para la identificacin de las infecciones subclnicas. El anticuerpo especfico frente al
virus de la EVP puede identificarse mediante la prueba de microneutralizacin o por el ELISA.
Aunque se requieren de 2 a 3 das para completar la prueba de microneutralizacin, sta
constituye la prueba definitiva para la deteccin de anticuerpos frente al virus de la EVP. Una
pequea proporcin (hasta el 0,1%) de los cerdos normales, no infectados, reaccionarn
positivamente en las pruebas serolgicas para la EVP. La reactividad de estos animales positivos
aislados es transitoria, de modo que pueden diferenciarse de los cerdos infectados mediante un
nuevo muestreo de los animales positivos y de sus cohortes.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: Actualmente no se dispone de
vacunas comerciales contra la EVP. Los reactivos estndares y de diagnstico estn disponibles
en los laboratorios de referencia regionales.
A. INTRODUCCIN
La enfermedad vesicular porcina (EVP) es una enfermedad subclnica, leve o severa, dependiendo de la cepa de
virus implicada, de la va y la dosis de infeccin y de las condiciones de cra en las que se mantiene a los cerdos.
Clnicamente, la EVP no es distinguible de la fiebre aftosa (FA), y esto tiene una importancia crucial. Por lo tanto,
es urgente diferenciar los casos de la EVP de los de la FA, mediante la investigacin en el laboratorio. Los brotes
recientes de EVP se han caracterizado por la presencia de sntomas menos graves o por la ausencia de los
mismos; se ha detectado la infeccin al ensayar muestras para un programa de serovigilancia o para la
certificacin relacionada con la exportacin.
Captulo 2.8.9. Enfermedad vesicular porcina
2 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
El perodo de incubacin de la EVP dura entre 2 y 7 das, tras los cuales puede aparecer una fiebre pasajera de
hasta 41C. A continuacin, se desarrollan las vesculas en la banda coronaria, de forma tpica en la unin con el
taln. Estas vesculas pueden afectar a la banda coronaria completa, dando lugar a la prdida de la pezua. Con
menos frecuencia, las vesculas pueden aparecer en el hocico, particularmente en la superficie dorsal, en los
labios, la lengua y las ubres, y pueden observarse erosiones superficiales en las articulaciones. Los cerdos
afectados pueden renquear y estar inapetentes durante unos cuantos das. El aborto no es una caracterstica
tpica de la EVP. La recuperacin completa se produce normalmente en 23 semanas, y como nica seal de la
infeccin queda una lnea horizontal y oscura en la pezua, donde se ha interrumpido temporalmente el
crecimiento. Los sntomas varan segn la edad de los cerdos afectados, las condiciones de manejo y la cepa de
virus de la EVP implicada (13). La enfermedad causada por cepas atenuadas puede pasar desapercibida,
particularmente en los cerdos a los que se mantiene sobre la hierba o en locales con mucha paja. Los animales
ms jvenes resultan ms gravemente afectados, aunque la mortalidad debida a la EVP es muy rara, a
diferencia de lo que ocurre con la fiebre aftosa en los cerdos jvenes. Se han descrito sntomas nerviosos, pero
no son frecuentes. Los cerdos afectados pueden excretar el virus por la nariz, la boca y en las heces, hasta
48 horas antes de la aparicin de los sntomas. La mayor parte de los virus se produce en los primeros 7 das
despus de la infeccin, y la excrecin de virus por la boca y la nariz se detiene normalmente en menos de
2 semanas. El virus se puede seguir eliminando en las heces durante un periodo de hasta 3 meses. El virus de la
EVP es extraordinariamente resistente a la inactivacin en el hbitat natural, y es estable en el rango de pH 2,5
12,0 (14), a diferencia del virus de la fiebre aftosa, que resulta muy lbil fuera del rango de pH 6,08,0.
Debido a que la EVP puede ser leve o subclnica, es imprescindible que se incluyan muestras de suero de los
cerdos sospechosos y de otros animales aparentemente no afectados del grupo, cuando se enven muestras
procedentes de casos clnicamente sospechosos. El virus de la EVP puede pasar desapercibido hasta que afecta
a un grupo particularmente susceptible y, por lo tanto, con el fin de establecer cunto tiempo estar presente la
enfermedad, es necesario comprobar la seroconversin frente al virus de la EVP en animales aparentemente
sanos. As mismo, la identificacin del istopo de las inmunoglobulinas (M o G) contra el virus de la EVP puede
ser de ayuda para determinar el tiempo de exposicin a la infeccin.
La enfermedad vesicular porcina es clnicamente muy similar a la fiebre aftosa. Las muestras para el aislamiento
del virus o la deteccin antignica deben manejarse y enviarse como si contuvieran el virus de la fiebre aftosa, y
deben transportarse en solucin salina tamponada con fosfato (PBS) mezclada con glicerol (1/1), pH 7,27,6,
con antibiticos (concentracin final por mililitro) como penicilina (1.000 Unidades Internacionales [UI]), sulfato de
neomicina (100 UI), sulfato de polimixina B (50 UI) y micostatina (100 UI) (10).
El virus de la EVP ha sido clasificado como un enterovirus perteneciente a la familia Picornaviridae. Todos los
aislamientos se clasifican en un nico serotipo, con cuatro variantes antignicas/genmicas diferenciables (2).
Antignicamente, el virus de la EVP se relaciona con el virus humano coxsackievirus B5. Hay informes de la
seroconversin frente al virus de la EVP en personal de laboratorio que est en contacto con el agente. Se
inform de que la enfermedad clnica era leve, con excepcin de un nico caso de meningitis asociada a la
infeccin por el virus de la EVP. Sin embargo, no se han descrito casos de seroconversin o de la enfermedad
en granjeros o veterinarios en contacto con cerdos infectados. No se ha podido demostrar la transmisin de
coxsackievirus B5 entre los cerdos en condiciones experimentales.
B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1. Identificacin del agente
Cualquier afeccin vesicular en los cerdos puede ser fiebre aftosa. En el caso de que se haya eliminado la
sospecha de fiebre aftosa, se requiere la utilizacin de las instalaciones de un laboratorio especializado para el
diagnstico de la EVP. Los pases que carezcan de dichas instalaciones habrn de enviar las muestras para ser
investigadas al laboratorio de referencia de la OIE para la EVP
1
. En Amrica se debern realizar tambin
pruebas paralelas para el antgeno vrico de la estomatitis vesicular.
La deteccin de los antgenos o el genoma del virus de la EVP por medio de un enzimoinmunoensayo (ELISA) y
por la reaccin en cadena de la polimerasa de transcripcin inversa (RT-PCR) tienen el mismo valor diagnstico
que el aislamiento del virus. Por su rapidez, el ELISA y la RT-PCR constituyen pruebas analticas adecuadas. Sin
embargo, el aislamiento del virus constituye el mtodo de referencia y debera utilizarse en el caso de que un
resultado positivo mediante ELISA o RT-PCR no se asocie con la deteccin de sntomas de la enfermedad, con
la deteccin de cerdos seropositivos, o con una conexin epidemiolgica directa con un brote confirmado.

1 FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) World Reference Laboratory for FMD, Institute for Animal
Health, Pirbright, Woking, Surrey GU24 0NF, United Kingdom (Tambin es un laboratorio de referencia para la fiebre
aftosa [FA], la enfermedad de Marek [EM] y la enfermedad vesicular porcina [EVP]). Istituto Zooprofilattico Sperimentale
della Lombardia e dellEmilia Romagna (IZSLER), Brescia, Via Bianchi 9, Italia.
Captulo 2.8.9. Enfermedad vesicular porcina
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 3
Si hay sntomas, la investigacin comenzar con el examen de una suspensin al 10% de material de las
lesiones en PBS. Las muestras fecales se utilizan para la deteccin del virus cuando se sospeche la presencia
de una infeccin subclnica. Pueden recogerse de los cerdos o del suelo de las instalaciones en las que se
sospeche que alberguen o hayan albergado cerdos infectados con EVP. Normalmente el nivel de virus de las
heces es insuficiente para la deteccin mediante el ELISA y se requiere la utilizacin de la RT-PCR y/o
aislamiento del virus. La inoculacin de una proporcin significativa de muestras fecales en los cultivos celulares
propiciar el crecimiento de otros enterovirus. Estos ltimos pueden diferenciarse del virus de la EVP mediante el
ELISA o la RT-PCR, pero pueden crecer en cantidad superior al virus de la EVP, que tambin est presente, y de
este modo dar lugar a resultados negativos falsos.
Preparacin de las muestras
Material procedente de lesiones: Se prepara una suspensin triturando la muestra con arena esterilizada en
un mortero esterilizado con un pequeo volumen de medio de cultivo celular y antibiticos. Se debe aadir
ms medio de cultivo hasta obtener una suspensin de en torno al 10%. sta se clarifica mediante un
centrifugado a 10.000 rpm durante 2030 minutos en una ultracentrfuga y se recoge el sobrenadante.
Muestras fecales: Se resuspende el material fecal (aproximadamente 20 g) en una cantidad mnima de
medio cultivo celular de tejido o en tampn fosfato (0,04 M de tampn fosfato o PBS). Se homogeneiza la
suspensin en un vrtex y se clarifica mediante una centrifugacin a 10.000 rpm durante 2030 minutos en
una ultracentrfuga; se recoge el sobrenadante y se filtra con un filtro de 0,45 m.
a) Aislamiento del virus
Se inocula una porcin de la suspensin epitelial en monocapas de clulas IB-RS-2 u otras clulas porcinas
susceptibles. Para el diagnstico diferencial (por ejemplo, la fiebre aftosa) se emplearn tambin sistemas
de cultivos celulares bovinos. Por lo general, el virus de la EVP crece solamente en clulas de origen
porcino; no obstante, existe un informe segn el cual el virus puede aislarse en clulas secundarias de rin
de cordero. Para el crecimiento celular, se aade suero bovino al 10%; para el mantenimiento, se aade
suero bovino al 3% y antibiticos.
Los cultivos se examinan a diario. Se observa el efecto citoptico, se recoge el lquido sobrenadante y se
realiza la identificacin del virus mediante un ELISA (u otra prueba adecuada, como la RT-PCR). En los
cultivos negativos no se aprecia ningn efecto despus de 48 o 72 horas, aunque se mantienen en
observacin durante 2-3 das ms. Si no se produce el efecto citoptico manifiesto tras el segundo pase, la
muestra se etiqueta como NVD (sin deteccin de virus). Cuando se asla el virus en las heces, donde la
cantidad de virus presente puede ser pequea, puede ser necesario un tercer pase del cultivo celular.
b) Mtodos inmunolgicos
Enzimoinmunoensayo
Para la deteccin del antgeno vrico de la EVP se ha preferido utilizar un ELISA indirecto de tipo sndwich
en lugar de la prueba de fijacin del complemento. La prueba es la misma que se utiliza para el diagnstico
de la FA. Se recubren los pocillos de las placas ELISA con antisuero de conejo contra el virus de la EVP.
Este es el suero de captura. Se aaden las suspensiones de los sueros problema y se incuban. Se incluyen
tambin los controles apropiados. En la siguiente fase se aade el suero detector de cobaya, seguido de la
adicin del suero anticobaya de conejo conjugado con peroxidasa de rbano. Se hace un lavado exhaustivo
entre cada etapa para eliminar los reactivos que no se hayan unido. La reaccin positiva se pone de
manifiesto si se produce una reaccin de color al aadir un cromgeno (por ejemplo, ortofenilendiamina) y
un substrato (H
2
O
2
). En el caso de las reacciones fuertemente positivas el resultado ser evidente a simple
vista, pero los resultados se pueden leer tambin por espectrofotometra a la longitud de onda adecuada, en
cuyo caso una lectura de absorbancia de 0,1 por encima del nivel de fondo indica una reaccin positiva.
Como alternativa a los antisueros de cobaya y de ratn, se pueden emplear tambin anticuerpos
monoclonales apropiados (MAb), adheridos a la placa ELISA y utilizados como anticuerpo de captura o
conjugados con peroxidasa como anticuerpo de rastreo.
Para estudiar la variacin antignica entre las cepas del virus EVP, se puede utilizar tambin un ELISA
basado en los MAb. Las cepas vricas obtenidas en los cultivos celulares son capturadas por un antisuero
de conejo hiperinmune frente al virus de la EVP adherido a la fase slida. Despus se hacen reaccionar con
un grupo de MAb apropiados, y la unin de los MAb a las cepas de campo se compara con la unin a las
cepas originales. Una unin fuerte indica la presencia de eptopos compartidos por la cepa original y las
cepas de campo (2).
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c) Mtodos de reconocimiento de los cidos nucleicos
La transcripcin inversa seguida de la PCR (RT-PCR) es un mtodo til para detectar el genoma vrico de la
EVP en una variedad de muestras de casos clnicos y subclnicos. Se han descrito varios mtodos (3, 7, 12,
1518), en los que se emplean diferentes tcnicas para la extraccin de ARN, orientados a diferentes
partes del genoma vrico de la EVP, y se emplean diferentes enfoques para la deteccin de los productos
de amplificacin de ADN. En relacin con las muestras fecales, se ha demostrado la efectividad de una
tcnica de inmunocaptura en la que se usa un MAb especfico contra el virus de la EVP (7). Dicho mtodo,
que se describe ms adelante, es adecuado para laboratorios que no cuentan con un equipo sofisticado
para la deteccin en tiempo real de los productos de amplificacin de ADN; pero, en los que cuentan con
ese equipo, un enfoque como el descrito por Reid et al. (16, 17) ofrece ventajas en trminos de la facilidad
de uso y de un menor riesgo de contaminacin del laboratorio por los productos de la PCR.
i) Extraccin de ARN: Se recubren pocillos de una placa de ELISA con una solucin saturada de MAb
5B7 (200 l/pocillo, diluida en tampn carbonato-bicarbonato) mediante incubacin a 4C. Se lavan las
placas tres veces con PBS. Se utilizan las placas de forma inmediata o se guardan a 20C durante
un mximo de 23 semanas, o ms si se ha estabilizado. NOTA: Como alternativa a la inmunocaptura,
para la extraccin de ARN puede utilizarse un kit adecuado disponible en el mercado (como el kit
RNeasy de Qiagen).
ii) Se distribuye cada muestra (suspensin de heces) en tres pocillos de la placa recubierta de 5B7
(200 l/pocillo, 600 l de muestra en total).
iii) Despus de incubar durante 1hora a 37C agitando con suavidad, se lavan los pocillos tres veces con
PBS. El lavado se realiza a mano, para evitar la contaminacin cruzada de los pocillos.
iv) Se extrae ARN de cada muestra mediante la adicin de aproximadamente 100 l/pocillo de tampn de
lisis (4 M de tiocianato de guanidina, 25 mM de citrato sdico, pH 7, 0,5% de sarkosyl). Se incuban los
pocillos durante 35 minutos, se recupera la muestra de los tres pocillos (300350 l en total) y se
transfiere a un nico tubo.
v) Se precipita el ARN aadiendo un mezcla de 750 l de etanol absoluto y 35 l de 3 M acetato sdico
(pH 5,2); los viales se agitan con un vrtex y se incuban a 20C durante un mnimo de 1 hora (puede
ser conveniente una precipitacin durante toda la noche a 20C).
vi) Se centrifuga la muestra a 13.000 rpm durante 30 minutos a 4C, tras lo cual debera ser visible un
precipitado que debe lavarse con 500 l de etanol fro al 70% (centrifugado a 13.000 rpm durante
10 minutos a 4C) y secarse.
vii) Se juntan las mezclas de la reaccin para la transcripcin inversa del ARN de la EVP. Las mezclas
(20 l del volumen total) contienen 4 l de tampn de reaccin 5AMV (la concentracin de la reaccin
final es 8 mM MgCl
2,
30 mM KCl, 1 mM ditiotreitol, 50 mM Tris/HCl, pH 8,5), 2 l 10 mM de le mezcla
dNTP, 1 l de Cebador Aleatorio pd(N)
6
(100 pmoles), 0,3 l del inhibidor de RNasa I (12 unidades),
0,2 l AMV de la transcriptasa inversa (5 unidades) 0,5 l BSA (0,5 g) y 12 l de agua libre de
nucleasas.
viii) Se resuspende el precipitado de ARN en 20 l de la mezcla para la transcripcin inversa (vase ms
arriba).
ix) Se incuban las reacciones a 42C durante 60 minutos y a 95C durante 3 minutos.
x) PCR para el genoma de la EVP: Se aaden 5 l del ADNc preparado a 20 l de una mezcla de la
amplificacin por PCR que contenga 0,55 l 2M KCl (la concentracin final de la reaccin es 44 mM),
2 l 10 mM de la mezcla dNTP, 1 l del cebador inverso pSVDV-SA2 (10 pmoles: 5-TCA-CGT-TTG-
TCC-AGG-TTA-CC-3), 1 l del cebador directo pSVDV-SS4 (10 pmoles: 5-TTC-AGA-ATG-ATT-GCA-
TAT-GGG-G-3), 0,25 l de Taq polimerasa (1,24 unidades) y 15,2 l de agua libre de nucleasas.
xi) Se coloca la placa en un termociclador para PCR y se realiza el siguiente programa:
Un ciclo a 94C durante 3 minutos,
40 ciclos a 94C durante 20 segundos, 60C durante 20 segundos y 72C durante 30 segundos,
Un ciclo a 72C durante 5 minutos.
xii) Se mezcla una alcuota de 20 l de cada muestra con 4 l de solucin de tincin y se coloca en gel de
agar al 2%. Tras la electroforesis, un resultado positivo aparece indicado por la presencia en el gel de
un fragmento de 154 pb del gen (3D) del ARN polimerasa de la EVP.
El anlisis comparativo de las secuencias del genoma vrico es til para establecer las relaciones entre los
aislamientos del virus de la EVP. La secuenciacin del gen 1D, que codifica la principal protena estructural
VP1, ha permitido agrupar las cepas del virus de la EVP en funcin de la homologa de sus secuencias, y
relacionar epidemiolgicamente las cepas causantes de la enfermedad en distintas regiones o en pocas
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diferentes (2). Resulta til el anlisis comparativo de las secuencias del genoma vrico. Se conserva una
base de datos de las secuencias del gen ID de los virus de la EVP en el laboratorio de referencia de la OIE
de Pirbright, UK.
2. Pruebas serolgicas
Estas pruebas se utilizan para la confirmacin de los brotes por los laboratorios, para la vigilancia serolgica y
para la certificacin relacionada con la exportacin de cerdos. Normalmente la enfermedad vesicular porcina se
diagnostica slo con los resultados aportados por las pruebas serolgicas. Debido a la naturaleza subclnica o
leve de la enfermedad, la primera sospecha de la enfermedad se tiene con frecuencia despus de las pruebas
serolgicas rutinarias que se realizan para la vigilancia de la enfermedad o para el certificado de exportacin.
Para la deteccin de anticuerpos contra el virus de la EVP se han descrito la prueba de neutralizacin vrica
(NV), la de inmunodifusin doble, la de inmunodifusin radial, la de contra-inmunoelectroforesis y el ELISA (1, 5,
8). Sin embargo, las pruebas de NV y el ELISA son las nicas pruebas de uso comn. La prueba de NV es la
prueba estndar aceptada, pero tiene la desventaja de que lleva 23 das completarla, y requiere instalaciones
para el cultivo celular. El ELISA es ms rpido, y puede estandarizarse con mayor facilidad. Una pequea
proporcin de los sueros procedentes de los animales que no han estado previamente expuestos al virus de la
EVP reaccionarn positivamente en pruebas serolgicas de deteccin de anticuerpos contra el virus de la EVP.
El ELISA de competicin que emplea el MAb 5B7 (MAC-ELISA) es una tcnica fiable para la deteccin de
anticuerpos de la EVP (1,9) y se han obtenido resultados similares con otras pruebas ELISA (4, 11). Los
resultados con una pequea proporcin (0,25%-0,45%) de sueros de cerdos normales son dudosos o positivos
mediante el MAC-ELISA, y deben probarse de nuevo mediante la prueba de NV. Hasta aproximadamente el 50%
de estos sueros tambin resultarn positivos en la prueba de NV, es decir, entre el 0,1 y el 0,2% de la poblacin
original). Se pueden considerar como no infectados a los animales que den positivo mediante el ELISA pero
negativo en la prueba de NV. Deben recogerse muestras repetidas de los animales que den positivo en ambas
pruebas y tambin de sus cohortes. Una titulacin constante o decreciente del ttulo en el animal positivo y la
ausencia de anticuerpos contra el virus de la EVP en las cohortes confirma el estado del animal positivo como un
positivo aislado. Se desconocen los factores responsables de la aparicin de los animales positivos aislados.
La reactividad serolgica cruzada con el virus de la EVP podra darse debido a la infeccin por otro picornavirus,
aunque an sin identificar, o puede deberse a factores inespecficos presentes en el suero. Puede resultar til la
identificacin del isotipo del anticuerpo que se halla en los sueros positivos (1), puesto que los sueros de los
cerdos infectados contienen normalmente IgG especfica sola o IgG e IgM, mientras que, normalmente, los
sueros de los animales positivos aislados contienen, exclusivamente, IgM y no se convierten en IgG (6). Las
pruebas ELISA especficas para el isotipo IgM/IgG tambin son de ayuda para determinar el momento de
infeccin del cerdo o de las instalaciones infectadas. La presencia de IgM, solo o junto con IgG, es prueba de
una infeccin reciente y de la propagacin del virus, mientras que la deteccin de solo IgG indicara una
exposicin ms antigua a la infeccin (1).
a) Neutralizacin vrica (prueba prescrita para el comercio internacional)
La microprueba cuantitativa de NV para la deteccin de anticuerpos frente al virus de la EVP se lleva a cabo
utilizando clulas IB-RS-2 (o clulas adecuadas de cerdo susceptible) en placas de microtitulacin de fondo
plano para cultivos de tejidos.
Se hace crecer el virus en monocapas de clulas IB-RS-2 y, despus de aadir un volumen igual de
glicerol, se guarda a 20C. Se ha observado que el virus de la EVP es estable en estas condiciones
durante al menos 1 ao. Antes de probar los sueros, se inactivan a 56C durante 30 minutos. Un medio
adecuado para el cultivo es el medio completo de Eagle/LYH con antibiticos.
sta es una prueba de volmenes iguales en la que se utilizan volmenes de 50 l.
i) A partir de una dilucin 1/4, se hacen diluciones seriadas con un factor de dilucin 2 de los sueros en
las placas, empleando dos hileras de pocillos para cada uno de los sueros problema.
ii) Se aade el virus previamente titulado. Cada volumen de 50 l de suspensin vrica contiene
alrededor de 100 DICC
50
(dosis infectiva 50% de cultivo celular).
iii) Se incluyen los siguientes controles: al menos un suero dbilmente positivo y un suero negativo, un
control celular, un control de medio de cultivo y una titulacin del virus utilizada para calcular el ttulo
vrico real empleado en la prueba.
iv) Se cubren las placas y se incuban a 37C durante 1 hora.
v) Se prepara una suspensin celular de 10
6
clulas/ml en medio con suero bovino al 10%, a fin de
favorecer el crecimiento celular. Se aaden 50 l de esta suspensin celular a cada pocillo.
Captulo 2.8.9. Enfermedad vesicular porcina
6 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
vi) Se sellan las placas con una cinta sensible a la presin y se incuban a 37C durante 23 das.
Alternativamente, las placas pueden taparse con cubiertas no hermticas e incubarse a 37C en una
atmsfera con dixido de carbono al 5% durante 23 das.
vii) Al cabo de 4872 horas, se realizan las lecturas al microscopio. Finalmente se pueden fijar las placas
y, normalmente, se tien al tercer da. La fijacin se realiza con formalina/solucin salina al 10%
durante 30 minutos. La tincin se realiza sumergiendo las placas durante 30 minutos en azul de
metileno al 0,05% preparado en formalina al 10%. Las placas se enjuagan con agua corriente.
viii) Los tapices celulares teidos de azul constituyen los resultados positivos; los pocillos negativos estn
vacos. Los ttulos se expresan por la dilucin final del suero presente en las mezclas de suero/virus
que corresponden al 50% a punto final. La prueba se considerar vlida cuando la cantidad de virus
por pocillo realmente utilizada se encuentre entre 10
1,5
y 10
2,5
DICC
50
, y el ttulo del suero estndar
positivo se encuentre dentro de los lmites del doble de su ttulo esperado.
ix) Interpretacin de los resultados: En el laboratorio de referencia para la EVP que la OIE tiene en
Pirbright (vase la nota 1 a pie de pgina), se considera negativo un ttulo de NV inferior o igual a 1/11.
Un ttulo comprendido entre 1/16 y 1/32 es dudoso, y se considera positivo un ttulo igual o superior a
1/45. Sin embargo, dado que los ttulos dependen del sistema celular utilizado, los laboratorios
debern establecer sus propios criterios tomando como referencia los reactivos estndares que se
encuentran disponibles en el laboratorio de referencia para la fiebre aftosa de la OIE.
b) Enzimoinmunoensayo
En el ELISA desarrollado por Brocchi et al. (1), el antgeno vrico de la EVP es capturado en la fase slida
utilizando el MAb 5B7. A continuacin se evala la capacidad de los sueros problema para inhibir la unin
del anticuerpo MAb 5B7 conjugado con peroxidasa al antgeno capturado. Finalmente se detecta la
cantidad del MAb conjugado unido, mediante la adicin de substrato y cromgeno.
i) Se revisten las placas ELISA con 50 l/pocillo de MAb 5B7 a una dilucin saturada, en tampn
carbonato/bicarbonato, pH 9,6, y se incuban a 4C durante toda la noche.
ii) Se lavan las placas tres veces con PBS ms Tween 20 al 0,05%, y se aaden 50 l de antgeno de la
EVP (el virus de la EVP se ha hecho crecer en clulas IB-RS-2, se ha clarificado, filtrado e inactivado)
a una dilucin ptima predeterminada. La dilucin ptima del antgeno se determina mediante las
titulaciones de doble entrada del antgeno y del MAb conjugado que definen la dilucin de trabajo,
presentando un valor de absorbancia situado en la parte superior de la regin lineal de la curva de
titulacin del antgeno (entre 1,5 y 2,0 unidades de densidad ptica). A continuacin se incuban las
placas a 37C durante 1 hora.
iii) Despus de tres lavados adicionales, se incuban 50 l de los sueros problema diluidos (no
inactivados) y de los sueros control con el antgeno capturado a 37C durante 1 hora. Los sueros se
someten a diluciones seriadas con un factor de dilucin 3 directamente en los pocillos de las placas
ELISA, aadiendo 10 l de suero a 65 l de tampn (dilucin 1/7,5) transfiriendo a continuacin 25 l a
los pocillos consecutivos, que contienen 50 l de tampn mezclando y desechando finalmente 25 l.
iv) Despus de 1 hora de incubacin, se aaden 25 l de una dilucin ptima de MAb 5B7 conjugado con
peroxidasa (vase la etapa (ii)) a cada pocillo, y se incuban las placas a 37C, durante 1 hora ms.
v) Despus de una serie final de lavados, se inicia la reaccin colorimtrica mediante la distribucin de
50 l por pocillo de la solucin substrato (por ejemplo 0,5 mg/ml de ortofenilendiamina en tampn
fosfato/citrato, pH 5, ms H
2
O
2
al 0,02%).
vi) Transcurridos 10 minutos, se detiene la reaccin aadiendo 50 l de cido sulfrico 2 N. Se lee la
absorbancia a una longitud de onda apropiada de 492 nm utilizando un lector de microplacas.
El antgeno, los sueros y el conjugado se diluyen en PBS (pH 7,4) que contenga Tween 20 al 0,05% y
extracto de levadura al 1%; el tampn de dilucin para los sueros contiene, adems, suero de ratn al 1,0%,
bien recubriendo la placa o conjugado con peroxidasa, para impedir la unin inespecfica del suero de cerdo
al MAb 5B7.
vii) Controles: Cuatro pocillos de cada placa con todos los reactivos, excepto el suero problema, para
confirmar la lectura de mxima absorbancia para el antgeno; el suero procedente de un cerdo
convaleciente a cuatro diluciones seleccionadas; el suero de un cerdo negativo y un suero estndar de
cerdo dbilmente positivo.
viii) Interpretacin de los resultados: Las reacciones se expresan por el porcentaje de inhibicin de la
reaccin del MAb con el antgeno de la EVP, causado por cada suero problema. Se considera que los
sueros son positivos cuando se produce una inhibicin 80% en la dilucin 1/7,5; los sueros son
negativos cuando se produce una inhibicin <70% en la dilucin 1/7,5; son dudosos cuando se
produce una inhibicin 70% y <80% en la dilucin 1/7,5. La segunda dilucin (1/22,5) es indicadora
Captulo 2.8.9. Enfermedad vesicular porcina
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008 7
del nivel de anticuerpos: los sueros fuertemente positivos muestran una inhibicin >80% en las
diluciones 1/7,5 y 1/22,5, mientras que los sueros con inhibicin >80% en la dilucin 1/7,5, pero con
menos del 50% de inhibicin en la dilucin 1/22,5 se consideran dbilmente positivos o dudosos.
Debern confirmarse todos los sueros positivos y dudosos utilizando la prueba de NV.
SUEROS DE REFERENCIA ESTNDAR PARA LAS PRUEBAS SEROLGICAS DE LA EVP
El laboratorio de referencia para la fiebre aftosa de la OIE en Pirbright, Reino Unido, mantiene una serie de
sueros de referencia que han sido exhaustivamente validados por los laboratorios de referencia nacionales de la
EVP de los estados miembros de la Unin Europea.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO
Actualmente no existen vacunas disponibles comercialmente para la EVP. Los sueros estndar pueden
obtenerse del laboratorio de referencia mundial para la fiebre aftosa de la OIE/FAO (vase la nota 1 a pie de
pgina). El anticuerpo MAb 5B7 puede conseguirse en el laboratorio de referencia de la OIE para la enfermedad
vesicular porcina, que se encuentra en Italia (vase el cuadro mostrado en la parte 3 de este Manual).
REFERENCIAS
1. BROCCHI E., BERLINZANI A., GAMBA D. & DE SIMONE F. (1995). Development of two novel monoclonal antibody-
based ELISAs for the detection of antibodies and the identification of swine isotypes against swine vesicular
disease virus. J. Virol. Methods, 52, 155167.
2. BROCCHI E., ZHANG G., KNOWLES N.J., WILSDEN G., MCCAWLEY J.W., MARQUARDT O., OHLINGER V.F. & DE
SIMONE F. (1997). Molecular epidemiology of recent outbreaks of swine vesicular disease: two genetically
and antigenically distinct variants in Europe, 19871994. Epidemiol. Infect., 118, 5161.
3. CALLENS M. & DE CLERCQ K. (1999). Highly sensitive detection of swine vesicular disease virus based on a
single tube RT-PCR system and DIG-ELISA detection. J. Virol. Methods, 77, 8799.
4. CHENARD G., BLOEMRAAD M., KRAMPS J.A., TERPSTRA C. & DEKKER A. (1998). Validation of a monoclonal
antibody-based ELISA to detect antibodies directed against swine vesicular disease virus. J. Virol. Methods,
75, 105112.
5. DONALDSON A.I., FERRIS N.P., KNOWLES N.J. & BARNETT I.T.R. (1983). Comparative studies of United Kingdom
isolates of swine vesicular disease virus. Res. Vet. Sci., 35, 295300.
6. DE CLERCQ K. (1998). Reduction of singleton reactors against swine vesicular disease virus by a combination
of virus neutralisation test, monoclonal antibody-based competitive ELISA and isotype specific ELISA. J.
Virol. Methods, 70, 718.
7. FALLACARA F., PACCIARINI M., BUGNETTI M., BERLINZANI A. & BROCCHI E (2000). Detection of swine vesicular
disease virus in faeces samples by immune-PCR assay. In: Veterinary Virology in the New Millennium,
Proceedings of the 5
th
International Congress of the European Society for Veterinary Virology, Brescia, Italy,
2730 August 2000, pp 173174.
8. GOLDING S.M., HEDGER R.S., TALBOT P. & WATSON J. (1976). Radial immunodiffusion and serum neutralisation
techniques for the assay of antibodies to swine vesicular disease. Res. Vet. Sci., 20, 142147.
9. HECKERT A., BROCCHI E., BERLINZANI A. & MACKAY D. (1998). An international comparative analysis of a
competitive ELISA for the detection of antibodies to swine vesicular disease virus. J. Vet. Diagn. Invest., 10,
295297.
10. KITCHING R.P. & DONALDSON A.I. (1987). Collection and transportation of specimens for vesicular virus
investigation. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 6, 263272.
11. KO Y.-J., CHOI K.-S., NAH J.-J., PATON D.J., OEM J.-K., WILSDEN G., KANG S.-Y., JO N.-I., KIM J.-H., LEE H.-W. &
PARK J.-M. (2005). Noninfectious virus-like particle antigen for detection of swine vesicular disease virus
antibodies in pigs by enzyme linked immunosorbent assay. Clin. Diagn. Lab. Immunol., 12, 922929.
Captulo 2.8.9. Enfermedad vesicular porcina
8 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008
12. LIN F., MACKAY D.K.J. & KNOWLES N.J. (1997). Detection of swine vesicular disease virus RNA by reverse
transcription-polymerase chain reaction. J. Virol. Methods, 65, 111121.
13. LOXAM J.R. & HEDGER R.S. (1983). Swine vesicular disease: clinical signs, diagnosis, epidemiology and
control. Rec. sci. tech. Off. int. Epiz., 2, 1124.
14. MANN J.A. (1981). Swine vesicular disease. In: Virus Diseases of Farm Animals, Vol. 2, Gibbs E.P.J., ed.
Academic Press, London, UK, 365381.
15. NUNEZ J.I., BLANCO E., HERNANDEZ T., GOMEX-TEJEDOR C., MARTIN M.I., DOPAZO J. & SOBRINO F. (1998). A RT-
PCR assay for the differential diagnosis of vesicular viral diseases of swine. J. Virol. Methods, 72, 227235.
16. REID S.M., FERRIS N.P., HUTCHINGS G.H., KING D.P. & ALEXANDERSEN S. (2004). Evaluation of real-time
reverse transcription polymerase chain reaction assays for the detection of swine vesicular disease virus. J.
Virol. Methods, 116, 169176.
17. REID S.M., PATON D.J., WILSDEN G., HUTCHINGS G.H., KING D.P., FERRIS N.P. & ALEXANDERSEN S. (2004). Use
of automated real-time RT-PCR to monitor experimental swine vesicular disease virus infection in pigs. J
Comp. Pathol., 131, 308317.
18. VANGRYSPERRE W. & DE CLERCQ K. (1996). Rapid and sensitive polymerase chain reaction based on
detection and typing of foot-and-mouth disease virus in clinical samples and cell culture isolates, combined
with a simultaneous differentiation with other genomically and/or symptomatically related viruses. Arch.
Virol., 141, 331344.
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NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la enfermedad vesicular porcina (vase el cuadro en la
parte 3 de este Manual de animales terrestres o consltese la lista actualizada en la pgina web de la OIE:
www.oie.int).