NTC 5733

NORMA TCNICA NTC
COLOMBIANA 5733

2009-12-16

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y PRODUCTOS
DE ALIMENTACIN ANIMAL.
MTODOS HORIZONTALES PARA LA DETECCIN
Y ENUMERACIN DE ENTEROBACTERIAS.
PARTE 2: MTODO DE RECUENTO DE COLONIAS

E: MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING
STUFFS. HORIZONTAL METHODS FOR THE DETECTION
AND ENUMERATION OF ENTEROBACTERIACEAE. PART 2:
COLONY. COUNT METHOD

CORRESPONDENCIA: esta norma es una adopcin idntica
(IDT) respecto a su documento de
referencia, ISO 21528-2:2004.

DESCRIPTORES: microbiologa de alimentos;
alimentacin animal; mtodo
horizontal; mtodo de recuento de
colonias; enterobacterias.

I.C.S.: 07.100.01

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC)
Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435

Prohibida su reproduccin Editada 2009-12-24

PRLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo
nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993.

ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.

La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica
est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo
caracterizado por la participacin del pblico en general.

La NTC 5733 fue ratificada por el Consejo Directivo de 2009-12-16.

Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.

A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a
travs de su participacin en el Comit Tcnico 25 Microbiologa.

3 M COLOMBIA
ALGARRA S.A.
ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A.
BIOQUILAB LTDA.
BIOTRENDS LABORATORIOS LTDA.
CARULLA VIVERO S.A.
CASA LUKER S.A.
ENZIPN LABORATORIOS S.A.
IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA.
KOYOMAD S.A.
LABCONTROL E.U.
LABORATORIO SFC LTDA.
LABORATORIOS ERMA S.A.
LABORATORIOS GRAM
LABORATORIOS MICROLAB LTDA.
MERCADEO DE ALIMENTOS DE
COLOMBIA S.A.
MULTIDIMENSIONALES
NULAB LTDA.
PURIFICACIN Y ANLISIS DE FLUIDOS
LTDA.
QUALA S.A.
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
VECOL S.A.

Adems de las anteriores, en Consulta Pblica el Proyecto se puso a consideracin de las
siguientes empresas:

ABASTICO DEL VALLE
ACEGRASAS S.A.
ACUAGYR S.A. E.S.P.
ALIMENTOS POLAR COLOMBIA S.A.
ANNAR DIAGNOSTICA IMPORT LTDA.
AQUALAB
ARCHIVO DE BOGOT
AREPAS DOA ALEJA
ASBIOQUIM LTDA.
ASEBIOL
ASINAL
ASOCIACIN COLOMBIANA DE
MICROBIOLOGA
BAVARIA S.A.
BECTON DICKINSON DE COLOMBIA
LTDA.
BIANLISIS
BIOCONTROL LTDA.
CALIDAD INDUSTRIAL LTDA.
CERVECERA LEONA S.A.

COLOMBIANA S.A.
COMPAA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A.
CONGELAGRO S.A.
CORPOLAC
CORPORACIN PARA EL AVANCE DE LA
MICROBIOLOGA Y LA MICROSCOPIA
MICROS
DUPONT QUALICON
EMPRESA DE ACUEDUCTO Y
ALCANTARILLADO DE BOGOT E.S.P.
FABRICA DE ESPECIAS Y
CONDIMENTOS EL REY S.A.
FRUGAL S.A.
INDUSTRIA PRODUCTORA DE ACEITES
RENOVABLES.
INDUSTRIAS ALIMENTICIAS ZEN S.A.
INSTITUTO DE GENTICA UNIVERSIDAD
NACIONAL DE COLOMBIA.
JOHNSONDIVERSEY
KLIK S.A
LA CAMPIA
LABFARVE LABORATORIO DE
FARMACOLOGA VEGETAL

LABORATORIO A.B.B.A.
LABORATORIO DE GENTICA Y
BIOLOGA MOLECULAR.
LABORATORIO EMICAL
LESNIAK E.U.
MICROBIOLOGOS ASOCIADOS LTDA.
NESTL DE COLOMBIA S.A.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
PRODUCTOS NATURALS DE LA SABANA
S.A. -ALQUERA-
QUIK LTDA.
ROCHE DIAGNOSTICS
SECRETARIA DISTRITAL DE SALUD DE
BOGOT.
SERVICIOS DE LABORATIO CLINICO
LTDA.
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
UNIVERSIDAD DEL VALLE
UNIVERSIDAD MANUELA BELTRN
VILASECA LTDA.
VITROFARMA S.A.

ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados.

DIRECCIN DE NORMALIZACIN

NORMA TCNICA COLOMBIANA NTC 5733

CONTENIDO

Pgina

INTRODUCCIN......................................................................................................................1

1. ALCANCE.....................................................................................................................1

2. REFERENCIAS NORMATIVAS...................................................................................2

3. TRMINOS Y DEFINICIONES.....................................................................................2

4. PRINCIPIO....................................................................................................................3

4.1 PREPARACIN DE LA SUSPENSIN INICIAL Y LAS DILUCIONES
DECIMALES.................................................................................................................3

4.2 AISLAMIENTO .............................................................................................................3

4.3 CONFIRMACIN..........................................................................................................3

4.4 CLCULO.....................................................................................................................3

5. DILUYENTE, MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVO......................................................3

5.1 DILUYENTE..................................................................................................................3

5.2 MEDIO DE CULTIVO....................................................................................................3

5.3 REACTIVO DE OXIDASA............................................................................................6

6. EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO ...........................................................................6

7. MUESTREO..................................................................................................................7

8. PREPARACIN DE LA MUESTRA DE ENSAYO.......................................................7


Pgina

9. PROCEDIMIENTO........................................................................................................7

9.1 INFORMACIN GENERAL..........................................................................................7

9.2 PORCIN DE ENSAYO, SUSPENSIN INICIAL Y DILUCIONES.............................7

9.3 INOCULACIN E INCUBACIN .................................................................................7

9.4 RECUENTO Y SELECCIN DE LAS COLONIAS PARA LA CONFIRMACIN........8

9.5 SUBCULTIVO DE LAS COLONIAS SELECCIONADAS ............................................8

9.6 ENSAYOS DE CONFIRMACIN BIOQUMICA..........................................................8

10. EXPRESIN DE RESULTADOS .................................................................................9

10.1 TUBOS POSITIVOS CONFIRMADOS.........................................................................9

11. INFORME DE ENSAYO ...............................................................................................9

BIBLIOGRAFA......................................................................................................................11

DOCUMENTO DE REFERENCIA..........................................................................................12

ANEXOS

ANEXO A (Normativo)
LMITES DE CONFIANZA PARA LA ESTIMACIN DE CANTIDADES
PEQUEAS DE COLONIAS..................................................................................................10


1 de 12

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y PRODUCTOS
DE ALIMENTACIN ANIMAL.
MTODOS HORIZONTALES PARA LA DETECCIN
Y ENUMERACIN DE ENTEROBACTERIAS.
PARTE 2: MTODO DE RECUENTO DE COLONIAS

INTRODUCCIN

Esta norma est destinada a brindar unas directrices generales para el examen de los
productos que no son tratados en normas tcnicas colombianas existentes y para ser tomada
en consideracin por organizaciones que preparen mtodos de ensayo microbiolgico para la
aplicacin en alimentos o productos alimenticios para animales. Debido a la gran variedad de
productos dentro de este campo de aplicacin, estas directrices pueden no ser apropiadas en
todo detalle para algunos productos y para algunos otros puede ser necesario usar mtodos
diferentes. No obstante, se espera que en todos los casos se hagan todos los intentos para
aplicar las directrices suministradas en la medida de lo posible y que las desviaciones con
respecto a ellas nicamente se lleven a cabo si es absolutamente necesario por razones
tcnicas.

En la prxima revisin de esta norma, se tomar en consideracin toda la informacin que est
disponible con respecto a la extensin en la cual las directrices se han cumplido y las razones
para las desviaciones en el caso de productos particulares.

La armonizacin de los mtodos de ensayo no puede ser inmediata y para algunos grupos de
productos pueden existir ya normas nacionales o internacionales, o ambas que no cumplen con
este mtodo horizontal. Se espera que cuando se revisen tales normas se les realicen cambios
para satisfacer esta norma de tal manera que, eventualmente, las nicas desviaciones de ste
mtodo horizontal sern aquellas necesarias y bien establecidas por razones tcnicas.

1. ALCANCE

Esta norma especfica un mtodo sin pre-enriquecimiento para la enumeracin de
enterobacterias. Se aplica a:

- productos destinados para consumo humano y alimentacin de animales, y

- muestras ambientales en el rea de produccin y manipulacin de alimentos.

La enumeracin se realiza mediante el recuento de las colonias en un medio slido despus de
la incubacin a 37 C (o 30 C)
1)
.

1)
La temperatura de 37 C se usa generalmente cuando la enumeracin de enterobacterias es para un
indicador higinico. Como alternativa se puede seleccionar la temperatura de 30 C cuando la enumeracin
de enterobacterias se ejecuta con propsitos tecnolgicos e incluye enterobacterias psicotrpicas.


2
Esta tcnica se recomienda cuando se espera que la cantidad de colonias que se busca
sea superior a 100 UFC (unidades formadoras de colonia) por ml o por gramo de
muestra de ensayo.

2. REFERENCIAS NORMATIVAS

Los siguientes documentos de referencia son indispensables para la aplicacin de esta norma
para referencias con fecha, nicamente se aplica la edicin citada. Para referencias sin fecha,
se aplica la ltima edicin del documento citado (incluyendo todas las enmiendas).

NTC 4092, Microbiologa de alimentos y de alimentos para animales. Reglas generales para el
anlisis microbiolgico.

NTC 4491-1, Microbiologa de alimentos y alimentos para animales. Preparacin de muestras
para ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales para anlisis microbiolgico. Parte 1:
Reglas generales para la preparacin de la suspensin inicial y de diluciones decimales.

para ensayo. Suspensin inicial y diluciones decimales para anlisis microbiolgico. Parte 2.
Reglas especificas para la preparacin de carne y productos crnicos.

para ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales para anlisis microbiolgico. Parte 3.
Reglas especificas para preparacin de muestras de pescado y productos de la pesca.

Reglas especificas para la preparacin de productos diferentes de leche, productos lcteos,
carne, productos crnicos, pescados y productos de la pesca.

Reglas especificas para la preparacin de productos la de leche y derivados lcteos.

GTC 78, Microbiologa de alimentos y alimentos para animales. Gua para la preparacin y
produccin de medios de cultivo. Gua general para el aseguramiento de la calidad para la
preparacin de los medios de cultivo en el laboratorio.

DE 205-06, Microbiologa de alimentos y alimentos para animales. Gua para la preparacin y
produccin de medios de cultivo. Gua general para los ensayos de desempeo de medios de
cultivo.

3. TRMINOS Y DEFINICIONES

Para los propsitos de este documento, se aplican los siguientes trminos y definiciones.

3.1 Enterobacterias. Microorganismos que forman colonias caractersticas sobre agar violeta
rojo bilis glucosa que fermentan la glucosa y presentan una reaccin negativa a la oxidasa,
cuando los ensayos se realizan segn los mtodos que se especifican en esta norma.

3.2 Recuento de enterobacterias. Cantidad de enterobacterias que se encuentran por mililitro
o por gramo de muestra de ensayo, cuando el ensayo se realiza de acuerdo con el mtodo que
se especifica en esta norma.


3
4. PRINCIPIO

4.1 PREPARACIN DE LA SUSPENSIN INICIAL Y LAS DILUCIONES DECIMALES

Se prepara una suspensin inicial y diluciones decimales a partir de la muestra de ensayo
(vase la serie de normas NTC 4491, Parte 1, 2, 3, 4 y 5).

4.2 AISLAMIENTO

El agar violeta rojo bilis glucosa que se encuentra en dos cajas de Petri (tcnica de siembra en
caja) se inocula con una cantidad especfica de la muestra de ensayo, si el producto es lquido,
o con la suspensin inicial en el caso de otros productos. Se adiciona una capa del mismo
medio.

Otros pares de cajas se preparan bajo las mismas condiciones, utilizando diluciones decimales
de la muestra de ensayo o de la suspensin inicial.

Las cajas se incuban a 37 C (o 30 C)
1
durante 24 h 2 h.

4.3 CONFIRMACIN

Subcultivo de colonias de enterobacterias presuntivas sobre un medio no selectivo y
confirmacin por medio de ensayos para la fermentacin de glucosa y la presencia de oxidasa.

4.4 CLCULO

La cantidad de enterobacterias por ml o por g de muestra de ensayo se calcula a partir del
nmero confirmado de colonias tpicas por cada caja.

5. DILUYENTE, MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVO

Para la prctica actual del laboratorio, vase NTC 4092, GTC 78 y GTC 171.

5.1 DILUYENTE

Vase la NTC 4491-1.

5.2 MEDIO DE CULTIVO

5.2.1 Agar violeta rojo bilis glucosa (VRBG)

5.2.1.1 Composicin

Producto de digestin enzimtica de tejidos animales 7,0 g

Extracto de levadura 3,0 g

Sales de bilis No. 3 1,5 g

Glucosa 10,0 g

Cloruro de sodio 5,0 g


4
Rojo neutro 0,03 g

Cristal Violeta 0,002 g

Agar 9 g a 18 g
a)

Agua 1 000 ml

5.2.1.2 Preparacin

Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en agua mediante ebullicin.

Ajuste el pH, si es necesario, de manera tal que despus de la ebullicin est en 7,4 0,2 a 25 C.

Dispense el medio de cultivo en tubos o frascos estriles (vase el numeral 6.5) con capacidad
no superior a 500 ml.

No esterilice el medio.

Prepare el medio inmediatamente antes del uso. Utilice el medio fundido dentro de un periodo
de cuatro horas a partir de su preparacin.

5.2.1.3 Ensayo de desempeo para aseguramiento de la calidad del medio de cultivo

Para la definicin de selectividad y productividad, consulte la GTC 78. Para los criterios de
desempeo, consulte la GTC 171, Tabla B.1.

5.2.2 Agar nutritivo

5.2.2.1 Composicin

Extracto de carne 3,0 g



Agar 9 g a 18 g
a)

Agua 1 000 ml

5.2.2.2 Preparacin

Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en agua, mediante calentamiento,
si es necesario.

Ajuste el pH, si es necesario, de manera tal que despus de la esterilizacin est en 7,3 0,2 a
25 C.

no superior a 500 ml.
Esterilice durante 15 min en autoclave (vase el numeral 6.1) ajustado a 121 C.

a)
Dependiendo de la potencia de gelificacin del agar.


5
5.2.2.3 Preparacin de las cajas de agar

Transfiera porciones de 15 ml aproximadamente del medio de cultivo, fundido y enfriado hasta
aproximadamente 47 C, a cajas de Petri (vase el numeral 6.7) y permita que se solidifique.

Inmediatamente antes del uso, seque las cajas, de preferencia sin las tapas y con la superficie
de agar hacia abajo, en una superficie lisa y en condiciones aspticas (vase el numeral 6.3)
hasta que el agar est seco.

Si se preparan con anticipacin, las cajas sin secar se pueden almacenar en condiciones que
no cambien su composicin hasta durante dos semanas a 5 C 3 C.

5.2.2.4 Ensayo de desempeo para aseguramiento de la calidad del medio de cultivo

Para la definicin de selectividad y productividad, consulte la GTC 78. Para los criterios de
desempeo, consulte la GTC 171, Tabla D.6.

5.2.3 Agar de glucosa

5.2.3.1 Composicin


Extracto de levadura 1,5 g

Glucosa 10,0 g


Prpura de bromocresol 0,015 g

Agar 9 g a 18 g
a)

Agua 1 000 ml

5.2.3.2 Preparacin

Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en agua, mediante calentamiento,
si es necesario.

Ajuste el pH, si es necesario, de manera tal que despus de la esterilizacin est en 7,0 0,2 a
25 C.

adecuada.

Esterilice durante 15 min en autoclave (vase el numeral 6.1) ajustado a 121 C. Deje los tubos
en posicin vertical.

El medio se puede almacenar hasta por una semana a 5 C 3 C.

a)
Dependiendo de la potencia de gelificacin del agar.


6
Inmediatamente antes del uso, caliente el medio en agua hirviendo o en un flujo de vapor
durante 15 min, luego enfre rpidamente hasta la temperatura de incubacin.

5.3 REACTIVO DE OXIDASA

5.3.1 Componentes

N,N,N,N-Tetrametil-p-fenilenediamina dihidrocloruro 1,0 g

Agua 100 ml

5.3.2 Preparacin

Disuelva el componente en agua fra.

Prepare el reactivo inmediatamente antes del uso.

Se pueden utilizar las tiras o discos disponibles en el comercio. En este caso, siga las
recomendaciones del fabricante.

6. EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO

Equipos comunes para el laboratorio microbiolgico y, en particular los siguientes (vase la
NTC 4092).

6.1 Equipos para esterilizacin seca (horno) o esterilizacin hmeda (autoclave).

Vase la NTC 4092.

6.2 Incubadora, con capacidad para operar a 37 C 1 C.

6.3 Estufa de secado (ventilado por conveccin) o incubadora con capacidad para operar
a una temperatura entre 37 C y 55 C.

6.4 Bao de agua/mara o equipo similar con capacidad de mantener una temperatura
entre 44 C y 47 C.

6.5 Recipientes (por ejemplo tubos de ensayo), con dimensiones de 16 mm x 150 mm y
20 mm x 200 mm y frascos o botellas con capacidad entre 150 ml y 500 ml, adecuados para
esterilizar y almacenar el medio de cultivo.

6.6 Cajas de Petri, de vidrio o plstico con dimetro de 90 mm a 100 mm.

6.7 Asas redondas (con dimetro aproximado de 3 mm) y asas rectas elaboradas de
platino/iridio o nquel/cromo y/o rastrillos de vidrio, o asas desechables estriles equivalentes
o agujas de inoculacin.

6.8 Pipetas graduadas de entrega total, de 1 ml de capacidad nominal graduadas en
divisiones de 0,1 ml y con una abertura de salida de flujo de 2 mm a 3 mm de dimetro.

NOTA Pueden utilizarse pipetas automticas debidamente calibradas.

6.9 Medidor de pH con una exactitud de 0,1 unidad de pH a 25 C.


7
6.10 Homogeneizador

Vase la NTC 4092.

7. MUESTREO

Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representativa
del producto y que no se haya deteriorado ni haya cambiado durante el transporte o el
almacenamiento.

El muestreo se debera realizar de acuerdo con la norma especfica para el producto en
cuestin. Si no existe tal norma, se recomienda que las partes interesadas logren un acuerdo
con respecto a este tema.

8. PREPARACIN DE LA MUESTRA DE ENSAYO

Prepare la muestra de ensayo de acuerdo con la NTC 4491 partes 1, 2, 3, 4 y 5, y/o la norma
especfica adecuada para el producto en cuestin. Si no existe tal norma, se recomienda que
las partes interesadas logren un acuerdo con respecto a este tema.

9. PROCEDIMIENTO

9.1 INFORMACIN GENERAL

Para obtener directrices sobre la realizacin del procedimiento vase la NTC 4092.

9.2 PORCIN DE ENSAYO, SUSPENSIN INICIAL Y DILUCIONES

Vanse la coleccin de la NTC 4491 partes 1, 2, 3, 4 y 5.

Prepare una sola serie de diluciones decimales a partir de la muestra de ensayo, si el producto
es lquido o a partir de la suspensin inicial en el caso de otros productos.

9.3 INOCULACIN E INCUBACIN

9.3.1 Tome dos cajas de Petri estriles (vase el numeral 6.6). Utilizando una pipeta estril
(vase el numeral 6.8), transfiera a cada caja 1 ml de la muestra de ensayo, si el producto es
lquido o 1 ml de la suspensin inicial en el caso de otros productos.

Tome otras dos cajas de Petri estriles. Utilizando una pipeta estril nueva, transfiera a cada
caja 1 ml de la primera dilucin decimal (10
-1
) de la muestra de ensayo, si el producto es lquido
o 1 ml de la primera dilucin decimal de la suspensin inicial (10
-2
) en el caso de otros
productos.

Repita el procedimiento descrito con las diluciones adicionales, utilizando una pipeta estril
nueva para cada dilucin.

9.3.2 Vierta en cada caja de Petri aproximadamente 10 ml del medio de violeta rojo bilis
glucosa (vase el numeral 5.2.1) el cual se ha preparado y luego enfriado hasta 44 C a 47 C en
el bao de agua o mara (vase el numeral 6.4). El tiempo transcurrido entre la inoculacin de las
cajas de Petri y el momento en que el medio se vierte en las cajas no debe exceder 15 min.


8
Mezcle cuidadosamente el inculo con el medio mediante movimientos horizontales y permita
que el medio se solidifique, con las cajas de Petri en reposo sobre una superficie fra.

9.3.3 Despus de terminar la solidificacin de la mezcla, aada una capa de cubierta de
aproximadamente 15 ml del medio de violeta rojo bilis glucosa (vase el numeral 5.2.1),
preparado y luego enfriado tal como se describe en el numeral 9.3.2, para evitar el crecimiento
disperso y lograr condiciones semianaerbicas. Permita que se solidifique tal como se describi
anteriormente.

9.3.4 Invierta las cajas preparadas e incbelas en la incubadora (vase el numeral 6.2)
ajustada en 37 C durante 24 h 2 h.

9.4 RECUENTO Y SELECCIN DE LAS COLONIAS PARA LA CONFIRMACIN

Las colonias caractersticas son de color rosa a rojo o prpura (con o sin halos de
precipitacin).

Seleccione las cajas (vase el numeral 9.3.4) que contengan menos de 150 colonias
caractersticas, cuente estas colonias. Despus seleccione al azar cinco de tales colonias para
subcultivo (vase el numeral 9.5) para los ensayos de confirmacin bioqumica (vase el
numeral 9.6).

Considere el anlisis nulo, si la mitad o ms de la mitad del rea superficial de una caja tienen
exceso de crecimiento. Si menos de la mitad de la superficie de la caja tiene exceso de
crecimiento, cuente las colonias en la parte transparente y extrapole de tal manera que el
nmero corresponda al rea superficial total de la caja.

Algunas enterobacterias pueden ocasionar decoloracin de sus colonias o del medio. Por lo
tanto, cuando no estn presentes colonias caractersticas, seleccione cinco colonias
amarillentas para la confirmacin.

9.5 SUBCULTIVO DE LAS COLONIAS SELECCIONADAS

Siembre en las cajas de agar nutritivo (vase el numeral 5.2.2) cada una de las colonias
seleccionadas para la confirmacin (vase el numeral 9.4.).

Incube estas cajas a 37 C durante 24 h 2 h.

Seleccione una colonia bien aislada de cada una de las cajas incubadas para los ensayos de
confirmacin bioqumica (vase el numeral 9.6).

9.6 ENSAYOS DE CONFIRMACIN BIOQUMICA

9.6.1 Reaccin de oxidasa

Utilizando un asa redonda o un asa recta (vase el numeral 6.7), tome una porcin de cada
una de las colonias bien aisladas (vase el numeral 9.5) y siembre sobre papel filtro
humedecido con el reactivo de oxidasa (vase el numeral 5.3) o sobre un disco de los que se
encuentran en el comercio. No se debe utilizar un asa ni de alambre de nquel/cromo (utilizar
asas desechables plsticas).

El ensayo se considera negativo si el color del papel filtro no se torna oscuro en un lapso de 10 s.


9
Consulte las instrucciones del fabricante para la utilizacin de las tiras o los discos listos para
usar.

9.6.2 Ensayo de fermentacin

Utilizando un asa (vase el numeral 6.7), introduzca las mismas colonias seleccionadas en el
numeral 9.5 que dieron un ensayo negativo para oxidasa en tubos que contenga agar de
glucosa (vase el numeral 5.2.3).

Incube estos tubos a 37 C durante 24 h 2 h.

Si se presenta color amarillo en todo el contenido del tubo, considere la reaccin como positiva.

9.6.3 Interpretacin de los ensayos bioqumicos

Las colonias que son negativas para oxidasa y positivas para glucosa se confirman como
enterobacterias.

10. EXPRESIN DE RESULTADOS

10.1 TUBOS POSITIVOS CONFIRMADOS

Vase la NTC 4092.

11. INFORME DE ENSAYO

El informe de ensayo debe especificar:

- toda la informacin necesaria para la identificacin completa de la muestra;

- el mtodo de muestreo utilizado, si se conoce;

- el mtodo de ensayo utilizado, con referencia a esta norma;

- la temperatura de incubacin utilizada;

- todos los detalles operativos que no se especifican en sta norma o que se consideran
opcionales, junto con los detalles de todos los incidentes que pueden haber tenido
influencia en los resultados de ensayo;

- los resultados de ensayo obtenidos.


10
ANEXO A
(Normativo)

LMITES DE CONFIANZA PARA LA ESTIMACIN DE CANTIDADES
PEQUEAS DE COLONIAS

Los lmites de confianza en el nivel de 95 % para la estimacin de cantidades pequeas,
cuando la cantidad de colonias retenidas es inferior a 15, se indican en la Tabla A.1.

Tabla A.1. Lmites de confianza para la estimacin de cantidades pequeas de colonias

Lmites de confianza en el nivel de 95%
Nmero de microorganismos
Inferior Superior
1 < 1 2
2 < 1 4
3 < 1 5
4 1 6
5 2 9
6 2 10
7 2 12
8 3 13
9 4 14
10 4 16
11 5 18
12 6 19
13 7 20
14 7 21
15 8 23


11
BIBLIOGRAFA

[1] Cowell N.D. and Morisetti M.D. J.Sci. Fd. Agric., 20, 1969, p.573.


12
DOCUMENTO DE REFERENCIA

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology of food and
animal feeding stuffs. Horizontal Methods for the Detection and Enumeration of
Enterobacteriaceae. Part 2: Colony. Count Method. Geneva: ISO, 2004, 10 p (ISO 21528-
2:2004 (E)).

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