UNIVERSIDAD CATOLICA DE VALPARAISO

FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS MATEMATICAS

INSTITUTO DE QUIMICA
SECCION BIOQUIMICA

GUIA DE
LABORATORIO
BIOQUIMICA
Experimental 1
Por Diego Fernando Daz Ojeda
Bioqumico
P.U.C.V.

Laboratorio n 1:
Preparacin de tampones, manejo de micropipetas y de
pHmetros.
*** para el ayudante:
reactivos a solicitar NaH 2PO4 y Na2HPO4 HCl e NaOH + 4
vasos precipitados 250ml (limpiezaelectrodo) + 2 pipetas
graduadas 10ml + hacer soluciones HCl y NaOH concentradas
para ajuste pH.
Recomendar al profesor encargado realizar adicionalmente
Correcto uso y verificacin del estado de calibracin de las micropipetas

Tampn fosfato pH=7,0 ; 50mM ; 100ml.

Separar grupos de tal manera que una mitada haga dos
soluciones madres (concentracin superiores a 50mM) y
mezclen X ml de cada una para hacer y aforar el tamn,
mientras la otra mitad pesa, disuelve y afora directamente
las dos sales.
*** Materiales para 1 grupo de 2 personas
2 matraces de aforo 100ml (soluciones finales)
2 matraces de aforo 50 (soluciones madre)
4 vasos precipitados 250ml + 4 agitadores magnticos
2 pipetas graduadas 10ml
2 esptulas
2 pro-pipetas

Laboratorio n 2:
Manejo de diluciones, uso de espectrofotmetros y
determinacin del coeficiente de extincin de una sustancia.
*** para el ayudante:
reactivos a solicitar son azul coomasie, etanol 95%, cido
fosfrico 85% + vaso precipitado 250ml + agitador magntico +
matraz aforo 1000 + papel filtro + embudo grande.
Como preparar solucin Azul Coomasie (CBB) 1 Lt:
1. Disolver 100mg de CBB en 50ml de etanol, para facilitar se
puede aplicar un poco de temperatura. Es difcil disolverlo.
2. Disuelto la mayor cantidad posible, agregar 100ml de cido
fosfrico y la solucin DEBE quedar de color cafzoso,
caso contrario agregar poco a poco ms cido fosfrico.
3. Lavar muy bien el matraz de aforo 1000ml con etanol y un
poco de cido fosfrico y dejar secarlo.
4. Filtrar la solucin de CBB en el matraz y aforarla, solucin
final DEBE quedar de color cafzoso. Guardar en botella
oscura o proteger con papel alumnio.
5. Hacer solucin blanco con etanol al 4,7% y cido fosfrico
al 8,5%.
*** Materiales para 1 grupo de 2 personas:
Para el trabajo de los alumnos avisar que deben diluir
la solucin obtenida de CBB a 0,0001M, si el PM = 854,02 gr/mol
y trabajo= 620nm.
Las celdas se van lavando con una solucin X% de etanol.

4
4
1
1

matraz aforo 25ml

vasos de 10ml
celdas espectrofotmetros 1,5ml o 3,0ml
bolsa puntas amarillas
bolsa puntas azules

Laboratorio n 3:
Obtencin de una curva estndar: mtodos de Bradford y Lowry..
*** para el ayudante:
Reactivos para mtodo Bradford:
si la solucin de 1000ml del laboratorio n2 aun est caf, se
puede seguir utilizando. Caso contrario preparar una nueva
solucin ajustando el volumen final segn lo requerido.
Reactivos para mtodo Lowry
Reactivo Cobre Alcalino (RCA): carbonato de sodio +
tartrato sodio-potasio + sulfato de cobre + hidrxido de
sodio.
Para 400ml , disolver 4gr de carbonato de sodio, 0,4gr de
tartrato sodio-potasio, 0,2gr de sulfato cobre, 8gr hidrxido
sodio.
Para reactivo de Folin, se prepara el mismo dia, diluyndolo
en una proporcin de 0,25ml de Folin en 4,25ml de agua.
Para solucin madre de BSA 10mg/ml
Para la MP (si es necesario), pesar 0,01gr y disolverlo en 50ml.
*** Materiales para 1 grupo de 2 personas:

celdas espectrofotmetro 1,5ml o 3ml

1 gradilla
6 tubos de ensayo + bulbos
3 vasos precipitado 50ml
3 vasos precipitados 100ml
2 pipetas graduadas 10ml
1 cronmetro
parafilm 20cm

Laboratorio n 4:
Separacin mediante cromatografa de exclusin, cromatografa
de intercambio aninico y catinico.
*** para el ayudante:
solicitar 3 vasos precipitados 250ml + parafilm + esptula. Gel
sephadex G-50 (o 75), sephadex DEAE, sephadex CM. Hidratar
de 1 a 2 cucharadas de t, los geles por separado con tampn
fosfato pH=5,0 ; 0,1M
Preparar tampn fosfato pH=5,0 ; 0,1M ; 2Lts.
Preparar tampn fosfato pH=5,0 ; 0,1 M ; KCl 0,01M ; 1Lt.
Muestra Problema X ml, con concentraciones finales de.
Azul dextrano (2000 kDa) ----------------- 2 mg/ml
Citocromo C (12,4 kDa) ---------------------- 10mg/ml
DNP-glicina (0,24 kDa) ----------------------- 0,2 mg/ml
o bien
-amilasa (200 kDa)

4mg/ml
alcohol deshidrogenasa (150 kDa)
5 mg/ml
Albmina de suero bovino (66 kDa) 10 mg/ml
Anhidrasa carbnica (29 kDa)

3 mg/ml

Se cargan 0,5 ml de la MP.

*** Materiales para 1 grupo de 2 personas:

3
columnas cromatografa + manguera + pinza.
3
vasos precipitados 50ml
3
vasos precipitados 100ml
3
pipetas graduadas 1ml
1
probeta 25 ml
1
bolsa eppendorf.
1
bolsa puntas amarillas
1
bolsa puntas azules.

Lana de vidrio + guantes.

Laboratorio n 5:
Fraccionamiento de protenas. Precipitacin por sales de
protenas del suero.
*** para el ayudante:
Solicitar sulfato de amonio y hacer 1lt de tampn fosfato pH=7,0 ;
0,1M.

*** Materiales para 1 grupo de 2 personas:

2 vasos precipitados 250ml
1 vasos precipitado 100ml
1 probeta 10ml
1 esptula
3 tubos centrfuga o tubos de ensayo
1 agitador magntico
1 bolsa puntas azules
1 bolsa ependorf

Laboratorio n 6:
Desalinizacin de soluciones de protenas por filtracin en gel.
Determinacin de concentracin de protenas.
*** para el ayudante:
Solicitar azul de dextrano, preparar 500ml Bradford y hacer 1lt de
tampn fosfato pH=7,0 ; 0,1M.
*** Materiales para 1 grupo de 2 personas:

1
1
1
1
2
1

columnas cromatografa (+pinzas + mangueras)

probeta 25ml
pipeta graduada 1ml
pipeta graduada 10ml
vasos precipitados 50ml
vasos precipitado 100ml
celdas espectrofotmetro 3ml
ependorf
puntas amarillas
puntas azules
parafilm

Laboratorio n 7 y 8:
Cintica Enzimtica Parte 1 y 2:
*** para el ayudante:
Preparar 1lt de tampn fosfato pH=7,0 ; 0,1M. Tambin se puede
pedir que un grupo lo prepare.
Preparar la Di-hidrOxi-Phenil-Alanina (D.O.P.A) 15mM; vol.final
segn grupos (x3), preparar el mismo da porque se autoxida con
el tiempo.
*** Materiales para 1 grupo de 2 personas:

2 vasos precipitacin 25ml

2 vasos precipitacin 50ml
10 cm parafilm
caja celdas espectrofotmetro 3ml
bolsa puntas azules
bolsa puntas amarillas
bolsa ependorf.

Alternativa a la Tirosinasa (ver guia QUI-343)

puede usarse soluciones stock de
** B-galactosidasa = 40mg/ml
** p-nitrophenyl B-d-glucopiransido 50mM, rango trabajo desde 3-10mM
Tampn acetato 200mM, pH=5
incubar durante 5min a 50C y medir Abs a 405nm.

Laboratorio
Purificacin Fosfatasa Alcalina desde hgado de rata.

Primera Parte: extraccin y precipitacin salina

** Ayudante: preparar 2 Lts de Tris-HCl 200mM, pH=8,0.
Preparar reactivo de Bradford.
Buscar tubos falcon de 15ml, el vidrio se rompe.
Pedir sulfato de amonio
*** Materiales para 1 grupo de 2 personas:
Primera parte.
1 mortero pequeo o mediano
1 vidrio reloj
1 agitador magntico

2 vasos precipitacin 50ml

2 vasos precipitacin 100ml
1 vaso precipitacin 250ml
1 esptulas
3 tubos centrfuga falcon de 15ml
1 probeta 10ml
1 bolsa de ependorf
1 bolsa puntas amarillas
1 bolsa puntas azules.

Segunda parte: desalinizacin y actividad enzimtica

Lo mismo que la primera parte (pero sin mortero, agitador y
vidrio reloj), y adicionalmente por grupo de 2 personas:

1 columna cromatografa
1 pipeta 1ml
1 caja de celdas espectrofotmetro 3ml.
papel filtro.
Parafilm

Para dos personas, preparar aprox. 25 ml de p-nitrofenil fosfato

0,003M, considerando triplicado de 6 alcuotas.

Laboratorio n 11:
Extraccin ADN desde tejido
o
Electroforesis de Protenas y ADN.

Extraccin ADN desde tejido:

** Para el ayudante: preparar NaOH 50ml, 8mM.
EtOH 75% 50ml con DEPC
EtOH absoluto 50 ml.
Agarosa 0,7% - 1%, cmara docencia hace 90ml.
BrEt.
Agua DEPC
Solucin Chomczynski 10-20ml.
Tijeras y pinzas para trozar tejido.
*** Materiales para 1 grupo de 2 personas:
bolsa eppendorf autoclavados
bolsa puntas amarillas autoclavadas
bolsa puntas azules autoclavadas
1 o 2 cubetas cuarzo
homogenizador plstico
parafilm.

Electroforesis de Protenas y ADN:

Preparacin de muestras de protenas para SDS-PAGE y
Preparacin de muestras para electroforesis en gel de agarosa
*** Materiales para 1 grupo de 2 personas:
10 vasos precipitados 50 ml
10 vasos precipitados de 25 ml

cubetas cuarzo (mayor cantidad posible)

bolsa de ependorf
Bolsa puntas azules
bolsa puntas amarillas
Parafilm