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Biotechnologie : Terminologie introduite en 1913 Karl Ereky (Ingnieur agricole Hongrois)

Il voulait dvelopper la production agricole pour en faire une matire premire pour la
production industrielle de molcules par les mthodologies BIOCHIMIQUES naissantes
Mise en uvre de matriel biologique pour la production de biens et ou de services
Avantages des microorganismes :
Multiplication rapide -> bonne rentabilit des infrastructures
Se dveloppent sur des nutriments renouvelables
Grande diversit mtabolique : peuvent tre utilises pour produire beaucoup de molcules
Peuvent tre adapts des objectifs productivistes : slection, gnie gntique, transgnse
Peuvent produire des molcules trangres (clonage)
Facile cultiver, croissance rapide -> peu de risque de contamination
Facilit de purification des molcules produites
Production temprature modres (nergtiquement conome)
Historique
Mthodes ancestrale utilises depuis le dbut de lhumanit pour la fabrication de fromages, de pain et de
boissons alcoolises.
Pratiques empiriques magiques qui permettaient de conserver les aliments (fermentation, vinification)
Des microorganismes alors compltement mconnus taient luvre
Cette phase de proto-biotechnologie (empirique) a dur jusquau XIX sicle
Cest dire, lpoque pastorienne de la dcouverte des microorganismes et de leur caractrisation
Quelques points de repres :
Slection des espces vgtales et animales pratiques des lantiquit
Distillation XV me sicle
Culture des champignons XVII Sicle
Prparation industrielle du sucre de betterave (XVIIme sicle)
Prparation de molcules capacits pharmacologiques (XVII me sicle)
XVIII sicle essor de la chimie : Lavoisier (respiration, photosynthse fermentations) Chaptal (vinification)
Berzelius (la catalyse), purification de la premire diastase (amylase)
Pasteur : nature biologique de la fermentation et rle des microorganismes; pasteurisation
1876; dfinition dun enzyme : ferment isol dun organisme vivant
1883; Hause socit Carlsberg : dveloppement des cultures pures de levure
1888; cration de lInstitut Pasteur
1912 dcouverte des vitamines -> production industrielle par des microorganismes
1913 Premire prparation denzymes pour la lessive
1915 production de solvants par fermentation anarobie (explosifs)
1940-45 purification des antibiotiques (Fleming 1929, penicillium utiliss comme agent antibactrien des 1870)
1963 commercialisation des premires lessives aux enzymes
1972-74 les premiers OGM (clonage dexognes dans E. coli, vecteurs bactriens : virus et plasmides
1980 Premiers OGM dintrt industriel (production insuline, hormones de croissance, interfron)
1980-81 Transgnse vgtale (Plasmide Ti dAgrobacterium)
1987 Mas transgnique
1994 Tomates transgniques
etc
Procaryotes (anucles) : les bactries et les arches (archae)
Les microorganismes utiliss en biotechnologies sont principalement des champignons et des bactries
Exemple de procaryote : une bactrie frquente du
tube digestif de lHomme : Escherichia coli vue en
microscopie lectronique,
(Photo F. Sauvager / Universit Rennes).
Exemple de procaryote :
archobactrie thermoacidophile
(milieu chaud et fortement acide)
Acidianus ambivalens
Microorganismes
Organismes microscopiques souvent unicellulaires
Eucaryotes (nucles) : Champignons, algues, protozoaires
Exemple de protozoaire cili : la paramcie utilise
des cils pour se dplacer et se nourrir
Exemple de levure : Saccharomyces cerevisae
Elle est utilise dans la fabrication du pain, du vin
et de la bire
Exemple dalgues : leuglne
Les bactries sont classes selon :
G+C% : varie de 25 75%
Hybridation des acides nucliques : Cintique de rassociation des ADN dnaturs
provenant de 2 gnomes(avant squenage systmatique des gnomes complets)
donne une ide de % dhomologies entre gnomes.
Les bactries peuvent aussi tre classes selon :
Analyse phylogntique : tablir une parent entre les organismes et estimer leur temps de divergence
Arbres phylogntiques : reprsentation shmatique de la phylognse (Haekel 1866)
Squenage des gnomes
Etablissement darbre phylogntiques bas sur des donnes de squences.
Principe : Lapparition de mutations tant alatoire et spontane le nombre de mutations (diffrences
de squence) qui sparent deux espces mesure le temps qui sest coul depuis leur apparition partir
dune espce pr-existante unique.
Cette hypothse revient postuler lexistence dune cellule vivante originale unique quon appelle LUCA
pour : Last Universal Common Ancestor)
On raisonne en distance volutive : nombre de substitutions survenues dans les deux lignes depuis leur
divergence. Elle est, bien sur, fonction du temps.
Il faut choisir un gne universellement conserv : Systme de transcription, de traduction
LARN 16S a t choisi
Ses avantages : Prsent dans tous les organismes
Structure trs conserve
Abondant et facile purifier partir de ribosomes
Principes de la mthode
Aligner plusieurs squences du 16S ayant la mme origine et dnombrer les diffrences.
1 CGUAGACCUGAC (12 mer)
X X X 3 diffrences entre les squences; soit une distance volutive de 3/12 = 0,25
2 CCUAGACGUGUC
Si on analyse plus de deux squences (4 : A, B, C et D) on compare les squences 2 2
A-B = 0,3; A-C = 0,44; A-D = 0,61
B-C = 0,31; B-D = 0,46
C-D = 0,43
Puis on tente de construire larbre le plus vraissemblable.
Par exemple
C
B
A
D
0,08
0,23
0,08
0,29
0,13
0,01
Feuille
Branche
noeud
Anctre commun
Last Universal Common Ancestor (LUCA) (3,5-4 milliards dannes)
Chloroplastes
Mitochondries
(ascomycota)
Diversit du mtabolisme bactrien
Les bactries ont besoin dENERGIE pour se multiplier
Elles tirent leur nergie de lenvironnement
Elles utilisent soit le potentiel chimique des molcules disponibles (chimiotrophes)
soit lnergie lumineuse (phototrophes)
Elles se sont adaptes des environnements trs divers
Le potentiel chimique des molcules de lenvironnement (SH2) est transfr la cellule
grce des couples oxydo-rducteurs (exemple : A-AH2)
SH2 + A (oxyd) -> S (oxyd) + AH2 (rduit) + nergie
Chaque couple a un potentiel doxydo-)rduction qui dtermine le sens de la raction
Le couple qui a le potentiel le plus lev est oxydant ; il sera rduit lors de la raction.
red ox
Succinate / fumarate pot redox = +0,02 V
H2O / 1/2 O2 pot redox = 0,82 V
FADH2 / FAD pot redox = -0,20 V
H2 / H+ pot redox = 0
red ox red ox red ox red ox
FADH2 + Fumarate -> succinate + FAD succinate + 1/2 O2 -> H2O + fumarate
Les chaines doxydo rductions (transfert dlectrons) permettent la cellule de rcuprer lnergie
SH2
S AH2
A
BH2
B
C
CH2
NH2
N
Accepteur final
(donneur dlectrons)
Accepteur rduit
Rcupration de lnergie Couplage avec la machinerie de synthse dATP
Le potentiel chimique diminue progressivement
Les bactries utilisent lnergie chimique dun grand nombre de molcules minrales ou organiques
Le shma ci-dessus montre que les bactries ont galement besoin dun ACCEPTEUR final qui peut tre
loxygne ou une molcule minrale (lithotrophe) ou organiques (organotrophe).
Laccepteur peut tre intracellulaire (fermentation) ou extracellulaire (respiration). La respiration peut tre
anarobie si laccepteur nest pas loxygne (NO3
-
/NO2
-
; SO4
2-
/H2S; etc)
Les bactries ont galement besoin de MATIRE pour se multiplier (synthse de biomasse)
quelles peuvent puiser dans des molcules organiques (htrotrophe) ou minrale (autotrophe)
La source dnergie peut galement tre utilise comme source de matire. Cest le cas des bactries
Htrotrophes qui oxydent des molcules organiques qui leur fournissent galement carbone et azote.
Les bactries chimiotrophes ont besoin de sources de carbone distinctes de leur source dnergie (H2, H2S,
NH3 etc;)
Les bactries qui utilisent des sources dnergie minrales faible potentiel chimique ont en gnral un
mtabolisme nergtique de type arobie (rentabilit maximum de lnergie interne)
Quelques exemples de sources dnergie et daccepteurs finaux des chanes
doxydo-rduction
Bactries chimiotrophes utilisant une source dnergie minrale (non organique)
Bactries utilisatrice hydrogne
H2 est donneur dnergie, laccepteur dH est lOxygne, la source de carbone est le CO
2

H
2
+ 2O
2
+ CO
2
-> molcules organiques (biomasse) + H
2
O
Aquifex, Hydrogenobaculum
Bactries sulfureuses
Donneurs dnergie : H
2
S, S, S
2
O
3
-
, laccepteur de proton est O
2,
elle librent de lacide
sulfurique (SO
4
2-
), elle utilisent CO
2
comme source de carbone.
Beggiatoa, Thiotrix, Thiobacilles (trs corrosives : maladie de la pierre)
Bactries utilisant le Fer et le Manganse
Fe
2+
+ O
2
+ H+ -> Fe
3+
+ H
2
O
Sphaerotilus, Leptothrix, Thiobacillus
Sphaerotilus est utilis pour purer leau (elle est prsente dans les boues actives des
purateurs)
Gallionela prolifre dans les canalisations deau potable quelle peut boucher
Bactries nitrifiantes utilisant les nitrates
Elle utilisent NH
3
ou les nitrites NO
2
-
commes source dnergie et forment des nitrates
(NO
2
-3
) . Laccepteur dhydrogne est toujours O
2
et la source de carbone est le CO
2
.
Certaines transforment NH
3
en NO
2
-
(nitrites)
Bactries lithotrophes anarobies (laccepteur final dH est extracellulaire et nest pas lO
2
:
respiration anarobie)
Sources dnergie : H
2
S, sulfures, thiosulfates
Les accepteurs dH sont principalement : les nitrates, les sulfates te les carbonates.
Nitrates : NO
3
-

-> NO
2
-
NO ou N
2
E. coli,

Bacilli, Pseudomonas, peuvent avoir ce genre de mtabolisme en anarobie
Mais les vraies bactries dnitrifiantes assurant la dnitrification complte sont peu nombreuses
: Thiobacillus denitrificans
Sulfates : Desulfovibrio rduit SO
4
2-
(accepteur dH) en sulfures (S
2-
) puis en hydrogne sulfur (H
2
S)
Source dnergie : Carbone organique et aussi H
2
.
Carbonates : Bactries mthanognes. Methanobactrium, Methanobacillus, Methanococcus,
Methanosarcina
Bactries utilisant les molcules organiques comme sources dnergie et de carbone et lO
2

comme accepteur dH
2
. Elles librent du CO
2
(Organotrophes arobies)
Certaines comme Pseudomonas peuvent utiliser juqu 80 molcules diffrentes comme source
dnergie alors que Diplococcus glycinophilus nen utilise quune : le glycocolle.
Certaines bactries (Acetomonas, Acetobactre) noxydent pas compltement la molcule utilise
comme source dnergie. Elles librent de lacide actique et aussi de lacide fumarique, de lacide
citrique etc

Un grand nombre de bactries peuvent changer de mtabolisme suivant leur environnement :
des lithotrophes anarobies peuvent devenir organotrophes anarobies en prsence de certaines
molcules organiques
Certaines bactries utilisent des molcules organiques intracellulaires comme accepteur dH
2

Ce type de mtabolisme anarobie sappelle fermentation.
Il y a plusieurs types de fermentation dans differents types de cellules : fermentation alcoolique ( Ethanol),
homolactique, mixte, htrolactique, butyrique, actobutyrique, propionique
Toutes ces voies ncessitent
lintervention dun accepteur de
protons (NAD
+
/NADH+H
+
) qui
rduit laccepteur organique
final.
Mtabolites primaires
Biomasse
Mtabolites Primaires et Secondaires
Mtabolites secondaires
Un exemple de mtabolite primaire lthanol
Lalcool est produit par Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergiensis partir de sucres
assimilables : le glucose, le fructose, le saccharose (Glu (alpha 1-4) Fru), le maltose (Glu
(alpha 1-4) Glu), le maltotriose (Glu (alpha 1-4) Glu (alpha 1-4) Glu).
S. c. produit 0,51 g dthanol partir de 1g de glucose dans des conditions anarobies.
90% du glucose est transform en thanol et 10% sert faire de la biomasse.
Lalcool industriel : les biocarburants (voir cours Mme Buffard)
Alcool alimentaire : boissons alcoolises
Cest une mthode trs ancienne dj pratique plusieurs sicles avant notre re pour
conserver les aliments.
De nombreuses boissons sont fabriques partir de diffrents produits naturels
(essentiellement des produits agricoles) contenant des sucres ou des polysaccharides.
Le vin
La quasi totalit des vins sont obtenus partir des raisins produits par les nombreuses varits de
Vitis vitifera; on parle de cpages, il y en a environ 5000.
La nature dun vin est fonction du cpage, de la nature du sol, des conditions climatiques et du mode
de vinification
La fermentation des fruits est un phnomne spontan du la prsence de levure indignes leur
surface
Le jus de raisin qui a une teneur trs forte en sucre est un de ceux qui fermentent le plus facilement
La vinification consiste contrler le phnomne naturel. Les premiers exemples de domestication de la
vigne datent du IVme sicle avant JC en Grce, Egypte, Rome et en Gaule. Elle sest ensuite dveloppe
dans les rgions tempres
Origine tymologique : le sanscrit Vna qui dsignait un liquide sucr en Inde. La racine a t conserve
dans de nombreuses langues. Le vin a ses divinits : Bacchus (Rome), Dionysos (Grce).
La religion catholique a beaucoup oeuvre au maintien de la culture de la vigne dans les monastres.
XIX sicle; le philloxera (insecte qui sattaque au racines des plantes) a dcim les vignes europennes.
Les vignes actuelles sont des cpages europens grffs sur des portes greffes amricains (vitis ripana et
vitis rupestris).
Un des aspects de la vinification consiste prparer un mot contenant les lments ncessaires la confection
du vin tout en vitant dextraire les molcules lorigine de qualits organoleptiques indsirables
Les diffrentes structures du grains de raisin (pellicules, pulpe, ppins) contiennent des lments diffrents
Ppins : lments phnoliques qui participent la vinification des vins rouges et substances huileuses
indsirables
Pellicule : anthocyanes et composs volatiles responsables de la couleur et de lodeur des raisins qui peuvent
tre plus ou moins extraits lors de la prparation des mots
La pulpe est compose de grosses cellules vgtales entoures de parois cellulosiques qui constituent
75 85% du grain de raisin.
Le grain de raisin contient entre 150 et 250 g/l de sucres. Jusqu 300 g/l dans certains cpages tels que le
muscat. Les baies concentres par la croissance de moisissures ( pourritures ) peuvent dpasser cette
concentration
Le glucose et le fructose sont en quantit peu prs quivalentes. Ils sont trs largement majoritaires; on
trouve aussi un peu de saccharose de xylose, de rhamnose de maltose et de raffinose
La rpartition des sucres dans la grain nest pas homogne; ils sont plus abondants proximit des ppins
Les principaux acides organiques du grain sont les acides tartrique, malique et citrique. Leur concentration
est plus importante vers la surface.
Azote et substances azotes : NH
4
, protines et peptides
Lazote ammoniacal (NH
4
) facilite beaucoup la croissance des levures lors de la fermentation
Substances odorantes. Principalement localises dans la pellicules elles varient avec les cpages
quelles caractrisent
Certaines sont prsentes dans le raisin (terpnes) alors que dautres vont acqurir leur caractre odorant
la suite de transformations qui se font au cours de la vinification
La vinification
Prparation du substrat
Le raisin est grapp et cras (foul). On peut garder qqs rafles qui fournissent des tanins. Il ne faut pas
craser les ppins
Vins blancs / vins rouges
Le vin blanc est en gnral prpar partir de raisin blanc mais on peut obtenir du vin blanc avec du raisin
Noir. Le vin rouge est toujours obtenu partir de raisin noir.
Vins rouges : le raisin cras contenant encore des rafles, les pellicules et les ppins est incorpor directement
dans la cuve de fermentation
Vin blanc : le raisin est grapp, foul et lgrement press. Les rafles et les ppins sont enlevs et les grains
restant sont nouveau presss. Les pellicules et les ppins sont finalement spars du mot par soutirage ou
centrifugation avant la fermentation.
La fermentation
La fermentation en rouge dure de 3 21 jours et se fait de 25 30C. Il ne faut pas dpasser cette
temprature au dessus de laquelle on risque dextraire des quantits excessives de tanins ou autres
molcules des pellicules et des ppins
La fermentation en blanc peut se faire jusqu 36 38C (pas de risque dextraction des molcules qui
pourraient dvelopper de mauvaises odeurs)
Les mots contiennent des bactries dont il faut restreindre la croissance. Ceci est ralis en ajoutant
du SO
2
qui a galement lavantage dempcher loxydation.
Les levures indignes prsentes la surface du raison ne permettent pas dobtenir plus de 4 5 degrs
dalcool
Pratiquement la fermentation est dclenche par laddition de levures commerciales slectionnes raison
de 1 5 10
6
par ml. Ceci plusieurs avantages : le premier est le contrle et la reproductibilit de la
vinification. De plus, elle permet un dmarrage rapide de la fermentation qui limite la croissance bactrienne
et loxydation grce un dgagement rapide de CO
2
Un peu doxygne est ncessaire au dveloppement des levures (mot lgrement ar lorsquil est
transfr dans la cuve de fermentation).
La forte concentration des mots en acide (pH 3 3,9) les protge galement contre le dveloppement des
bactries
La croissance des levures est galement facilite par laddition de molcules telles que lacide olque,
linolique ncessaires la synthse des acides gras et des strols de la membrane
Les levures ajoutes sont trs caractrises. Elles sont commercialises sous forme de levures sches
actives (LSA) par des levuristes . Des souches de levure diffrentes sont utilises pour faire des vins
diffrents.
En plus de lalcool et le CO
2
la fermentation des hexoses par la levure produit de nombreuses autres
molcules; par exemple : le glycrol, lacide lactique, lactaldhyde, lacide succinique, et quelques
autres alcools. Le bilan global est:
180 g de glucose -> 83,6 g de CO
2
+ 87,4 g dthanol + 8,1 g de molcules diverses + 1 g de levure
Le degr final dalcool est fonction de la teneur en sucre : 1degr = 18g/l (vin rouge) et 17 g/l (blanc)
Les levures classiques ne tolrent pas plus de 12 14 degrs dalcool; elles ne se dveloppent plus et
ne fermentent plus. On ne dpasse habituellement pas 14 15 degrs. Certaines levures slectionnes
peuvent supporter 18 20 dalcool.
Les acides amins et les protines du jus de raisin sont indispensables la croissance de la levure
Certains vins sont le sige dune deuxime fermentation malolactique qui transforme le diacide
acide malique (COOH- CH
2
-HCOH-COOH) en acide lactique (CH
3
- CH
2
-HCOH-COOH) monoacide.
Elle a lieu dans des vins acides vendangs prcocement quand le raisin nest pas compltement mur
(pH 3 3,5). Elle est en gnral amorce par Leuconostoc oenos. Les bactries lactiques dgradent
galement lacide citrique les vins rouges doivent en gnral subir une fermentation lactique
Quelques variantes.
Les Sauternes : On utilise des levures particulires qui utilisent prfrentiellement le fructose. Les sucres
restant confre le got spcifique ces vins.
Vins ross : Comme les vins rouges mais macration plus courte : 1 2 jours au lieu de 4 5 jours pour les
vins rouges. La macration peut durer jusqu 15 jours pour les vins colors trs taniques.
Champagne
Il tait fabriqu dans des rgions septentrionales ou le raisin est peu sucr et la fermentation lente
Le raisin est ramass tt et le pressage est lger : clatement de faon rcuprer prfrentiellement la pulpe la
plus riche en sucre (temprature lente)
Fermentation dclenche par levures commerciales, pas de fermentation malolactique
Le vin est mis en bouteille, on rajoute du sucre et des levures et la fermentation se poursuit 10C pendant
4 mois en bouteilles
Il faut ensuite liminer les levures : les bouteilles renverses, le goulot congels et le bouchon retir.
Les levures accumules dans le goulot sont extraites, le volume est rajust et les bouteilles rebouches.
Lopration est ralise au froid afin que le gaz carbonique produit au cours de la fermentation secondaire
ne schappe pas ; il reste soluble.
Dans la mthode originale on najoutait pas de levure. Le vin tait seulement mis en bouteille avant la fin de la
premire fermentation
Les dernires tapes
Aprs fermentation le fin est filtr. Cette tape est prcde de la clarification afin de limiter les troubles et
dpts qui sont un inconvnient commercial. Les troubles sont dus la formation dagrgats dus loxydation
du fer la modification des protines par les tanins temprature leve au cours de la fermentation
On peut dcanter et transvaser le vin. On peut aider la floculation en ajoutant des colles charges
positivement : sang de buf, casine, glatine, blanc duf.
On rajoute parfois des enzymes (enzymes pectinolytiques, glucanases qui facilitent la filtration
On ajoute parfois des enzymes protolytiques au dbut de la fermentation pour librer des acides amins qui
facilitent la croissance des levures
Le vieillissement
Les esters (raction des acides avec les alcools) vont se former au cours du temps
Certains de ces esters, trs odorants (et volatiles) sont indsirables
Les vins peuvent tre conservs en bouteille ou en ft (toujours en chne). Le bois cde ses tanins au vin,
la conservation en ft permet loxydation. Les grands vins sont vieillis en fts ou ils acquirent un fumet
bois
Loxydation est arrte lors de la mise en bouteille. Le got des vins rouges volue lentement en bouteille
probablement cause de processus de rduction
Les vins blancs ne doivent pas soxyder : ils sont vieillis en bouteille.
Tentatives damlioration des procds industriels de fabrique du vin
Slection des souches pures de levure. Il est cependant parfois impossible de reproduire avec une levure
les proprits des levures indignes utilises pour la vinification de certains vins
Tentatives damlioration gntiques; TRES rglement (ne peuvent tre utilises comme donneur que des
gnes dorganismes normalement utiliss dans la fabrication du vin)
On essaye de modifier les levures afin de mieux contrler lacidit, damliorer le rendement alcoolique,
la floculation (production denzymes extracellulaires) ou les proprits organoleptiques.
Exemples : levures capables de faire la fermentation malolactique (clonage denzymes bactriens), construction
de levure surproduisant du glycrol (auto clonage des gnes de levure en multicopies)
La bire
Les matriaux vgtaux utiliss ne sont pas directement utilisables par la levure. Ils contiennent des
polysaccharides qui doivent tre transforms en sucres fermentescibles
Il sagit essentiellement de lamidon (polyglucose) contenu dans les graines de crales : orge, seigne,
Millet, Sorgo mais aussi de pommes de terres et de betteraves.
La bire est essentiellement faite partir dorge. Mais elle peut galement contenir dautres crales
(voir ci-dessous)
Le premire tape consiste dgrader lamidon dorge ou dautres crales laide damylases. Les
amylases sont obtenues en faisant germer les graines
Le maltage
Le malt est de lorge dont la germination a t arrte un stade prcoce. Il est prpar par un malteur
Aprs la rcolte lorge est conserv 2 mois en dormance avant dtre malt. La premire tape est le
trempage : priodes de trempages de 10 heures entrecoupes dtapes de passage lair libre. Elle est
ralise 10C et dure 2 3 jours.
Les graines humidifies (d dhumidit passe de 10-12% 44-50%) sont tales dans des germoirs ; la
temprature est de 15C. Il y a apparition dune plantule et de radicelles (petite plante). Les graines sont
rgulirement remues afin de favoriser loxygnation et dempcher lentremlement des radicelles.
La germination est arrte aprs environ une semaine pendant laquelle il y a eu synthse d!- et de
"-amylases ainsi que de glucanases, xylanases, peptidases, pectases capables de dgrader la parroi de
la graine qui sera ainsi fragilise.
Cest le malt vert . A ce stade la graine a perdu environ 5% de son amidon utilis comme nergie et
source de nutriments pour le dveloppement de la graine. Elle contient un excs damylase capable de
dgrader 2 fois la quantit damidon contenue dans la graine.
Le touraillage pour but de stopper la germination. Le malte vert est dshydrat (dessiccation) dans
un four ventil 45 pendant une trentaine dheures. Le d dhumidit est ramen environ 4%. Dans
ces conditions, les enzymes sont inactifs mais nont pas t dnaturs
Trempage
Germination
Tourraillage, coup de feu
Le malteur procde alors un coup de feu (chauffage 85C-10C) de 1 4 heures qui dtermine ltat
final du malte; le malt ple (coup de feu court) est utilis pour les bires les plus courantes, le malt ambr
(coup de feu plus long et chaud) qui apporte couleur et arme, et enfin le malt torrfi utilis pour les bires
irlandaises.
Le malt est ensuite commercialisable (les radicelles sont utilises pour lalimentation des animaux). Cest un
produit inerte qui peut tre stock et transport.
Le brassage
La premire tape est la saccharification qui consiste dgrader lamidon du malt avec les enzymes
synthtises au cours du maltage.
Les grains de malt sont concasss en prsence deau chaude; on obtient la mache laquelle on peut
ajouter dautres crales non maltes (mas, riz, bl*). Un des objectifs est de rduire les cots.
Un exemple : une bire blanche contenant du bl (Hoegaardeen, Louvain, B). Elle contient 50 60
% dorge malt, 25/50% de malt de froment, 10 50% de froment non malt et 0,1 5% davoine
ou de sarrasin.
En France, lappellation bire implique que la mache contient au moins 50% de malt dorge.
Il y a plusieurs procds dinfusion (monopaliers, multipaliers, chauffage direct) qui ont tous pour objectifs de
favoriser lactivit des diffrents enzymes contenu dans le malt.
Linfusion multipaliers dcrites ci-dessous est trs utilise dans le nord de la France.
La mache (malt concass mlang de leau et port 45C) est port des paliers successifs de 64C puis
72C par addition deau bouillante. Le volume dorigine est le plus faible possible afin que la mache finale (le
brassin) ne soit pas trop dilue aprs ces oprations.
Dautres mthodes consistent prlever une partie de la mache qui est 45C, la porter bullition et la
rajouter au reste de la mache afin dobtenir une temprature de 64C. On peut procder de la mme manire
pour atteindre le palier de temprature suivant. Lbullition lavantage de glatiner lamidon qui nest pas trs
soluble : le brassin est un mlange trs visqueux quil faut brasser pour lhomogniser.
Les diffrents paliers correspondent aux tempratures optimales de diffrents denzymes. Ie temps
dincubation ces tempratures laisse aux enzymes le temps dagir sur les composants de la mache avant
quune lvation de temprature ne les inactive.
Les diffrents paliers
Emptage : 45-55C, pH 3,8 5,9 pendant 10-30 minutes. Les protases agissent, elle liminent des
protines indsirables et insolubles et fournissent des acides amins. Une grande partie des protines
responsable du trouble de la bire sont limines cette tape
Saccharification : 55C-65C pH 5 5,5 pendant 30 60 minutes. Les !-amylases dgradent lamidon.
Lamidon est un polymre linaire (amylose) structure branche.
Les !-amylases attaquent les extrmits de lamylose, elles librent des molcules de maltose
assimilables. Les "-amylases librent des dextrines
Le palier de saccharification favorise lactivit des !-amylases
Le palier suivant : 68-72C pH 5,3, 5,7 pendant 30 90 minutes seule l "-amylase est encore active elle
libre des dextrines non fermentescibles. Cette tape favorise le corps de la bire.
Le dernier palier 80C pendant 10 15 minutes inactive compltement les enzymes.
Le mot est ensuite filtr (percolation = filtration lente sous pression) : les dchets dresches sont
rcuprs comme aliments pour le btail
Laromatisation par le houblon (inflorescences femelles) est faite cette tape (2heures). Le houblon
donne une saveur amre due la lupuline. Il tait lorigine ajout pour ses proprits antibiotiques
favorisant la conservation de la bire
liaisons "1-4
liaisons "1-6
"-amylases
!-amylases
Dresches
La fermentation
Le mot est ensemens avec des levures (10
7
cellules/ml) qui proviennent en gnral dune fermentation
prcdente. Il y a plusieurs types de fermentations qui dpendent des levures utilises
Fermentation basses. Elles sont ralises 5-14C par saccharomyces uvarum (anciennement
carlsbergensis). La fermentation dure une dizaine de jours. Les levures sdimentent au fond de la cuve ou
elles peuvent tre rcupres. Types de bires : lager (de lagern : stocker en allemand). Elles sont
conserves
Les fermentations hautes. Sont ralises 15-25C par saccharomyces cerevisiae. Elles durent de 4 8
jours. Types de bire ale, stout (UK). Les levures remontent la surface du mot pendant la fermentation.
Les degrs dalcool sont suprieurs ceux obtenus par la fermentation basse.
Fermentation spontanes : Brettanomyces bruxellencis, ou B. lambic. Ensemencement naturel du mot
par les levures indignes. Procd limit une rgion de Belgique qui produit la bire Lambic.
A la fin de la fermentation 70% de lamidon a t transform en sucres fermentescibles qui ont t
compltement utiliss par la levure. Le reste est sous forme de dextrines.
La bire est finalement clarifie (filtration) sur Kiesellgurh (diatomes fossiles) et mises en bouteilles. Elle
doit tre conserve labri de loxygne et des contaminations bactriennes. Quelques bires de grande
consommation sont pasteuriss pour faciliter la conservation
Certaines bires subissent des fermentations secondaires: bires de garde du nord de la France. Ce sont
le plus souvent des fermentations hautes (d alcool lev : 7-8) qui ne sont pas filtres. La fermentation
continue en bouteille fermes (garde).
Garde (0C)
Filtration
Amlioration des procds
Levures surproductrices de !-glucanases (fabrique mais non autorise)
Levures produisant des amylases
-clonage de la glucoamylase de Saccharomyces dicistaticus (libre du glucose et coupe les
liaisons "1-6) dans S. uvarum
-clonage des gnes de la glucoamylase, de l "-amylase et de la pullulanase (glucanase
spcifique des liaisons "1-6; le pullulane est un polymre de glucoses relis par des liaisons
"1-6)
Elimination se produits secondaires indsirables; le diactyl ralenti le murissement de la
bire. Ceci est ralis en faisant exprimer lactolactate carboxylase qui limine
lactolactate utilis pour former le diactyl
- une protine de bl la puro-indoline est ajoute (10g/ml) pour stabiliser la mousse. A
linverse les lipides dstabilisent la mousse.
Un autre exemple impliquant une distillation : le Whisky
La fabrication du whisky utilise galement du malt comme source damidon et denzymes
Le procd de prparation du malt est trs proche de celui dcrit pour la bire
Germination : humidification, graines tales sur une paisseur de 20-30cms et retournes
rgulirement pendant une semaine 12 jours.
Touraillage : chauffage dans un four qui peut tre chauff la tourbe (Ecosse Irelande). La prsence de
tourbe dans le combustible modifie la saveur du malt
Le malt livr la distillerie est dans un premier temps broy sous forme de farine grossire appele
Grist
Le Grist est ensuite rhydrat (1 volume de grist + 4 volume dH
2
O). Lorigine de leau est trs
importante.
Comme pour la bire, la conversion de lamidon en sucres fermentescibles est ralise par paliers (3) entre 65
et 95C. Les cuves font 25000 litres.
Le mot est ensuite spar en drafts (dchets) recycls pour lalimentation du btail. Cette opration est
appele brassage car le mlange trs visqueux doit tre brass pour lhomogniser et faciliter lcoulement
du mot
Le mot est ensuite mis en cuve dinox (autrefois en bois (pin ou mlze) et la levure est ajoute
On obtient un bier 8 degrs dalcool.
Le bier sera utilis tel quel pour tre distill
Les distilleurs apportent une grande importance la forme de lalambic et au cuivre dont il est fait
Le whisky peut tre distill 2 3 fois
Le whisky est ensuite vieilli dans des futs de chne, le plus souvent usags, pendant au moins 3 ans. Cest le
temps minimum pour mriter lappellation whisky.
Les fts usags peuvent confrer au whisky un got particulier qui dpend de la nature de lalcool qui y avait
t prpar. Par exemple du Sherry (Xeres). Ces grands futs (420-520 litres) parmi les plus chers sont dabord
utiliss (lous) pour lever du Xeres avant dtre utiliss pour faire vieillir du Whisky. Les distilleries utilisent
galement des fts ayant contenu du madre, du porto, du sauterne, du bordeaux, du calvados du rhum
pour enrichir la palette gustative des whiskys. Le vieillissement peut commencer dans des fts ayant contenu
du Bourbon amricain avant dtre transfr dans les fts mentionnes plus haut.
Le vieillissement cause une vaporation (le chne est poreux). La teneur en alcool la sortie de lalambic est
de 70%. Elle diminue avec le temps cest la part des anges
Le whisky est ensuite embouteill. Le whisky est stable en bouteille. Le titre est ajust 40% en alcool avec de
leau. Certains whisky titrent 43 ou 46 pour des problmes de lgislation.
Dautres crales sont employes pour faire du whisky : Pure malt = 100% malt dorge; Le bourbon amricain
contient du malt dorge et du seigle. On peut y ajouter des pommes de terre, de la betterave ou de lavoine.
Les whisky cossais et irlandais peuvent contenir du bl
Beaucoup dacides amins sont produits par voie fermentaire
Le glutamate (agent de sapidit), qqs acides amins doivent tre ajouts aux aliments dorigine vgtale
(lysine) ils sont essentiels pour lhomme
Prparation du glutamate.
Bactrie : Corynbactrium glutamicum
Milieu de culture (amidon ou extraits de betterave : on utilise la mlasse qui est un rsidu des sucreries). Il
faut ajouter des sels dammonium car les acides amins contiennent de lazote. LUre peut tre utilise
Le pH est maintenu 7-8 en ajoutant du NH
3
gazeux.
Lacide glutamique est secrt dans le milieu, ltape limitante est la scrtion. Lapport dacides gras
favorise la production de Glu; peut tre en modifiant les proprits de la membrane. Laddition de
pnicilline (en quantit subltale) qui perturbe la synthse des enveloppes bactriennes favorise la
production de Glu; peut tre en augmentant la porosit des membranes.
La souche industrielle est mute dans le cycle de Krebs (ceto-glutarate deshydrognase). Le cycle du
glyoxylate shunte le cycle. Cette mutation favorise la transformation de lisocitrate en"cetoglutarate puis la
synthse de glutamate.
Prparation de la lysine
Cest la mme bactrie qui est utilise mais elle est modifie dans a voie mtabolique qui aboutit la
synthse de lysine, methionine, thronine et isoleucine.
La lysine est scrte on obtient jusqu 40g/l de lysine.
Les antibiotiques
On connat environ 8000 antibiotiques et on en dcouvre plusieurs chaque anne. Une cinquantaine sont
utiliss des fins thrapeutiques
Les antibiotiques sont des mtabolites secondaires dont la synthse drive de celle de mtabolites
primaires (voir diapo)
La plupart sont synthtiss partir de champignons (penicillium) ou de bactries (bacilli, actynomyctes)
(voir tableau)
Les antibiotiques se rpartissent en plusieurs catgories dpendantes de leur nature chimlque
Les plus populaires sont les !-lactams qui sont des drivs dacides amin. La valine donne le cycle !-
lactam
Les principaux (pnicillines (la cystine donne le cycle thiazolidine), cphalosporines, cphalines)
Ils agissent en inhibant la synthse du peptidiglycane (ils empchent la transpeptidation qui forme le
rseau du peptidoglycane)
Penicilline G (la premire isole) active contre la gram+. Nouvelles pnicillines actives contre le gram
-
Le penicillium produit plusieurs penicillines naturelles (G, F, K, X) parmi lesquelles seule la penicilline G
est utilisable en thrapeutique. On peut influencer la synthse des pnicillines en ajoutant dans le milieu
des molcules qui seront incorpores comme chane latrale (penicilllines G, V et 0 byosynthtiques voir
tableau). Les trois sont utilisables.
On produit galement des penicillines semi-synthtiques partir de lacide 6-aminopenicillanique sur
lequel on greffe des radicaux (voir tableau)

Ils existe de nombreux autres !-lactams (tableau) et on en cre des nouveaux par voie chimique
(tableau)
Production de penicilline
La dcouverte 1929 Alexander Fleming : colonie de Staphylococcus aureus lyses par un moisissure
contaminant la boite dagar. La penicilline est toujours lantibiotique le plus facile utiliser.
La souche originale est Pnicillium notatum. Elle produisait 1,2 mg/l (2 IU) de pnicilline. La recherche
dautres souches conduit la lidentification de Penicillium chrysogenum NRRL-1951 qui tait plus
approprie pour les cultures submerges. Elle produisait 120 IU/ml.
La recherche de variants a permis disoler la souche B25 produisant 3 fois plus. Une premire
mutagnse aux UV a donn une souche X1612 (500 IU/ml). Elle a t suivie par une mutagnse
chimique qui a permis disoler la souche Wisconsin Wis Q176 qui produisait 900 IU/ml.
Lamlioration de la souche industrielle a pu tre encore amliore la suite de la dcouverte de la
voie de biosynthse qui a permis dimaginer des mthodes de slections diffrentes
Lamlioration des connaissance du cycle de dveloppement de Penicillium c. et de son mode de
reproduction a permis damliorer les croisements par les mthodes de fusion dhyphes haplodes,
recombinaison mitotique, et fusions de protoplastes.
Ces techniques de plus en plus sophistiques ont abouti lobtention dune souche produisant
85000 IU/ml; soit plus de 700 fois plus que la souche de P. c. dorigine. Environ 40 000 fois plus que la
Souche P. n. de Fleming.
Lamlioration des souches industrielle dj performantes est difficile. Il est en effet compliqu de
diffrencier une souche qui produirait 1000 IU (soit un peu plus de 1%) de plus que la souche
actuellement utilise.
Haplode
Production Industrielle de penicilline
La pnicilline est synthtise partir de la valine et de la cystine. Lefficacit de la synthse dpend de
lapport de val et de souffre. La lysine rtroinhibe la synthse de pnicilline. Il y a galement un effet de
rpression catabolique par le glucose
La production se fait sur un extrait de bl ou de mas (riche en protines), enrichi en ammoniaque et en sels.
La source de carbone est le glucose, le lactose ou la mlasse (sous produit de sucreries).
La production se fait dans un racteur (batch) agit de 2,5 10
5
litres partir dune ampoule de spores
Le racteur est strilis la vapeur. Il est aliment avec un milieu strile et en oxygne strilis par filtration
Il faut dvelopper un inoculum de taille suffisante qui puisse se dvelopper dans un trs grand volume. Cela
est ralis en effectuant des cultures successives dans les fermenteurs de tailles croissantes. La premire
prculture est faite dans un erlen de 1 litre. Les bactries en phase exponentielles sont transfres dans un
fermenteur plus grand de 10 L o la culture continue jusqu tre transfre dans un rcipient de 10
3
L puis
10
4
L puis enfin le fermenteur final.
La fermentation est troitement surveille : le glucose est ajout en continu, le pH est contrl; elle dure 6 8
jours. La temprature peut varier au cours de la fermentation pour favoriser le dveloppement du myclium
(30C) ou la production dantibiotique (25C)
Larrt de la fermentation et la rcupration des produits est base sur quatre critres
mesure de la concentration de pnicilline
rduction de la consommation de glucose
rduction de 0
2
dissout
tendance forte un changement de pH
Autres antibiotiques
Aminoglucosides : streptomycines, kanamycine, gentamycine, neomycine
Actives contre les bactries gram-
A permis de lutter efficacement contre la tuberculose (avance majeur)
Inconvnients : beaucoup de rsistantes dues des mutations des protines ribosomales
Supplant par pnicillines actives sir gram-
Macrolides : Erythromycine, olandomycine, ttracyclines
Trs utilises, large spectres sur gram+ et -
Problme des spectres daction (voir tableau)
Mycobacterium tuberculosis
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Haemophilus influenzae
Bordetella pertussis
Amylose (linaire)
Amylopectine (branch)
~ 40000 rsidus glucose
liaisons "1-4
liaisons "1-6
"-amylases
!-amylases
gluco-amylases
Prpare partir de Bacillus subtilis,
Bacillus licheniformis ou Aspergillus oryzae.
Lenzyme thermostable 110C de
B. Licheniformis permet de raliser en une
tape la liqufaction ( haute temprature
= 110C) et la dgradation de lamidon.
La gluco-amylase qui coupe les
liaisons "1-6 est isole de
champignons filamenteux :
Aspergillus niger ou orizae
Lamidon est dgrad jusqu diffrents stades
Hydrolyse partielle faible -> malto dextrines (aliments pour bbs)
Hydrolyse partielle -> Sirop de glucose + maltose (Confiserie biscuiterie)
-> Sirop de glucose (Confiserie, brasserie, confiturerie, boissons
Hydrolyse totale -> Sirop de glucose 90-99%

Concentration et cristallisation (Alimentation, Fermentation, Pharmacie : excipients)
Isomrisation sous forme de fructose (Boisson, ptisserie, biscuiterie, confiserie, confitures
hydrognation -> sorbitol (plastifiants, textile, papeterie, dittique, vitamine C)
Lhydrolyse de glucose modifie plusieurs proprits de lamidon
pouvoir sucrant
fermentescibilit
viscosit
pouvoir liant
Lisomrisation du glucose en fructose augmente le pouvoir sucrant
Le pouvoir sucrant du glucose est faible par rapport celui du saccharose (canne sucre et betterave)
et du fructose (saccharose = glucose + fructose)
pouvoir dulcorant relatif
glucose 68
saccharose 100
fructose 120 150
Le glucose est incub en prsence de glucose isomrase isole de Bacillus coagulens ou de Streptomyces
murinus.
Dans la cellule cet enzyme est une xylose-isomrase dont lactivit est dvoye en remplaant le Mn
2+
par
des ions Co
2+
. Elle est fixe sur une rsine et introduite dans des colonnes (racteurs) sur lequelles ont fait
passer le glucose.
.
La raction sarrre quand 55% du glucose est transform en fructose. Cest ce mlange : HFCS 55
(High Fructose Corn Syrup) prpar partir de Mas (mais aussi partir de bl) qui est utilis pour prparer
les soft drinks (Coca, Pepsi).
Le fructose peut tre purifi par chromatographie (HFCS 90) pour tre utilis en patisserie
Saccharose