UNIVERSIDAD SAN MARTIN DE PORRES

FACULTAD DE ODONTOLOGA
ASIGNATURA DE MICROBIOLOGA
PRCTICA N 02
COLORANTES Y COLORACIONES
POR: FREDDY A. MANAYAY
LLAGUENTO



I. COMPETENCIAS
Interpretar el fundamento de las coloraciones en la prctica microbiolgica bajo el soporte
de la base terica y qumica de los procedimientos de tincin diferencial.
Comprender la base qumica de la tincin de Gram.
Comprender el procedimiento para diferenciar entre dos grupos principales de
bacterias: Gram-positivas y Gram-negativas.
II. INTRODUCCIN.
as c!lulas en su estado natural" son casi invisibles al microscopio convencional. #na manera de
$acerlas visibles es te%irlas con colorantes orgnicos selectivos. & principios del siglo 'I' la
demanda de colorantes te(tiles" produjo un periodo f!rtil para la qumica orgnica. )e observ que
algunos colorantes te%an los tejidos biolgicos y que sorprendentemente" a menudo mostraban una
preferencia por determinados componentes de la c!lula" el n*cleo o las membranas" $aciendo
visibles estas estructuras internas. +n la actualidad disponemos de una rica variedad de colorantes
orgnicos" que presentan una afinidad especfica por ciertos componentes celulares.
+n general" las bacterias y otros microorganismos son transparentes" por eso para distinguirlos del
medio es necesario $acer una coloracin ,tinciones simples-" las cuales tambi!n sirven para
contrastar o real.ar distintas caractersticas morfolgicas o estructurales ,tinciones diferenciales-.
a mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica
por alg*n componente celular. +(isten varios tipos de colorantes" pero los ms usados en
microbiologa son: las sales colorantes y los colorantes liposolubles
Los colorantes" son sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos.
La Coloracin" es el proceso mediante el cual un cuerpo es te%ido por una sustancia colorante" sin
perder el color cuando es lavado con el disolvente utili.ado al preparar la solucin colorante.
os colorantes se comportan como compuestos cidos o bsicos y tiene la tendencia de formar
uniones electrostticas con los radicales ioni.ables de los tejidos.
Clasificacin de los colorantes:
a) Sales colorantes:
os colorantes ms com*nmente usados son sales que pueden ser de tipo cido o bsico"
t!rminos que no indican necesariamente su p/ en solucin" sino que una parte significativa de la
mol!cula sea aninica o catinica.
os colorantes bsicos consisten en un catin coloreado unido a un anin incoloro.
+j: clor$idrato ,-- de a.ul de metileno ,0-.
os colorantes cidos tienen el catin incoloro unido a un anin coloreado.
+j: eosinato ,-- de sodio ,0-.
os colorantes se combinan qumicamente con el protoplasma bacteriano1 si la c!lula no $a
muerto" el proceso de tincin la mata.
a c!lula bacteriana posee constituyentes celulares cargados negativamente" tales como los
cidos nucleicos y los polisacridos cidos" y ellos son los ms usados en citologa bacteriana.
as bacterias son ricas en cidos nucleicos que poseen cargas negativas en forma de grupos
fosfatos. os colorantes bsicos ti%en la c!lula bacteriana uniformemente" a menos que antes sea
destruido el &23 del citoplasma.
os colorantes cidos no ti%en la c!lula bacteriana" y por lo tanto" pueden usarse para impartir al
fondo un color de contraste ,coloracin negativa-.
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4esde el punto de vista prctico entonces" los colorantes bsicos ti%en estructuras de naturale.a
cida" como la cromatina nuclear de las c!lulas eucariotas y procariotas1 los colorantes cidos
reaccionan con sustancias bsicas" como las estructuras citoplasmticas de las c!lulas eucariotas.
b) Colorantes liposolubles
os colorantes liposolubles se combinan con los componentes lipdicos de la c!lula" usndose a
menudo para revelar la locali.acin de los depsitos de grasa. +j. 3egro )udn.
+n algunos casos se usan mordientes con la finalidad de engrosar estructuras muy finas" con
el propsito de $acerlas visibles al microscopio ptico1 uno de ellos es el cido tnico que se emplea
en la coloracin de flagelos y espiroquetas.

TCNICAS PARA REALIZAR NA PREPARACI!N C"L"REA#A
#na preparacin coloreada e(ige la sucesin de tres pasos: preparacin del e(tendido" fijacin y
coloracin.
$%& Preparacin del e'tendido
4ebe utili.arse un portaobjetos limpio y desengrasado.
)i el cultivo proviene de un medio lquido" se transfiere con ansa una gota del mismo y se e(tiende
$asta formar una fina pelcula que cubra el centro del portaobjetos.
)i el cultivo proviene de un medio slido" se procede as de la siguiente manera:
Con pipeta o ansa se coloca una gota de agua en el centro del portaobjetos.
)e quema el e(ceso de cultivo que queda en el ansa" se deja enfriar y luego se e(tiende la
suspensin bacteriana $asta formar una fina pelcula sobre el portaobjetos sin tocar los
bordes.
+sperar $asta que el lquido se evapore o bien acelerar el proceso acercando el
portaobjteto al aire caliente de la llama del mec$ero.
(%& )i*acin
+ste segundo paso se efect*a para que los microorganismos queden ad$eridos al vidrio y
no se desprendan del portaobjetos con los lavados a los que $ay que someterlos
posteriormente.
a fijacin coagula las sustancias proteicas de las c!lulas" lo cual $ace que los
microorganismos queden pegados al portaobjetos. Con este procedimiento no mueren todas las
bacterias.
+(isten dos tipos de fijacin: con calor ,o m!todo de 5oc$- y fijacin qumica.
+,todo -oc.
+l procedimiento ideado por 5oc$ consiste en pasar lentamente el preparado por la llama del
mec$ero 6 veces seguidas" con la precaucin de llevar el e(tendido $acia arriba. +l inconveniente
de este m!todo es que los microorganismos pueden deformarse demasiado si el calentamiento
resulta e(cesivo. 4espu!s del procedimiento" el portaobjetos debe notarse caliente pero no debe
quemar cuando se coloca en la parte posterior de la mano.
)i*acin /u01ica
a coagulacin del protoplasma microbiano con sustancias qumicas es lo ideal pues las c!lulas no
resultan deformadas. +(isten varios m!todos:
- )e inunda el preparado con alco$ol metlico" se deja actuar 6 minutos y se lava con agua. +s el
ms usado.
- Idem con formalina al 7 8 ,v9v-.
- )e inunda el e(tendido con licor de /offman ,partes iguales de etanol absoluto y !ter sulf*rico- y
se deja actuar $asta su evaporacin completa.
2%& Coloracin
+n este paso se $acen actuar sobre el preparado ya fijado las soluciones de colorantes de
acuerdo al m!todo de tincin que se realice.
TIP"S #E TINCI"NES
:ara la observacin microscpica e(isten diferentes tipos de coloraciones seg*n las caractersticas
morfolgicas o estructuras que quieran ponerse de manifiesto. )e clasifican en simples y
compuestas.
TINCI!N SI+PLE
)e entiende por tincin ,o coloracin- simple al te%ido de los microorganismos aplicando slo
una solucin colorante. +ste tipo de tinciones pueden ser positivas o negativas.
a coloracin positiva es la tincin de los microorganismos" efectuada con colorantes bsicos que"
como ya dijimos" poseen afinidad por los constituyentes celulares y se combinan qumicamente con
el citoplasma microbiano.
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T,cnica: a coloracin consiste en cubrir el frotis" despu!s de fijado" con la solucin colorante y
se deja actuar el tiempo preciso. uego se lava con agua y se deja secar.
Con fucsina bsica: se diluye ;9;< la solucin de uso ,fucsina fenicada de =ie$l- y se
deja actuar 6< a >< segundos.
Con violeta de genciana: se diluye al ;9;< la solucin de uso y se deja actuar 6< a ><
segundos.
Con a.ul de metileno: se cubre el preparado con la solucin de uso ,a.ul de metileno
alcalino de oeffler- sin diluir y se deja actuar 6 a 7 minutos.
+l a.ul de metileno es el colorante ms d!bil de los tres" ra.n por la cual se usa ms concentrado y
se deja actuar durante ms tiempo. ?ambi!n a la solucin de a.ul de metileno de uso se le agrega
un lcali ,5@/- como intensificante" que act*a $aciendo ms rpida e intensa la reaccin de
coloracin. Generalmente como intensificante se usa un lcali para un colorante bsico y un cido
para un colorante cido. 4ebido a que el protoplasma bacteriano tiene una d!bil carga negativa
que aumenta al aumentar el p/" se e(plica que en medios alcalinos las coloraciones de bacterias
se $agan ms intensas.
+n la coloracin negativa los microorganismos quedan sin te%ir y se colorea el medio que los rodea.
:or lo tanto" lo que se ve es el perfil de las c!lulas.
a sustancia usada para la tincin negativa es un colorante opaco que no tiene afinidad por
los constituyentes celulares y que simplemente rodea a las c!lulas" tal como:
?inta c$ina ,suspensin de partculas de Carbono coloidal demasiado grandes como para
penetrar en la bacteria-
Colorantes cidos ,no poseen afinidad por los constituyentes celulares-. +l ms utili.ado es
la nigrosina dado que ofrece un mayor contraste por ser negro.
a coloracin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de los
microorganismos en microscopa ptica" pero su m(ima utilidad est en revelar estructuras
como cpsulas tanto bacterianas como de levaduras" esporas que se observan como
cuerpos refringentes y espiroquetas que" por su peque%o dimetro transversal" resulta difcil
ponerlas en evidencia.
T,cnica: A!todo de Burri ,con tinta c$ina o nigrosina-. )e coloca en un e(tremo del portaobjetos
una gota de tinta c$ina o nigrosina y otra de la suspensin microbiana y se me.clan bien con el
ansa. uego" con otro porta se apoya sobre la me.cla y se $ace un e(tendido a lo largo del porta.
Con este procedimiento el espesor del frotis vadisminuyendo a medida que se e(tiende" con lo cual
se conseguir una .ona donde el contraste sea el adecuado. )e deja secar bien y se observa
con el objetivo de inmersin.
TINCI!N C"+PESTA 3" #I)ERENCIAL)
&unque e(isten m*ltiples tipos de tinciones" aqu vamos a referirnos a los dos m!todos de
coloracin compuesta ms com*nmente empleados en la prctica corriente del laboratorio de
microbiologa: la tincin de Gram y la de =ie$l-3eelsen. +stas coloraciones permiten
diferenciar las bacterias incluso cuando tienen igual forma y tama%o" por esta ra.n es una
Ctincin diferencialD.
?I3CIE3 4+ G2&A
+laborada por /ans C$ristian Gram en ;FFG" es la ms empleada en bacteriologa.
as etapas a seguir se detallan en la ?abla ;.
&unque no totalmente aclarada" la propiedad de la grampositividad depende de la naturale.a
y composicin qumica de la pared o parte de ella. )e $an propuesto varias teoras para su
e(plicacin" pero la ms aceptada es la que sostiene que las bacterias gramnegativas son ms
permeables al alco$ol debido a su alto contenido en lpidos.
Cuando la bacteria se ti%e con el complejo colorante bsico-mordiente" !ste queda atrapado
en las bacterias grampositivas y no puede ser arrastrado por el decolorante a causa de la
naturale.a fsico-qumica de su pared. :or el contrario" en las gramnegativas es arrastrado
debido a su alto contenido lipdico.
III. MATERIALES Y MTODOS
MATERIALES
+uestras: Cultivos de HG $oras en agar nutritivo en tubo inclinado de +sc$eric$ia coli" Aicrococcus
luteus" Bacillus megaterium y2$odospirillum rubrum o muestras de saliva" sarro dentario.
Reacti4os: Cristal violeta" Iodo de Gram" &lco$ol +tlico J78" )afranina.
E/uipos 5 1ateriales:
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Aec$ero de alco$ol" asa de siembra" cubeta de tincin" portaobjetos" papel de absorcin" papel de
lentes" y microscopio.
PROCEDIMIENTO
;. @btenga ; portaobjeto limpio.
H. :repare un frotis de cada uno de las muestras. :ara preparar los frotis se sigue el siguiente
procedimiento:
a. Colocar una peque%a gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. +s necesaria muy
poca cantidad de agua" por lo que se puede usar el asa de siembra" ya que en el e(tremo curvo de su
filamento queda retenida una mnima gota de agua" que es suficiente.
b. Klamear el asa de siembra y dejar enfriar. ?omar" en condiciones as!pticas" una peque%a cantidad de
muestra y transferirlo a la gota de agua. 2emover la me.cla con el asa de siembra $asta formar una
suspensin $omog!nea que quede bastante e(tendida para facilitar su secado. 3ota: )i la muestra se
toma de una muestra lquida" no es necesario reali.ar los dos primeros pasos ya que basta con
colocar y e(tender una gota de la suspensin bacteriana" que se toma con el asa de siembra"
directamente sobre el portaobjetos.
c. +sperar $asta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando el portaobjetos
a la llama del mec$ero. +n este caso $ay que tener muc$a precaucin de no calentar demasiado el
portaobjetos pues las c!lulas pueden deformarse o romperse.
6. :ermita que los frotis se sequen al aire y luego fjelos con calor.
G. ?i%a con cristal violeta agregando suficiente colorante y deje que act*e durante ; minuto.
7. ave suavemente con agua.
>. Inunde suavemente con el mordiente" yodo de Gram" y deje actuar durante ; minuto.
L. ave suavemente con agua.
F. 4ecolore con alco$ol etlico al J78. 3ota: no sobredecolore" agregue el alco$ol gota a gota $asta
que este salga casi claro" solo ligeramente a.ul.
J. ave suavemente con agua.
;<. &gregue la safranina para la tincin de contraste.
;;. ave suavemente con agua.
;H. )eque la preparacin.
;6. +(amine al microscopio con el objetivo ;<<' de inmersin de aceite.
IV. RESULTADOS Y DISCUSIN
V. CONCLUSIONES.
CUESTIONARIO
$% Indique cules son los componentes de los reactivos de la coloracin G2&A y como se prepara.
(% MCules son las fuentes de errores ms comunes en la tincin de GramN
2% e(plique qu! reaccin de Gram darn las levaduras. +stos tendrn la misma importancia que
para la bacteriasN
6% e(plique el fundamento de la tincin negativa" en la prctica que tipo de informacin se obtieneN
7% Investigue otra t!cnica de ?incin selectiva que permita observar otras estructuras bacterianas.
8% M& qu! se debe el distinto comportamiento de las bacterias seg*n sean Gram positivas o Gram
negativasN
9% M:ara qu! se necesita el aceite de inmersinN
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VI. REFERENCIAS
Aanual :rctico de Aicrobiologa. 2. 4a." y colaboradores" Haedicin. +d. Aasson" Barcelona"
;JJJ
- Korbes" B. &.- )a$m 4. K. O Peissfeld &. ). Bailey y )cott" 4iagnstico Aicrobiolgico" ;;Q +dicin.
+ditorial A!dico :anamericana. H<<G
VII. ANEXO.
Tabla 1 Etapas en la tincin de Gram
Pasos Mtodo GRAM POSITIVA GRAM NEGATIVA
Colorante bsico Rioleta de genciana ,luego de 6< seg.
se lava con agua el
e(ceso de colorante-
)e ti%e de violeta )e ti%e de violeta
Aordiente ugol ,pasado ; min. se lava con agua
el e(ceso de lugol-
:ermanece violeta :ermanece violeta
4ecoloracin &lco$ol de J78 o &lco$ol-acetona
,durante apro(. 6<
seg. y luego lavar con agua para
eliminar el resto de disolvente-
:ermanece violeta )e decolora
Contraste Kucsina o )afranina ,luego de 6< seg.
se lava con agua el e(ceso de
colorante-
:ermanece violeta )e ti%e de rosa
@bservar al
microscopios
Colocar sobre el frotis una gota de
aceite de inmersin.
Rioleta 2osa
5