CASTILLO PREZ ARMANDO ALBERTO BIOTE DE CULTIVOS BITACORA

PRACTICA 2 CULTIVO DE CLULAS EN SUSPENSIN ACTIVIDADES PREVIAS

1.- Qu funcin tiene el BAP?

2.- Qu es 24D?

Auxinas

Se denominan auxinas los compuestos caracterizados por su capacidad de
inducir elongacin en clulas de vstagos. La auxina natural de mayor distribucin es
el cido 3-indolactico (AIA), aun cuando el cido 4-cloroindol-3-actico ha sido
aislado de plantas superiores. En general este grupo de hormonas afecta otras
caractersticas fisiolgicas, adems de la elongacin, pero esta accin es considerada
crtica.





Son numerosos los ejemplos de auxinas sintticas utilizados en cultivo de
tejidos vegetales, fundamentalmente porque su accin es ms prolongada que la de
sus anlogos naturales y su costo inferior.

N
CH
2
H
COOH
Acido indol-3-actico
(AIA)
N
CH
2
H
COOH
Cl
Acido 4-cloroindol-3-actico
(4-Cl-AIA)
Auxinas naturales
N
CH
2
H
CH
2
CH
2
COOH
O CH
2
COOH
Cl Cl
Auxinas sintticas
Acido indol-3-butrico
(AIB)
Acido 2,4-diclorofenoxiactico
(2,4-D)
O CH
2
COOH
Cl Cl
Acido 2,4,5-triclorofenoxiactico
(2,4,5-T)
CH
2
COOH
Acido -naftalenactico
(ANA)
H
3
C
N
H
3
C
C
S
O CH
2
COOH
N,N-dimetiltiocarbamoilactico
Cl
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En el siguiente esquema puede observarse la similitud entre una auxina
natural, el cido indolactico (AIA) y su ms potente anlogo de sntesis el cido 2,4-
diclorofenoxiactico (2,4-D).



Esta comprobado que diferentes tejidos responden en forma distinta a iguales
concentraciones de una misma auxina habindose observado que la respuesta
depende de la edad y de su estado fisiolgico.
Al igual que la mayor parte de las hormonas vegetales las auxinas inducen una
gran diversidad de efectos fisiolgicos y entre los de mayor significacin cabe
mencionar:

Participacin en los perodos S y G1 del ciclo celular, promoviendo la
duplicacin
del ADN.
Aumento de la extensibilidad de la pared celular.
Participacin en la diferenciacin celular.
Estimulacin de foto y gravitropismos.
Estimulacin del desarrollo del fruto luego de la fecundacin.
Regulacin de la abscisin.
Participacin en el fenmeno de dominancia apical, etc.

Las auxinas causan una rpida extensibilidad de pared en coleoptilos y tallos
jvenes, si bien su accin no es directa sobre la pared sino intracelular o en
membranas plasmticas. La clula vegetal exporta factores que aumentan la
extensibilidad de la pared celular (WLF) en respuesta al AIA.
Se postula para el citado fenmeno un mecanismo denominado hiptesis del
crecimiento por acidez. El mismo seala que la clula secreta H
+
a las paredes
primarias por medio de una bomba ATPsica. El descenso del pH producido favorece
la accin hidroltica de enzimas que escinden uniones de polisacridos haciendo ms
laxa la estructura; la citada modificacin en la presin de la pared se opone a la
presin de turgencia por lo que se modifica el potencial de agua producindose el
ingreso de agua lo que permite un crecimiento hasta el 70% de su volumen original,
aparejado con el ingreso de electrolitos, fundamentalmente potasio. Las auxinas
O CH
2
C
Cl Cl
O
O
N
CH
2
H C
O
O

AIA
2,4-D
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seran tambin reguladoras del balance osmtico en razn de regir la concentracin
citoplasmtica de electrolitos.
Simultneamente las auxinas estimulan la sntesis de enzimas que intervienen
en la biosntesis de polisacridos de pared, lo que ocasiona un crecimiento
irreversible. Este proceso ocurre por medio de la activacin de protenas regulatorias
que migran del citosol al ncleo para unirse a sitios especficos en los genes
estimulando la transcripcin.
Se han identificado protenas que se unen a auxinas y no son necesariamente
receptores (ABP); se localizan principalmente sobre retculo endoplsmico y en la
parte exterior de la membrana plasmtica.
Mediante extensos screening se ha determinado que numerosos compuestos
de sntesis presentan actividad auxnica; los ms comunes son: cido 1-naftalen
actico (ANA), cido fenilactico, cido cis-cinmico, cido 2,4-diclorofenoxiactico
(2,4-D) y cido indolbutrico (IBA). Entre estos el ms utilizado es 2,4-D
fundamentalmente para promover el crecimiento de explantos en forma
indiferenciada.
Se han descubierto compuestos con actividad antiauxnica tanto naturales,
aislados de plantas superiores y hongos, como sintticos. Como es de suponer existe
relacin entre la estructura y la actividad antiauxnica, as por ejemplo 2,4-
dicloroanisol, anlogo de 2,4-D, inhibe el crecimiento de coleoptilos de avena.



Existen tambin compuestos naturales y de sntesis que inhiben el transporte
de auxinas como el llamado DPX 1840 cuyos efectos fisiolgicos contrarrestan a los de
auxinas y presentan sinergismo con etileno y cido abscico (ABA).
Se han establecido cuatro rutas diferentes para la sntesis de AIA a partir de L-
triptofano. La ms frecuente en plantas superiores involucra, en primer lugar la
desaminacin del aminocido por parte de triptofanoaminotransferasa para generar
cido indol-3-pirvico, la posterior descarboxilacin de ste genera indol-3-
acetaldehido por medio de la indolpirvicodescarboxilasa y la obtencin de AIA por
deshidrogenacin y oxidacin catalizada por la indolacetaldehidodeshidrogenasa NAD
dependiente y la indolacetaldehido oxidasa respectivamente. (Takahashi, 1986).


O
Cl
Cl
CH
2
COOH
O
Cl
Cl
CH
3
2,4-Dicloroanisol 2,4-Diclorofenoxiactico
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La auxina natural se metaboliza por dos rutas principales: el metabolismo
oxidativo o peroxidativo y la conjugacin con aminocidos y azcares.
El primero de ellos genera, como principal producto en plantas superiores, al
indol-3-aldehdo.
Como metabolitos mayoritarios de la segunda ruta se producen cido indol-3-
acetilasprtico y 1-(indol-3-acetyl)- -D-glucosa (Takahashi, 1986).




El rol que se atribuye a los compuestos conjugados de auxinas es variado, se
sugiere que sta es la forma de transporte de AIA, de almacenamiento, de reutilizacin
N
NH
2
COOH
H
N
H
COOH
cido indol-3-pirvico
N
H
C
H
O
indol-3-acetaldehido
N
H
COOH
IAA
O
N
H
COOH
N
COOH
H
O
N
OOH
COOH
N
H
O
NH
CHCOOH
CH
2
COOH
cido indol-3-acetilasprtico
N
O
N
O
H
H
N
CH
2
OH
H
N
COOH
H
N
OH
H
O
N
H
O
N
H
O
O
O
O
H
N
HOH
2
C
OH
OH
OH
1-(indol-3-acetil)- -D-glucosa
indol-3-aldehido
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, de proteccin frente a la degradacin enzimtica y de control homeosttico de la
concentracin de AIA en las plantas (Cohen, 1982).

Existen estudios que indican la mayor eficiencia de las auxinas sintticas como
el ANA o el IBA respecto del IAA. Esto puede deberse en el caso de NAA, que al no
poder ser degradado por la IAA-oxidasa y otras enzimas encargadas de la degradacin
del IAA, este permanezca ms tiempo en el tejido originando en consecuencia mejores
respuestas. Respecto de IBA se conoce que presenta gran actividad, an cuando es
metabolizado con rapidez para formar IBA-aspartato y otros conjugados, lo que
sugiri que es una manera de almacenamiento del IBA y que permite una liberacin
gradual del mismo, lo que mantiene las concentraciones adecuadas para el desarrollo
de los tejidos.

3.- Define Friabilidad

Una de las propiedades importantes del tejido calloso es la llamada friabilidad, esta se
puede definir, como la tendencia de las clulas a separarse unas de otras, por cual un
callo friable es aquel que se disgrega con facilidad. Desde el punto de vista
morfognico, la caracterstica ms importante del callo es la totipotencialidad de sus
clulas, ya que, en general, con un manejo adecuado de las condiciones nutricionales,
hormonales y ambientales, tienen la capacidad de desarrollar brotes, races, em-
briones, etc., los cuales pueden llegar a formar plntulas completas.

4.- Aumentar friabilidad

Uno de los usos principales del cultivo de callos es la obtencin de suspensiones
celulares. En muchos casos, para obtener suspensiones celulares finas, es adecuado
aumentar la friabilidad (callo disgregado y esponjoso) del tejido calloso por
incremento de la concentracin de la auxina o disminucin de la citoquinina en el
medio de crecimiento. Dependiendo de la especie utilizada el ciclo de subcultivo a
partir de callo es de 4 semanas de acuerdo con la especie. Callos con crecimientos ms
rpidos debern subcultivarse cada dos semanas para renovacin de las clulas. Para
crecimientos muy lentos no es conveniente demorar los subcultivos por ms de seis
semanas.

Son muchos los medios de cultivo utilizados en suspensiones celulares vegetales que
suministran los elementos esenciales para el desarrollo y mantenimiento celular. El
medio de cultivo ms utilizado es el medio MS; ste tiene altos niveles de nitrgeno
inorgnico y de sales minerales, mientras que otras formulaciones, como NN (Nietsch
et al., 1967) tienen niveles muy bajos de nitrgeno inorgnico y el medio White
(1943) tiene bajo contenido de sal. En general, hay una tendencia a usar niveles ms
bajos de NH4+ que de NO3- en medios para cultivos de tejidos vegetales. La cantidad
de NH4+ en el medio MS es casi la mitad que de NO3-, mientras otras formulaciones,
tales como SH (Schenk y Hildebrandt, 1972), B5 (Gamborg et al., 1968) y GD
(Gresshoff y Doy, 1974), contienen niveles an ms bajos de NH4+. La fuente de
carbono comnmente utilizada es la sacarosa en concentraciones de 3%, este azcar
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es fosforilado y luego forma un compuesto complejo con una molcula transportadora
que facilita su ingreso a la clula a travs de la membrana plasmtica (Vsquez y
Torres, 1995). La adicin de vitaminas mejora ostensiblemente el crecimiento de los
cultivos vegetales y las hormonas son necesarias para el alargamiento, crecimiento y
divisin celular.

Las suspensiones de cultivos celulares es un conjunto de clulas indiferenciadas en
forma libre o de agregados, distribuidos en medio de cultivo lquido homogneo en
constante agitacin, empleado para mantener y propagar las clulas vegetales. Entre
los usos de estas suspensiones se encuentra: estudios sobre el ciclo celular, estudios
fisiolgicos y bioqumicos, formacin de metabolitos secundarios, aislamiento de
mutantes y estudios de embriognesis somtica (Roca y Mroginski. 1991).
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Una suspensin celular se prepara transfiriendo pequeos segmentos de callo friable
a un medio de cultivo lquido agitado para su crecimiento y disgregacin, con una
buena biomasa celular activa y lo suficientemente abundante para alcanzar una buena
densidad celular. La agitacin es realizada mediante agitadores orbitales con el fin de
ayudar a la dispersin de las clulas y favorecer el intercambio gaseoso; las
velocidades que se manejan oscilan entre 30 y 150 r.p.m. dependiendo de la especie
vegetal y el volumen de operacin (Dixon, 1991).
Para la formacin de cultivos de clulas en suspensin normalmente es necesario un
inculo grande. Si el callo no es friable pocas clulas se desprendern del callo y el
tamao del inculo de clulas en suspensin puede no ser alcanzable. Cuando el nuevo
cultivo de clulas en suspensin ha alcanzado una densidad adecuada para
subcultivar, se remueve el material calloso no desprendido y los agregados celulares,
utilizando una jeringa estril, por filtracin, permitiendo que el material ms grande
se sedimente y tomando con una pipeta la parte superior del cultivo, o simplemente
vaciando directamente. Existe un tamao mnimo de inculo por debajo del cual las
suspensiones no reasumen fcilmente el crecimiento activo luego de la transferencia y
en algunos cultivos parte del crecimiento ocurre sobre la superficie de los pequeos
agregados. La densidad mnima de clulas requeridas para el cultivo en suspensin
depende de la rata de crecimiento y de la composicin del medio. Generalmente 10%
de la densidad celular inicial al volumen total del cultivo ser suficiente. La adicin de
medio en el cual la lnea celular ha estado creciendo previamente (medio
acondicionado) estimular el crecimiento de las suspensiones celulares a baja
densidad del inculo. La rata de crecimiento del cultivo a menudo se incrementar si
las clulas son transferidas antes de que el cultivo alcance la fase estacionaria.
(Franklin y Dixon, 1994).

Los mtodos ms utilizados para determinar la concentracin o el crecimiento de las
clulas vegetales en suspensin segn Roca y Mroginski (1991) son:
Numero de clulas: Es un parmetro de crecimiento de mucha utilidad en el
cual se realiza el conteo de clulas. Sin embargo, como las clulas vegetales
tienden a permanecer en agregados, es necesario separarlas tratndolas
previamente con trixido de cromo acuoso al 8% entre 2 y 15 min a 70 oC
pectinasa al 0.1% por 16 h a 25 oC.
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Volumen celular: Consiste en tomar un volumen conocido de suspensin en un
tubo cnico graduado, se centrifuga durante 3 minutos a 200 r.p.m y luego se
separa del filtrado. La concentracin se expresa como el volumen del pellet
por volumen de la muestra del cultivo.
Peso fresco: Sobre un papel de filtro previamente pesado se colocan las clulas
lavadas con agua destilada, se filtran al vaco y se pesan
Peso seco: Se procede de igual forma que para el peso fresco y posteriormente
se secan a 60o C durante 24 horas y se pesan nuevamente. Este mtodo no es
recomendable para pequeas cantidades de clulas.
Turbidez: Este mtodo aplica a suspensiones celulares que crecen en frascos
provistos de brazo lateral. El nmero de clulas es proporcional a la turbidez
del cultivo y esta se puede medir con un espectrofotmetro con filtro azul entre
longitudes de onda de 400-465nm.

Viabilidad celular: Son tcnicas utilizadas para determinar la viabilidad de las
clulas en cultivo. El mtodo ms empleado es la tincin con el azul de Evans,
mediante el cual se tien las clulas viables. Otras formas de tincin usan
diacetato de fluorocena o sales de tetrazolio, segn el protocolo establecido.
Indice Mittico (IM) Mtodo utilizado para determinar el nmero de ncleos en
mitosis por el total de clulas en el cultivo (IM = clulas.en.mitosis 100 ), el
total.de.clulas nmero mnimo de clulas analizadas debe ser de 100 .

5.- Mtodos de obtencin de Biomasa

Un proceso tipo para la obtencin de un producto obtenido por va biotecnolgica
suele constar de las siguientes etapas (Belter et a/., 1988):

Eliminacin de insolubles: bsicamente filtracin y centrifugacin como
operaciones unitarias, producen poca concentracin y mejora de la calidad del
producto.
Aislamiento de productos: etapa en la que se eliminan materiales de propiedades
muy distintas al producto de inters, y donde suele ocurrir una apreciable
concentracin y mejora de la calidad del producto.
Purificacin: donde mediante tcnicas altamente selectivas se separa el producto de
inters de productos de caractersticas fsico-qumicas similares.
Cristalizacin: etapa final para la obtencin de un slido de alta pureza.

En casos reales, como operaciones de separacin de la biomasa se pueden destacar:

1. Centrifugacin: operacin unitaria slido-lquido en la que un slido y un
lquido se separan por diferencias de densidad al aplicarles una fuerza
centrfuga. La separacin del slido y el lquido puede ser tipo sedimentacin al
campo centrfugo o tipo filtracin con filtros centrfugos.

2. Filtracin: operacin bsica en la que se separan slidos en suspensin en un
lquido haciendo pasar la mezcla por un poro que es capaz de retener el slido.
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3. Decantacin: con el mismo principio que la centrifugacin pero los slidos son
separados por diferencia de densidad con respecto al lquido sometidos
nicamente a la accin de la fuerza de la gravedad.

4. Dilisis: usada para la eliminacin de componentes de bajo peso molecular,
normalmente sales inorgnicas, se basa en las propiedades de una membrana
semipermeable que permite el paso a molculas de un determinado corte
molecular, siendo el transporte consecuencia de una diferencia de
concentracin a ambos lados de la membrana.

5. Ultrafiltracin:tambinbasadaenelusodeunamembranasemipermeableconunr
ango definido de corte molecular, aunque a diferencia de la dilisis implica el
uso de fuerza para favorecer el paso del lquido a travs de la membrana, ya
sea con presin, vaco o por fuerza gravitacional. Es una tcnica verstil cuyo
uso es aplicable desde escala de laboratorio a industrial. Las membranas de
ultrafiltracin deben ser estructuras slidas, rgidas y estables a la presin de
trabajo y adems tener el corte apropiado para la concentracin de la protena
de inters, es decir, lo ms cercano posible al peso de la protena pero
asegurando la completa recuperacin. Una tendencia conocida de las
membranas de ultrafiltracin es su capacidad de adsorber protena en la
superficie, especialmente las de celulosa, siendo recomendable el uso de
membranas de polisulfona cuya afinidad qumica por las protenas es mucho
menor. Otro efecto conocido en la ultrafiltracin es la disminucin del flujo a
travs de la membrana con el paso del tiempo, fenmeno causado por la
polarizacin de la membrana y que normalmente implica el lavado de las
membranas con soluciones limpiadoras de carcter alcalino, o tener agitacin
cerca de la membrana.

6. Liofilizacin: se trata de la evaporacin por sublimacin de la solucin
congelada conteniendo la protena de inters. El sistema se compone de un
recipiente adecuado, una trampa fra de condensacin y una bomba de vaco de
elevada capacidad. Normalmente, se recomienda una rpida congelacin para
favorecer la estabilidad de la protena, adems de intentar aumentar la relacin
superficie/volumen expuesto al vaco para aumentar la velocidad de
sublimacin. El gran inconveniente de esta tcnica es que no implica ningn
tipo de separacin excepto por lo que se refiere a compuestos voltiles, por lo
que las sales y otros componentes no voltiles permanecern en el slido y su
concentracin aumentar junto con la del producto de inters.





Metodologa

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Preparar Medio MS completo









Inoculacin del matraz

Preparar250mL de medio
MS completo
Agregar 50mL de medio
MS completo a 2 matraces
Erlenmeyer de 250mL
Agregar los reguladores
de crecimiento.
Ajuatar el pH entre 5.6 a
5.8
Adicionar las vitaminas
Etiquetar Matraz
Esterilizar el medio en el
autoclave a 121C durante
15 minutos.
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Bibliografa

H. E. Lee-Espinosa: J. Murgua-Gonzlez. Encapsulacin de embriones
somticos de laelia anceps ssp. Dawsonii para la produccin de semilla sinttica.
Universidad Veracruzana. Facultad de Ciencias Biolgicas-Agropecuarias. Revista
Chapingo Serie Horticultura. 17 de septiembre, 2009. Citado 20 de mayo del 2013.
Rey, Hebe Y.; Mroginski, Luis A. Semilla sinttica. Biotecnologa y Mejoramiento
Vegetal. Citado 20 de mayo del 2013. En lnea
http://www.biblioteca.org.ar/libros/150416.pdf
Fierros Romero Grisel. Crecimiento de las clulas de Nicotiana tabacum NT-1
en suspensin activado por insulina. Biologicas. Instituto de Investigaciones Qumico-
Biolgicas, Diciembre 2010. Citado [26-mayo-2013] En lnea.
http://www.biologicas.umich.mx/documentos/no12/diciembre/Dic-art3.pdf
Arias Mario. Aspectos ingenieriles del cultivo in vitro de clulas vegetales para
la produccin de metabolitos secundarios. Universidad Nacional de Colombia. Marzo
del 2009. Pp 109-121. En lnea http://www.redalyc.org/pdf/496/49611942011.pdf







A apartir de callos crecidos
anteriormente, se tom un callo en
condicines estriles.
Se inoculo cada matraz con el callo.
Se coloco en agitacin a 120rpm