BILIRRUBINA

Mtodo colorimtrico direto (Jendrassik-Grof) para a determinao de Bilirrubina direta e

total em sangue e outros lquidos biolgicos.
Somente para uso in vitro

Art. 1721 100 Determinaes
FUNDAMENTO DO MTODO
A bilirrubina reage especificamente com cido sulfanlico diazotado, produzindo um pigmento vermelho (azobilirrubina)
que se mede a 530 nm.
A bilirrubina conjugada (direta) reage diretamente com o diazoreativo. Para se obter a reao de toda a bilirrubina
presente (total) emprega-se um revelador aquoso de benzoato de cafena.

REATIVOS FORNECIDOS
Padro de Bilirrubina: 01 frasco contendo 500 g de bilirrubina purssima segundo normas A.A.C.C.
Podem ser realizadas 3 curvas de calibrao, abrangendo valores baixos e altos (at 10 mg/dL). Tem um coeficiente
de absoro molar de 60.700 1.600 a 453 nm e 25C.
Revelador: 01 frasco contendo 240 mL de soluo aquosa de benzoato de cafena 0,13 mol/L, tamponada e
estabilizada.
Reativo sulfanlico: 100 mL de soluo de cido sulfanlico 29 mmol/L em HCI 0,17 mol/L.
Nitrito de Sdio: 4 mL de soluo estabilizada de nitrito de sdio 0,07 mol/L.
Os reativos so estveis temperatura ambiente at a data de validade indicada na embalagem.

PRECAUES E CUIDADOS ESPECIAIS
Os cuidados habituais de segurana devem ser aplicados na manipulao de reagentes.

AMOSTRA
Usar soro fresco livre de hemlise. Proteger a amostra da luz natural ou artificial, envolvendo o tubo com papel preto.
Se no for possvel realizar puno venosa, pode-se fazer determinaes com sangue capilar.
Separar o soro dentro das 2 horas da extrao e efetuar a determinao imediatamente. Se isso no for possvel, o
soro pode conservar-se at 48 horas refrigerado e protegido de luz e o sangue total no mais de 24 horas em geladeira
ou 12 horas temperatura ambiente.

INTERFERNCIAS
Valores de hemoglobina abaixo de 100mg/dL no produzem interferncia significativa.
Valores de hemoglobina acima de igual ou maior que 100mg/dL produz resultados falsamente elevados na
determinao de bilirrubina total e falsamente diminudos na determinao da bilirrubina direta.

PREPARAO DOS REATIVOS
Padro 10 mg/dL: abrir o frasco , adicionar 5 mL de gua destilada e fechar. Agitar vrias vezes durante um
tempo mnimo de 30 minutos, at dissoluo completa da bilirrubina. Aps a reconstituio, o padro estvel por at
6 horas temperatura ambiente e protegido da luz.
Diazo-reativo: preparar no momento do uso adicionando uma gota (50 L) de nitrito () para cada 1,5 mL de Reativo
Sulfanlico (). Estvel por at 6 horas aps a preparao.

PROCEDIMENTO PARA CURVA DE CALIBRAO
Em 6 tubos de ensaio marcados 1, B1, 2, B2, 3, B3 colocar:
Tubo 1 B1 2 B2 3 B3
Pad. 0,1 0,1 0,2 0,2 0,5 0,5
Rvo. 6,4 - 6,3 - 6,0 -
gua - 6,4 - 6,3 - 6,0
Diazo 0,5 - 0,5 - 0,5 -
Rvo. - 0,5 - 0,5 - 0,5
Misturar imediatamente cada tubo, por inverso. Aps 5 minutos ler em espectrofotmetro a 530 nm ou em
fotocolormetro com filtro verde, zerando o aparelho com gua destilada.
A cor estvel por 15 minutos.
Clculos
Tubo 1 B1 2 B2 3 B3
C(mg/dL) 2,0 - 4,0 - 10,0 -
ABS
ABS corrig. - - -
Anotar as leituras na linha ABS. Diminuir das leituras dos tubos 1, 2 e 3 os brancos correspondentes (B1, B2 e B3
respectivamente) e anotar os resultados na linha ABS corrigida. Com estes valores construir um grfico da maneira
usual colocando no eixo vertical os valores de ABS corrigida e no eixo horizontal as concentraes de bilirrubina em
mg/dL.
A reao segue a lei de Beer, o que permite calcular um fator para cada tubo, dividindo a concentrao em mg/dL pela
ABS corrigida:
Fator = Conc. mg/dL
ABS corrig.
Em seguida calcular a mdia dos fatores obtidos nos tubos 1, 2 e 3.




PROCEDIMENTO
Em trs tubos marcados B (Branco), D (Direta) e T (Total) colocar:
B D T
Soro 200 L 200 L 200 L
gua 2,4 mL 2,4 mL -
Rvo. - - 2,4 mL
Rvo. 0,2 mL - -
Diazo-reat. - 0,2 mL 0,2 mL
Imediatamente aps a adio do diazo-reativo misturar cada tubo por inverso.
Aos 5 minutos ler os tubos em espectrofotmetro a 530 nm ou fotocolormetro com filtro verde, zerando o aparelho com
o Branco.
As leituras podem ser realizadas entre 4 e 15 minutos, exceto a Bilirrubina Direta, que deve ser lida aps 5 minutos
exatos, pois neste tempo os valores se correspondem com as determinaes realizadas pelo mtodo de partio entre
solventes. Se a leitura for efetuada antes, os valores resultantes sero baixos devido reao incompleta. Se a leitura
for efetuada depois, sero altos, pois comear reagir a Bilirrubina Livre.


CLCULOS
Bilirrubina Total (mg/dL) = T x f
Bilirrubina Direta (mg/dL) = D x f
Bilirrubina Indireta = Bilirrubina Total - Bilirrubina Direta

LINEARIDADE
A reao linear at 15,0 mg/dL.


Quantidade de amostra a usar / Soro Ictrico
Com soro ictrico empregar menores quantidades de amostra de acordo com o seguinte esquema:

Normal ou leve Moderada Intensa
Soro 200 L 50 L 20 L
Rvo. ou gua 2,4mL 2,5mL 2,6mL
Resultado - x4 x10


TCNICA NO LQUIDO AMNITICO
Determina-se a Bilirrubina total em dois tubos marcados B e T, colocando-se:
B T
Lquido amnitico 2,5mL 2,5mL
gua 4,0mL -
Rvo. - 4,0mL
Rvo. 0,5mL -
Diazo-reativo - 0,5mL

Proceda da mesma forma que na Tcnica, utilizando o mesmo fator colorimtrico para os clculos. Dividir o resultado
final por 5.

VALORES DE REFERNCIA
Soro
Direta (conjugada) at 0,2mg/dL
Total at 1,0 mg/dL

Lquido Amnitico
A determinao no lquido amnitico de importncia fundamental no diagnstico pr-natal da enfermidade hemoltica
"in vitro". Valores menores que 0,1 mg/dL so considerados normais enquanto que entre 0,1 e 0,27 mg/dL sugerem a
possibilidade de comprometimento fetal. Os nveis acima de 0,27 mg/dL se encontram somente em presena de
eritroblastose fetal. Se a quantidade de bilirrubina superior a 0,47mg/dL pode indicar uma falha circulatria. Se a
quantidade de bilirrubina ultrapassa 0,95 mg/dL a morte fetal eminente.


OBSERVAES
Sob ao da luz tanto os soros como a soluo padro pode ter os valores de bilirrubina diminudos em
aproximadamente 50% em uma hora.
Hemlise ligeira no interfere, mas quando a hemlise moderada ou intensa, a reao direta se inibe e a
bilirrubina total mostra valores artificialmente elevados.
Para dosagem em soro de recm-nascidos utilizar a tcnica para o soro ictrico.





CARACTERSTICAS DO DESEMPENHO
Repetitividade Impreciso intra-ensaio
N Mdia DP CV %
Amostra 01 20 0,36 0,02 5,61
Amostra 02 20 0,83 0,02 5,31

Reprodutibilidade
N Mdia DP CV %
Amostra 01 20 1,41 0,018 1,28
Amostra 02 20 6,46 0,065 1,00

Sensibilidade Metodolgica
Uma amostra protica contendo bilirrubina foi utilizada para calcular o limite de deteco do ensaio tendo sido
encontrado um valor de 0,33mg para bilirrubina total, equivale mdia de 20 ensaios mais dois desvios padro.

SIGNIFICADO CLNICO
A determinao da bilirrubina total fraes importante indicador de hepatopatias e de quadros hemolticos, em
particular, na avaliao da ictercia do recm-nascido. Alm da eritroblastose fetal, outras causas de ictercia no recm-
nascido incluem: ictercia fisiolgica, reabsoro de hematoma, hipotiroidismo, obstruo das vias biliares,
galactosemia, sfilis, toxoplasmose, citomegalia, rubola, deficincia de Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD),
esferocitose.

REFERNCIAS
1.Jendrassik, L. & Grof, P. - Biochem. Z., 297:81-9, 1938.
2.Doumas, B.T., Kwok-Cheung, P.P., Perry, B.W., et al - Clin. Chem., 31:1779-89, 1985.
3.Brazie, J.V., Ibbott, F.A., & Bowers, W.A. - J. Pediatr., 69:354-358, 1966.
4.Kaplan, L.A. & Pesce, A.J. - Clinical chemistry: theory, analysis and correlation. 2a. ed., The CV Mosby Co., 1989.































































































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