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Captulo 12

Uso de Mar cador es



J. P. Marais
Seo de Bioqumica, Departamento de Agricultura KwaZulu-
Natal, Pietermaritzburg, Repblica da frica do Sul.





Introduo

A produtividade dos animais e em ltima instncia
a lucratividade de empreendimentos pecurios
esto intimamente ligados nutrio dos animais a
qual, por sua vez, determinada pela quantidade
de alimento consumido e pelo valor nutritivo da
dieta. A mensurao acurada da ingesto de
matria seca e do grau de seleo de espcies
especficas de plantas em pastagens mistas, por
animais em pastoreio, vital para a avaliao do
balano energtico destes animais. O valor
nutritivo dos alimentos determinado por suas
composies qumicas e pelo grau em que estas
substncias so transformadas no trato gastro-
intestinal (TGI) em nutrientes requeridos pelo
animal. A digestibilidade da fibra determinada
pela extenso e taxa potenciais de digesto, e pela
taxa de passagem. Sntese de protena microbiana
a principal supridora de nitrognio -amnico para
o ruminantes e de particular importncia para a
formulao de dietas para ruminantes. A
mensurao do volume da digesta e fluxo ao longo
do TGI proporciona informaes concernentes a
quantidade de componentes alimentares existentes
no TGI e a eficincia de suas utilizaes pelo
animal. Todas estas medies, utilizadas para
otimizar a produo animal, podem ser feitas
rotineiramente atravs da adoo de tcnicas que
levam em conta o uso de substncias marcadoras
indigestveis que so quantificadas nas fezes ou em
segmentos do trato digestivo, dependendo da
finalidade do estudo. Este captulo uma
avaliao crtica acerca dos marcadores mais
comumente utilizados na nutrio animal.


Propriedade dos Marcadores

Marcadores ideais so substncias indigestveis,
no absorvveis ou afetadas pelo TGI. Elas
tambm no deveriam afetar ou ser afetadas pela
populao de microrganismos do sistema
digestivo. Marcadores devem ser intimamente
associados ou fisicamente semelhantes ao
nutriente indigestvel em questo, ou devem fluir
atravs do trato digestivo sem se dissociarem do
nutriente marcado e a uma taxa de fluxo idntica
a do nutriente em estudo. Anexao de um
marcador ligado a partculas crtica em
segmentos digestivos tais como no rmen, onde o
fluxo das partculas varia, mas a aderncia torna-
se menos problemtica quando em condies
ps-ruminais, onde a variao no fluxo das
partculas menor. Alm disso, devem estar
disponveis mtodos analticos altamente
sensveis e especficos para quantificao dos
marcadores. A sensibilidade das anlises
determinar a quantidade de material marcador
administrado com o intuito de obter resultados
aceitveis, sem exceder a capacidade ligante das
partculas do alimento. Alteraes menores na
concentrao dos marcadores podem ter
2
destacado efeito sobre as estimativas da cintica
obtidas a partir de modelos matemticos
complexos.
No existe um marcador que satisfaa
completamente todos estes quesitos. Alguns
marcadores de partculas (marcadores-particulares)
tendem a migrar a partculas no marcadas
inicialmente. Neste aspecto, marcadores-lquidos
so geralmente mais satisfatrios que marcadores-
particulares. A migrao de marcadores de
interesse porque a marca que esta sendo seguida
poderia no ter relao alguma com o componente
originalmente marcado. A menos que a integridade
da partcula do alimento tenha sido estabelecida,
tamanhos do pool e taxa de passagem deveriam ser
discutidos em termos do marcador empregado, e
no da frao inicialmente marcada. Alguns
marcadores como a lignina podem ser parcialmente
metabolizados e podem conseqentemente no
serem apropriados para estimativa do tempo de
permanncia, desde que o desaparecimento no
seja proporcional ao tempo de resistncia. Alguns
marcadores so ligeiramente absorvveis no TGI, e
no so portanto completamente recuperveis nas
fezes. Partculas modas finamente utilizadas na
marcao podem deixar o rmen mais rapidamente
que partculas alimentares visto que elas no so
retardadas para reduo de tamanho. Partculas
mordentes podem tambm deixar o rmen mais
rapidamente em razo de suas densidades maiores.
Devido a afinidade ligante variar entre os
componentes alimentares, os alimentos podem ser
marcados de formas diferentes. A importncia do
critrio do marcador tal como a indigestibilidade,
entretanto, depende inteiramente da utilizao para
o qual o marcador proposto. Marcadores
deveriam conseqentemente ser selecionado com
prudncia no intuito de se evitar srios erros na
interpretao de resultados. Eles so classificados
em marcadores internos e externos.


Marcadores Internos

Um marcador interno substncia selecionada a
qual parte integrante da forragem ou do alimento
consumido pelo animal. Marcadores internos tm
como vantagem possurem preo reduzido e
serem prticos, e podem ser particularmente teis
em experimentaes com animais selvagens ou
em pastoreio livre, nos quais difcil fazer
dosagens de marcadores externos. Embora
muitos marcadores internos paream ser
promissores, poucos tem ganhado aceitao,
principalmente devido ao fato de que o marcador
na dieta poder ser diferente do marcador
analisado nas fezes em virtude de alteraes
ocorrentes durante a digesto. Alm disso,
resultados errticos freqentemente tem sido
relatados em estudos de avaliao de marcadores
internos por diferentes laboratrios, ou quando
um marcador aplicado em um extenso grupo de
forragens. Dentre os marcadores internos, os
alcanos tem a aplicao mais difundida para
estimao da digestibilidade da matria orgnica
e seleo de espcies forrageiras, enquanto as
purinas parecem ser mais promissoras para
predio da sntese de protena microbiana no
rmen.


Fibra em detergente cido indigestvel
(FDAI)

O benefcio da fibra indigestvel como um
marcador interno tem sido limitado por falhas na
padronizao de procedimentos analticos. O
tratamento de material vegetal com detergentes
neutro e cido resulta em uma frao conhecida
como lignocelulose ou fibra em detergente cido
(FDA) (Van Soest, 1963). A FDAI determinada
gravimetricamente aps incubao da FDA com
celulase durante 10-14 dias (Penning e Johnson,
1983), aps fermentao em fluido ruminal in
vitro por 4 dias ou aps incubao em sacos de
nylon dentro do rmen por 6-8 dias. Estas fraes
deveriam, teoricamente, ser totalmente
indigestveis, prestando-se ser marcadores
adequados, mas na prtica resultados variveis
so freqentemente obtidos. Alm do que,
recuperaes fecais de FDA
I
in vitro de 0,46 e
0,99, e recuperaes de celulose da FDA
I
de 0,47
3
e 0,97, foram alcanadas com festuca imatura e
alfafa, respectivamente, demonstrando que as
fraes de FDA
I
deveriam ser utilizadas como
marcadores em forragens imaturas com precauo
(Cochran et al., 1986).


Lignina indigestvel

Em razo dos mamferos no possurem sistemas
enzimticos capazes de degradar componentes
fenlicos polimerizados, teoricamente a lignina
deveria ser indigestvel e adequada como um
marcador interno. Entretanto, a lignina possui uma
estrutura complexa, as propriedades qumicas das
quais podem variar entre plantas e mesmo dentro
da mesma planta. Uma deficincia da lignina como
marcador interno refere-se a sua baixa e
inconsistente recuperao nas fezes. Ademais, a
lignina pode fornecer recuperaes fecais positivas
atravs de sua anexao a componentes de
natureza indeterminada (Thewis et al., 1989).
Recuperaes de lignina em detergente cido entre
0,52 e 1,16 foram encontradas por Cochran et al.
(1986).
A lignina em detergente cido
determinada gravimetricamente aps a celulose ter
sido removida da FDA por meio de tratamento
com cido sulfrico 26 M e o contedo de cinzas
ter sido deduzido (Van Soest, 1963). Lignina
perxido-alcalina, uma frao menos digestvel
preparada atravs do tratamento da amostra com
perxido de hidrognio alcalino antes da etapa de
detergente cido, foi proposta como um marcador
interno para predies de digestibilidade. No
entanto, Momont et al. (1994) demonstraram que
embora a lignina perxido-alcalina seja quase
totalmente recupervel das fezes, os resultados em
fenos de gramneas maduras foram variveis e
adversamente afetaram as predies de ingesto de
matria seca. Concluram que a lignina perxido-
alcalina no aparenta incrementar a acurcia da
predio da digestibilidade da matria seca (MS)
de gramneas acima da obtida com a lignina e,
detergente cido (Sunvold e Cochran, 1991).

Cinzas insolveis

Cinzas insolveis em cido so freqentemente
utilizadas como marcadores indigestveis na
estimativa da energia metabolizvel em frangos e
digestibilidade em ruminantes. Ela preparada
atravs da secagem e incinerao da amostra, e
cozimento das cinzas em cido clordrico 2 M
durante 5 minutos. O contedo de cinzas
determinado gravimetricamente aps a hidrlise
quente ter sido filtrada, liberada de resduos de
cido por meio de lavagem e ento re-incinerada
(Van Keulen e Young, 1977). Contaminaes de
amostras de alimento e de fezes com p ou solo
poderiam resultar em resultados errneos.


Cadeias mpares de n-alcanos

Cadeia de n-alcanos vegetais so simples cadeias
lineares de hidrocarbonetos com comprimentos
que variam do pentacosano (C
25
) at o
pentatriacontano (C
35
). Elas so componentes da
cera cuticular que recobre as plantas maiores e
ocorrem nos tecidos vegetais principalmente
como molculas de cadeias mpares. Alcanos
individuais das plantas diferem em concentrao,
resultando que cada planta possui um nico perfil
de alcanos, com o hentriacontano (C
31
) e o
tritriacontano (C
33
) usualmente como os
principais componentes (Tabela 12.1). Alcanos
esto associados predominantemente com a
matria particulada da digesta, e alguns so
quantitativamente excretados virtualmente nas
fezes. Suas estabilidades no trato digestivo de
ruminantes parece aumentar com o aumento do
tamanho da molcula. A recuperao do C
33
nas
fezes em torno de 0,87,enquanto que do C
35
tem
sido estimada ser de 0,95. Alcanos parecem ser
completamente estveis no trato digestivo de
lebres montanhesas. Alcanos naturais so
utilizados para estimar a digestibilidade e a
seleo de espcies durante o pastejo animal.
Separao de alcanos a partir de amostras
de fezes envolve a saponificao em hidrxido
alcolico de potssio e extrao com solvente
4
no-polares tais como o heptano (Dillon e
Stakelum, 1990). Os alcanos excretados so
purificados por meio de colunas de slica gel, e as
diferentes molculas so separadas e quantificadas
por meio de cromatografia gasosa de capilares
(Dove e Mayes, 1991).


cido 2,6-diamInopimlico (DAPA)

DAPA um aminocido ocorrente em
concentraes variveis nas clulas bacterianas.
Uma vez a relao entre o DAPA e protena de
bactrias ruminais mistas relativamente
constante, tem se constitudo o marcador interno
mais comumente utilizado na estimao da
sntese de protena microbiana (Czerkawski,
1974). Broderick e Merchen (1992) apontaram
que este marcador apresenta diversas deficincias
srias. Em razo de que o DAPA somente ocorre
em paredes celulares microbianas, a relao
DAPA:protena poderia ser alterada dependendo
do tamanho e forma das clulas microbianas. De
maior importncia a ocorrncia de substanciais
quantidades de DAPA em certos alimentos. A
relao DAPA:N em alimentos comuns tais como
o farelo de soja poderia ser to alto quanto 37%
como encontrado em bactrias isoladas do rmen
(Rahnema e Theurer, 1986).

Tabela 12.1. Perfis de alcanos de uma seleo de espcies de forragens.


Contedo de alcanos (mg.kg
-1
de MS)
Espcies C
27
C
29
C
30
C
31
C
32
C
33
C
34
C
35
Total

Digitaria eriantha 28 32 0 37 4 24 1 4 130
Festuca arundinacea 48 278 0 594 12 114 0 0 1046
Lolium multiflorum 34 248 0 350 12 100 0 0 744
Lolium perenne 15 63 0 114 10 101 4 16 323
Paspalum dilatatum 3 7 0 36 3 16 1 2 68
Pennisetum clandestinum 17 29 7 124 9 300 13 241 740
Plantago lanceolata 47 34 0 24 0 9 0 0 114
Setaria sphacelata 40 116 6 68 1 7 0 0 238
Trifolium repens 34 168 40 443 46 134 6 15 886


O fluxo abomasal do DAPA deveria,
conseqentemente, ser corrigido para a ingesto
de DAPA diettico. Devido atividade catablica,
uma proporo grande e varivel (>50%) do
DAPA que deixa o rmen pode no estar
associada com a frao bacteriana ou em uma
forma ligada a peptdeos no celular (Masson et
al., 1991). Fluxo desproporcionalmente alto de
DAPA saindo do rmen pode levar a
superestimativas do rendimento protico
bacteriano. Altos valores obtidos podem tambm
ser devido a procedimentos analticos utilizados.
difcil separar DAPA de outros
aminocidos por meio de tcnicas convencionais
de anlise de aminocidos utilizando a ninhidrina
como reagente ao pH 5,5. Entretanto, atravs da
manipulao do pH do tampo eluente, pode ser
separado dos aminocidos que mais interferem
(Rahnema e Theurer, 1986; Sadik et al., 1990).
ODAPA tambm pode ser quantificado por meio
de um analisador de aminocidos aps converter a
metionina interferidora do processo em
metionina-sulfona atravs do uso de cido
perfrmico (Ibrahim et al., 1970).




5
D-Alanina

D-Alanina mais amplamente distribuda entre as
espcies de bactrias que o DAPA e forma parte
de oligopeptdeos ligados s peptidoglicanas das
paredes celulares das bactrias. No est
freqentemente presente em amostras de
alimentos e tem sido sucesso para estimar a
sntese e fluxo de protena bacteriana (Garrett et
al., 1987). No entanto, relatos de valores de fluxo
de protena bacteriana excedendo o fluxo total de
protena, quando as estimativas so realizadas
atravs do uso da D-alanina, pe em dvida a
utilidade deste mtodo como marcador de protena
bacteriana (Quigley e Schwab, 1988). Ela pode
ser analisada atravs de procedimentos
colorimtricos (Quigley e Schwab, 1988), ou por
meio de analisador de aminocidos.


cidos nuclicos

Altas concentraes de cidos nuclicos,
particularmente RNAs em microrganismos,
levaram a seus reconhecimentos como potenciais
marcadores de protenas bacterianas. cidos
nuclicos em amostras de digesta so
freqentemente analisados como bases purnicas,
adenina e guanina, ou seus derivados
(principalmente alantona) por meio de
cromatografia gasosa lquida de alta presso
HPLC (Barcells et al., 1992)., ou aps hidrlise da
amostra com cido perclrico (Martin Orue et al.,
1995). Tcnicas invasivas que requerem animais
experimentais canulados no rmen e no duodeno
proximal so normalmente utilizadas para
mensurar o fluxo de protena. Recentemente,
mtodos no-invasivos baseados na excreo
urinria de derivados de purina tais como
alantona tm sido desenvolvidos (Perez et al.,
1996).





Marcadores Externos

Marcadores externos so substncias indigestveis
que so adicionadas ou ligadas aos alimentos ou
digesta. Estes marcadores comumente so
administrados por via oral, pela fstula ou por
meio de meios de artifcios de liberao
controlada. Estes mecanismos de liberao
controlada oferecem a vantagem da eliminao da
necessidade de dosagens repetidas diariamente ou
do uso contnuo de sacos de coleta fecais durante
o perodo de coleta total de fezes. Os quais
poderiam interferir no comportamento animal.
Entretanto, problemas associados com estes
artifcios s vezes resultam em falta de
consistncia nas predies de excreo fecal
(Buntinx et al., 1992). Dispositivos de liberao
controlada freqentemente parecem superestimar
a excreo fecal quando as taxas de liberao
prescritas pelos fabricantes so usadas para
calcula-la. Marcadores externos so administrados
tanto em dose nica ou de forma contnua ou
freqente ao longo de perodo de tempo na
tentativa de alcanar uma condio de estado fixo
sob a qual a digesta marcada uniformemente e a
relao marcador:digesta constante. O tempo
necessrio para que a excreo de um marcador
alcance a condio de estado fixo depende da
dieta e do tipo de animal. Um perodo de
adaptao usualmente de 6 a 8 dias para ovinos e
bovinos necessrio antes do perodo
experimental.


Metais de transio

xidos e sais de metais tri e tetravalentes tais
como o titnio, cromo, cobalto, rutnio e hfnio
tem caractersticas de marcadores inertes e tm
sido utilizados como tais com variveis graus de
sucesso. Dentre estes, o cromo tem sido o mais
extensamente empregado.




6
Cromo

SESQUIXIDO DE CROMO (Cr
2
O
3
). O xido de
cromo praticamente insolvel em gua, mas
ligeiramente solvel em lcalis e cidos, e um
dos mais marcadores mais comumente usados
para estimativa da excreo fecal. administrado
oralmente em ruminantes, por meio de cpsulas
gelatinosas, ou misturados com as raes. Um
dispositivo de liberao controlada para liberar
continuamente o Cr
2
O
3
tambm disponvel. A
taxa de liberao do cromo no rmen tem sido
demonstrada aumentar com o decrscimo da
digestibilidade da matria seca do alimento e
tambm varia entre animais, mas no entre
mecanismos dentro do mesmo animal (Pond et al.,
1990). Estes pesquisadores concluram que os
dispositivos de liberao controlada so
inadequados para estimao acurada da ingesto
de animais individualmente, mas so apropriados
para ingestes mdias de animais em situaes de
agrupamentos.

CROMO MORDENTE . Metais trivalentes e
tetravalentes, tais com o cromo, os quais formam
ligantes fortes com os componentes da parede
celular dos vegetais, so comumente ligados
fibra para formar formas mordentes utilizadas
como marcadores-particulares. Visto que as
ligaes coordenadas estveis de cromo trivalente
resultam em baixas taxas de troca de ligantes, o
cromo mordente preferivelmente preparado
atravs da reduo, com uso de cido ascrbico,
de dicromato hexavalente ao invs de sais
trivalentes. No entanto, os hidrxidos da maioria
destes elementos, os quais so solveis ao pH do
rmen, tornam difcil estabelecer se o elemento se
move em forma complexada com os ingredientes
alimentares ou separadamente como um hidrxido
insolvel. Com o objetivo de proporcionar
resultados mais confiveis, metais mordentes
devem ser recuperados na matriz vegetal a qual
foram ligados.
Antes de promover-se o processo ligante
com o cromo sob forma mordente, substncias
solveis que podem reduzir a ligao do cromo
fibra, deveriam ser removidas por meio do
tratamento de pequenas partidas (batches) de
material vegetal com detergentes neutros tais
como o lauril sulfato (Van Soest, 1963; Udn et
al., 1980). Grandes partidas poderiam ser lacradas
em sacos de pano e postas em ciclos de lavagem,
em mquinas de lavanderia, ou poderiam ser
cozidas em detergentes de lavanderia em sistemas
de coco de alta presso. As preparaes de fibra
ou resduos em detergente neutro (RDN) deveriam
ser enxaguadas completamente em gua e acetona,
e ento secas 65 C.
Posto que o cromo se liga firmemente ao material
particulado, ele pode afetar adversamente a
densidade do alimento (Ehle et al., 1984) e
resultando na parede celular virtualmente
indigestvel (Faichney e Griffiths, 1978; Udn et
al., 1980). Devido limitada fermentao, a taxa
de passagem das partculas da fibra em detergente
neutro ligada ao cromo (Cr-FDN) tem se
apresentado significativamente menor que
partculas marcadas como trtio (Van Bruchem et
al., 1990). Udn et al. (1980) ligou a fibra vegetal
ao cromo mordente por meio de uma soluo com
concentrao de cromo de 120-140 g.kg
-1
de fibra.
Em diversos estudos seguintes, a concentrao de
cromo nas solues mordentes foi reduzida para
diminuir o contedo de cromo mordente e
minimizar as alteraes na densidade do alimento.
Concentraes de cromo de 10 g.kg
-1
em fenos e
23 g. kg
-1
em peletes alimentares foram
considerados suficientemente baixos a ponto de
no afetar adversamente a densidade e a cintica
dos alimentos no trato digestivo (Moore et al.,
1992). Porm, o desaparecimento de silagem e
feno contendo cromo, a partir de sacos de nylon
no rmen, contendo concentraes de 31 e 21
g.kg-1 de MS, respectivamente, foi reduzido em
36,7 e 56,4%, respectivamente (Beauchemin e
Buchanan-Smith, 1989).
A digestibilidade do material vegetal
ligado a metal-mordente tem um destacado efeito
na recuperao do marcador nas fezes. A menor
recuperao associada com amostras com
maiores digestibilidades. Alm disso, o tamanho
da partcula de Cr-FDN tem um marcado efeito
7
em determinadas taxas de passagem. Partculas de
tamanho entre 0,6-1,0 mm apresentaram uma taxa
de passagem fracional de 2,0%.h
-1
, comparada
com a taxa de passagem de 4,1%.h
-1
para
partculas menores que 0,3 mm (Bruining e
Bosch, 1992).

CROMO-CIDO ETILENO DIAMINO TETRACETICO
(Cr-EDTA). O Cr-EDTA, que prontamente
solvel em gua, utilizado como marcador da
fase lquida. Udn et al. (1980) preparou Cr-
EDTA como seu sal de ltio (o nico sal que
poderia ser cristalizado) atravs da solubilizao
em gua de cromo (III)-acetato monohidratado,
EDTA e hidrxido de ltio monohidratado, por
banho-maria. O Cr-EDTA foi cristalizado por
resfriamento e adio em etanol. O composto
resultou em um rendimento de aproximadamente
90% e foi estvel secagem a 100 C. O Cr-EDTA
usualmente infundido continuamente no rmen
(Remillard et al., 1990). Se for utilizado o Cr-
EDTA marcado radiativamente (
51
Cr-EDTA),
primeiramente diludo com um carreador Cr-
EDTA.
Assim como o polietileno glicol (PEG), o
Cr-EDTA ligeiramente absorvvel pelas paredes
do rmen, mas ocupa maior espao fluido no
rmen que o PEG. Ele afetado por flutuaes na
presso osmtica que podem conduzir a uma
superestimativa do fluxo e afluxo de gua
ruminal. Baixas concentraes de Cr-EDTA
podem tambm se ligar ao material slido
(particulado) no rmen.
O cromo pode ser analisado pro meio de
procedimentos titrimtricos (Christian e Coup,
1954), por espectrofotometria (Fenton e Fenton,
1979) ou por espectrofotometria de absoro
atmica (Arthur, 1970). Cromo no marcado pode
tambm ser analisado como
51
Cr aps ativao de
nutron (Udn et al., 1980) ou espectroscopia de
emisso de plasma (Combs e Satter, 1992). Uma
vez que o
31
Si, o principal contaminante, tem uma
meia-vida de apenas 2,6 horas, este no interfere
nas anlises. Vantagens desde mtodo so que a
contaminao radioativa dos animais evitada e
as amostras secas de fezes podem computadas
sem preparaes prvias.


Cobalto

Cobalto-cido etilenodiamino tetractico (Co-
EDTA) preparado tanto na forma de sal de ltio
como de sal de sdio do nion monovalente do
Co-EDTA (den et al., 1980). O rendimento do
LiCo-EDTA foi aproximadamente de 90%, o qual
maior que o rendimento do sal sdico. Ambos os
sais so estveis secagem a 100 C. O cobalto
quantificado por espectrofotometria de absoro
atmica, por anlise de ativao de nutron ou por
espectroscopia de emisso de plasma (Combs e
Satter, 1992).


Rutnio

Rutnio utilizado como marcador de partculas,
usualmente na forma de rutnio-fenantrolina (Ru-
phe), o qual no possui efeitos adversos na
atividade metablica da microbiota ruminal s
concentraes usuais (Tan et al., 1971).
preparado atravs da converso do cloreto de
rutnio em pentaclorohidroxirrutenato de potssio
e pelo refluxo do hidroxirrutenato com 1,10-
fenantrolina e hipofosfito para formar o cloreto de
Ru-fenantrolina (Tan et al., 1971).
Ru-phe infundido continuamente dentro
do rmen, freqentemente como um istopo,
103
Ru-phe, ou administrado como dose nica. A
dose pode ser preparada por solubilizao do
marcador em gua, misturando-o em gramneas
modas e deixando o alimento embeber-se na
soluo durante uma noite e ento, com ajuda de
uma seringa plstica com bocal largo,
administrada diretamente dentro do rmen. O Ru-
phe administrado fortemente adsorvido pela
frao particulada da digesta. Ele no absorvido
em nenhuma extenso significativa no trato
digestivo, e 93-102% recuperado nas fezes,
enquanto < 0,4% excretada na urina de ovinos
(Tan et al., 1971).
8
Rutnio quantificado por
espectrofotometria de absoro atmica ou o
istopo mensurado por espectrometria
autogamma. Visto que o
103
Ru-phe e o
51
Cr-EDTA
podem ser quantificados simultaneamente, estes
marcadores podem convenientemente ser
utilizados juntos, como marcadores das fraes
slida e lquida, respectivamente.


Titnio

O xido de titnio insolvel em gua e cidos
diludos e no levado nos vegetais em grande
extenso. Ele no apresenta efeito prejudicial em
ovinos se ingerido em concentraes de 2-3 g.dia
-
1
, e completamente excretado via fezes (98% de
recuperao). Titnio quantificado
espectrofotometricamente aps oxidao com
perxido de hidrognio (Brandt et al., 1983).


Hfnio

O hfnio se liga fortemente a forragens e
concentrados, e resistente ao desligamento em
meio cido (pH 2) (Worley, 1987). Ele pode
conseqentemente ser um marcador til em
segmentos acidificados do trato digestivo. Devido
sua forte capacidade ligante (acima de 5% de
matria seca), a concentrao do elemento
utilizada para marcar alimentos deve ser restrita
com o objetivo de evitar um aumento
desfavorvel da densidade do alimento marcado e
uma excessiva reduo na digestibilidade. Sua
propriedade ligar-se fortemente faz do hfnio um
marcador apropriado para alimentos concentrados.


Elementos terras raras

Os elementos terras raras parecem ser
indigestveis no so absorvveis no trato
gastrintestinal de mamferos. Vrios destes
metais, tais como o lantnio, o crio, o neodmio,
o samrio, o eurpio, o disprsio, o rbio e o
itrbio tm sido ligados a materiais vegetais e
utilizados como marcadores insolveis. Uma vez
que as terras raras fornecem idnticas estimativas
de cintica da digesta, eles podem ser usados para
marcar diferentes partculas (Quiroz et al., 1988)
ou diferentes ingredientes (Moore et al., 1990) em
um nico experimento.A fora de ligao a
partculas de fibras depende do mtodo de
aplicao. Borrifar terras raras sobre partculas de
alimentos resulta na saturao tanto de pontos de
ligao fortes como fracos (Mader et al., 1984) e
pode levar a substancial dissociao do marcador
no trato digestivo a menos que o marcador
frouxamente ligado seja removido por meio de
enxge completo.O marcador preparado
atravs da embebio de amostras de alimentos
por uma noite em uma soluo de nitrato, acetato
ou cloreto de elementos terras raras, e posterior
enxge em gua corrente e secagem em estufa
com circulao de ar focada (Beauchemin e
Buchanan-Smithm 1989; Remillard et al., 1990;
Moore et al., 1992). Um mtodo tem sido
desenvolvido no qual os elementos terras raras so
ligado s partculas alimentares na presena de um
ligante solvel como o citrato, assegurando que os
elementos apenas se liguem nos pontos fortes de
ligao, prevenindo assim trocas durante a
passagem ao longo do TGI (Faichney et al.,
1989).
Existem diferenas relativamente grandes
entre os elementos terras raras em relao s suas
afinidades ligantes. Itrbio tende a formar os mais
forte complexos com alimentos. O crio trivalente
no forma complexos estveis com a fibra vegetal.
Porm, complexos estveis so obtenveis com
crio tetravalente. Perdas por dissociao parecem
ser mnimas durante perodos de incubao de 24
horas se as concentraes de elementos terras
raras aplicadas a amostras de alimentos forem
menores que a capacidade ligante das partculas
de fibras (<0,18%) (Hartnell e Satter, 1979; Teeter
et al., 1984).
O marcador tambm tende a dissociar das
partculas dos alimentos e migrar para partculas
no marcadas e componentes solveis no trato
digestivo, especialmente em meios acidificados
9
tais como o abomaso (Crooker et al., 1982). A
dissociao do marcador de pouca conseqncia
nos estudos de fluxo da digesta envolvendo
ruminantes desde que nenhuma variao ocorra
entre o fluxo de material solubilizado e
particulado no segmento acidificado do TGI.
Durante incubao in vitro de alimentos marcados
com itrbio ou disprsio 6-23% dos marcadores se
dissociaram das partculas, mas apenas 0,3-1,4%
se re-associaram a partculas no marcadas
sugerindo que marcadores dissociados deixam o
rmen juntamente com a frao lquida da digesta
em grande proporo.
Se elementos terras raras (ou qualquer
outro marcador) forem utilizados para estimar a
tempo mdio de reteno de partculas, os
marcadores deveriam apenas ser aplicados em
partculas de tamanhos estreitos. Faichney et al.
(1989) descreveram um procedimento de
peneiramento mido para tamisao da digesta do
rmen atravs de um conjunto de peneiras
vibratrias e usando apenas partculas de um
nico tamanho para que sejam marcadas.
Marcadores podem ser administrados por meio de
cpsulas gelatinosas ou ser incorporadas
diretamente no alimento. Elementos terras raras
so analisados por espectrofotometria de absoro
atmica aps incinerao mida (Quiroz et al.,
1988; Luginbuhl et al., 1994), por anlise de
ativao de nutron (Kennelly et al., 1980) ou por
espectroscopia de emisso de plasma (Combs e
Satter, 1992). Crio foi tambm estimado por
incinerao da amostra, oxidao at a forma Ce
(IV) e titriao com sulfato de amnio ferro (III),
utilizando O-fenatrolona como indicador.
Mtodos para extrao de elementos terras raras
sem utilizar processos de incinerao tm sido
desenvolvidos (Hart e Polan, 1984).


Cadeias de n-alcanos com cadeias pares

Alcanos com cadeias pares ocorrem em plantas
apenas em baixas concentraes, mas so
disponveis comercialmente e podem ser
administradas em suspenso com celulose em p
atravs de cpsulas gelatinosas (Dove e Mayes,
1991; Vulich et al., 1991); atravs de tiras de
papel filtro ou tampes de papel impregnados com
alcanos (Girldez et al., 1997) ou em suspenses
aquosas com partculas de gramneas impregnadas
com alcanos (Marais et al., 1996). Em algumas
circunstncias, alcanos com cadeias pares podem
ser pulverizados sobre forragens (Mayes et al.,
1997). Um mecanismo intra-ruminal de liberao
controlada tambm tem sido desenvolvido e
avaliado para ovinos, e forneceu uma liberao
constante de alcanos com cadeias pares dentro de
1,5-4,0% do valor nominal de liberao e um
coeficiente de variao da taxa de liberao entre
animais de 4,07% (Dove et al., 1991).
Dotriacontano (C
32
) o alcano de cadeia par mais
comumente usado como marcador externo e
possui uma recuperao nas fezes por volta de
87%. Alcanos de cadeias pares e mpares so
quantificados simultaneamente por meio de
cromatografia gasosa de capilar.


Polietileno glicol (PEG)

PEG utilizado como marcador lquido, mas ele
tem demonstrado ser excludo de uma grande
proporo do contedo aquoso do tecido de
beterrabas quando utilizado com peso molecular
de 4.000 Da (Czerkawski e Breckenridge, 1969), e
precipitado em alimentos ricos em tanino (Kay,
1969). PEG infundido continuamente dentro do
rmen (De Smet et al., 1992), e tem recuperao
nas fezes e digesta em ovinos e coelhos em torno
de 95%, sugerindo absoro parcial do PEG no
trato digestivo. PEG na fase lquida de digesta no
diluda e fezes quantificada pro turbidmetro de
acordo com Malawer e Powell (1967).


Esporos de bactrias

Esporos de Bacillus stearothermophillus tm sido
utilizados para medir a taxa de passagem tanto de
partculas slidas como da frao lquida em um
nico procedimento. (Mir et al., 1997). Esporos
10
bacterianos foram isolados a partir de ampolas
comercialmente disponveis e cultivadas em
placas com gar. Clulas e esporos foram lavados
das placas e posteriormente propagados por ciclos
repetidos de tratamento de choque em gua
fervente e cultura em gar. Em seguimento
administrao a novilhas ou novilhos de
suspenso contendo 10
8
esporos, contedos do
rmen foram amostrados em intervalos regulares e
foram coados em pano para obteno de frao
lquida e slida. Ambas fraes foram cultivadas
em gar e incubadas 65 C. Concentraes
microbianas foram expressas tanto como unidades
formadoras de colnias (UFC) por mL de fluido
ruminal ou UFC.g
-1
de MS.


Nitrognio inorgnico (
15
N)

Nitrognio inorgnico
15
N freqentemente
preferido em relao a outros istopos para
estimativas da sntese de protena microbiana
visto que ele um istopo estvel e no apresenta
riscos para o meio ambiente. Com o intuito de
obter uma distribuio uniforme do marcador
15
N
em todo o pool de nitrognio microbiano, sulfato
de amnia enriquecido 10-85% com
15
N
infundido continuamente atravs de fstula do
rmen por um perodo de 48 horas. Aps este
perodo, existe pouca diferena entre os pools
microbianos de
15
N ruminal e ps-ruminal
amostrados simultaneamente, embora demore
cerca de 7-8 dias para se alcanar um plat e
enriquecimento especfico constante de pools de
nitrognio ruminal e ps-ruminal. Se o
15
N for
administrado atravs de incluso no alimento, um
perodo de alimento maior que 48 horas
requerido (Broderick e Merchen, 1992).
Procedimentos para quantificar o
15
N tem
sido revisados (Agncia Internacional de Energia
Atmica. 1985). Embora a acurcia e preciso de
anlises por espectrometria de massa seja muito
boa (enriquecimento de 0,01-0,05% adequado
na maioria dos estudos) o procedimento tedioso,
visto que a frao de nitrognio sob estudo deve
ser isolada antes da anlise.
L-[4,5-
3
H] Leucina

L-[4,5-
3
H] Leucina, infundida dentro do rmen
por 36 horas, incorporada na frao protica de
todas as espcies microbianas, e apresenta um
meio acurado para estimativa do fluxo de
nitrognio microbiano (Sinclair et al., 1993). [
3
H]
Leucina mensurada por cintilao lquida.


Enxofre inorgnico (
35
S)

Enxofre marcado pode ser infundido
continuamente (14 dias) dentro do rmen na
forma de sulfato de sdio marcado com
35
S
(Kang-Meznarich e Broderick, 1981). Aps a
reduo para sulfito, o marcador incorporado
junto protena bacteriana por meio de sntese de
novo de aminocidos sulfurados, cistena e
metionina, ou por incorporao em outras
substncias tais como a coenzima A. Protozorios
eventualmente tornam-se marcados por meios
indiretos. Amostras de digesta colhidas so
tratadas e analisadas de acordo com Elliott e
Armstrong (1982). Embora de meia-vida
relativamente curta (87 dias), o
35
S
potencialmente danoso para a sade e pode se
acumular na carne e leite, tornando-os imprprios
para o consumo.


Fsforo inorgnico (
32
P)

O fsforo inorgnico (
32
P) tambm tem sido
utilizado como marcador microbiano atravs da
incorporao dele junto aos fosfolipdeos
(Bucholtz e Bergen, 1973), mas precaues
substanciais necessitam ser tomadas para seu uso
como traador radiativo.


Microsferas radionucleadas marcadas

Microesferas so bolhas polimricas de resina
contendo ons marcados com
141
Ce,
57
Co,
95
Nb ou
103
Ru, disponveis comercialmente (Young et al.,
11
1991). Quando administradas diretamente dentro
do rmen de ovinos, as microsferas so injetadas
como suspenses de dextrano. No entanto, quando
fornecidas oralmente a ovinos, elas so misturadas
com farinha de peixe finamente moda e
peletizadas. O contedo radionucleado
determinado em amostras de fezes secas estufa e
comprimidas em cilindros e auferidas diretamente
em frascos de contagem gamma.
Foi demonstrado que microsferas no
passam atravs das paredes do trato gastro-
intestinal e permitem uma satisfatria recuperao
de 98,6% nas fezes (Young et al., 1991).
Microsferas no representam o fluxo de nenhuma
partcula alimentar em especial no trato digestivo,
mas parece ser adequada para estudos
comparativos.Elas tm a vantagem da
uniformidade do tamanho e densidade da partcula
a qual no se altera durante a passagem ao longo
do TGI. Elas so disponveis com diferentes
istopos marcados e so facilmente mensurveis
nas fezes.


Material vegetal marcado intrinsecamente
com
14
C e
3
H

Paredes celulares vegetais podem ser marcadas
com
14
C atravs da dosagem em mltiplo pulso de
dixido de carbono [
14
C] em plantas em
crescimento em casas de vegetao (Smith, 1989),
ou pela imerso de folhas em soluo de 10 M
de acetato
14
C-marcado e subseqente exposio a
uma fonte de luz de tungstnio de alta-intensidade
por diversos perodos de 30 minutos, intercalados
por perodos de escuro tambm de 30 minutos
(Kolattukudy, 1965). Gramneas trtio-marcadas
podem ser obtidas por pulverizao em intervalos
regulares com gua tritiada, conforme descrito por
Van den Hoek et al. (1985). Conforme o marcador
incorporado em componentes indigestveis e
potencialmente digestveis, o tecido vegetal trtio-
marcado e
14
C-marcado no enquadram no critrio
de indigestibilidade, conforme requerido por
marcadores nos estudos de cintica do rmen.
Componentes digestveis deveriam ser
previamente removidos empregando-se fraes
relativamente indigestveis tais como o FDN (aps
tratamento com cromo ou cobalto mordente) e
alcanos como marcadores isotopicamente
marcados.


Gesso tritiado

O gesso marcado em sua gua de cristalizao
preparado por meio de mistura de gesso em p
com uma quantidade apropriada de gua, sendo o
contedo de trtio desta ajustado para adequar o
nvel de suplementao requerida. Aps mistura
at consistncia de uma pasta macia, o gesso
esparramado para secagem. ento modo a p,
seco a frio e adicionado aos ingredientes
alimentares (Dove, 1984). A atividade
mensurada por meio de cintilao lquida.


Estimaes com Uso de Marcadores

Uma vez que as tcnicas de marcadores tendem a
fornecer resultados variveis dependendo das
condies experimentais, o marcador utilizado, o
material analisado e o modelo utilizado para o
processamento dos dados deveriam ser
verificados, se possvel, utilizando marcadores ou
procedimentos alternativos.


Fluxo da digesta

A digesta consiste de partculas de vrios
tamanhos suspensas em um fluido, formando um
nmero de pools interagentes. Marcar e traar
cada pool ao longo do trato digestivo uma tarefa
complexa e um dado marcador apropriado para
um marcar um determinado pool pode no o ser
para outro. Atravs do uso de animais preparados
cirurgicamente com cnulas, o fluxo da digesta
pode ser estimado em cada ponto de canulao.
Uma vez que a estimao do fluxo requer a
mensurao do marcador consumido pelo animal,
tanto desvios analticos como de dosagens
12
influenciaro os resultados. Alm disso, as
estimativas dependem da amostragem fecal
regular, mas apenas permitiram resultados
acurados se o fluxo do marcador for constante.
Entretanto, as concentraes dos marcadores
freqentemente apresentam considerveis
flutuaes dependendo do padro de alimentao
dos animais.
Para estimar o fluxo da digesta, uma
quantidade limitada de marcadores tais como o
cormo-mordente ou fibras marcadas com terras
raras administrada, usualmente como uma nica
dose seguida por amostragens da digesta
seqenciais no tempo. Porm, uma dosagem
contnua de marcador como componente da dieta
normal prefervel em relao a dosagens nicas
em virtude de ocorrer menor possibilidade de
homogeneizao do contedo ruminal com o
marcador, quando em dose nica, e pelo fato do
fluxo de sada da digesta, a partir do rmen ser
diversificada. Aps a suspenso do fornecimento
continuado do marcador no rmen, a curva de
declnio da concentrao do marcador ajustada a
modelos apropriados. Comparaes abrangentes
de modelos matemticos utilizados para estimar
cinticas de passagem j foram realizadas (Lalls
et al., 1991; Ellis et al., 1994; Huhtanen e
Kukkonen, 1995). Os modelos mais
freqentemente utilizados so os que bi-
compartimentais, que consideram duas taxas de
declnio, uma mais lenta associada passagem
pelo rmen e outra mais rpida, relacionada com o
fluxo ps-ruminal (Grovum e Willians, 1973). O
modelo de Grovum e Willians assume que a
passagem tem uma distribuio exponencial no
tempo e sugere que a probabilidade das partculas
de deixarem o rmen a mesma,
independentemente de seus tamanhos ou tempo de
permanncia no rmen. Este modelo
recomendado para a passagem de lquidos (Quiroz
et al., 1988). O modelo tempo-dependente gama
de Ellis et al. (1994) assume uma distribuio
gama no tempo e sugere que a probabilidade de
uma partcula em deixar o rmen aumenta com o
decorrer do tempo. Modelos bi-compartimentais
gama-2 so recomendados para partculas mdias
e pequenas e o gama-3 recomendado para
partculas grandes (Quiroz et al., 1988). Modelos
algbricos ou multi-compartimentais tambm tem
sido utilizados na tentativa de aperfeioar a
descrio das curvas de excreo de marcadores
(Pond et al., 1984; Dhanoa et al., 1985; Quiroz et
al., 1988; Lalls et al, 1991). Os modelos multi-
compartimentais assumem mistura instantnea e
fluxo constante atravs dos sucessivos
compartimentos. Comparao entre modelos
demonstrou que os modelos bi-compartimentais
requerem boas estimativas de parmetros iniciais
mas proporcionam taxas de turnover ruminal
similares s obtidas com modelos multi-
compartimentais (Beauchemin e Buchanan-Smith,
1989). Porm, taxas aparentes de turnover no ceco
e clon proximal foram o dobro e o tempo de
transito foi 35% maior quando se utilizaram
modelos multi-compartimentais em relao a
modelos bi-compartimentais.
Reese et al. (1995) desenvolveu um
modelo de fluxo de digesta multi-compartimental
com tempo de reteno com distribuio gama
que permite a estimao do tempo de reteno
total da digesta por compartimento, ao invs do
temo de reteno do marcador. Este modelo
utilizado principalmente para calcular as
alteraes no fluxo da digesta relacionadas s
modificaes ambientais, dietticas e das
condies fisiolgicas do animal.
Susmel et al. (1996) ajustou resultados
obtidos com forragem marcada com Cr-mordente,
administrada em dosagem nica, tanto para
modelos multi-compartimentais como modelos
tempo-dependente gama, para predio de
excreo fecal. As predies obtidas foram
semelhantes, mas o modelo multi-compartimental
proporcionou resultados mais precisos.
Marcadores como o xido de cromo, o
qual tende a se comportar independentemente da
fase slida ou lquida, quando utilizadas para
estimar taxa de fluxo destas fase, fornecero
estimativas errneas das mesmas. Estas limitaes
so superadas pela comumente utilizada tcnica
de Faichney (1992 , 1993), de duplos-marcadores.
Esta tcnica envolve a administrao de um
13
marcador-particular, tal como o Ru-phe, e um
marcador da fase lquida, como por exemplo o Cr-
EDTA, no alimento ou atravs de fstula, tanto
como dosagem nica ou em taxa constante at que
se alcance um estado fixo. Amostras so colhidas
no(s) ponto(s) onde se deseja mensurar o fluxo.
Este procedimento requer distribuio uniforme
dos marcadores dentro das fases, mas no exige a
associao exclusiva de cada marcador dentro de
cada fase.
Os elementos terras raras so utilizados
extensivamente para mensurao da reteno de
slidos no trato gastro-intestinal, enquanto o Cr-
EDTA e Co-EDTA so amplamente utilizados
para medir o tempo de reteno da fase lquida.
Taxas de turnover ruminal baseadas no FDN-
itrbio marcado foram maiores do que as obtidas
com fibra marcada com Cr-mordente, conforme
analisadas por modelos multi ou bi-
compartimentais, e provavelmente refletem uma
diferena no tamanho da partcula do alimento
marcado (Beauchemin e Buchanan-Smith, 1989).
Elementos terras raras tendem a se ligar s
partculas em relao rea de superfcie destas,
promovendo tempos mdios de reteno mais
relacionados com partculas de menor tamanho.
Estes marcadores, quando parcialmente
dissociados das partculas alimentares tambm
tendem a deixar o rmen mais rapidamente que as
partculas dos alimentos. Comparaes diretas das
taxas de passagem obtidas com elementos terras
raras e Cr-mordente no so, conseqentemente,
aconselhveis. No entanto, a dissociao dos
elementos terras raras no abomaso podem no
invalidar as estimativas de cinticas baseadas nas
concentraes fecais de marcadores. Elementos
terras raras podem reduzir a digestibilidade de
partculas alimentares. Silagem marcada com
itrbio concentrao de 35 g.kg
-1
de MS teve sua
taxa de desaparecimento do rmen reduzida em
26% (Beauchemin e Buchanan-Smith, 1989), mas
concentraes menores que 6 g.kg
-1
de MS no
afetaram a digesto (Siddons et al., 1985).
A curva de excreo de microsferas
radionucleadas marcadas em ovinos, ajustada para
modelo bi-compartimentais, proporcionou tempos
mdios de reteno de 55 horas enquanto que com
o marcador da fase lquida Co-EDTA obteve-se
51,2 horas e como xido de cromo (Cr
2
O
3
), 61,8
horas. Para os marcadores-particulares rutnio e
itrbio, os tempos de reteno auferidos foram de
61,9 e 55,1 horas, respectivamente (Young et al.,
1991).
O tempo mdio de reteno no rmen
estimado utilizando esporos de bactrias como
marcadores, os quais podem ser mais indicativos
do transporte da digesta no rmen do que com
marcadores inorgnicos, foi 5,5 horas maior que o
alcanado com Co-EDTA, e poderia ser devido
diferena na gravidade especfica entre os esporos
e o Co-EDTA (Mir et al., 1997).
Excreo fecal pode ser estimada atravs
da diluio de um marcador externo oralmente
administrado por meio da equao 12.1.

Excreo fecal = M
d
/M
c
(12.1)

onde M
d
dose diria do marcador e M
c
a
concentrao do marcador nas fezes.
O fluxo de um componente nutriente no
trato digestivo, ou parte dele, pode ser calculado
com o uso da equao 12.2

Fluxo do nutriente = N
d
.(M
h
/M
d
) (12.2)

onde N
d
a concentrao do nutriente no trato
digestivo, M
h
a concentrao do marcador na
forragem ou dieta e M
d
a concentrao do
marcador no trato digestivo.
Tanto n-alcanos marcadores externos
como internos parecem ser fortemente associados
com a fase slida (particulada) da digesta
abomasal, mas a matriz carreadora utilizada pelos
marcadores externos podem afetar a taxa de
passagem. Alcanos administrados recobertos por
celulose em p proporcionaram fluxo mais rpido
do que quando se utilizou tiras de papel filtro ou
tampes de papel impregnados com alcanos.
Alcanos dosados parecem ser to efetivos como o
acetato de itrbio como marcador da taxa de
passagem da digesta (Girldez et al., 1997). Os
alcanos naturais com sua recuperao duodenal
quantitativa e forte afinidade pela fase slida da
14
digesta, parece ser um marcador adequado para
estudo da cintica da digesta, particularmente em
razo do fato de que seu fluxo com resduos
alimentares indigeridos e a taxa de degradao das
partculas dos marcadores no TGI serem
semelhantes ao das partculas da digesta. Com a
finalidade de utilizar alcanos naturais como
marcadores, a planta pode ser marcada com
14
C e
fornecida como dose nica. A cintica da digesta
pode ser estudada por meio do acompanhamento
do
14
C marcando os alcanos da digesta ou fezes.


Sntese de protena microbiana

Estimaes do fluxo de nitrognio microbiano ao
duodeno e eficincia da sntese de N microbiano
dependem grandemente do marcador utilizado.
Com o uso do
15
N como marcador, a frao de N
bacteriano do total de N da digesta pode ser
calculado por meio da equao 12.3.

Frao de N bacteriano = E
d
/E
b
(12.3)

onde E
d
a quantidade de
15
N enriquecendo a
dieta e E
b
o enriquecimento da frao bacteriana.
Para marcadores internos tais como o
DAPA, a frao de N bacteriano calculado
utilizando a equao 12.4.

Frao de N bacteriano = M
d
/N
d
x N
b
/M
b



onde M
d
a concentrao do marcador na
digesta, N
d
a quantidade total de nitrognio na
digesta, N
b
a quantidade total de nitrognio na
frao bacteriana e M
b
a concentrao de
marcador na frao bacteriana.
Marcadores de protena ideais deveriam
considerar a sntese tanto bacteriana como
provinda de protozorios, associadas tanto fase
lquida como fase slida. Na atualidade no
existe um marcador ideal simples. O fluxo de
protena bruta de origem bacteriana ou de
protozorios a partir do rmen obtida a partir da
relao entre a quantidade de bactrias e
protozorios presentes em amostras do total de
microrganismos existentes no rmen. Revisando
marcadores de protena, Broderick e Merchen
(1992) chamaram ateno para o fato de que este
meio no se provou ser satisfatrio posto que os
resultados obtidos so relativos ao invs de
absolutos. O procedimento levando em conta o
uso de
15
N fornece resultados mais plausveis e
menos variveis que o que leva em conta o uso do
DAPA (Sadik et al., 1990). Em estudos com
15
N
como sais de amnio em dosagens de curta
durao, apenas o N microbiano marcado, posto
que ele no encontrado em dietas normais acima
do enriquecimento natural. Todos os pools de
nitrognio sero marcados, mas com diferentes
enriquecimentos visto que as bactrias so
marcadas diretamente atravs da incorporao do
15
NH
3
, enquanto que o nitrognio dos protozorios
marcado indiretamente atravs da predao das
bactrias marcadas, tornando assim incerto a base
para o clculo do rendimento microbiano do
rmen.
Schnhusen et al. (1995) comparou a D-alanina,
15
N, DAPA, RNA e perfis de aminocidos como
marcadores microbianos e concluiu que a D-
alanina e
15
N proporcionaram os melhores
resultados de bactrias ruminais e duodenais.
Estimativas do fluxo de nitrognio a partir do
procedimento com uso do
15
N tem apresentado
menores resultados do que quando estimados com
uso de derivados de purinas (Perez et al., 1996),
mas este achado tem sido atribudo inadequada
distribuio dos istopos ou a dificuldades na
obteno de amostras de pools de microrganismos
representativos. A presena na dieta de farinha de
peixe, que contm concentraes relativamente
altas de cidos nuclicos, poderia levar a
predies errneas. Na maioria dos outros
alimentos, a passagem intestinal de cidos
nuclicos dietticos parece ser insignificante. Uma
preocupao posterior relativa ao uso de cidos
nuclicos como marcadores a descoberta de que
a relao cidos nuclicos:protenas podem variar
entre bactrias e protozorios e tambm entre os
pools associados fase lquida e fase slida
(particulada) do rmen. Uma vez que a biomassa
microbiana est grandemente associada com a
(12.4)
15
= 1000 . (1 M
h
/M
f
)
frao particulada do rmen, recomendvel que
a frao particulada, ou os pools de bactrias
ruminais misturados no tempo aps alimentao,
seja utilizado para mensurar a relao
purina:nitrognio das bactrias que saem o
rmen.Embora as bactrias associados ao fluido
sejam muito mais fceis de isolar do que as
associadas frao slida, o seu uso na
determinao da relao purina:nitrognio poderia
levar a uma sub-estimativa da produo de
protenas bacterianas. As relaes de
purina:nitrognio dos protozorios so
normalmente metade das obtidas com bactrias
ruminais (Broderick e Merchen, 1992), e
conduziro a uma sub-estimativa da contribuio
da protena provinda de protozorios se o fluxo
total de bactrias e protozorios for estimada a
partir da relao purina:nitrognio bacterianos.
Mtodos no invasivos baseados na
excreo urinria de derivados de purina assumem
que os cidos nuclicos do duodeno so
primordialmente de origem microbiana e so
recuperados proporcionalmente na urina
principalmente como alantona e, em menor
extenso, como hipoxantina e cido rico aps a
digesto intestinal. Estimativas confiveis do
fluxo duodenal foram obtidas utilizando esta
tcnica, contanto que os derivados menores no
alantona tambm tivessem sido computados nos
clculos. cidos nuclicos dietticos contribuem
pouco para a excreo de derivados de purina,
visto que so degradados extensivamente nos
ruem. Estimaes da protena microbiana que
alcana o duodeno, baseadas nos ensaios de
derivados de purinas urinrios, no diferem
significativamente das estimaes baseadas no
nitrognio de purina presente na digesta duodenal
(Perez et al., 1996).


Digestibilidade

Convencionalmente, a digestibilidade de uma
forragem a diferena entra as quantidades
consumidas e excretadas nas fezes e envolve a
mensurao da ingesto de alimentos e excreo
total de fezes. A digestibilidade aparente das
forragens ou alimentos pode ser estimada pelo uso
de marcadores internos, ou incorporados como
marcadores externos junto dieta em
concentraes conhecidas e coletas de amostras de
fezes quando se atinge um estado constante. A
vantagem do uso de marcadores em estudos de
digestibilidade que a coleta total de fezes
substituda por tomada aleatria de amostras, a
qual reduz custos e trabalho, especialmente em
estudos com grandes herbvoros.
Uma combinao dos valores de digesto
derivados da evacuao do rmen com modelos
bi-compartimentais de passagem proporcionou
boas estimativas da digestibilidade ruminal da
FDN (0,94 a 0,96 da digestibilidade verdadeira)
(Huhtanen et al., 1995). Coeficientes de
digestibilidade parcial tm sido estimados por
meio do mtodo de reconstituio de dois
marcadores de Faichney (1980) utilizando o Cr-
EDTA e o itrbio como marcadores, ou mtodo de
concentrao de marcador nico de Schneider e
Flatt (1975), utilizando o itrbio. Os dois mtodos
forneceram resultados semelhantes, mas o mtodo
de reconstituio exigiu maior tempo de
preparao de amostras e trs vezes o nmero de
anlises em espectrofotmetro de absoro
atmica que o mtodo de indicador nico
(Remillard et al., 1990).
A digestibilidade pode ser derivada
atravs da equao 12.5.



(12.5)

onde M
h
a concentrao do marcador na
forragem e M
f
a concentrao do marcador nas
fezes.

Esta tcnica tambm pode ser utilizada
para estimar a digestibilidade aparente de
nutrientes dentro da forragem, utilizando a
equao 12.6.


Digestibilidade
da matria seca
16



(12.6)

onde M
h
a concentrao do marcador na
forragem, M
f
a concentrao do marcador nas
fezes, N
h
a concentrao do nutriente na
forragem e N
f
a concentrao do nutriente nas
fezes.
Estas equaes so baseadas na
pressuposio de que o marcador
completamente inerte e no absorvido, e que a
concentrao do marcador atingiu um estado
constante no trato digestivo. Alm disso, se um
marcador externo for utilizado, a ingesto de
alimentos deve ser conhecida com o objetivo de
permitir calcular a concentrao do marcador na
dieta.
Marcadores com recuperao fecal
incompleta, tais com os n-alcanos de cadeias
pares, podem ser utilizados se a equao contiver
um fator de correo para compensar a
recuperao incompleta. Uma vez que a perda de
alcanos graas absoro ao longo do intestino
delgado tende a decrescer com o aumento no peso
molecular do alcano, a concentrao do alcano
natural C
35
, que possui uma recuperao constante
de 95% (Mayes et al., 1986), utilizada para
estimar a digestibilidade, desde que ele esteja
presente na forragem em quantidades suficientes
(equao 12.7).






onde M
f
a concentrao de C
35
nas fezes e M
h

a concentrao de C
35
na forragem.
A acurcia das estimativas depende do
grau de variao da recuperao do marcador.
Erros nas estimativas de digestibilidade podem ser
maiores em bovinos do que em ovinos devido a
uma aparente menor e mais errtica recuperao
dos alcanos (Dove e Mayes, 1991). Uma
desvantagem do C
35
como marcador seu
contedo relativamente baixo em muitas plantas e
forragens (Dove e Mayes, 1996). Entretanto,
alguns dos alcanos naturais presentes em
concentraes suficientes podem ser utilizados
como marcadores desde que suas concentraes
sejam conhecidas. Comparando o alcano C
31
e o
xido de cromo como marcadores obteve-se
valores de digestibilidade de 605 e 633 g.kg
-1
,
respectivamente (Ohajuruka et al., 1991).
A recuperao de um marcador pode ser
estimada atravs da dosagem de animais em
pastejo com misturas conhecidas de alcanos de
cadeias pares e assim comparando as
concentraes relativas destes em amostras de
fezes com as quantias dosadas ou por meio de
mensurao da excreo de alcanos de cadeias
pares atravs da coleta total de fezes excretadas.
Em razo da baixa concentrao de alcanos de
cadeias pares em forragens, as recuperaes de
alcanos dietticos com cadeias mpares podem ser
calculadas atravs de interpolaes. A
recuperao pode tambm ser estimada por
intermdio de um grupo de animais estabulados
com ingestes conhecidas e nos quais a coleta
total de fezes tem sido levada a efeito (Mayes et
al., 1994; Salt et al., 1994).
Penning e Johnson (1983) obtiveram
resultados variveis ao utilizarem a cinza
insolvel em cido como marcador nas estimaes
de digestibilidade. Resultados precisos de
digestibilidade de gramneas foram alcanadas
utilizando a cinza insolvel em cido como
marcador (Van Keulen e Young, 1977; Sunvold e
Cochran, 1991), mas resultados altamente
variveis tm sido obtidos em fenos. Fenos
tambm foram ordenados em uma posio
diferente do que a obtida atravs dos mtodos in
vitro ou de procedimentos in vivo em bovinos de
corte. A variao observada poderia
particularmente ser devido contaminao das
amostras com p.
A lignina em detergente cido e o xido
de cromo adicionado ao alimento como marcador
externo, em vacas , permitiu a obteno de valores
de digestibilidade de 11,0 e 12,4% mais baixos,
Digestibilidade
de nutrientes
(g.kg
-1
)
= 1000 - 1000 . (M
h
/M
f
).(N
f
/N
h
)
= 1000 . (1 (M
h
/M
f
) . 0,95)
Digestibilidade
de nutrientes
(g.kg
-1
)
(12.7)
17
respectivamente, do que a calculada a partir da
coleta total de fezes (Morse et al., 1992). Uma
comparao da adequao dos marcadores
internos: FDN indigestvel no rmen, FDA
indigestvel em celulase, lignina de Klasons,
lignina de Klasons solvel e insolvel em
permanganato de potssio, e dos marcadores
externos: cromo-mordente e Co-EDTA, nas
estimativas de digestibilidade de componentes
alimentares, mostraram que apenas o cromo-
mordente, o Co-EDTA e a FDA indigestvel em
celulase pode ser considerada como adequada
(Tamminga et al., 1989).
O xido de cromo tem sido utilizado na
determinao da digestibilidade de aminocidos
em sunos por meio de mtodos de anlises ileal e
fecal (Li et al., 1993; veja tambm o captulo 13).
Animais recebendo o xido crmico em suas
raes foram adaptados com uma cnula-T junto
ao leo terminal. A digesta era amostrada atravs
da cnula e as digestibilidades dos aminocidos
eram calculadas em base das concentraes dos
marcadores indigestveis no alimento e na digesta.
O mtodo ileal forneceu resultados mais
confiveis que o mtodo fecal. Comparao do
mtodo do xido crmico com o mtodo direto na
mensurao da digestibilidade em todo o trato em
sunos demonstrou que o mtodo do xido
crmico proporcionou resultados menores (trs
pontos percentuais menores para a digestibilidade
total e sete pontos percentuais menores para a
digestibilidade ileal), provavelmente em razo da
menor recuperao (82-85%) do xido crmico
nas fezes (Mroz et al., 1996). Contudo,
preferncia tem sido dada tcnica de marcadores
em relao ao mtodo direto, desde que os
clculos baseados nos marcadores sejam
independentes para as perdas no alimento, digesta
e fezes. A digestibilidade tem tambm sido
estimada com sucesso em eqinos utilizando o
xido de cromo como marcador (Todd et al.,
1995b). O disprsio no tem sido apontado como
um marcador satisfatrio para estimaes de
digestibilidade em eqinos mas pode ser usado
para estimar taxas de passagem relativas. A
recuperao do disprsio encontrada nas fezes dos
cavalos foi de 82,9%. Devido sua recuperao
incompleta, a digestibilidade da matria seca foi
seis a sete unidades menor do que as alcanadas
com coleta total ou com xido crmico (Todd et
al., 1995a).
Digestibilidades dos alimentos obtidas
com microsferas radionucleadas com terra rara
114
Ce como marcadores foram similares quelas
obtidas por meio de coletas totais (Young et al.,
1991).


Ingesto de forragens e suplementos

O mtodo mais comumente utilizado para
estimativa da ingesto de forragens em animais
baseado na relao entre a excreo fecal e a
digestibilidade da forragem, conforme
representado na equao 12.8.

Ingesto de forragem = F / (1 D)
(12.8)

onde F a excreo fecal e D a digestibilidade
da forragem.
A excreo fecal pode ser mensurada
diretamente por meio do uso de sacolas coletoras
de fezes mas, alme de afetar o comportamento
alimentar dos animais, podem ocorrer perdas das
sacolas levando a uma subestimao da ingesto.
Quando animais no podem ser contidos em
gaiolas ou quando no desejvel sobrecarrega-
los com os aparatos de coleta fecal, a coleta de
fezes pode ser estimada a partir da concentrao
nas fezes de marcadores externos administrados
oralmente (equao 12.6).
Antes do surgimento da tcnica dos n-
alcanos, a ingesto de matria seca era obtida
utilizando a excreo fecal estimada,
principalmente atravs do uso do Cr
2
O
3
como
marcador, e da digestibilidade, utilizando a
tcnica in vitro. A principal desvantagem desta
tcnica que a digestibilidade in vitro no
considera as alteraes na digestibilidade de uma
forragem decorrentes do seu nvel de ingesto, do
uso de suplementao ou do nvel de infestao
18
parasitria que o animal sofre. Alcanos so
idealmente apropriados para a estimativa da
ingesto de forragens em animais sob pastejo a
partir da taxa de dosagem diria, e as
concentraes dietticas e fecais do alcano de
cadeia par dosado e um alcano natural de cadeia
mpar, de comprimento adjacente ao alcano
dosado. Tanto mercadores internos como externos
so extrados e quantificados simultaneamente e
os resultados so calculados utilizando a equao
12.9.



(12.9)

onde D
e
a dose diria de alcano de cadeia par, F
o

so as concentraes fecais de alcanos naturais de
cadeias mpares, H
o
a concentrao na forragem
do alcano natural de cadeia mpar, F
e
a
concentrao fecal do alcano de cadeia par dosado
e H
e
so as concentraes dos alcano naturais de
cadeias pares.
Alcanos com comprimentos de cadeias
adjacentes parecem ter taxas de recuperao
similares. O par adjacente, C
32
e C
33
, os quais so
mais freqentemente utilizados nas predies de
ingesto, possuem recuperaes de 0,868 0,0175
e 0,872 0,0125, respectivamente (Dove e
Mayes, 1991). digno de nota que um dado par
de alcanos que possua recuperao semelhante
seja utilizado para predies de ingestes, sua
recuperao incompleta nas fezes no se
constituiria em problema, desde que estes valores
pudessem se auto anular (veja a equao 12.9).
importante assegurar que a amostragem
da forragem analisada seja representativa da
forragem realmente ingerida pelos animais
experimentais em termos da composio de
alcanos. Amostras colhidas manualmente podem
ser adequadas nos casos de pastagens cultivadas
uniformemente, mas podem ser inadequadas para
pastagens mistas ou de composio complexa.
Amostras representativas de extrusa podem ser
obtidas atravs de animais com fstulas esofgicas
adaptadas com bolsas ou vlvulas esofgicas
remotamente controladas (Raats e Clarke, 1992;
Raats et al., 1993). Concentraes fecais de
alcanos dosados alcanam equilbrio aps 5 a 6
dias. Entretanto, variaes diurnas podem ocorrer,
dependendo do tempo e freqncia da dosagem do
marcador e da coleta fecal. A variao diurna na
concentrao fecal de alcanos em ovinos dosados
uma nica vez ao dia com papeis impregnados
com alcanos, ou duas vezes ao dia, com celulose
em p recoberta com alcanos, pequena mas pode
ser de maior proporo em bovinos (Dove e
Mayes, 1996). Com marcadores tais como Cr
2
O
3
e
o rutnio-fenantrolina (Ru-phe), a variao diurna
nas concentraes absolutas importante,
enquanto que no caso dos alcanos um erro
somente ser introduzido se existir variao
diurna na relao entre a concentrao fecal da
forragem e a concentrao do alcano dosado.
Alcanos apresentam muitas vantagens
sobre a maioria dos outros marcadores
indigestveis utilizados para estimao da ingesto
em animais em livre pastejo. Estimativas de
ingesto no so dependentes das determinaes
da digestibilidade in vitro. A verdadeira
digestibilidade dos alimentos em animais
individuais calculada e o mtodo
conseqentemente bem ajustado para o estudo de
diferenas genticas relativas ingesto,
digestibilidade e converso alimentar. A oferta de
suplementos bem acomodada pelo mtodo e tem
sido validado por diversos estudos (Mayes et al.,
1986; Dove et al., 1995). Em virtude de que os
alcanos so cadeias lineares simples de
hidrocarbonetos, sua extrao, purificao e
separao quantitativa por meio de cromatografia
gasosa so procedimentos relativamente simples e
envolve menos trabalho que a tcnica do xido
crmico.
Em dez estudos de validao reportados
por Dove e Mayes (1996), a maior discrepncia
entre a ingesto conhecida e a estimada foi de
aproximadamente 2,6%. Piasentier et al. (1995)
demonstraram que o alcano marcador externo
(C
32
) neste estudo proporcionou uma maior
recuperao fecal do que os alcanos naturais C
31
e
C
33
, os quais conduziram a uma subestimao na
Ingesto de
matria seca
= (F
o
/F
e
) x D
e
/ (H
o
(F
o
/F
e
) x H
e
)
19
ingesto da ordem de 3% em mdia. Em
comparao, o mtodo do xido crmico
superestimou a ingesto em torno de 5% em
decorrncia de sua recuperao incompleta nas
fezes.
A ingesto de suplementos em situaes
de campo pode ser estimada atravs da mistura de
um marcador, como o itrbio com metil-celulose
por exemplo, e borrifa-lo sobre o suplemento.
Aps a coleta total de fezes, a ingesto do
suplemento pode ser estimada a partir da
recuperao do marcador nas fezes (Curtis et al.,
1994).
Ingestes individuais de suplementos por
animais tm sido determinadas atravs da
marcao deles com Cr
2
O
3
e mensurao da
excreo total de fezes (Dove e Coombe, 1992).
Uma desvantagem deste mtodo a necessidade
de se determinar a excreo total de fezes. Atravs
do uso do xido crmico e do gesso tritiado como
marcadores e a medio do acmulo do trtio no
pool de gua corporal dos animais, torna
desnecessria a medio da excreo total de
fezes. Ambos os mtodos fornecem resultados
semelhantes, embora o mtodo do xido crmico
apresente menores erros padres. Ao passo que o
mtodo do gesso tritiado proporcione resultados
mais acurados sob condies de campo e em
baixos nveis de ingesto alimentar (Dove, 1984;
Dove e Coombe, 1992).
Em razo de sua quase completa ausncia
em alimentos e alta recuperao fecal (0,95), o
hexatriacontano (C
36
) poderia ser utilizado como
um marcador de suplemento por meio da
pulverizao dele sobre o suplemento.


Seleo de espcies forrageiras

Antes do surgimento da tcnica dos alcanos como
marcadores, era extremamente difcil, se no
impossvel, estimar acuradamente a composio
botnica das plantas ingeridas por herbvoros em
pastejo. O exame microscpico de fraes da
cutcula vegetal indigestvel tem sido mais
amplamente utilizado, mas problemas associados
com este e outros procedimentos tm sido
recentemente discutidos (Dove e Mayes, 1996).
J longamente conhecido que diferenas
na composio dos alcanos de diferentes espcies
de plantas poderiam ser utilizadas em estudos
quemataxonmicos. A composio da dieta em
termos de espcies vegetais ou das partes dos
vegetais pode hoje ser estimada a partir do
conhecimento do perfil de alcanos ou
fingerprint (impresso digital) de uma
amostra representativa da dieta mista, em forma
de extrusa esofgica (Dove et al., 1993) ou fezes
(Salt et al., 1994), e os perfis de alcanos dos
componentes das plantas ou alimentos que
compem a dieta. Quando amostras fecais so
utilizadas, correes para a recuperao
incompleta podem ser necessrias com o intuito
de evitar uma tendncia concernente a
componentes dietticos com uma predominncia
maior de alcanos com cadeias mais longas (Mayes
et al., 1994; Salt et al., 1994). Equaes
simultneas (Dove, 1992) ou mtodos de
otimizao de quadrados mnimos (Dove et al.,
1993; Salt et al., 1994; Newman et al, 1995) tm
sido utilizadas para estimar a composio de
dietas. Mtodos de otimizao de quadrados
mnimos tendem a minimizar desvios quadrados
entre padres de alcanos observados nas forragens
consumidas ou fezes e aquela indicada pela
composio predita da dieta, mas os resultados
preditos so por outro lado semelhantes s
predies obtidas com equaes simultneas
(Dove e Mayes, 1996). Atravs da utilizao da
concentrao de alcanos nos procedimentos de
minimizao de quadrados mnimos, uma
estimativa da digestibilidade total da dieta pode
tambm ser obtida.
Teoricamente, o nmero de espcies
componentes que poderia ser determinada em uma
mistura limitado ao nmero de marcadores
alcanos presentes, os quais podem variar entre 8 a
15. Entretanto, na prtica, o nmero pode ser
menor devido a possibilidade de similaridade
entre os perfis de alcanos nas diferentes espcies
constituintes da dieta, ou a possibilidade de certas
espcies apresentarem baixas concentraes em
20
alcanos. Os perfis de alcanos de diferentes partes
das plantas tais como folhas e talos podem
tambm ser diferentes e devem ser levados em
conta quando forem feitas amostragens
representativas das forragens ingeridas. Estas
diferenas podem ser exploradas com o objetivo
de estimar a ingesto das diferentes partes das
plantas consumidas (Dove et al., 1992).
Com o objetivo de validar a estimativa da
composio da dieta, misturas conhecidas de
plantas tem tido suas composies em alcanos
analisadas e suas propores de misturas preditas
por meio da tcnica dos alcanos (Figura 12.1A). A
composio de espcies de trs ou quatro
componentes nas misturas tem tambm sido
estimadas (Dove, 1992). Diversos estudos de
validao demonstraram que os perfis de alcanos
podem proporcionar estimativas precisas da
composio da dieta em animais sob pastejo ou
consumindo ramagens (Figura 12.1B) (Dove e
Mayes, 1996). O uso dos alcanos para estimar a
seleo de espcies no est restrito a ruminantes,
mas tambm tem sido aplicado a no-ruminantes
tais como sunos, eqinos e lebres montanhesas
(Dove e Mayes, 1996).










Figura 12.1. (A) Relao entre propores conhecidas de quicuio (Pennisetum clandestinum) e plantago
(Plantago lanceolata) em misturas vegetais e as propores preditas a partir das concentraes de
alcanos das espcies componentes e de suas misturas. (B) Propores do junco (Juncus effusus) na
dieta de cabras alimentadas com uma mistura de Juncus e Lolium perenne (dados de Dove e Mayes,
1996), recuperaes fecais estimadas atravs de dosagens dos alcanos C
24
, C
28
, C
32
e C
36
. Linhas
slidas representam a proporo 1:1.


Concluses

Nos anos recentes, importantes avanos tm sido alcanados com o uso de marcadores indigestveis no
estudo da cintica da digesta, sntese de protena microbiana ruminal, digestibilidade, ingesto de
forragens e seleo de espcies forrageiras. Estimativas da taxa do fluxo da digesta so amplamente
influenciadas pelo marcador e modelo utilizado, e cuidados devem ser tomados na escolha dos
procedimentos experimentais. Devido s falhas na concordncia entre distintos procedimentos,
21
estimativas dos parmetros do fluxo da digesta devem freqentemente ser considerados como ndices
relativos ao invs de valores absolutos. A quantificao da sntese de protena microbiana dificultada
pelo enriquecimento desigual de
15
N e marcadores internos em relao ao pools de protozorios e
bactrias. Um maior avano tem sido o advento do n-alcanos como marcadores internos e externos.
Estimativas de digestibilidade, ingesto e seleo de espcies por meios dos marcadores alcanos parecem
ser mais acurados que outros procedimentos. O uso de marcadores tem intensificado grandemente nossos
conhecimentos da nutrio de animais domsticos e em particular da nutrio de animais sob livre
pastejo.


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