UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCION

Facultad de Ciencias Qumicas

Microbiologa Industrial

Medios de cultivo microbiolgico



Responsables:
- Freddy Gustavo Alderete
- Daniel Rodrguez Monroy
- Edgar Rojas Zaracho
- Ana Liz Torales Ayala
- Claudio Sosa

Ingeniera Qumica

San Lorenzo Paraguay
2014



Definicin: Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de microorganismos.
Clasificacin de los medios de cultivo
Atendiendo su estado fsico (consistencia):
- Slido: se preparan a partir de los medios lquidos, agregndoles un agente gelificante. Los
ms utilizados son la gelatina y el agar.
Gelatina: Es una protena animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es
hidrolizada por muchas bacterias, y adems su uso est muy limitado porque su punto de fusin es
bajo (lica a temperatura ambiente) razn por la que no puede utilizarse para cultivos a 37C, que es
la tempera ptima de crecimiento para muchos microorganismos.
Agar: Es un polmero de azcares obtenido de algas marinas. Se trata de una molcula insoluble en
agua pero soluble en agua caliente; funde a 90C y solidifica una vez fundido alrededor de los 45C.
Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgnicos indefinidos que pueden falsear los
resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo. Aunque el agar es una mezcla de
polisacridos, Araki, en 1937, los dividi en dos grupos: agarosa, con poco sulfato, libre de cido
pirvico, y agaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La proporcin de agarosa a
agaropectina en el agar vara segn el alga de origen.
- Semislido: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregando a stos un agente
solidificante en una proporcin menor que para preparar medios slidos.
- Lquido: Son los que se presentan en este estado, denominndose por esta razn caldos. El
medio lquido ms utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de
carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtencin de una
suspensin bacteriana de una determinada concentracin.




Segn su composicin qumica
- Sintticos o qumicamente definidos: Son aquellos que contienen en su composicin
exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones
determinadas, resultando un medio de composicin perfectamente definida.
- Complejos: Fueron los primeros utilizados, y los ms empleados se preparan a partir de
tejidos animales, y ms raramente de vegetales. Su composicin no es exactamente definida, y por
consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones
experimentales, donde la reproductibilidad no podr ser exacta. En la prctica corriente estos medios
dan excelentes resultados y son los ms empleados.
- Semisinttico: El gran nmero de factores de crecimiento exigidos para ciertos grmenes hace
que la fabricacin de un medio sinttico para estos grmenes sea imposible o demasiado cara. En
este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico complejo
(extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos grmenes no crecen en ningn medio por muy
enriquecido que est ste, hacindolo exclusivamente en clulas vivas con unas caractersticas
determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc

Segn su utilidad
- Generales: Son aquellos que poseen los componentes mnimos para que pueda producirse el
crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio ms conocido de este
grupo es el agar nutritivo o agar comn, que resulta de la adicin de agar al caldo nutritivo. Otros
representantes de este grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia, etc.
- De enriquecimiento: Son aquellos que, adems de las sustancias nutritivas normales,
incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes.
Este enriquecimiento se hace por adicin de sangre u otros productos biolgicos (sangre, suero,
leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible aadir suplementos
artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (ejemplo: Polivitex, Isovitalex,
etc). El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cistena para su crecimiento. Estas sustancias son
aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo (agar chocolate).

- Selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias
contenidas en una poblacin polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar
nutricionalmente el crecimiento de una poblacin microbiana especfica. Un ejemplo de medio
selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el
del resto de enterobacterias.
- Diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia caractersticas bioqumicas que ayuden a
diferenciar gneros o especies. La adicin de un azcar fermentable o un sustrato metabolizable se
utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los
grmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. Tambin lo son el C.L.E.D. (lactosa
+/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemlisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc.
- De mantenimiento: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese
mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos
utilizados en el Laboratorio de Microbiologa. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres
formas:
a) haciendo pases peridicos de placa a placa,
b) mediante liofilizacin de una suspensin bacteriana, y
c) congelando las cepas en leche descremada estril al 0,1%.
- Inhibidores: Cuando las sustancias aadidas a un medio selectivo impiden totalmente el
crecimiento de una poblacin microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podran
considerarse como una variante ms restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se
consiguen habitualmente por adicin de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba
completamente el desarrollo de una poblacin determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey
que permite el crecimiento de los grmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram
positivos.
- De identificacin: Son los destinados a comprobar alguna cualidad especfica que puede
servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los
elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato especfico que
vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de
Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya aadido un elemento diferencial de un
microorganismo, son medios utilizados en identificacin. Actualmente estn apareciendo en el
mercado una gran cantidad de medios especficos de identificacin para ciertos microorganismos,
con lo cual se consigue simultneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de identificacin. Son
ejemplos de esto ltimo los medios CPS ID3 o Uriline ID (Biomerieux), utilizados para identificar
los grmenes urinarios ms importantes a partir de la placa de cultivo gracias a la utilizacin de
sustratos cromognicos especficos.
- De Multiplicacin: Sirven para obtener una gran cantidad de clulas a partir de un
microorganismo ya aislado. Se emplean en la obtencin de vacunas, en la investigacin y en la
industria. Los medios ms adecuados para la multiplicacin suelen ser lquidos. El caldo-infusin
cerebro-corazn (BHI), es un ejemplo tpico de estos medios.
- De Transporte: Se usan para el transporte de muestras clnicas que no pueden sembrarse
inmediatamente. Su utilizacin debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la
muestra en el interior del medio (generalmente en un tubo). Son ejemplos tpicos de este grupo los
medios de Stuart-Amies, Cary-Blair, etc.
Usos
Los medios de cultivo se utilizan para diferentes propsitos: la enumeracin, el aislamiento de
ciertos tipos de bacterias, el mantenimiento de los cultivos para uso posterior y para facilitar el
reconocimiento de algn tipo de bacteria en particular.
Para estos fines se han desarrollado una gran cantidad de medios, las cuales, con base en su funcin o
uso:
Atendiendo a su utilidad prctica:
1-Para Aislamientos primarios
En este grupo encontramos los siguientes medios de cultivo:

No Selectivos o para usos generales: son nutritivamente muy ricos y se emplean
comnmente para enumerar la microbiota total. A menudo estn enriquecidos con materiales
como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el
crecimiento de las bacterias (Agar Sangre,Schaeadler, etc)

- Agar sangre: El agar sangre es una combinacin de un agar base (agar nutritivo)
con el agregado de 5 % de sangre ovina, tambin puede usarse sangre humana,
para cultivos en una placa de Agar.

- El Agar CLED o cistina-lactosa deficiente en electrlitos es un medio de
cultivo usado en el aislamiento y diferenciacin de organismos urinarios.
El agar CLED tiene la caracterstica de ser semitransparente y por la accin del azul
de bromofenol las colonias de bacterias fermentadoras de lactosa se tien de color
amarillo mientras que las no fermentadoras se tien de azul.

Selectivo: Un medio selectivo permite el crecimiento de ciertos microorganismos de
inters (que son los microorganismos seleccionados) e impide o inhibe la multiplicacin
de microorganismos competidores. Son tiles en muestras mixtas.

Pueden ser:

De moderada o alta selectividad dependiendo de la sustancia aadida al medio

Ejemplos:

-Agar Mac Conkey:

Es un medio utilizado para la deteccin, aislamiento y enumeracin de bacterias coliformes
y patgenas intestinales en aguas, productos lcteos y muestras biolgicas

Sirve como un indicador visual de pH, distinguiendo as las bacterias Gram negativas que
pueden fermentar la lactosa (Lac+) y las que no pueden (Lac-).

Al utilizar la lactosa en el medio, como consecuencia ocurre la aparicin de colonias de color
rosadas o rojas.(Lac+) y formando colonias blancas o incoloras(Lac-)(la distincin de color
se debe principalmente a la diferencia de pH para cada bacteria)

-Kanamicina-Vancomicina: Aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos
Anaerobios. Se utiliza para el aislamiento rpido de Bacteroides.
- Medio Salmonella-Shigella (SS): Es un medio selectivo para el aislamiento de Shigella y
Salmonella de heces,alimentos y otros materiales. Se utilizan para detectar la contaminacin
bacteriana en la carne cruda. Las bacterias coliformes como E. coli fermentan la lactosa en
los medios de cultivo, dando como resultado el crecimiento bacteriano con un color
rosa. (Ellos no producen sulfuro de hidrgeno.) Los miembros del gnero Salmonella no
fermenta la lactosa, pero lo hacen de gas sulfuro de hidrgeno de producto. Las colonias
bacterianas resultantes aparecern incoloro con el centro negro. Los miembros del
gnero Shigella no fermentan la lactosa o producen gas de sulfuro de hidrgeno, por lo que
las colonias resultantes sern incoloro.
Medio de enriquecimiento es un medio de cultivo que contiene los nutrientes necesarios
para apoyar el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos, entre ellos algunos
de los ms exigentes.
Ciertos organismos no crecen en medios de cultivo ordinarios. Requieren ingredientes que
promueven el crecimiento, como la sangre, glucosa, suero, huevo, entre otros.
Este mtodo se utiliza para los microbios que se encuentran en pequeas cantidades en la
muestra y cuyo crecimiento es lento, que las especies presentes. Algunas bacterias tienen
requisitos muy especficos para su crecimiento.
Ejemplos :
-Agar Sabourau: es un tipo de medio de cultivo selectivo que contiene peptonas. Es
utilizado para el cultivo de hongos.
-Agar chocolate: Medio de enriquecimiento y no selectivo,para bacterias que no crecen en
medios habituales y para atmosfera CO2. Es una variante del agar sangre. Contiene glbulos
rojos, que han sido lisados por el suave calentamiento a 56 C. Este agar se usa para el
delicado y exigente crecimiento de bacterias respiratorias.

-Caldo Selenito: El caldo selenito, medio de cultivo lquido de enriquecimiento selectivo, ha
sido preparado por recuperacin de especies de Salmonella y Shigella de muestras de materia
fecal, alimentos, artculos farmacuticos y otros productos de importancia sanitaria

Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen
requerimientos de grupos especficos de bacterias, ayudando a su identificacin.
Ejemplo:
-Lowenstein Jensen: Base utilizada para la preparacin de diferentes medios destinados al
aislamiento cultivo y diferenciacin de microbacterias, fundamentalmente la Mycobacterium
tuberculosis.
Caracteristicas: de color verde malaquita,homogneo,opaco



2-Medios para identificacin

Medio diferencial :consiste en un medio de cultivo que es capaz de distinguir
dos microorganismos por su crecimiento diferencial en el mismo, usando las propiedades
metablicas de ambos en presencia de un determinado nutriente y de un indicador que
evidencia por ejemplo, un pH cido en su entorno.
Ejemplo:

- Agar TSI: El Agar-hierro-triple azcar es un medio de cultivo. Gracias a su composicin es
uno de los medios de cultivo ms empleados para la diferenciacin de enterobacterias segn:
1. Fermenten o no glucosa.
2. Fermenten o no lactosa o sacarosa.
3. Produzcan o no cido sulfhdrico.
4. Produzcan o no gas
Medios Selectivo-diferenciales: Un medio que contenga tanto agente selectivo como
diferenciales es un mtodo eficaz para la seleccin y diferenciacin de los microorganismos
que se buscan de entre los presentes en una microbiota compleja.Estos medios son muy utiles
ya que ,adems de la seleccin de un tipo de bacteria , se logra a la vez, informacin sobre
sus caractersticas metabolicas.
Un medio selectivo- diferencial tpico es el agar manitol-sal, es utilizado para el aislamiento
y diferenciaion de stafilococos a partir de diversas muestras.

Importancia del cultivo de microorganismos
Obtencin de cultivos puros
La obtencin de un cultivo puro se hace mediante una tcnica de aislamiento. La
tcnica de aislamiento ms utilizada consiste en sembrar en un medio de cultivo slido
en placa de tal manera que los microorganismos generen colonias separadas
("Aislamiento por agotamiento en estras").

Se sabe que cada colonia procede de una sola clula. Por lo tanto el cultivo
descendiente de una colonia es un cultivo puro.
Analisis morfolgico,fisiolgico,gentico,y otras caracteristias.
Produccion
-Procesado y conservacin de alimentos
-Cultivos probioticos
-Bioconservantes
-Produccion de sustancias teraputicas.
Conteo de colonias(UFC=Unidad Formadora de Colonias)
Un contador de colonias es un instrumento utilizado para contar colonias de bacterias
o de otros microorganismos que crecen en una placa de agar.
Generalmente tras analizar un cultivo se realiza un conteo bacteriano con el fin de
saber cul es la densidad de poblacin microbiana que se encuentra en el medio.

RECUENTO TOTAL (en placa) DE MICROORGANISMOS EN LOS ALIMENTOS
En general los recuentos bacterianos bajos estn asociados con alimentos seguros. La mayora de los
alimentos industrializados (excepto, por ejemplo, los productos fermentados) deben ser considerados
como inadecuados para el consumo cuando contienen un gran nmero de microorganismos aun
cuando estos microorganismos no sean conocidos como patgenos y no hayan alterado de forma
apreciable los caracteres organolpticos del alimento. Algunos microbilogos han estimado el
recuento bacteriano como uno de los mejores indicadores del grado de alteracin de los alimentos.

Crecimiento microbiano

Es el aumento del nmero de microorganismos a lo largo del tiempo. El crecimiento de una
poblacin resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los individuos de dicha poblacin.
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie
de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio:


1. Disponibilidad de nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como
mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern
necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento.
2. Consistencia adecuada del medio
Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como
albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o slido. Los
medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos
no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante
y de que otros tienen la capacidad de licuarla.
3. Presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal.
Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos
anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno
ambiental.
4. Condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un
buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos.
5. Luz ambiental
La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz
solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos.

6. pH
La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los
microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque
los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos
o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o
incluso alterar sus procesos metablicos normales.
7. Temperatura
Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C. Otros
como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores
(hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura
mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saproftos tienen rangos ms amplios.


8. Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de
formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano
normal del o de los especmenes inoculados en dichos medios.

En un cultivo bacterias en un medio determinado, se pueden diferenciar cuatro fases en la
evolucin de los parmetros que miden el crecimiento microbiano:
1.- Fase lag o de adaptacin durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo las
nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar
la fase de crecimiento exponencial.
2.- Fase exponencial o logartmica: en ella la velocidad de crecimiento es mxima y el tiempo
de generacin es mnimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad mxima los
nutrientes del medio.
3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el nmero de bacterias (ni la masa u otros
parmetros del cultivo). Las clulas en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al
de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulacin y liberacin de metabolitos
secundarios que pueden tener importancia industrial.
Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algn nutriente esencial del
medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que
el medio sea inhspito para el crecimiento microbiano.
La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad
el estado metablico real de los microorganismos en los ambientes naturales.
4.- Fase de muerte: se produce una reduccin del nmero de bacterias viables del cultivo.

Cuando una clula aislada e inmvil comienza a crecer sobre un substrato slido, el resultado del
crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por consiguiente, se denomina unidad formadora
de colonia (UFC) a una clula bacteriana viva y aislada que si se encuentra en condiciones de
substrato y ambientales adecuadas da lugar a la produccin de una colonia en un breve lapso de
tiempo.
En el caso de microorganismos mviles (deslizantes) o en el de los hongos filamentosos que
tienen un crecimiento trfico no se producen colonias aisladas sino formaciones ms difusas o
miceliares.

Medicin directa del crecimiento bacteriano
El crecimiento de las poblaciones microbianas puede medirse de diferentes maneras. Algunos
mtodos determinan el nmero de clulas y otros la masa total de la poblacin, que a menudo es
directamente proporcional al nmero de clulas. La magnitud de la poblacin normalmente se
registra como el nmero de clulas que hay en un mililitro de lquido o en un gramo de material
slido. Como las poblaciones bacterianas suelen ser muy grandes la mayora de los mtodos de
cuantificacin se basan en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeas; despus se
determina mediante clculos el tamao de la poblacin total.
Medir muestras muy pequeas resulta poco prctico, por consiguiente el procedimiento se efecta
indirectamente en una serie de diluciones.
Recuentos en placas
El recuento en placa se basa en la suposicin de que cada bacteria crece y se divide para producir una
sola colonia. Esto no siempre es cierto porque las bacterias con frecuencia crecen unidas en cadenas
o como grumos. Por consiguiente, a menudo una colonia no se produce como resultado de una nica
bacteria sino de segmentos cortos de una cadena o de un agregado bacteriano. Para reflejar esta
realidad los recuentos en placa suelen informarse como unidades formadoras de colonias (UFC).
Cuando se realiza el recuento en la placa es importante que crezca slo un nmero limitado de
colonias en la placa. Cuando hay demasiadas colonias algunas clulas se encuentran apiadas y no
pueden desarrollarse; esta situacin es causa de inexactitudes en el recuento.
Diluciones seriadas: Se transforma 1 mL de un lquido que contuviera 1000 bacterias a un segundo
tubo con 9 mL de agua estril. Cada mililitro de este tubo contendra 100 bacterias y si se sembrara 1
mL de este contenido en una placa se formaran en teora 100 colonias, un nmero fcil de contar.
Placa vertida y diseminacin en placa: El recuento en placa se efecta con el mtodo de la placa
vertida o con el mtodo de diseminacin en placa. Se inocula 1,0 mL 0 0,1 mL de diluciones de la
suspensin bacteriana en una placa de Petri. El medio nutritivo, en el que el agar se mantiene lquido
en un bao de agua a cerca de 50C, se vierte sobre la muestra, que luego se mezcla en el medio con
una agitacin suave de la placa. Cuando el agar se solidifica la placa se incuba. Con esta tcnica las
colonias crecern en el medio nutritivo (a partir de las clulas en suspensin en el medio nutritivo
cuando el agar solidifica) as como la superficie del agar.
Esta tcnica tiene algunos inconvenientes porque ciertos microorganismos relativamente sensible al
calor pueden resultar daados por el agar fundido y por consiguiente ser incapaces de formar
colonias. Adems, cuando se utilizan algunos medios diferenciales el aspecto caracterstico de las
colonias desarrolladas en la superficie es esencial para el diagnstico. Las colonias que aparecen
debajo de la superficie no son adecuadas para estas pruebas. Para evitar estos problemas con
frecuencia se utiliza el mtodo de diseminacin en placa. Para ello sobre la superficie del medio
previamente vertido y solidificado se coloca 0,1 mL del inculo, el que se extiende uniformemente
sobre la superficie del medio utilizando una varilla de vidrio esterilizada de forma especial. Esta
tcnica permite el crecimiento de todas las colonias sobre la superficie del medio y evita el contacto
de las clulas con el agar fundido.
Filtracin
Cuando la cantidad de bacterias es muy baja, como en lagos o en ros con corrientes relativamente
limpias, las bacterias se pueden contar con mtodos de filtracin. En esta tcnica se hacen pasar al
menos 100 mL de agua a travs de un filtro consistente en una membrana delgada cuyos poros son
demasiado pequeos como para permitir el paso de las bacterias, que entonces son tamizadas y
retenidas en la superficie del filtro. Este filtro se transfiere despus a una placa de Petri que contiene
una almohadilla embebida en un medio nutritivo lquido, donde las colonias surgen de las bacterias
presentes en la superficie del filtro.
Mtodo Del Nmero Ms Probable (Nmp)
Otro mtodo que se utiliza para la determinacin del nmero de bacterias presentes en una muestra
es el mtodo del nmero ms probable. Esta estimacin estadstica se basa en el hecho de que cuanto
mayor sea el nmero de bacterias en una muestra mayor ser la dilucin necesaria para reducir la
densidad hasta el punto en el cual no se desarrolle ninguna bacteria en los tuvos de una serie de
diluciones. El mtodo del NMP es el ms utilizado cuando los microorganismos por contar no crecen
en medios slidos. Tambin es til cuando se utiliza el crecimiento en un medio lquido diferencia
para identificar el microorganismo. El NMP es slo un informe de que existe un 95% de
probabilidades de que la poblacin bacteriana disminuya dentro de ciertos lmites y de que el NMP
es el nmero estadsticamente ms probable.
Recuento Microscpico Directo
En el mtodo conocido como recuento microscpico directo un volumen medido de una suspensin
bacteriana se coloca dentro de un rea definida en un portaobjeto. Por ejemplo, en el mtodo de
recuento de Breed que se usa para contar las bacterias de la leche, se extiende una muestra de 0,01
mL sobre un recuadro de un centmetro cuadrado marcado sobre el portaobjetos, se agrega un
colorante para que puedan verse las bacterias y la muestra se observa con la lente del objetivo de
inmersin. Es posible determinar el campo de visin de este objetivo. Una vez contado el nmero de
bacterias en varios campos se calcula el nmero promedio de bacterias por campo. Con estos datos
tambin puede calcular el nmero de bacterias por centmetro cuadradoo a partir del cual la muestra
se propag. Como esta rea del portaobjetos contena 0,01 mL de la muestra, el nmero de bacterias
por mililitro de suspensin es el nmero de bacterias de la muestra multiplicado por cien.
Para los requenetos microscpicos directos tambin se usa un portaobjetos diseado especialmente
denominado cmara de Petroff-Hausser.
Las bacterias mviles son difciles de contar con este mtodo y, como sucede con otros mtodos
microscpicos, las clulas muertas presentan un aspecto similar al de las vivas que se pretende
contar. Adems de estas desventajas, se necesita una concentracin bastante elevada de clulas. La
ventaja ms importante de los recuentos microscpicos es que no se requiere un tiempo de
incubacin, por lo que su utilizacin se reserva sobre todo para aplicaciones en las que el tiempo es
el factor principal. Esta ventaja tambin es vlida para los contadores electrnicos de clulas, a veces
denominado Coulter counters, que cuentan de forma automtica el nmero de clulas en un volumen
determinado de lquido. Estos instrumentos se utilizan en algunos laboratorios de investigacin y
hospitalarios.

Estimacin Del Nmero De Bacterias Por Mtodos Indirectos
No siempre es necesario contar las clulas microbianas para estimar su nmero. En la ciencia y en la
industria se determinan tambin las poblaciones microbianas o su actividad por alguno de los
siguientes mtodos indirectos.
Turbidimetra
Para algunos tipos de trabajo experimental la determinacin de la turbidez (turbidimetra) es un
mtodo prctico para controlar el crecimiento bacteriano. Cuando las bacterias se multiplican en un
medio lquido este se torna turbio o nebuloso por las clulas.
El instrumento utilizado para medir la turbidez es un espectrofotmetro. En el espectrofotmetro un
haz de luz se transmite a travs de una suspensin bacteriana a una clula fotoelctrica. Cuando la
cantidad de bacterias aumenta, menos luz alcanza la clula fotoelctrica. Este cambio de luz se
registra en la escala del instrumento como porcentaje de transmisin. Tambin se puede determinar
como una medicin logartmica del instrumento denominada absorbancia, o como un valor derivado
del porcentaje de transmisin. La absorbancia se utiliza para graficar el crecimiento bacteriano.
Cuando las bacterias estn en fase logartmica de crecimiento o de declinacin la representacin de
la absorbancia frente al tiempo forma una lnea casi recta. Si las lecturas de la absorbancia son
compatibles con el recuento en placa del mismo cultivo esta correlacin se puede utilizar en
estimaciones futuras del nmero de bacterias obteniadas directamente por turbidimetra.
Para que puedan visualizarse las primeras trazas de turbidez debe haber ms de un milln de clulas
por mililitro y se precisan de 10 a 100 millones por mililitro para que la suspensin se vuelva lo
bastante turbia como para ser medida en un espectrofotmetro. Por lo tanto, la turbidimetra no es un
mtodo til para medir la contaminacin de lquidos por un nmero relativamente pequeo de
bacterias.
Actividad Metablica
Otra forma indirecta de estimar el nmero de bacterias es mediar la actividad metablica de la
poblacin. Este mtodo supone que la cantidad de cierto producto metablico, como el cido o el
dixido de carbono es directamente proporcional a la cantidad de bacterias presentes. Un ejemplo de
aplicacin prctica de la prueba metablica es el ensayo microbiolgico en el que se utiliza la
produccin de cido para determinar la cantidad de vitaminas.
Peso Seco
En este procedimiento se extraen los hongos del medio de crecimiento, se los filtra para elimnara el
material extrao y se los seca en un desecador para luego pesarlos. En elo caso de las bacterias se
sigue el mismo procedimiento bsico.

Mtodos tradicionales
Organismos indicadores
El anlisis rutinario de los alimentos para poner de manifiesto un amplio rango de bacterias
patgenas es impracticable en la mayora de los laboratorios, bien porque estn inadecuadamente
dotados, bien porque el tamao de la muestra impedira su manejo convenientemente. Por ello se ha
convertido en prctica corriente investigar en los alimentos la existencia de bacterias que indican la
posibilidad de presencia de las productoras de toxiinfecciones alimentarias o de otras patgenas. Por
esto se les denomina microorganismos indicadores y se catalogan frecuentemente con de gran
importancia al establecer la seguridad y calidad microbiolgica de los alimentos. Las principales
bacterias empleadas como indicadores son coliformes, entercocos y, ms recientemente, entero
bactericeas.
Las principales bacterias coliformes son Escherichia coli y Enterobacter aerogenes
Bacterias productoras de toxiinfecciones alimentarias
Salmonella
El mtodo aprobado en U.E. para la deteccin de Salmonella en los alimentos procesados consta de
una serie de pasos. La fase de pre enriquecimiento requiere 25g de alimento homogeneizados que se
incuban en 225 ml de agua peptona tamponada (BPW) para dar tiempo a la resucitacin de las
bacterias lesionadas. Transcurridas 24 horas se adiciona una alcuota a un caldo de cultivo: 1 ml a 10
ml de caldo de selenito (37C) o 0.1 ml a 10 ml de caldo de Rappaport Vassiliadis (42C). Su
objetivo es permitir que se multiplique Salmonella mientras se suprime el crecimiento de otras
bacterias distintas. El caldo del cultivo de enriquecimiento, despus de incubado 24 a 48 horas, se
siembra en estras en difentes medios de diferenciacin: agar verde brillante (BGA) y agar
desoxicolato lisina xilosa (XLD).
Las colonias presuntivas de Salmonella (negras en XLD y rosa en BGA) se confirman mediante
ensayos bioqumicos y serologa.
Campylobacter
El recuento directo de las especies de Campylobacter es poco corriente. Generalmente se emplea una
fase de enriquecimiento para recuperar el bajo nmero de microorganismos de los alimentos
procesados, as resucitan los microorganismos lesionados. El procedimiento corriente consiste en
homogeneizar 25 g del alimento en incubarlos en 225 ml de caldo de enriquecimiento a 37C durante
148 h, dejando slo un pequeo espacio de cara en el matraz.
L. monocytogenes
Algunas normas microbiolgicas exigen su recuento, mientras otras requieren la ausencia total de L.
monocytogenes en 25 g de alimento. Para el pre enriquecimiento 25g de una muestra
homogeneizada del alimento se incuba con 225 ml de agua de peptona tamponada (mtodo de la
FDA) a 30C durante 20-24 horas. A continuacin una alcuota de 1 ml se siembra en caldo
modificado de soja triptona que, despus de 24 a 48 horas se siembra en medios diferenciales, como
el Oxford para Listeria y el PALCAM. Las colonias de Listeria tienen forma de rosquilla con un
cerco negro que las rodea.
S. aureus
Los mtodos para el examen de S aureus son dos: Primero el recuento de estafilococos y segundo
comprobacin de la enterotoma en el alimento. Puesto que solo el 50% aproximadamente de las
cepas de S. aureus son enterotoxigncias, se deduce que para la investigacin de brotes de
toxiinfecciones alimentarias el segundo mtodo es ms concluyente.
El medio de Baird-Parker permite recuperar directamente los estafilococos, incluido los estresados, a
partir de las muestras de alimentos. Este medio contiene telurito potsico y cloruro de litio como
agentes inhibidores emulsin de yema de huevo como sistema indicador. Despus de 24-48 horas de
incubacin a 37C aparecen las tpicas colonias negro-grisceas, brillantes con un borde estrecho
blanco y corrientemente ( salvo en las cepas bovinas) una zona clara.
Los cultivos positivos necesitan ser confirmados mediante la prueba de la actividad de la coagulasa.


Especies de Vibrio
Se homogenizan 25g del alimento con 225 ml de agua de peptona alcalina (APW)con suplemento de
electrolitos (pH 8,6). Se incuba a 37C de 20 24 H. Las muestras se siembra en estras en agar
sacarosa sales biliares citrato tiosulfato (TCBS) y se incuba a 37C o a 25-30C, segn corresponda.
Microorganismos alterantes de los alimentos
Pseudomonas
Las Pseudomonas crecen en medios simples. En caldo crecen abundantemente formando un anillo y
un sedimento de color verde azulado. En agar simple forman colonias brillantes, confluentes, de
borde continuo y a veces ondulado con un centro opaco. El pigmento (piocianina) se difunde en el
medio dndole una tonalidad verdosa. Este pigmento tiene cualidades bactericidas sobre otras
bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Micrococos
El agar-manitol-sal (Champan, 1945) es el que ms se emplea corrientemente para el aislamiento y
enumeracin de los micrococos de los alimentos. Contiene 7,5% de NaCl, como agente selectivo e
inhibe el crecimiento de todos los microorganismos, salvo micrococos y estafilococos. Para su
diferenciacin se incorporan al medio manitol y un indicador de pH (rojo fenol), pues se admite que
solo los estafilococos atacan al carbohidrato produciendo cido. Esta suposicin es errnea, luego se
idearon un medio que inhiba por completo el crecimiento de los estafilococos debido a que posea
furazolidona; este medio se a empleado con xito para la deteccin de micrococos en los alimentos.
Levaduras y mohos
Generalmente se cultivan en medios de pH bajo y a temperaturas de 20-30C. Puesto que son muchas
las bacterias que crecen en estas condiciones se aaden a los medios antibiticos de amplio
espectro.las levaduras y mohos se cuentan directamente sembrando en superficie el agar
cloranfenicol diclorn glicerol, el agar cloranfenicol diclorn rosa de Bengala o el agar extracto de
levadura oxitetraciclina glucosa.
Alimentos enlatados
Ya que el tratamiento trmico de los alimentos enlatados debe destruir o inactivar los
microorganismos, su presencia indica un fallo tecnolgico. Por lo tanto las tcnicas de examen
microbiolgico se limitan nicamente al aislamiento e identificacin de los microorganismos. Los
medios que se emplean se dividen en dos grupos principales, dependiendo del pH del alimento: para
los alimentos de acidez baja (pH>4.5) los medios principales son agar dextros triptona y medio
reforzado para clostridios, mientras que para los alimentos de acidez alta (pH<4.5) se emplean
corrientemente el agar jugo de tomate y el agar extracto de malta
Agar dextrosa triptona: Este medio se emplea para el cultivo de los termfilos, especialmente
Bacillus stearothermophilus y por lo tanto la incubacin se realiza a 55C aerbicamente.
Esta bacteria origina cido a partir de la dextrosa y cambia el color del medio, del purpura al
amarillo, en presencia del indicador purpura de bromocresol, Es medio tambin puede emplearse
para el aislamiento de mesfilos, en cuyo caso la incubacin se har a 37C.
Medio reforzado para clostridios: Es igual que el medio diferencial reforzado para clostridios,
empleado en el recuento de esporulados, si bien se trata de un medio solido (esto es, contiene agar) y
no lleva el sistema indicador de azufre/sal de hierro.
Agar jugo de tomate: Se emplea para el cultivo de lactobacilos, Bacillus coagulans y clostridios que
crecen en alimentos enlatados de pH bajo. El pH del medio puede ajustarse al que corresponde al del
alimento objeto de examen, adicionndole cido lctico
Agar extracto de malta: Este medio de pH bajo (aproximadamente 4.5) constituye un ejemplo de
los empleados para el cultivo de levaduras y hongos de los alimentos enlatados.

Alimentos congelados y deshidratados
Para el examen de los alimentos congelados y deshidratados se emplean los mtodos estndar. Sin
embargo, muchas de las clulas estn metablicamente lesionadas por lo que se requiere un periodo
de descongelacin o de rehidratacin adecuado para que se efecte su recuperacin; otro mtodo
alternativo consiste en pre incubar muertas de alimento en medios nutritivamente complejos. Los
fallos en alguna de estas fases se traducen en recuentos menores en los medios selectivos.
Bibliografa
Madigan, M. Et al., Biologa de los microorganismos, 10 ed. Ed Pearson, Mxico DF.
http://perso.wanadoo.es/sergioram1/medios_de_cultivo.htm
http://libroslaboratorio.files.wordpress.com/2012/09/medios-de-cultivo-en-un-
laboratorio-de-microbiologc3ada.pdf