UNIVERSIDAD MICHOACANA DE

SAN NICOLS DE HIDALGO

FACULTAD DE BIOLOGA




Micropropagacin de dos variedades de guayabo
(Psidium guajava L.) por regeneracin in vitro de
brotes en yemas apicales y laterales.



Tesis



que presenta:

SEBASTIN VEGA AGUILAR



COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER
EL TTULO PROFESIONAL DE


B I L O G O





DIRECTOR DE TESIS:
DR. RAFAEL SALGADO GARCIGLIA



MORELIA, MICHOACN, MXICO
OCTUBRE 2007
Firmado digitalmente
por AUTOMATIZACION
Nombre de
reconocimiento (DN):
cn=AUTOMATIZACION,
o=UMSNH, ou=DGB,
email=soporte@bibliotec
a.dgb.umich.mx, c=MX
Fecha: 2009.09.22
09:56:08 -05'00'











El presente trabajo se realiz en el Laboratorio
de Biotecnologa Vegetal del Instituto de
Investigaciones Qumico Biolgicas de la UMSNH, bajo
la direccin del Dr. Rafael Salgado Garciglia. Forma
parte de la LGAC Propagacin, Conservacin y
Mejoramiento Gentico de Plantas del Cuerpo
Acadmico Biotecnologa Plantas (UMSNH-CA-155).

NDICE GENERAL Pgina.

NDICE DE CUADROS i
NDICE DE FIGURAS ii
RESUMEN iii
1. INTRODUCCIN 1
2. ANTECEDENTES 5
2.1. CULTIVO IN VITRO DE PLANTAS 5
2.1.1 Micropropagacin 6
2.1.2. Regeneracin in Vitro 10
2.1.3. Micropropagacin de frutales 13
2.2. GUAYABO (Psidium guajava L.) 17
2.2.1 Descripcin botnica 19
2.2.2 Micropropagacin de guayaba 20
3. OBJETIVOS 23
3.1. OBJETIVO GENERAL 23
3.1.1. Objetivos especficos

23
4. MATERIALES Y MTODOS

24
4.1. MATERIAL BIOLGICO

24
4.2. ESTABLECIMIENTO IN VITRO

24
4.2.1 Mtodo de asepsia para semilla 24
4.3 DESARROLLO DE PLNTULAS DE SEMILLA IN VITRO 26
4.4. REGENERACIN DE BROTES 26
4.5. ENRAIZAMIENTO 26
4.6. TRASPLANTE Y ACLIMATACIN 28
4.7 . ANLISIS ESTADSTICO 28
5. RESULTADOS Y DISCUSION 29
5.1. ESTABLECIMIENTO in Vitro 29
5.2. DESARROLLO DE BROTES 32
5.3. ENRAIZAMIENTO Y DESARROLLO DE BROTES 38
5.4. TRASPLANTE Y ACLIMATACIN

41























6. CONCLUSIONES 43
7. LITERATURA CITADA 44

NDICE DE CUADROS
Pgina
Cuadro 1. Ejemplo de algunos rboles frutales micropropagados.

16
Cuadro 2. Constituyentes del medio de cultivo MS (Murashige y Skoog,
1962).


25
Cuadro 3. Tratamientos con auxina/citocinina (ANA/BA, AIA/CIN, mg/l) para
la induccin de brotes en yemas axilares de las dos variedades
de guayabo.



27
Cuadro 4. Nmero de brotes producidos en yemas apicales y axilares de P.
guajava Var. China Rosa, en los diferentes tratamientos con
ANA/BA.



34

i
NDICE DE FGURAS
Pgina
Figura 1. Frutos de guayaba (Psidium guajava L.), A) Var. China; B) Var.
China Rosa.
21
Figura 2. Porcentajes de germinacin de semillas cultivadas in vitro (A) y
altura de las plntulas (B) de guayabo Var. China y Var. China
Rosa, determinados a los 15, 30, 45 y 60 das de cultivo.
Asterisco (*) significa diferencias estadsticas a un nivel de
confianza P<0,05, segn comparacin mltiple de medias de
Tukey-Kramer (n=10).






30
Figura 3. Plntulas a los 60 das de su cultivo in vitro en MS con 0.05 mg/L
de BA: A, Guayabo Var. China; B, Guayabo Var. China Rosa.


31
Figura 4. Fotografas del sistema de produccin de brotes de guayabo (P.
guajava Var. China Rosa): A, Plntula de 60 das de cultivo,
fuente de explantes; B, Yemas axilares o apicales en medio MS
con reguladores de crecimiento para la produccin de brotes; C,
Desarrollo del brote en tratamiento control, MS sin reguladores
de crecimiento; D, Regeneracin de brotes en yemas cultivadas
en MS con 0.5 mg/L de ANA ms 0.1 mg/L de BA (T12).







33
Figura 5. Regeneracin de brotes en yemas de guayabo Var. China: A) En
MS con 0.5 mg/L de BA y 0.1 mg/L de ANA; B) En MS sin reg.
de crecimiento.



37
Figura 6. Nmero (A) y tamao de races (B) en brotes de guayabo (P.
guajava L. Var. China Rosa, cultivados en MS y MS con
diferentes concentraciones de sacarosa, determinados a los 30 y
60 das del cultivo. Asterisco (*) significa diferencias estadsticas
a un nivel de confianza P<0,05, segn comparacin mltiple de
medias de Tukey-Kramer (n=10).






39
Figura 7. Plntulas de guayabo en medio de enraizado: A) Var. China
Rosa en MS 20 g/L de sacarosa; B) Var. China Rosa en MS
con 40 g/L de sacarosa: C) Var. China en MS con 40 g/L de
sacarosa.




41
Figura 8. Plntulas de guayabo durante el trasplante y aclimatacin: A)
Tres das del cultivo ex vitro; B) A los 30 das de cultivadas.


42

ii
RESUMEN
En el Estado de Michoacn, las variedades de Guayaba de mayor demanda son
China, de pulpa blanca, y China Rosa, de pulpa rosa, por lo que se requiere
sistemas de propagacin que garanticen la uniformidad tanto en la cantidad
producida como en la calidad de los frutos. Por ello, en esta investigacin se
establecieron sistemas de cultivos in vitro de guayabo de estas dos variedades para
conseguir su micropropagacin, por medio de la siembra de yemas apicales y
laterales de tallos de plntulas obtenidas por la siembra de semillas in vitro. La
siembra in vitro en MS con 0.05 mg/L de BA, de semilla de ambas variedades de
guayabo fue exitosa, ya que la contaminacin fue mnima (20%) y la germinacin
inici desde los 8 das del cultivo, alcanzado altos porcentajes de germinacin a los
30 das del cultivo, con un 88% para Var. China y un 94% para Var. China Rosa. El
crecimiento de las plntulas fue progresivo en ambas variedades, ya que a los 60
das, la altura fue de 3.5 cm y de 3.7 cm, para Var. China y Var. China Rosa,
respectivamente, el mximo crecimiento determinado. Estas plntulas desarrollaron
en promedio de 4 a 6 hojas por plntula, con hasta dos races en promedio de 1.2
cm de largo, las de la variedad China Rosa fueron utilizadas como fuente de tallos
con yemas apicales y laterales para los estudios de organognesis, al cultivarlos en
medio MS con diferentes dosis de ANA/BA y/ AIA/CIN. En esta ltima combinacin
de reguladores de crecimiento, solo en el tratamiento con 0.1 mg/L de AIA y 1.0
mg/L de CIN se obtuvo la regeneracin de brotes y apenas de 0.75 brotes/explante.
Sin embargo, en varios tratamientos de ANA/BA se consigui la proliferacin de
brotes, con un mximo de 4 brotes/explante, al cultivar tanto yemas de la var. China
Rosa como de la var. China (apicales o laterales) en el medio MS con 0.5 mg/L de
BA y 0.1 mg/L de ANA. Se defini un medio de cultivo para el ptimo enraizado de
los brotes micropropagados y buen crecimiento de las plntulas, variando la
concentracin de los componentes del medio MS y la concentracin de sacarosa,
consiguiendo plntulas aptas para el trasplante y aclimatacin en MS con 30 g/L
de sacarosa, donde los brotes presentaron 2.6 races/brote, de 6.25 cm en promedio
y las plntulas presentaron un buen desarrollo, alcanzando los 3.2 cm de altura, con
6 hojas en promedio, a los 60 das de cultivo. stas sobrevivieron en un 60% a los
30 das del trasplante ex vitro, observando plntulas de hasta 5 cm de altura. Los
resultados muestran la eficacia del sistema de micropropagacin establecido para
dos variedades de guayabo.








iii







1

1. INTRODUCCIN

La propagacin de plantas a travs del uso de tcnicas de cultivo de
tejidos vegetales (micropropagacin) constituye una de las lneas de trabajo
ms importante de la biotecnologa moderna dada la magnitud de su
aplicacin prctica actual, la cual se fundamenta en la clonacin del material
vegetal lite. La micropropagacin se aplica a especies vegetales con el fin de
obtener su propagacin masiva en el menor perodo de tiempo posible. Se le
conoce como una biotecnologa de respuesta rpida, puesto que se logran
resultados en perodos de 3 a 6 meses. Se puede decir, que es adems verstil
puesto que se adapta a los requerimientos de cada especie en estudio, al
aprovechar al mximo la totipotencia celular, lo cual se canaliza hacia la
propagacin (McComb, 1994).

Las ventajas ms significativas que ofrece la micropropagacin es la propagacin
clonal, lo que la hace ideal para la multiplicacin de plantas con caractersticas
particulares; el nmero de plantas a obtener es prcticamente ilimitado, solo
depende de las caractersticas del laboratorio; las plantas producidas en
laboratorio presentan una mayor calidad que las producidas por mtodos
convencionales, en cuanto a control fitosanitario se refiere, por lo que su
exportacin se realiza con mayor facilidad; los costos de produccin son
competitivos, sobre todo en aquellas especies en donde es difcil su propagacin
por mtodos tradicionales, o en especies de un alto valor econmico, y tambin
juega un rol esencial en el mejoramiento y la preservacin de genotipos
sobresalientes (Prez-Molphe et al., 1999).

Donde el cultivo tradicional de plantas ha fallado para establecer lneas estables,
la micropropagacin ha sido utilizada para la rpida liberacin de variedades, un
ejemplo de ello son plantas ornamentales, frutales y forestales, que adems
representan un alto valor econmico. En Mxico la micropropagacin se concentra
principalmente en plantas ornamentales y algunos cultivos hortcolas (Prez-
2

Molphe et al., 1999). Entre los mtodos de regeneracin de plantas destacan la
organognesis, de los que se encuentran la formacin de yemas axilares, la
formacin de yemas adventicias y la embriognesis somtica (Dodds y Roberts,
1995).

La aplicacin de esta biotecnologa a especies frutales, tropicales y subtropicales
es bastante limitada y no fue sino hasta los 90s del siglo pasado en que
empezaron las investigaciones en este campo. La mayora de las especies frutales
tropicales son leosas, perennes, dicotiledneas y representan un difcil grupo de
cultivo in vitro debido a que en especies leosas la capacidad morfogentica bajo
estas condiciones de cultivo est ligada al empleo de materiales con
caractersticas juveniles (Pliego-Alfaro y Bergh, 1992). Esto limita la propagacin
de individuos adultos seleccionados que puedan presentar resistencia a
enfermedades y a estrs ambientales, sin embargo ha sido posible el
establecimiento in vitro de algunas especies como Citrus spp (ctricos), Musa spp
(pltanos), Carica papaya (papayo), Persea americana (aguacate) entre otras
(Leal-Nares et al., 2004).

Asimismo, la composicin de los medios de cultivo utilizados, en cada caso, vara
de acuerdo a los requerimientos de las diferentes especies y a las condiciones
particulares de cada laboratorio, no siempre fcilmente reproducibles. Son
mltiples las variables que inciden en el cultivo, como el origen y edad de los
explantes, presencia de contaminantes y respuesta a los diferentes medios, que
son puntos importantes a solucionar para la iniciacin o establecimiento de los
cultivos in vitro. Lograr el ajuste de la tcnica implica obtener brotes homogneos
para enraizar y plantas adaptadas capaces de sobrevivir a las condiciones
ambientales naturales (Prez-Molphe et al., 1999).

Para el caso de guayaba ya se han establecido condiciones de cultivo in vitro, con
resultados en la micropropagacin de algunas variedades como Safeda (Khattak
et al., 1990), Mara-7 (Pirela y Mogolln, 1996), Lucknow 49 y Thailand (Singh et
3

al., 2001), Enana Roja de Cuba (Prez et al., 2002), poco o no importantes para
nuestro pas o nuestro estado Michoacn. Las variedades ms cultivadas en
Mxico son Regional de Calvillo, China (Blanca o Rosa), Media China, La labor,
Acaponeta, Coyame y materiales Criollos (Gonzlez-Gaona et al., 2004;
SAGARPA, 2006), de las cuales no hay reportes para ptimos sistemas de
micropropagacin.

El porqu propagar este frutal por mtodos biotecnolgicos se explica debido a
que por la propagacin de guayabo masivamente a travs de semillas, o con la
tcnica de injertos, se presenta alta heterogeneidad en las plantaciones
comerciales (tamao de fruto, porte del rbol, nmero de frutos por rbol, etc.),
debido a que proceden las semillas o partes vegetativas de diferentes plantas,
repercutiendo todo ello en bajas considerables de la produccin por unidad de
superficie cultivada (Pirela y Mogolln, 1996; Ramrez, 1998). Lo anterior hace
necesario la bsqueda de otras formas de propagacin que permitan una mayor
uniformidad en las plantas al disminuir la variabilidad gentica; en este sentido la
propagacin asexual juega un rol de relevante importancia. La clonacin de
individuos seleccionados por productividad, calidad, resistencia a patgenos, entre
otras caractersticas, por medio de tcnicas convencionales (injertos, enraizados
de estacas y acodos) o por el cultivo in vitro de rganos, tejidos o clulas puede
dar como resultado una ganancia gentica importante en una sola generacin. Por
otra parte, permite la multiplicacin de hbridos e individuos poliploides (Caso,
1992). El desarrollo de una tecnologa para la propagacin in vitro de plantas
adultas de P. guajava puede acelerar los procesos de seleccin y multiplicacin de
plantas lite y puede facilitar el intercambio de material entre centros de
investigacin (Pirela y Mogolln, 1996).

Las variedades de Guayaba China, de pulpa blanca, y China Rosa, de pulpa
rosa, son de las ms demandadas por el mercado estatal y nacional, debido a las
caractersticas nicas de estos frutos, ya que son de gran tamao, de un ptimo
valor nutrimental y pueden ser destinadas a la elaboracin de jugos y otros
4

productos. Es por ello, que en la presente investigacin se plantea la
micropropagacin de estas variedades de guayabo (Psidium guajava L. Var. China
y Var. China Rosa), iniciando con el establecimiento in vitro de semillas
provenientes de frutos de plantas cultivadas en el campo.

5

2. ANTECEDENTES

2.1. CULTIVO IN VITRO DE PLANTAS

La expresin cultivo in vitro de plantas, significa cultivar plantas o parte de stas
dentro de un frasco de vidrio en un ambiente artificial. Esta forma de cultivo tiene
dos caractersticas fundamentales: la asepsia (ausencia de bacterias y hongos
principalmente) y el control de los factores que afectan el crecimiento. El avance
alcanzado por las ciencias biolgicas ha permitido en los ltimos aos el estudio
detallado de las plantas tanto a nivel celular como molecular. Haberlandt, un
cientfico alemn, postul a principios del siglo pasado que las plantas eran
capaces de reproducir su crecimiento a partir de clulas aisladas, originando la
hiptesis de la totipotencia celular en plantas. Sin embargo, este investigador no
pudo demostrar en forma prctica su hiptesis, debido a que la mayora de los
componentes complejos que integran los medios de cultivo actuales todava no
haban sido descubiertos. En la dcada de los 50s del siglo pasado fue cuando se
determin la importancia del balance hormonal en las plantas, con el
descubrimiento de las hormonas o reguladores del crecimiento vegetal ms
usados en la actualidad (Krikorian, 1991).

Reproducir en condiciones de laboratorio todos los factores que conforman el
ambiente de la planta en la naturaleza es tcnicamente muy complejo. Por esa
razn se realiza una simplificacin de la realidad escogiendo aquellos factores que
se puedan mantener controlados. Cuando no se realiza el estudio con todo el ser
vivo sino con solamente una parte del mismo, se utiliza el trmino explante para
indicar la parte del rgano tejido vegetal que se cultiva in vitro. A la dificultad de
reproducir las condiciones naturales en condiciones de laboratorio, se debe aadir
en este caso la dificultad de suministrar al explante todo aquello que antes obtena
del sistema completo. En resumen, el cultivo in vitro de plantas es una tcnica que
exige un control especfico del ambiente, tanto fsico como qumico, en el que se
sita al explante. Los principales factores que conforman al cultivo in vitro y que
6

deben ser controlados son: Ambiente qumico (composicin del medio de cultivo y
pH); Ambiente fsico (temperatura, luz y humedad) (Pardos y Toribio, 1984).

2.1.1. Micropropagacin

La micropropagacin o propagacin clonal, es una de las aplicaciones ms
importantes del cultivo in vitro, a travs de la micropropagacin, a partir de un
fragmento (explante) de una planta madre, se obtiene una descendencia uniforme,
con plantas genticamente idnticas, denominadas clones. El explante ms usado
para los procesos de propagacin in vitro son las yemas vegetativas de las
plantas. Los frascos que contienen las plantas se ubican en estanteras con luz
artificial dentro de la cmara de crecimiento, donde se fija la temperatura en
valores que oscilan entre los 24 y 28C, adems de controlar la cantidad de horas
de luz. Por su parte, el medio de cultivo se compone de una mezcla de sales
minerales, vitaminas, reguladores de crecimiento, azcar, agua y agar. La
composicin del medio depende del genotipo de la especie vegetal y de la etapa
del proceso de micropropagacin (Pierik, 1990).

Datos disponibles de los aos 1996-1997, muestran como se ha ido
estableciendo, en distintas partes del mundo, el cultivo de tejidos en los
laboratorios de investigacin privados y estatales. En Europa, junto con los
laboratorios pertenecientes a instituciones cientficas encargados de ajustar la
tcnica para una multiplicacin vegetativa rpida del material, y de desarrollar los
programas de mejoramiento gentico, conservacin de germoplasma y
saneamiento de los materiales, se hallan los laboratorios pertenecientes al sector
viverista cuyo principal inters es la multiplicacin clonal de las especies. Estos
laboratorios, para ser exitosos, deben disponer de afinados protocolos de
multiplicacin y de una adecuada planificacin del trabajo en cada una de las
etapas del cultivo. Estas condiciones sumadas a la necesidad de una
infraestructura mnima hace que esta tcnica no se encuentre al alcance de
viveros muy pequeos (Prez-Ponce et al., 1998).
7

En la propagacin de plantas, cualquiera sea el mtodo empleado, no se puede
prescindir de un control de la calidad el cual debe abarcar aspectos patolgicos,
genticos y fisiolgicos. La propagacin por va vegetativa utilizando los mtodos
tradicionales, posee el riesgo de transmitir infecciones virales u otros patgenos.
La micropropagacin, debido a que se realiza en un ambiente esterilizado y si
provienen los explantes de plantas sanas, no posee ese riesgo. As, esta tcnica
en todos sus aspectos permite la obtencin de plantas sanas y de calidad. Para
que esto se cumpla, cada una de las etapas de la micropropagacin deber ser
rigurosamente controladas. Este mtodo ofrece, adems, la posibilidad de
incrementar rpidamente nuevos materiales, controlar las condiciones ambientales
y estudiar diversos procesos fisiolgicos de la planta (Margara, 1988).

El proceso de micropropagacin consta de varias fases o etapas: Fase 0,
Seleccin y preparacin de la planta madre; Fase 1, Desinfeccin de las yemas de
la planta y/o desinfeccin de semillas; Fase 2, Introduccin del material
seleccionado o fase de establecimiento; Fase 3, Regeneracin in vitro,
multiplicacin de brotes o embriones somticos; Fase 4, Formacin de plntulas,
enraizamiento; Fase 5, Transplante y aclimatacin. Esta secuencia de etapas
abarca el ciclo completo de la multiplicacin de plantas in vitro y puede ser
aplicada a diferentes especies vegetales, en cada caso se podrn incluir
simplificaciones o cambios de acuerdo a las caractersticas de las plantas, pero en
trminos generales son comunes al proceso de propagacin in vitro (Prez-
Molphe et al., 1999).

Fase 0, Preparacin de la planta madre.- Para poder establecer el cultivo en
condiciones de asepsia, se deben obtener explantes con un nivel nutrimental y un
grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantes es recomendable
mantener a las plantas madre, es decir la planta donadora de yemas, durante un
perodo de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un
invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en
8

condiciones sanitarias ptimas y con un control de la nutricin y riego adecuados
para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.

Fase 1, Desinfeccin del material vegetal.- Una vez elegida la planta madre, se
extraen los fragmentos a partir de los cuales se obtienen los explantes, que
pueden ser yemas, trozos de hojas, porciones de races, semillas, etc. Antes de
extraer los explantes debe de hacerse una desinfeccin de los fragmentos de
planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los contaminantes ms
comunes son los hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el
ambiente. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en
condiciones de asepsia. A efecto de obtener las condiciones de asepsia, se
trabaja en cabinas de flujo laminar (rea estril de siembra) para extraer los
explantes a partir del material vegetal. Estos explantes se cultivan en frascos
conteniendo el medio de cultivo de iniciacin para poder controlar la sanidad y la
viabilidad, luego de realizar la desinfeccin del material con soluciones
surfactantes o desinfectantes como el hipoclorito de sodio, etanol, agua
oxigenada, a veces suplementadas con antibiticos y fungicidas, en
concentraciones y tiempos de exposicin por definir segn el tipo de explante y de
la plantas que se traten.

Fase 2, Establecimiento in vitro.- Despus de la desinfeccin superficial, las
semillas o las yemas dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio
de cultivo estril. En un perodo de una semana o quince das, comienza el
proceso de germinacin o regeneracin de nuevos tejidos vegetales, iniciando el
ciclo de cultivo in vitro.

Fase 3, Regeneracin in vitro.- Durante esta fase se espera que los explantes que
sobrevivieron originen brotes, embriones somticos o callos (de procedencia axilar
o adventicia). Uno de los mtodos principales de regeneracin de plantas in vitro
es la formacin de yemas axilares en hojas jvenes o primordios de hojas en
meristemos o yemas de tallo que han sido aislados y cultivados in vitro. Todas las
9

plantas formadas por este mtodo son genticamente uniformes y se originan
directamente de meristemos preexistentes o recientemente formados sin
intervencin del estado de callo. La formacin de brotes a partir de callo es
sumamente difcil, y frecuentemente genera anormalidades, no garantizando la
propagacin clonal. El nmero de plantas que se obtiene depender de la especie
vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El nmero de plantas que se
obtiene por la va de la micropropagacin permite alcanzar incrementos
exponenciales, considerando que todos los factores que afectan el crecimiento
hayan sido optimizados.

Fase 4, Formacin de plntulas o enraizamiento.- Para enraizar los brotes se
utilizan principalmente de un tamao aproximado de 2 centmetros. Los brotes
obtenidos durante la fase de multiplicacin se transfieren a un medio libre de
reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo auxinas.,
generalmente cido indolbutrico (AIB). Algunas especies de plantas no necesitan
pasar por esta etapa y emiten sus races en el mismo medio de cultivo donde
desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicacin y
enraizamiento transcurren en forma simultnea.

Fase 5, Transplante y aclimatacin.- Los brotes recin enraizados (plntulas) son
muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el xito o el fracaso de
todo el proceso depende de la aclimatacin. En esta etapa las plantas sufrirn
cambios de diferente tipo que permitirn la adaptacin de las mismas a vivir en
condiciones naturales. En el momento en que se extraen las plntulas de los
frascos, estn poco adaptadas a crecer en condiciones ex vitro, ya que stas han
enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y
generalmente tienen estomas que no son completamente funcionales frente a
descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la
desecacin del explante. Por otra parte, crecer en ambientes tan hmedos
tambin suele implicar la falta de una cutcula con cera bien desarrollada, que
10

representa la barrera fsica para evitar la perdida de agua a lo largo de toda la
superficie de la planta.

Las plntulas deben ser aclimatadas a las condiciones de humedad del
invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando
progresivamente la intensidad de luz. stas se plantarn en contenedores
(almacigueras) cubiertos por un plstico, para mantener la humedad relativa
elevada. La eleccin de un sustrato con buenas caractersticas fsicas, es clave
para el xito de esta etapa. Para el trasplante, debe de elegirse un sustrato suelto,
poroso, con mezcla de arena turba, agrolita (inerte), para permitir un desarrollo y
crecimiento de races muy rpido. Las mezclas son diferentes y muy variadas de
acuerdo a la especie con la que se trabaje. Luego de retirar cuidadosamente el
agar de las races para evitar daarlas, las plntulas se enjuagan y se colocan en
almacigueras con la mezcla de sustratos seleccionada y cubiertos con nylon.
Todos los das se debe controlar el nivel de humedad en las almacigueras. Si es
necesario, se aplica un riego con un pulverizador manual, para mantener un
ambiente hmedo a nivel del sustrato (>90% Humedad relativa). A los 15 das del
trasplante, se puede comenzar a levantar la cobertura de nylon en las horas de
menor calor (temprano en la maana o en la ltima hora de la tarde). Al comienzo,
las plantas se dejan media hora por da destapadas. A la semana siguiente se
dejan destapadas durante una hora. Al mes del trasplante, se dejan tapadas
durante la noche y si hay crecimiento de nuevas hojas, las plantas pueden
permanecer destapadas. Las condiciones del cultivo in vitro, generan cambios en
algunos aspectos anatmicos y fisiolgicos de las plantas, por esta causa, durante
la aclimatacin, los cambios deben ser muy graduales, para minimizar el estrs y
tener mayor tasa de supervivencia.

2.1.2. Regeneracin in vitro

La respuesta regeneradora in vitro incluye la embriognesis somtica (induccin
de embriones somticos) as como la organognesis (formacin de brotes o
11

races), procesos de morfognesis que explantes in vitro seguirn para la
regeneracin de una planta completa (Christianson y Warnick, 1988). La
organognesis se origina por la formacin inicial de meristemoides,
subsecuentemente primordios, brotes y finalmente la formacin de races
adventicias; est se utiliza con mayor frecuencia debido a que se tiene un buen
conocimiento de su biologa en un nmero considerable de especies (Vasil, 1994).
La embriognesis somtica es la formacin de un embrin a partir de una clula,
sin la necesidad de la fusin de gametos (Zimmerman, 1993).

La regeneracin de plantas a travs del cultivo de tejidos puede establecerse tanto
por embriognesis somtica como por organognesis (Tisserat, 1991). El carcter
totipotente de las clulas vegetales y tejidos puede ser expresado por su habilidad
para regenerar plantas va embriognesis u organognesis, ambos procesos
conducen a la regeneracin in vitro y son un principal prerrequisito para la
transformacin gentica. Sin embargo, la aplicacin general de las tcnicas de
transferencia de genes para el mejoramiento de cultivos puede no ser
exitosamente lograda si los procesos que dirigen la morfognesis no son bien
entendidos (Fortes y Pais, 2000).

Organognesis.- Este tipo de regeneracin in vitro consiste en un proceso
morfolgico secuencial que se traduce en la formacin de rganos de novo, que
se puede reproducir a travs de la manipulacin qumica de los medios de cultivo
(Villalobos, 1990; Prez et al., 1999)

En muchas ocasiones los explantes tienen la capacidad de desarrollar brotes,
races, o estructuras florales cuando se cultivan en un medio suplementado con
sales minerales, vitaminas, y una fuente de carbono pero sin hormonas vegetales.
Este proceso puede llamarse organognesis adventicia, la adicin de hormonas
vegetales muchas veces puede facilitarlo, pero no son absolutamente requeridas.
En esta instancia, los inmediatos precursores de nuevos rganos son las clulas
en el explante mismo. El otro tipo de organognesis es la no adventicia e involucra
12

una desdiferenciacin del explante, formacin de tejido calloso alrededor de la
orilla del corte del explante, y la induccin de rganos nuevos del tejido calloso
recientemente formado. El suplemento exgeno de fitohormonas no solamente
controla los procesos pero es necesario para que la organognesis se presente
(Christianson y Warnick, 1988; Woodward, 1997).

Los primeros en demostrar que la organognesis es controlada por el balance
entre auxinas y citocininas en el medio de cultivo fueron Skoog y Miller en 1957
(Minorsky, 2001). Un medio con mayor proporcin de auxina en relacin a
citocinina induce la formacin de races, en tanto que en relacin inversa se
forman brotes y con una relacin intermedia auxina: citocinina se induce
crecimiento desorganizado como tejido calloso.

Frecuentemente es necesario eliminar las citocininas para el alargamiento y el
enraizamiento, segn Von Arnold (1988) la capacidad de enraizamiento de las
yemas est altamente influenciada por la etapa juvenil de la planta madre y la
fuente del explante.

Los estudios de respuesta morfogentica in vitro se basan en combinaciones
diferentes de citocinina/auxina, p.e. al utilizar como explantes hojas de Duboisia
myoporoides y 65 combinaciones de citocinina/auxina se compararon los efectos
sobre la organognesis; dos diferentes tipos de callos fueron inducidos
dependiendo de las combinaciones usadas para la induccin de callos; ningn
brote con raz fue regenerado de los callos inducidos con 7 diferentes
combinaciones citocinina/auxina (Khanam et al., 2000).

Los sistemas ms estudiados en la organognesis in vitro han sido los de tabaco y
zanahoria, el modelo de tabaco se ha empleado desde los aos 40 para analizar
los factores relacionados con la formacin de rganos (Hurtado y Merino, 1994). El
cultivo de callo organognico es relativamente fcil a partir de plantas herbceas,
con el cultivo de tallos, hojas y pecolos. En especies perennes debe utilizarse
13

tejido celular activo (pices y meristemos). Una alta concentracin de auxinas y
una baja concentracin de citocinina, resulta en la formacin del callo, incluso
puede omitirse el uso de una citocinina, ya que esto es indispensable para una
mejor proliferacin del callo. Si la citocinina se omite para callo, se adiciona para la
proliferacin de brotes (Tisserat, 1991).

2.1.3. Micropropagacin de frutales

La biotecnologa es una herramienta que se puede emplear para la propagacin in
vitro de especies de alta importancia econmica como las frutales, bien sea
mediante el establecimiento in vitro de algn segmento de la planta (asexual) o a
partir de la siembra de semilla (sexual), para lo cual se requiere establecer cultivos
in vitro, un sistema de regeneracin de una planta completa a travs de
embriognesis somtica o por el sistema de organognesis que permita la
multiplicacin, el enraizamiento y la aclimatacin de los genotipos seleccionados.
Con el cultivo de tejidos vegetales in vitro se proporcionan ventajas de calidad
sanitaria en la produccin de plantas, puede disminuirse el tiempo para propagar
una especie importante y se garantiza la similitud gentica del material parental,
por la reproduccin clonal. Adems se ofrece este procedimiento en el
mejoramiento gentico y en la preservacin de germoplasma (Villalobos, 1990).

La mayora de los estudios realizados sobre micropropagacin se han llevado a
cabo en ms de 50, 000 variedades de ms de 1, 000 especies de plantas
ornamentales, agrcolas, forestales y en especies de uso industrial. Desde 1978, la
produccin comercial de algunas especies frutales por este mtodo se ha llevado
a cabo; son ejemplo de ello la produccin de portainjertos para manzano y
durazno en Europa, portainjertos de cerezo y ciruelo. Otras plantas de frutos
pequeos y cultivos de nuez como arndano o blueberry, frambuesa, grosella,
nogal, almendro y pistache, tambin han sido micropropagados aunque en menor
escala (Krikorian, 1991).

14

Ahora bien, la regeneracin de plantas a partir de cultivo in vitro de ciertas
especies leosas, exige la bsqueda de tcnicas complejas. Estas deben permitir
a las plantas sobrevivir a los problemas de oxidacin, heterogeneidad de
respuesta y sobre todo a la ambientacin cuando son trasplantadas a un sustrato
y expuestas a las condiciones naturales. Por otro lado, es comn que se cite como
desventaja de la micropropagacin, los posibles problemas de variabilidad
gentica. Este tipo de variaciones, pueden llegar a ser un problema menor en
plantas ornamentales, pero con cultivos frutales y especies forestales, la
estabilidad fenotpica es esencial. Este inconveniente se soluciona restringiendo el
nmero de subcultivos realizados y de hecho, aquellos laboratorios que producen
plantas certificadas deben cumplir con este requisito renovando el material de
partida cada ao. Es de importancia, adems, evaluar en campo el crecimiento y
desarrollo de las plantas micropropagadas, como as tambin tener conocimiento
del comportamiento general de la planta con relacin al destino final que se le dar
a la misma (Pardos y Toribio, 1984).

La necrosis en los tejidos al establecerlos in vitro, que es el oscurecimiento de
stos debido a la oxidacin de los polifenoles presentes en las clulas vegetales
por la accin de las peroxidasas y las polifenoloxidasas, puede ser reducida en
algunas ocasiones con la adicin de algunos compuestos qumicos como polivinil
pirrolidona (PVP), cistena, tidiazurn (TDZ), carbn activado, entre otros; este
problema representa una de las ms grandes dificultades (Haines, 1994).

Con la micropropagacin de especies arbreas o leosas, se permite eliminar los
problemas relativos a la duracin de los ciclos de desarrollo que comprenden
desde la siembra de la semilla hasta la floracin, lo cual ha hecho difcil la
aplicacin de programas de mejoramiento convencional para estas especies. La
aplicacin de tcnicas de cultivos de tejidos en conferas y otras especies leosas,
como frutales, ofrece una alternativa valiosa para la propagacin clonal de rboles
elite (con caractersticas importantes de crecimiento y desarrollo), as como un
15

modelo experimental para estudios morfognicos fisiolgicos y bioqumicos
(Prez-Ponce et al., 1998).

Los mtodos tradicionales de propagacin en especies leosas se han basado
principalmente en la siembra de estacas e injertos. Sin embargo, existen muchas
especies en las cuales la produccin de estacas enraizadas es muy difcil, debido
a una serie de problemas que varan entre especies y an entre rboles.
Generalmente, se ha sealado que la capacidad y velocidad de enraizamiento y la
longitud de las races, disminuye a la par que aumenta la edad del rbol donador.
Sin embargo, en algunas especies esta caracterstica no es un problema, mientras
que en otras an en estado juvenil muestran una baja eficiencia en el proceso de
enraizamiento (Orea y Villalobos, 1990).

Al ser la micropropagacin una tcnica que requiere una labor intensiva y de mano
de obra especializada, los costos de las plantas micropropagadas, muchas veces,
superan a los de las plantas producidas en forma tradicional. Actualmente existe
una tendencia a eliminar algunos pasos involucrados y a simplificar los procesos
con el fin de reducir costos. An as, es importante tener en cuenta el valor que,
desde el punto de vista productivo, posee un material producido in vitro.
En cuanto a los inconvenientes tcnicos a solucionar, se encuentra la correcta
planificacin del sistema de produccin y la necesidad de contar con una
infraestructura mnima, aspectos mencionados anteriormente. A pesar de que en
la bibliografa se cita la posibilidad de obtener miles de plntulas a partir de una
sola yema, meristemo o microestaca, en la realidad, si no se planifica
adecuadamente el sistema y se cuenta con un laboratorio bien equipado, el
manejo del material luego de numerosos subcultivos puede tornarse impracticable
y producir prdidas econmicas considerables (Prez-Molphe et al., 1999).

Diversos estudios sobre micropropagacin se han llevado con xito para muchas
especies frutales como arndano, ctricos, durazno, guanbana, manzano,
papayo, pera, pltano, vid, etc. (Cuadro 1).
16

Cuadro 1. Ejemplo de algunos rboles frutales micropropagados.

ESPECIE RESPUESTA in vitro REFERENCIA
Citrus aurantifolia
(Lima)
Brotes en yemas axilares
(MS BA 1 mg/L y 0.5 mg/L
KIN).
Jameel y Al-Bahrany,
2001.
Annona muricata
(Guanbano)
Establecimiento de yemas
axilares y apicales.
Rivero-Maldonado et al.,
2001.
Musa paradisiaca
(Pltano)
Cormos en pices (MS con
10-15 mg/L BA)
Priyono, 2001.
Citrus spp
(Naranjo y Mandarino)
Embriones somticos en
callos (Medio MT Sacarosa
50 g/L y Extracto de malta
500 mg/L)
Ricci et al., 2002.
Annona cherimola Mill.
Chiromoya
Brotes en secciones nodales
(MS con 2.28 M zeatina)
Padilla y Encina, 2003.
Prunus spp.
(Duraznero)
Brotes en yemas apicales y
laterales (Medio Lepoivre
con 0.5 mg/L de BA)
Silva et al., 2003.
Persea americana var.
drymifolia
Aguacate criollo
mexicano
Embriones somticos en
tejido nuclear (MS con 0.1
mg/L Picloram)
Leal-Nares et al., 2004
Malus X Domestica
BORKH. (Manzano)
Brotes en discos de hoja
(MS con 5 mg/L de BA y 1
mg/L de ANA)
Erig y Schuch, 2005.
Carica papaya L. Cv.
Maradol
(Papayo Cubano)
Brotes en yemas apicales y
axilares (MS con 0.5 mg/L
de KIN).
Carreto et al., 2006.
Vaccinium
cylindraceum Smith
(Arndano)
Brotes en yemas axilares y
apicales (Medio Zimmerman
y Broome con 24.6 M de 2-
iP)
Pereira, 2005
Rubus spp.
(Cerezos)
Brotes en yemas axilares
(MS con 2.0 mg/L de BA y
0.5 mg/l de AIB)
Ruzin y Lazic, 2006.
Citrus jambhiri Lush.
(Limn)

Brotes en callos o yemas
axilares (MS con 3 mg/L de
BA)

Shawkat y Mirza, 2006.
AIB= cido indol-3-butrico; ANA= cido naftalenactico; BA=benciladenina;
KIN=cinetina; 2iP= Isopenteniladenina.


17

Con base en la problemtica de indeterminacin de un protocolo comn para el
establecimiento y regeneracin in vitro para todas las plantas, debido a que los
tejidos difieren en su capacidad de respuesta, es necesario continuar con
investigaciones en diversas plantas, sobre todo en aquellas donde no se han
encontrado las condiciones ptimas del cultivo para lograr procesos de
organognesis o embriognesis somtica in vitro y as ofrecer un conocimiento
ms amplio que lleve a determinar qu o cules factores son determinantes en la
regeneracin de plantas in vitro.

2.2. GUAYABO (Psidium guajava L.)

El guayabo es un rbol de la familia Myrtaceae, que produce la guayaba
considerada como una de las frutas tropicales ms valiosas, una de las ms
conocidas y cultivadas en las regiones tropicales y subtropicales, crece en forma
silvestre desde Mxico hasta Brasil y Per, por que su origen es considerado en
Amrica tropical. Es un fruto que presenta grandes posibilidades en los mercados
nacionales y extranjeros. Con esta fruta se preparan jaleas, mermeladas,
conservas, bocadillos, as como jugos y helados. Adems que es una fruta con un
alto grado nutrimental ya que tiene 5 veces ms cido ctrico que la naranja
(Cathey y Brickell, 2004).

La guayaba tambin es conocida como xalxocotl o guayabilla, araz, arrayn,
hurapo, luma, parcha, piche o sahuinto en varios pases de Centro y Sudamrica.
Esta planta tiene un uso muy antiguo y actualmente es importante para tratar casi
medio centenar de padecimientos en casi todo el pas. Es utilizada con frecuencia
en enfermedades gastrointestinales como diarrea, escalofros y dolor de
estmago, mediante la infusin de las hojas tres veces al da o como agua de uso;
tambin puede tomarse con leche, bicarbonato, azcar y hojas de hierbabuena.
En Panam se emplea en cocimiento para tratar la debilidad y vmito; la coccin
de las hojas sirve para la disentera y los clicos. En padecimientos de la piel, las
hojas solas o mezcladas con otras hierbas, se ponen a hervir y despus se aplican
18

de forma local en lavados o cataplasmas. Por otro lado, se recomienda para la
caries, hinchazn, bilis, escarlatina, hemorragia vaginal, heridas, fiebre y
deshidratacin (Malo et al., 2005).

La guayaba es difcil de propagar por los mtodos usuales. La propagacin por
semillas an se usa comnmente a pesar de que no se replican las caractersticas
de la planta progenitora. El mtodo de propagacin ms fcil es el acodo, pero
tiene poca utilidad prctica cuando se requieren grandes cantidades de rboles y
el material que servir como fuente es limitado. Los injertos laterales y de pas
tienen xito slo cuando los patrones son jvenes y vigorosos (el dimetro de los
troncos no debe exceder a 1 cm) y las yemas provengan de ramas terminales que
an estn verde y tenga forma cuadrangular. Las estacas con hojas producen
races si se colocan en una cmara nebulizadora.

La propagacin de esta especie se lleva a cabo mediante el uso de estacas; sin
embargo, es un mtodo de baja eficiencia, debido a que una alta fenolizacin
impide el buen enraizado y, por otro lado, la existencia limitada de plantas
donadoras en algunas variedades. El injerto y acodo se afectan severamente por
la contaminacin ambiental, por lo que se emplean con poco xito para obtener
grandes cantidades de plantas. La semilla constituye otro mtodo de propagacin
convencional. La mayora de la planta de guayabo para cultivo se produce en
Calvillo, Aguascalientes (SAGARPA, 2004).

El fruto de guayaba tiene gran demanda en Mxico y en el extranjero, tanto para
consumo en fresco, como para la industria procesadora. La guayaba en Mxico se
cultiva en 22 mil 764 hectreas ubicadas en alrededor de 20 estados de la
Repblica, sin embargo la principal produccin (ca. 98%) se concentra en los
Estados de Michoacn, Aguascalientes y Zacatecas generando una produccin de
ms de 300 mil toneladas anuales, con un valor superior a los 863 millones de
pesos (SAGARPA, 2006).
19

Entre las variedades de guayaba que ms se cultivan en Mxico son: Regional de
Calvillo, China, Media China, La Labor, Acaponeta, Coyame y Criollos, adems de
las muy conocidas Hawai 74 (pulpa rosa con semilla), Lucknow (pulpa blanca con
semilla) y Java (pulpa blanca sin semilla). Esta ltima tiene gran potencial para la
industria de transformacin por que presenta mayor cantidad de pulpa y es ms
fcil su procesamiento ya que no se tienen que eliminar semillas. Esta expectativa
de industrializacin de la variedad blanca sin semilla, permite estimar que la
produccin se incrementar para poder cubrir la demanda (SAGARPA, 2004).

Michoacn tiene el primer lugar en produccin a nivel nacional, con ms 6000 Has
de superficie total sembrada, ms del 95% es de riego. Las principales zonas
productivas son Zitcuaro, Tuxpan, Jungapeo y B. Jurez, donde se cultivan
diversas variedades. En el 2002, se produjeron 101,693 toneladas de guayaba con
un valor aproximado de $ 358,909,828.00 pesos MN (SAGARPA, 2006).

2.2.1. Descripcin botnica

El guayabo es un rbol pequeo que alcanza 6 m de altura y posee una copa
amplia y extendida que se ramifica cerca del suelo. El tronco es corto, de color
verdoso-carmelitoso a carmelita claro y est cubierto de una cscara escamosa.
Las hojas son opuestas y de forma oblongada. Tienen de 3 a 7 pulgadas de
longitud y poseen venas prominentes en el envs. El envs posee tambin
pequeos pelitos, especialmente cuando son jvenes. Las flores son blancas, de
aproximadamente 2.5 cm de dimetro y se disponen en pequeos grupos o
individualmente en las axilas de hojas recin formadas. La autopolinizacin es
posible pero la polinizacin por insectos produce mayores rendimientos. La forma
de los frutos puede ser redonda, ovoide o piriforme y vara el color de la pulpa
segn la variedad (Malo et al., 2005).

El peso vara entre una onza y una libra. El color de la cscara usualmente es
amarillo, mientras que la pulpa puede ser blanca, amarilla, rosada o roja. Los
20

frutos pueden variar desde poseer una cscara delgada que rodea una pulpa firme
con numerosas semillas hasta poseer una cscara gruesa y una pulpa blanda con
pocas semillas. El sabor vara de dulce hasta altamente cido. Poseen un aroma
caracterstico que va desde ser fuerte y penetrante hasta suave y agradable. Los
frutos se producen y maduran prcticamente durante todo el ao, pero la mayor
parte de la produccin ocurre durante los meses del verano (Cathey y Brickell,
2004).

Guayaba Variedad China.- El rbol es de crecimiento vigoroso y rpido, produce
frutos varias veces al ao, grandes y redondos de hasta 4 pulgadas o ms de
dimetro, con pocas semillas. Piel delgada amarillo plida. La pulpa es firme
blanca cremosa, dulce de sabor delicioso. Tiene alto contenido en pectina, ideal
para jaleas y mermeladas (Figura 1A) (Gonzlez-Gaona et al., 2004).

Guayaba Variedad China Rosa.- Esta variedad se caracteriza por ser un rbol
de copa piramidal, con un hbito de crecimiento semierecto, con una dimensin
desde el nivel del suelo de ms de 5 metros y una distribucin de ramas irregular.
Las hojas son de forma elpticas, de naturaleza ondulada con flores solitarias y/o
dispuestas en grupos. El fruto es una baya de forma esfrica, cncavo en sus
extremos, con pulpa de color rojo, epidermis fina, casco delgado y de tamao
hasta de 5 pulgadas y con un promedio de peso de 250 g (Figura 1B) (Gonzlez-
Gaona et al., 2004).

2.2.2. Micropropagacin de guayaba

Se ha reportado la propagacin in vitro de algunas variedades de guayabo a partir
de fragmentos de plntulas (Loh y Rao, 1989; Papadatou et al., 1990) y tambin a
partir de tejido adulto utilizando segmentos nodales (Amin y Jaiswal, 1987; Loh y
Rao, 1989; Broodrijk, 1990; Fitchet, 1990). Sin embargo, la regeneracin de estas
plantas al utilizar material adulto, al igual que ocurre con un gran nmero de
especies leosas, an presenta problemas, principalmente durante la etapa de
21

iniciacin (Claudebon et al, 1988; Broodrijk, 1990; Fitchet, 1990; Marks y Simpson,
1990; Dalal et al., 1992).

Prez y col. (2002) han reportado con xito la regeneracin in vitro de Psidium
guajava L. var. Enana Roja Cubana EEA 18-40 a partir de pices y segmentos
nodales de plantas cultivadas in vitro. Los mejores resultados se alcanzaron
cuando se utilizaron como explantes los segmentos apicales y se colocaron en
medio MS (Murashige y Skoog, 1962) con el suplemento de 0.5 mg/l de
benciladenina (BA) durante 30 das, logrndose un coeficiente de multiplicacin de
4.03.

En el caso de guayabo, sobre todo de variedades o cultivares con problemas de
propagacin debido a la baja eficiencia de enraizamiento por estacas y prdida de
caractersticas cuando se propaga por semilla, debido a la variabilidad gentica,
es importante plantear o establecer nuevas alternativas de propagacin, una de
stas puede ser la micropropagacin, con la cual se puede mantener la
homogeneidad de las plntulas.












Figura 1. Frutos de guayaba (Psidium guajava L.), A) Var. China; B) Var. China
Rosa.
A B
22


Adems, en nuestro pas, incluyendo nuestro Estado Michoacn, no se cuenta con
sistemas de propagacin de cultivares o variedades de guayabo de forma masiva,
de manera que cuando se requieren plntulas para siembra en grandes reas de
cultivo, es difcil obtenerlas ya que hay pocos sitios de propagacin nacional. Las
variedades estudiadas en la presente investigacin no estn patentadas, debido a
que han sido seleccionadas de materiales o genotipos criollos de la regin o de
zonas productoras de guayaba.

Los productores de Guayaba de la zona de Taretan, Michoacn (Guayaberos
Unidos del Centro de Michoacn C.P.R. de R. L y FRUMICH S.S.S de R. L.),
requieren un nmero grande de plntulas para su siembra masiva.
23

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GENERAL

Obtener la regeneracin de brotes de dos variedades de guayabo (Psidium
guajava L.) a travs del cultivo in vitro de yemas apicales y laterales para lograr su
micropropagacin.


3.1.1. OBJETIVOS ESPECFICOS

1. Establecer las condiciones de asepsia y cultivo in vitro de semillas de las
variedades de guayabo, China y China Rosa
2. Determinar las dosis y tipos de reguladores de crecimiento ptimas para
la regeneracin in vitro de brotes en yemas apicales y laterales, as
como la formacin de plntulas de ambas variedades.
3. Desarrollar la propagacin masiva y conseguir la aclimatacin de
plntulas de guayabo variedad China y variedad China Rosa.


24

4. MATERIALES Y MTODOS

4.1. MATERIAL BIOLGICO

Se colectaron semillas de frutos maduros de guayabo Var. China y Var. China
Rosa en Taretan, Michoacn, para establecer los cultivos in vitro.

4.2. ESTABLECIMIENTO IN VITRO

A fin de micropropagar plantas de guayabo (Psidium guajava L.) a partir de la
siembra de yemas axilares de plntula in vitro (de semilla), se eligi el mtodo de
asepsia ms eficiente comnmente utilizado. Las semillas se cultivaron en el
medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) (Cuadro 2) y fueron incubadas en
cuarto de crecimiento con temperatura y luz controladas.

4.2.1. Mtodo de asepsia para semillas

Para el establecimiento in vitro se realiz la siguiente rutina de desinfeccin
superficial, en semillas recin extradas de los frutos maduros:

1.- Se sometieron a lavado con agua corriente para eliminar la pulpa y separar
las semillas.
2.- El segundo paso consisti en inmersin en detergente (Hyclin, 15%, 15 min),
con lavado final con agua corriente.
3.- Posteriormente se colocaron en etanol al 70% por 3 min, se retir el etanol
sin enjuagar.
4.- Se sumergieron en agua oxigenada (3%) durante 3 min, tambin sin
enjuagar al final del procedimiento.
5.- Finalmente se colocaron 20 min. en la solucin de hipoclorito de sodio
comercial al 20%, adicionado con 1 g/L del fungicida Tecto-60 (tiobendazol
25

60%, Syngenta) y 1 g/L del germinicida cido dicloro-isocianurato de sodio
(NaDCC, Sigma).

6.- Previo a la siembra in vitro, las semillas fueron enjuagadas por tres veces con
agua destilada estril, en rea estril (campana de flujo laminar), para ser
cultivadas en medio MS con 0.05 mg/L de benciladenina (BA), con 20 g/L de
sacarosa, 7 g/L de agar, el pH se ajust a 5.75 con KOH 1N..

Se utilizaron cinco frascos para cada variedad en cada frasco, con la siembra de
20 semillas por frasco. La incubacin fue en cuarto de cultivo (25C 2 C, 16 h de
luz, 2000 lux) y se determin el porcentaje y tiempo de germinacin, con
observaciones realizadas cada 15 das.


Cuadro 2. Constituyentes del medio de cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962).

Componente mg/l
(NH
4
) NO
3
1 650
KNO
3
1 900
Ca Cl
2
2 H
2
O 440
Mg SO
4
7 H
2
O 370
FeSO
4
7 H
2
O 27.8
Na
2
EDTA 37.3
MnSO
4
4H
2
O 22.3
ZnSO
4
H
2
O 8.6
H
3
BO
3
6.2
KI 0.83
Na
2
MoO
4
2 H
2
O 0.25
Cu SO
4
5 H
2
O 0.025
Co Cl
2
6 H
2
O 0.025
Myo-Inositol 100
Ac. Nicotnico 0.5
Piridoxina HCl 0.5
Tiamina HCl 0.1
Glicina 2.0
Sacarosa 30 000
pH 5.7-5.8

26

4.3. DESARROLLO DE PLNTULAS DE SEMILLA IN VITRO

El crecimiento de las plntulas obtenidas por siembra de semillas in vitro, de las
variedades China y China Rosa, se determin cada 15 das, midiendo altura (cm),
nmero de hojas y nmero de races.

4.4. REGENERACIN DE BROTES

Las plntulas obtenidas de las semillas cultivadas in vitro fueron utilizadas como
fuente de explantes (segmentos de yemas axilares o apicales) para estudios de
morfognesis, determinando la induccin de brotes.

Los explantes fueron cultivados en medio MS adicionando con 30g/l sacarosa, 7
g/L de agar y con pH 5.7, con los reguladores de crecimiento en combinacin,
acido naftalenactico y benciladenina (ANA/BA) y cido indolactico y cinetina
(AIA/KIN), en dosis entre 0 y 10 mg/l, siendo 35 diferentes tratamientos para cada
combinacin de reguladores (Cuadro 3). El cultivo se hizo a 25 2C, fotoperodo
de 16 horas de luz (2000 lux). Los parmetros a evaluar fueron el nmero de
brotes y el tamao de stos (cm) as como caractersticas de vigor, color y
desarrollo (si existen o no malformaciones), cada 15 das.

Cada 15 das se hicieron observaciones de las caractersticas de los explantes
(contaminacin, necrosis y respuesta) para seleccionar el mejor tratamiento
inductor de callo y brotacin mltiple directa.

4.5. ENRAIZAMIENTO

Para conseguir el enraizamiento de los brotes, se determin el efecto de la auxina
cido indolbutrico (AIB) en dosis desde 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0 y 10 mg/L,
utilizando el medio MS completo o a la mitad de sus componentes, con 20 g/L de
27

sacarosa y 7 g/l de agar. Se determin el nmero de races y su longitud (cm) as
como las caractersticas principales de las plntulas (nmero de hojas y altura).

Cuadro 3. Tratamientos con auxina/citocinina (ANA/BA, AIA/KIN, mg/L) para la
induccin de brotes en yemas axilares de las dos variedades de
guayabo.

































No.
TRATAMIENTO
ANA AIA BA KIN
1 0 0
2 0.1 0
3 0.25 0
4 0.5 0
5 1.0 0
6 0 0.1
7 0.1 0.1
8 0.25 0.1
9 0.5 0.1
10 1.0 0.1
11 0 0.5
12 0.1 0.5
13 0.25 0.5
14 0.5 0.5
15 1.0 0.5
16 0 1.0
17 0.1 1.0
18 0.25 1.0
19 0.5 1.0
20 1.0 1.0
21 0 2.5
22 0.1 2.5
23 0.25 2.5
24 0.5 2.5
25 1.0 2.5
26 0 5
27 0.1 5
28 0.25 5
29 0.5 5
30 1.0 5
31 0 10
32 0.1 10
33 0.25 10
34 0.5 10
35 1.0 10
28

Para obtener la formacin de races y buen desarrollo de las plntulas, se
cultivaron brotes en medio MS con o sin auxina (cido indol-3-butrico, AIB),
disminuyendo la cantidad de nutrimentos (MS1/2), con 20 g/L de sacarosa. Se
determin el nmero y tamao de las races cada 15 das. Adems con el
propsito de definir un medio de cultivo con mejores efectos para el enraizado de
los brotes de guayaba, stos fueron cultivados en mismos medios de cultivo, pero
variando la concentracin de sacarosa (40, 30, 20 y 10 g/L), determinando nmero
y tamao de las races, as como altura de las plntulas, a los 30 y 60 das de
cultivo.

4.6. TRASPLANTE Y ACLIMATACIN

Las plntulas micropropagadas se cultivaron en turba (peat-moss)/agrolita 2:1
como sustrato, para determinar su sobreviviencia, crecimiento y desarrollo, en
condiciones de laboratorio. El riego se realiz por aspersin, manteniendo una
humedad relativa por arriba del 70%.

4.7. ANLISIS ESTADSTICO

En todos los experimentos in vitro se utiliz una n=10. Los datos se analizaron por
el mtodo de anlisis de varianza (ANOVA) y se compararon las medias con la
prueba de Tukey-Kramer ( =0.05), utilizando el paquete estadstico SPSS de
Windows (9.0). Los datos se presentan como la media ms el error estndar.
Para el anlisis estadstico de valores determinados en porcentajes (%), stos
fueron transformados por la funcin Arcoseno (X).
29

5. RESULTADOS Y DISCUSION

La presente investigacin fue realizada con el fin de establecer las condiciones
ideales para conseguir la micropropagacin de guayabo (Psidium guajava L.) de
dos diferentes variedades (China y China Rosa), debido a que no existen sistemas
de cultivos in vitro, de estas plantas.

5.1. ESTABLECIMIENTO in vitro

El xito de la propagacin depende de proporcionar las condiciones ambientales
debidas como la humedad, temperatura, oxgeno, luz u oscuridad, a las semillas y
plntulas resultantes hasta que se establezcan bien. En el caso de las plntulas in
vitro de ambas variedades de guayabo (China y China Rosa), stas fueron
obtenidas exitosamente por la germinacin in vitro de semillas, al cultivarlas en MS
con 0.05 mg/L de BA, aunque hubo contaminacin en general para ambas
variedades, con un 20%, tanto por bacterias como por hongos.

La germinacin inici a los 8 y 10 das del cultivo, para Var. China y China Rosa,
respectivamente. A los 15 das de su cultivo, se consigui un 77% para Var. China
Rosa y un 85% para el Var. China, observando plntulas de hasta 0.75 cm de
altura con el desarrollo de 2 hojas. A este tiempo, las plntulas presentaron un
incipiente sistema radical, de apenas 2 mm de longitud (Figuras 2A). A los 30 das
se lograron los mximos porcentajes de germinacin, con un 88% para Var. China
y un 94% para Var. China Rosa, a los 45 y 60 das del cultivo, no se not un
aumento en este proceso. El crecimiento de las plntulas fue progresivo,
alcanzando los 2 cm a los 30 das de cultivo, en ambas variedades. A los 60 das,
la altura fue de 3.5 cm y de 3.7 cm, para Var. China y Var. China Rosa,
respectivamente, mximo crecimiento determinado, similar al presentado a los 45
das. Estas plntulas desarrollaron en promedio de 4 a 6 hojas por plntula, con
hasta dos races en promedio de 1.2 cm de largo (Figura 2B y 3).

30



Figura 2. Porcentajes de germinacin de semillas cultivadas in vitro (A) y altura
de las plntulas (B) de guayabo Var. China y Var. China Rosa,
determinados a los 15, 30, 45 y 60 das de cultivo. Asterisco (*)
significa diferencias estadsticas a un nivel de confianza P<0,05,
segn comparacin mltiple de medias de Tukey-Kramer (n=10).

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
15 30 45 60
Tiempo (Das)
G
e
r
m
i
n
a
c
i

n

(
%
)
Cv. China Cv. China Rosa
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
15 30 45 60
Tiempo (Das)
A
l
t
u
r
a

(
c
m
)
Cv. China Cv. China Rosa
*
* *
*
B
A
Var. China Var. China Rosa
Var. China Var. China Rosa
31







Figura 3. Plntulas a los 60 das de su cultivo in vitro en MS con 0.05 mg/L de
BA: A, Guayabo Var. China; B, Guayabo Var. China Rosa.




Tanto en el proceso de germinacin como en el crecimiento de las plntulas
(altura), no se encontraron diferencias significativas segn el anlisis estadstico
realizado, para ambas variedades de guayabo en estudio. Si hubo diferencias en
el crecimiento entre los tiempos de la determinacin, a los 15 y 30 das del cultivo,
con diferencia significativa a los 45 y 60 das de cultivo (Figura 2B).

Debido al buen xito de la germinacin de este tipo de semillas, no fue necesario
utilizar mtodos de escarificacin, as como evitar la adicin de los medios de
cultivo de reguladores de crecimiento, como el cido giberlico. Lo anterior se
recomienda solo para especies con recalcitrancia germinativa como Tilia mexicana
A
B
32

(Atrin-Mendoza, 2005) y algunas otras plantas como las cactceas, donde los
porcentajes de germinacin son muy bajos.

Solo la adicin de una dosis baja de citocinina (0.05 mg/L BA), pudo haber
favorecido el obtener altos porcentajes de germinacin en las dos variedades de
guayabo, comprobando lo ocurrido durante la germinacin in vitro de pitayo
(Stenocereus quevedonis) y de algunas orqudeas cultivadas in vitro en nuestro
laboratorio (Sarabia, 2001; Huapeo, 2004). Asimismo, estos altos porcentajes de
germinacin y obtenidos en un lapso corto, pudo haber influido a que las semillas
fueron colectadas de frutos maduros, con ptimo desarrollo de los embriones que
an no se encontraban en latencia. Las semillas de frutos que pasan por etapas
de secado y deshidratacin, desarrollan generalmente una cubierta dura (testa),
que evita la entrada de agua, disminuyendo la capacidad regenerativa (Bewley y
Black, 1982). Por ello, se hace necesario inducir la germinacin con el uso de la
escarificacin o adicin de sustancias reguladoras.


5.2. DESARROLLO DE BROTES


Plntulas in vitro del guayabo Var. China Rosa, de 60 das de cultivo, despus de
la germinacin (Figura 4A), se utilizaron como fuente de explantes (yemas
apicales y axilares), para su siembra en MS con reguladores de crecimiento
(ANA/BA y AIA/KIN) (Figura 4B), debido a que se tuvo un nmero mayor de
plntulas de esta variedad.

La determinacin del nmero de brotes se realiz cada 15, 30, 45 y 60 das del
cultivo, promediando stos por explante (yema). La brotacin fue dependiente de
la concentracin y tipos de reguladores de crecimiento, encontrando una mejor
respuesta de los explantes al ser cultivados en MS con ANA/BA que con AIA/KIN.
El nico tratamiento de esta ltima combinacin, donde hubo la formacin de
brotes, fue el T10 con 0.1 mg/L de AIA y 1.0 mg/L de KIN, en el cual se produjeron
solo 0.75 brotes/explante.
33

De los 35 tratamientos evaluados para la induccin de brotes en yemas de
plntulas de guayabo Var. China Rosa, tan solo en diez de ellos, la formacin de
brotes rebas los producidos en el tratamiento control (sin reg. de crecimiento). En
el cuadro 4 se muestra el nmero de brotes/explante de los tratamientos
utilizados, contra lo obtenido en el tratamiento control, donde solo se desarroll un
brote (Figura 4C): a los 15 das del cultivo, solo en la combinacin ANA/BA de
T11, T12, T21, T23 y T27, se logr un nmero promedio entre 2 y 3
brotes/explante; este nmero ligeramente aument a los 30 das del cultivo, con
hasta 3, 3.5 y 4 brotes/explante, en los tratamientos T27, T11 y T12,
respectivamente. En tratamientos como T17 (0.1/1.0), T21 (0/2.5), T23 (0.25/2.5),
T29 (0.5/5.0) y T30 (1.0/5.0), tan solo se duplic el nmero de brotes, respecto al
tratamiento control (T1, 0/0). En la Figura 4D se muestra la fotografa de brotes
desarrollados en el tratamiento T12, con el mximo nmero producidos.




Figura 4. Fotografas del sistema de produccin de brotes de guayabo (P.
guajava Var. China Rosa): A, Plntula de 60 das de cultivo, fuente
de explantes; B, Yemas axilares o apicales en medio MS con
reguladores de crecimiento para la produccin de brotes; C,
Desarrollo del brote en tratamiento control, MS sin reguladores de
crecimiento; D, Regeneracin de brotes en yemas cultivadas en MS
con 0.5 mg/L de ANA ms 0.1 mg/L de BA (T12).
A B C D
34

Cuadro 4. Nmero de brotes producidos en yemas apicales y axilares de P.
guajava Var. China Rosa, en los diferentes tratamientos con
ANA/BA.







































Valores con diferente letra, son estadsticamente diferentes, a un nivel de
confianza P<0.05, segn comparacin mltiple de medias de Tukey-Kramer
(n=10).
TRATAMIENTO
(ANA/BA)
Nmero de Brotes/Explante
15 Das 30 Das
Promedio Desv. Std. Promedio Desv. Std.
1 (0/0) 1 d
0.123
1 e
0.117
2 (0.1/0) 1.75 bc
0.211
1.75 d
0.198
3 (0.25/0) 1.25 cd
0.177
1.5 de
0.114
4 (0.5/0) 1 d
0.099
1.25 e
0.133
5 (1.0/0) 1 d
0.118
1.25 e
0.137
6 (0/0.1) 1.75 bc
0.209
1.75 d
0.199
7 (0.1/0.1) 1 d
0.0887
1.25 e
0.188
8 (0.25/0.1) 1.25 cd
0.137
1.25 e
0.107
9 (0.5/0.1) 1 d
0.131
1.5 de
0.142
10 (1.0/0.1) 1.25 cd
0.147
1.75 d
0.201
11 (0/0.5) 2.75 a
0.315
3.5 a
0.411
12 (0.1/0.5) 2.25 ab
0.299
4.0 a
0.377
13 (0.25/0.5) 1.5 c
0.189
2.25 bc
0.211
14 (0.5/0.5) 1 d
0.099
1.75 d
0.201
15 (1.0/0.5) 1.25 cd
0.147
1.25 e
0.157
16 (0/1.0) 1.5 c
0.139
1.75 d
0.147
17 (0.1/1.0) 1.5 c
0.122
2 c
0.112
18 (0.25/1.0) 1.25 cd
0.117
1.5 de
0.098
19 (0.5/1.0) 1.25 cd
0.127
1.25 e
0.126
20 (1.0/1.0/ 1 d
0.085
1 e
0.097
21 (0/2.5) 2 b
0.213
2 c
0.118
22 (0.1/2.5) 1 d
0.111
1.25 e
0.133
23 (0.25/2.5) 2 b
0.225
2 c
0.219
24 (0.5/2.5) 1.25 cd
0.175
1.25 e
0.175
25 (1.0/2.5) 1.5 c
0.177
1.75 d
0.099
26 (0/5.0) 1.25 cd
0.198
1.25 e
0.219
27 (0.1/5.0) 3 a
0.315
3 ab
0.312
28 (0.25/5.0) 1.75 bc
0.210
2.5 b
0.278
29 (0.5/5.0) 1.5 c
0.178
2 c
0.207
30 (1.0/5.0) 1.5 c
0.112
2 c
0.199
31 (0/10.0) 1 d
0.121
1 e
0.117
32 (0.1/10.0) 1.5 c
0.078
1.75 d
0.188
33 (0.25/10.0) 1.75 bc
0.112
1.75 d
0.154
34 (0.5/10.0) 1 d
0.088
1 e
0.096
35 (1.0/10.0) 1 d
0.115
1 e
0.107
35

A pesar de haber probado un gran nmero de tratamientos con la combinacin de
ANA/BA y AIA/KIN, no se observ la formacin de callos en este tipo de explantes
de guayabo. El desarrollo de callo en plantas leosas, generalmente se induce con
la adicin de auxinas sintticas de alta actividad como el 2,4-D (cido 2,4-
diclorofenoxiactico, picloram o dicamba o en concentraciones ms altas de ANA
o AIA (> 1.0 mg/L) (Pierik, 1990; Dodds y Roberts, 1995; Das et al., 2000) Debido
a que se propuso conseguir la multiplicacin de brotes de manera directa, sin
formacin de callo, los explantes de guayabo solo fueron cultivados en medio de
cultivo con dosis relativamente bajas de auxina (0 a 1 mg/L), ANA AIA, con
mayores concentraciones de citocinina (0 a 10 mg/L), BA KIN.

Con relacin a las combinaciones de reguladores de crecimiento utilizadas en esta
etapa de regeneracin de brotes, resulta notable que en la dosis de 0.5 mg/L de
la citocinina y cantidades bajas de auxinas (0 y 0.1 mg/L) en el medio de cultivo,
es determinante para lograr la brotacin, aunque es notable comentar que tambin
se obtuvo brotacin en los tratamientos con 5.0 mg/L de BA en combinacin con
0.1, 0.25, 0.5 y 1.0 mg/L de ANA, situacin que coincide con lo sealado por
Davies (1995), en donde para obtener brotacin y crecimiento de los brotes se
requiere la presencia de dosis mayores de citocinina en relacin a la de auxina.

El efecto sinrgico de BA y auxina ha sido demostrado en muchas plantas,
incluyendo Santonina canescens (Casado et al., 2002), Bupleurum fruticosum
(Fraternale et al., 2002), Acacia nilotica (Sane et al., 2001) y A. albida (Gassama
et al., 1986). Se ha demostrado que un baja concentracin de auxina puede
promover la formacin de brotes en yemas laterales por contrarrestar los efectos
inhibitorios de altas dosis de citocininas (Tisserat, 1991).

En diversos frutales con xito en la produccin de brotes in vitro, se ha
demostrado el efecto positivo por la adicin de BA en concentraciones
relativamente altas (>1.0 mg/L) (Puddephat et al., 1997; Saborio et al., 1997). En
algunos ctricos la BA en dosis de 2 a 5 mg/L en combinacin con ANA (0.1-0.2
36

mg/L), induce la produccin de brotes ya sea en callos o en explantes generando
hasta 5 brotes y de 70 a 80% de respuesta (Pea y Navarro, 1999; Costa et al.,
2002; Shawkat y Bushra, 2006).

Las yemas apicales o axilares de plantas leosas se han reportado como los
mejores explantes para la regeneracin de brotes in vitro, a diferencia del cultivo
de segmentos de hoja o de raz (Hartmann et al., 2002), por ello para guayabo,
solamente se decidi cultivar segmentos de tallos con yemas. Esto concuerda con
varios reportes, donde las yemas se han utilizado con xito para la multiplicacin
de brotes, de manera directa (Pea et al., 1997; Ghorbel et al., 1999; Cervera et
al., 2000; Dominguez et al., 2000).

En cuanto al nmero de brotes ptimo por explante, ste vara segn la especie
vegetal y puede variar entre dos y hasta 100 brotes por explante, sin embargo en
muchas de las plantas leosas, este nmero promedia solo los 5 brotes/explante.
En plantas como pawpaw (Asimila triloba) solo se producen entre 0.5 y un brote
por explante (Genev et al., 2003), de 2.4 en cacao (Traore et al., 2003) y entre 3
y 5 por explante para ctricos (Jameel y Al-Bahrany, 2001), Prosopis chilensis
(Caro et al., 2002) y Tilia platyphyllos (Chalupa, 2003) y entre otras.

En otras variedades o cultivares de guayabo, como en la variedad Enana Roja
Cubana EEA 18-40, el mximo de brotes obtenido es de 4.03 por explante (pices
y segmentos nodales) (Prez et al., 2002), valores similares a los obtenidos para
las dos variedades de guayabo en estudio.

En la prueba anterior tambin se observ que cuando no se utilizan reguladores
de crecimiento se obtiene una buena longitud del brote, pero sin que ste
multiplique, en algunas especies esta etapa es necesaria para desarrollar el brote,
antes de la induccin de races o de la aclimatacin. Lo antes mencionado
coincide con Von Arnold (1988) quien seala que frecuentemente es necesario
eliminar las citocininas para el alargamiento y el enraizamiento de los brotes.
37

Con los resultados del presente trabajo, fue considerada como ptima la
produccin de 4 brotes/explante, conseguida al sembrar yemas de la var. China
Rosa (apicales o axilares) en el medio MS con 0.5 mg/L de BA y 0.1 mg/L de ANA.
Al cultivar segmentos de yemas apicales o laterales de la variedad China, pudo
comprobarse el ptimo resultado de brotacin en dicho medio de cultivo, ya que se
obtuvieron tambin en promedio 4 brotes/explante (Figura 5A), en comparacin al
cultivarlos en medio MS sin reguladores de crecimiento (Figura 5B).




















Figura 5. Regeneracin de brotes en yemas de guayabo Var. China: A) En MS
con 0.5 mg/L de BA y 0.1 mg/L de ANA; B) En MS sin reg. de
crecimiento.



A B
38

5.3. ENRAIZAMIENTO Y DESARROLLO DE BROTES

En esta fase de la investigacin, los brotes de guayabo variedad China Rosa
fueron cultivados en diversos medios de cultivo para obtener la formacin de
races y buen desarrollo de las plntulas. Se determin el nmero y tamao de las
races cada 15 das, encontrando solo la formacin de races en los tratamientos
sin AIB o en la concentracin ms baja (0.1 mg/L), con 1.2 y 0.4 races/brote, de
1.5 y 0.85 cm de largo, en los medios MS y MS1/2, respectivamente.

Los resultados se muestran en la figura 6, donde se observa claramente un
aumento en el nmero de races as como su tamao, en relacin al tiempo de
cultivo, a la concentracin de nutrimentos y al de sacarosa (Figura 6A). A los 30
das del cultivo, el ms alto nmero de races se obtuvo en MS con 20 g/L de
sacarosa, con 1.2 races/brote, aunque no fue estadsticamente diferente al valor
encontrado en MS con 40, 30 y 10 g/L, con 1.0, 0.8 y 1.0 races/brote.

Este nmero aument a los 60 das de cultivo, principalmente en los brotes
cultivados en MS con 40 y 30 g/L de sacarosa, con 2.6 y 2.5 races/brote,
similar al encontrado en MS con 10 g/L de sacarosa, donde hubo 2.8 races/brote,
no encontrando diferencias significativas entre estos tratamientos (Figura 6A).

En cuanto al tamao de las races, ste fue muy variado, producindose algunas
muy largas (7 cm de longitud) y otras de tamao relativo corto (2 cm). El
crecimiento de stas dependi tanto de la concentracin de nutrimentos del MS
como de la sacarosa adicionada, ya que races de mayor longitud se obtuvieron en
MS con 6.25, 6.5 y 6.2 cm en promedio a los 60 das de cultivo, con 30, 20 y 10
g/L de sacarosa, sin embargo estos valores no presentaron diferencias
significativas con los obtenidos en MS con 40 y 20 g/L, con 6.2 y 7.0 cm,
respectivamente , tambin a los 60 das del cultivo (Figura 6B).

39



Figura 6. Nmero (A) y tamao de races (B) en brotes de guayabo (P. guajava
L. Var. China Rosa, cultivados en MS y MS con diferentes
concentraciones de sacarosa, determinados a los 30 y 60 das del
cultivo. Asterisco (*) significa diferencias estadsticas a un nivel de
confianza P<0,05, segn comparacin mltiple de medias de Tukey-
Kramer (n=10).
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
40 30 20 10
Sacarosa [g/L]
N

m
e
r
o

d
e

R
a

c
e
s
/
B
r
o
t
e
MS 30 Das MS 60 Das MS 1/2 30 Das MS 1/2 60 Das
A
*
*
*
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
40 30 20 10
Sacarosa [g/L]
L
o
n
g
i
t
u
d

d
e

R
a

c
e
s

(
c
m
)
MS 30 Das MS 60 Das MS 1/2 30 Das MS 1/2 60 Das
B
*
* * * *
40

Segn los criterios de seleccin de un medio ptimo de desarrollo de plntulas
micropropagadas, es conveniente obtener plntulas de buen desarrollo (> 3.5 cm
de longitud, con dos o ms races de ms de 2 cm de largo, lo que redunda en
mayor porcentaje de sobrevivencia durante el trasplante y aclimatacin (Baskaran
y Jayabalan, 2005).

Por ello, se consider que el mejor medio de cultivo para obtener plntulas de
guayabo aptas para el trasplante, fuera donde se formara el mximo de races por
brote y que su longitud fuera la promedio del tamao mximo encontrado y
adems que las plntulas presentaran un buen desarrollo, parmetros obtenidos
en MS con 30 g/L de sacarosa, donde los brotes presentan 2.6 races/brote, de
6.25 cm en promedio (Figura 7B). Asimismo, en este tratamiento, las plntulas
presentaron un buen desarrollo, alcanzando los 3.2 cm de altura, con 6 hojas en
promedio, a los 60 das de cultivo.

Brotes de las dos variedades de guayabo (variedad China y China Rosa) fueron
cultivados en dicho medio de cultivo para regenerar plntulas aptas para el
trasplante y aclimatacin, encontrando un similar comportamiento del crecimiento
entre estas dos variedades (Figura 7C).

En varias plantas de tipo leoso ha sido difcil el enraizado de los brotes, sobre
todo cuando se adicionan auxinas, por lo que los ndices de regeneracin de este
tipo de plantas es relativamente bajo, como en nogal (Mc Granahan y Leslie,
1987), manzano (James et al. 1988), ciruelo (Mante et al. 1991) y Carrizo citrange
(Poncirus trifoliata x Citrus. Sinensis) (Moore et al., 1992). La adicin de auxina
puede generar adems, la proliferacin de callo en explantes de plantas leosas,
como es el caso para algunos ctricos, ya que con 0.5 mg/L de ANA, un 92% de
los explantes producen callos (Das et al., 2000).

41


Figura 7. Plntulas de guayabo en medio de enraizado: A) Var. China Rosa en
MS 20 g/L de sacarosa; B) Var. China Rosa en MS con 40 g/L de
sacarosa: C) Var. China en MS con 40 g/L de sacarosa.



Para las variedades de guayabo cultivadas in vitro en esta investigacin, el cido
indol-3-butrico no fue esencial para el enraizado, incluso se gener callognesis
en concentraciones altas, siendo la concentracin de los nutrimentos del medio de
cultivo MS y la de la sacarosa, los principales efectores para un buen
enraizamiento. Esto concuerda con lo reportado por El Nour y col. (1991), quienes
no observaron enraizamiento significante al utilizar AIB en Balanites aegyptiaca.

5.4. TRASPLANTE Y ACLIMATACIN


Plntulas de 60 das de cultivo de ambas variedades de guayabo fueron
trasplantadas a suelo (condiciones ex vitro), sobre un sustrato comercial
compuesto con tierra de hoja y agrolita (MiracleGrow). Para conseguir una ptima
aclimatacin, las plntulas fueron preaclimatadas en condiciones no controladas
de luz y temperatura (laboratorio) por 48 horas, realizndoles orificios en la tapa
del frasco de cultivo y adicionando 5ml de agua corriente.
A C B
42


Posteriormente, las plntulas fueron sacadas de los frascos de cultivo y se les
lavaron las races con agua corriente para quitar residuos de agar. Se plantaron en
el sustrato, cubrindolas con bolsa de plstico transparente por 3 das (Figura 8A).
Se mantuvieron con alta humedad relativa (>90%). Al cuarto da se inici el
proceso de apertura de la bolsa de manera paulatina, haciendo orificios cada dos
das hasta apertura total a los 10 das, con riegos cada tres das. Hasta este
tiempo se inici el riego por aspersin de las plntulas cada tres das y se
mantuvieron 30 das en condiciones de laboratorio. A este tiempo, se consigui un
66% de sobrevivencia, presentando un par de hojas nuevas y alcanzado una
altura de 5 cm (Figura 8B).







Figura 8. Plntulas de guayabo durante el trasplante y aclimatacin: A) Tres
das del cultivo ex vitro; B) A los 30 das de cultivadas.



A B
43

6. CONCLUSIONES


Se estableci un ptimo sistema de cultivo in vitro de semillas de guayabo (P.
guajava L.) de las variedades China y China Rosa, obteniendo altos porcentajes
de germinacin (88 y 94%, respectivamente).

Se logr la regeneracin directa de brotes en yemas apicales y laterales
provenientes de plntulas in vitro de las dos variedades de guayabo en estudio. La
adicin de benciladenina en combinacin con el cido naftalenactico fue
determinante para promover la morfognesis in vitro de estas variedades de
guayabo, con una mxima respuesta de 4 brotes/explante.

El enraizado de los brotes fue conseguido sin la adicin de cido indol-3-butrico,
disminuyendo la concentracin de los nutrimentos del MS (MS ) y aumentando la
de sacarosa (30 g/L), produciendo 2.6 races/brote, de 6.25 cm de longitud total.

Las plntulas micropropagadas presentaron un desarrollo de hasta 5 cm con hasta
3 pares de hojas, durante el trasplante y aclimatacin, sobreviviendo un 66% de
ellas.

44

7. LITERATURA CITADA


Amin, M. N. y Jaiswal V.S. 1987. Rapid clonal propagation of guava through in
vitro shoot proliferation on nodal explants of mature trees. Plant Cell Tiss. Org.
Cult. 9: 235-243.

Atrin-Mendoza, E. 2005. Establecimiento de un sistema de regeneracin in vitro
de Tilia mexicana Schltdl. (Tiliaceae). Tesis de Licenciatura, Fac. de Biologa,
UMSNH. 72 p.

Baskaran, P. y Jayabalan N. 2005. Role of basal media, carbon sources and
growth regulators in micropropagation of Eclipta alba - A valuable medicinal herb.
KMITL Sci. J. Vol. 5(2):17-27.

Bewley, J. D.y Black M. 1982. Physiology and biochemistry of seed in relation to
genmination. v. 2. Viability, dormancy and environmental control. Berlin, Springer-
Verlag. 375 p.

Broodrijk, M. 1990. New sterilization method for the in vitro culture of guavas
(Psidium guajava L.). Horticultural Abstr. 60: 7.

Caro, L., Marinangel P., Curvetto N.R. y Hernndez Z. 2002. Agrobacterium
rhizogenes vs auxinic induction for the rizogenesis in vitro of Prosopis chilensis
(Mol.) Stuntz Multeqiuina, 9: 47-53,

Carreto-Montoya L., Salgado Garciglai R. y Lpez-Gmez Rodolfo. 2006. Desarrollo
del cultivo in vitro de papayo (Carica papaya L.) para su propagacin clonal. 1a.
Reunin Nacional de Innovacin Agrcola y Forestal. Mrida, Yucatn. INIFAP, CICY
y Colegio de Postgraduados. 9 de Sept.

Casado, J.P., Navarro M.C., Utrilla M.P., Martinez A. y Jimnez J. 2002.
Micropropagation of Santolina canescens Lagasca and in vitro volatiles production
by shoot explants. Plant Cell Tissue Organ Cult. 69: 147-153.

Caso, O. H. 1992. Juvenilidad, rejuvenecimiento y propagacin vegetativa de las
especies leosas. Agriscientia 9 : 5-16.

Cathey, H.M. y Brickell C. 2004. American Horticultural Society A to Z
Encyclopedia of Garden Plants, DR Publishing, INC, New York. 1091 p.

Cervera, M., Ortega C., Navarro A., Navarro I. y Pea l. 2000. Generation of
Transgenic citrus plants with tolerance-to-salinity gene HAL2 from yeast. J. Hort.
Sci. Biotechnol. 75, 2630.

45

Chalupa, V. 2003. In vitro propagation of Tilia platyphyllos by axillary shoot
proliferation and somatic embryogenesis. Journal of Forest Science, 49(12):537-
543

Christianson, M.L. y Warnick D.A. 1988. Organogenesis in vitro as a
developmental process. HortScience 23(3): 515-519.

Claudebon, M., Gendraud M. y Franclet A. 1988. Roles of phenolic compounds on
micropropagation of juvenile and mature clones of Sequoiadendron giganteum:
Influence of Activated Charcoal. Scientia Hort. 34: 283-291.

Costa, M.G.C., Otoni, W. C. y Moor G.A. 2002. An elevation of factors affecting the
efficieny of Agrobacterium-mediated transformation of Citrus paradisi (Macf.) and
production of transgenic plants containing carotenoid biosynthetic genes. Plant Cell
Rep. 21, 365373.

Erig, A.C. y Schuch M.W. 2005, In vitro morphogenesis of shoots of apple tree
(Malus domestica Borkh.) starting from thin fragments of leaves. Cinc. agrotec.,
Lavras, 29(3):575-581.

Dalal, M. A., Sharma B.B. y Rao S. M. 1992. Studies on stock plant treatment and
initiation culture mode in control of oxidative browning in in vitro cultures of
grapevine. Scientia Hort. 51: 35-41.

Das, A. Paul A.K. y Chaudhuri S., 2000: Micropropagation of sweet orange (Citrus
sinensis Osbeck) for the development of nucellar seedlings. Indian J. Exp. Biol. 38,
26972.

Davies, J.I. 1995. A phylogenetic structure for the Monocotyledons as inferred from
chloroplast DNA restriction site variation, and a comparison of measures of clued
support. Systematic Botany, 20: 503527.

Dodds, J. H. y Roberts L.W. 1995. Experiments in plant tissue culture. Cambridge
University Press, USA., pp 256.

Dominguez, A., Guerri J., Cambra M., Navarro I., Moreno P. Y Pea L. 2000.
Efficient production of transgenic citrus plants expressing the coat protein gene of
citrus tristeza virus. Plant Cell Rep. 19, 427433.

El Nour, M., El Khalifa, Massimo K. y El Hassen B. 1991. Preliminary study on
seed pregermination treatment and vegetative propagation of Balanites aegyptiaca
(L.) Del. En : Physiology des arbres et arbustes en zones aride et semi-aride.
Groupe dtude de larbre Paris, France, pp. 413-415.

Fitchet, M. 1990. Tissue culture of guava. Horticultural Abstr. 60(2): 1500.

46

Fortes, A.M. y Pais M.S. 2000. Organogenesis from internode-derived nodules of
Humulus lupulus var. Nugget (Cannabinaceae): histological studies and changes in
the starch content. Am. J. Bot. 87(7): 971-979.

Fraternale, D., Giamperi L., Ricci D. y Rocchi M.B.L. 2002. Micropragation of
Bupleurum fruticosum: the effect of triacontanol. Plant Cell Tissue Organ Cult. 69:
135-140.

Gassama, Y.K. y Duhoux E. 1986. Micropropagation dAcacia albida Del.
(Lgumineuses) adulte. Bulletin de lIFAN. Cheik Anta Diop:T. 46, Ser A. N 34:
315-320.

Genev, R. Kester S y Pomper K. 2003. Autonomous shoot production in awpaw
(Asimina triloba L. Dunal) on plant growth regulator free media. Propagation of
ornamental Plants, 7(2):51-56.

Ghorbel, R., Jurez J., Navarro I. y Pea l. 1999. Green fluorescent protein as a
screenable marker to increase the efficiency of generating transgenic woody fruit
plants. Theor. Appl. Genet. 99, 350358.

Gonzlez-Gaona, E., Padilla-Ramrez J.S., Reyes-Muro L, Esquivel Villagrana F.
Roles-Escobedo F.J. y Perales de la Cruz M.A. 2004. Tecnologa para producir
guayaba en Calvillo, Aguascalientes . INIFAP. Folleto para productores Nm. 28.

Haines, R.J. 1994. La biotecnologa en el mejoramiento de especies arbreas y
forestales: tendencias y prioridades de la investigacin. Revista Internacional de
silvicultura e industrias forestales. Vol. 45. No. 177.

Hartmann, H., Kester D., Davies F. y Geneve R. 2002. Plant propagation.
Principles and Practices. Prentice Hall. Upper Saddle River. New Jersey. 391 p.

Huapeo, P.Y. 2004. Establecimiento in vitro y regeneracin de plantas de Laelia
autumnalis (Llave y Lex.) Lindl. (Orchidaceae). Tesis de Lic., Fac. de Biologa,
UMSNH. 53 p.

Hurtado, D. y Merino M. 1994. Cultivo de Tejidos Vegetales. Editorial Trillas.
Tercera Edicin, Mxico. 233 p.

Jameel, M., A. y Al-Bahrany A.M. 2001. In vitro micropropagation of Citrus
aurantifolia (lime). Current Science, 81(9- 10 ):1242-1246.

James, D. J., Passey, A.J. y Rugini, E. 1988. Factors affecting high frequency plant
regeneration from apple leaf tissues cultured in vitro. Journal of Plant Physiology,
Stuttgart, 132:148-154.

47

Khanam, N., Khoo C. y Khan A..G. 2000. Effect of cytokinin combinations on
organogenesis, shoot regeneration and tropane alkaloid production in Duboisia
myoporoides. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 62: 125-133.

Khattak, M. S., M. N. Malik y M. A. Khan. 1990. Effect of surface sterilization
agents on in vitro culture of guava (Psidium guajava L.) cv. Sufeda tissue. Sarhad
J. of Agric. 6: 151-154.

Krikorian, A. D. 1991. Propagacin clonal in vitro. p. 95-125.En: W. M. Roca y L. A.
Mroginski (Eds). Cultivo de tejidos en la Agricultura. Fundamentos y aplicaciones.
Centro Internacional de Agricultura Tropical. CIAT. Cali, Colombia. Publicacin N
151.

Leal-Nares, O.A., Gonzlez-Gmez E., Vidales-Fernndez I. y Salgado-Garciglia
R. 2004. Embriognesis somtica por el cultivo in vitro de tejido nucelar de frutos
inmaduros de aguacate (Persea americana Mill.) Cv. Hass. Rev. Biolgicas (Fac.
de Biologa-UMSNH), Agosto 2004. No. 6, pp. 1-8. http://bios.biologa.umich.mx.

Loh, C. S. y Rao A.N. 1989. Clonal propagation of guava (Psidium guajava L.)
from seedlings and grafted plants and adventitious shoot formation in vitro.
Scientia Hort. 39: 31-39.

Malo, S.E., Campbell C.W., Balerdi C.F. y Crane J.H.. 2005. La Guayaba.
Publicaciones del Departamento de Horticultural Sciences, Servicio de Extensin
Cooperativa de la Florida, Instituto de Alimentos y Ciencias Agrcolas, Universidad
de la Florida. (UF/IUFAS). http://edis.ifas.ufl.edu/HS277.

Mansor, N., Ismala D. y Kne Gassama Y. 2003. In vitro multiplication of the semi-
arid forest tree, Balanites aegyptiaca (L.) Del. African Journal of Biotechnology Vol.
2 (11), pp. 421-424.

Mante, S., Morgens P.H., Scorza R., Cordts J.M. y Callahan A.M. 1991.
Agrobacterium-mediated transformation of plum (Prunus domestica L.) hypocotyl
slices and regeneration of transgenic plants. BioTechnology 9:853-857.

Margara, J. 1988. Bases de la Multiplicacin Vegetativa. Ed. Mundi-Prensa,
Madrid.

Marks, T. R. y Simpson S.E. 1990. Reduced phenolic oxidation at culture initiation
in vitro following the exposure of field- grown stockplants to darkness or low levels
of irradiance. J. Hort. Sci. 65(2): 103-111.

McComb, J. 1994. Clonal propagation of eucalyptus. En : Lindsey K. (ed), Plant
Tissue Culture. Kluwer, Dordrecht. The Netherlands. pp. 322-328.

48

Mc Granahan, G. y Leslie C.A. 1987. In vitro propagation of mature Persian walnut
cultivars. HortScience.23(1):220.

Minorsky, P.V. 2000. The hot and the classic. Plant Physiology, 124 (1):1162-1163.

Moore, G.A., Jacono C.C., Neidigh J.L., Lawrence S.D. y Cline K. 1992.
Agrobacterium-mediated transformation of citrus stem seg-ments and regeneration
of transgenic plants. Plant Cell Rep 11:238242

Murashige, T. y Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays
with tabacco tissue. Phys. Plant. 15: 473-493.

Orea, D. y Villalobos V. 1990. Micropropagacin de especies forestales. En
fundamentos tericos-prcticos del cultivo de Tejidos Vegetales. Estudio FAO.
Produccin y proteccin vegetal, Roma, Italia.

Padilla, I.M.G. y Encina C.L. In vitro germination of cherimoya (Annona cherimola
Mill) seeds. Scientia Horticulturae (2003). 97:219-227.

Papadatou, P., Pontikis C.A., Ephtimiadou E. y Lydaki M. 1990. Rapid
multiplication of guava seedlings by in vitro shoot tip culture. Scientia Hort. 45: 99-
103.

Pardos, J. A.. y Toribio P. 1984. El cultivo in vitro aplicado a la mejora forestal.
Comunicaciones I.N.I.A. Serie Recursos Naturales N 28. 55 p. 12.

Pea E, Cervera L., Juarez M., Navarro J., Pina A. y Navarro, L. 1997. Genetic
transformation of lime (Citrus aurantifolia Swing.): factors affecting transformation
and regeneration. Plant Cell Rep. 16, 731737.

Pea, L. y Navarro. 1999. Transgenic Citrus. Biotechnology in agriculture and
forestry 44, 3954.

Pereira, M.J. 2005. Conservation of Vaccinium cylindraceum Smith (Ericaceae) by
micropropagation using seedling nodal explants. In Vitro Cellular and
Developmental Biology-Plant. 42(1):6568.

Prez-Molphe, B.E., Ramirez M.R., Nuez P.H. y Ochoa, A.N. 1999. Introduccin
al Cultivo de Tejidos Vegetales. Cap. VII. U.A. de A. Mxico. pp. 71- 77.

Prez-Ponce, J. N. 1998. Propagacin y Mejoramiento Gentico de Plantas por
Biotecnologa de las Plantas. 5to. Coloquio Internacional de Biotecnologa
Vegetal. Instituto de Biotecnologa de las Plantas. Libro de reportes. Santa Clara,
Cuba. pp. 25-31.

49

Prez, T.A., Npoles L., Concepcin O. y Trujillo R. 2002. Multiplicacin in vitro de
brotes de guayaba (Psidium guajava L.) var. Enana roja cubana EEA 18-40
obtenidos a partir de semillas. Cultivos Tropicales (Cuba), 23(2):57-62.

Pierik, R. L. M. 1990. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ediciones Mundi-
prensa. Madrid, Espaa. pp. 149-167

Pirela, M. y Mogolln N. 1996. In vitro clonal propagation of guava (Psidium
guajava L.) cv. Mara-7 from stem shoots of cv. Mara-7. Acta Horticulturae 452: 47-
52.

Pliego-Alfaro, F. y Bergh, B.O. 1992. Avocado. In Biotechnology of Perennial Fruit
Crops. F. A. Hammerschlag and R.E. Litz (Eds.) C. A. B. International,
Wallingford, UK. 323-333.

Priyono, dan S. M. 2001. Micropropagation of Banana (Musa paradisiaca) through
Cormlet Initiation by In Vitro Culture of Apical Meristem Slices. Journal ILMU
DASAR, 2 (1): 41-48.

Puddephat I., Alderson P. y Wright N. 1997. Influence of explant source, plant
growth regulators and culture environment on culture initiation and establishment
of Quercus robur L. in vitro. Journal of Exp. Botany, Vol. 48, 951-962.

Ramrez, M. 1998. Tratamientos a plantas madres y al explante para el
establecimiento in vitro del guayabo ( Psidium guajava L.). La Universidad del
Zulia, Facultad de Agronoma, Maracaibo Venezuela. Trabajo de Grado para
optar al ttulo de Magster Scientiarum en Fruticultura. 132 p.

Ricci, A.P., Alves Mouro Filho A.F., Januzzi Mendes B.M. y de Stefano Piedade
S.M. 2002. Somatic embryogenesis in Citrus sinensis, C. reticulata and C. nobilis x
C. deliciosa. Scientia Agricola, 59 (1):41-46.

Rivero-Maldonado, G. del C., Ramirez Villalobos M. del C. y de Sierralta Le2.
2001. Tipo de explante en el establecimiento in vitro del guanbano (Annona
muricata L.) Rev. fac. Agron. (LUZ), 18: 258-265.

Rui, D. y Lazi T. 2006. Micropropagation as means of rapid multiplication of
newly developed blackberry and black currant cultivars. Agriculturae Conspectus
Scientificus,71 (4):149-153.

Saborio, F., Dvorak W.S., Donahue J.K. y Thorpe T.A. 1997. In vitro regeneration
of plantlets from mature embryos of Pinus ayacahuite. Tree Physiology, 17:787
796.

SAGARPA, 2004. Cuadro resumen mrgenes de comercializacin de productos
agropecuarios y pesqueros.
50

http://www.siea.sagarpa.gob.mx/modelos/Cuadro44.htm

SAGARPA, 2006. Suman esfuerzos SAGARPA y municipios productores de
guayaba para fomentar la produccin y exportacin de esta fruta. No. 236/03.

Sane, D, Borgel A., Chevallier M.H. y Gassama/Dia Y.K. 2001. Induction in vitro de
lenracinement de microboutures dAcacia tortilis subsp. raddiana par traitement
transitoire lauxine. Ann. For. Sci. 58: 43-437.

Sarabia, O.M.E. 2001.Reproduccin asexual in vitro de Laelia speciosa HBK
Schlechter. Tesis de Lic., Fac. de Biologa, UMSNH. 51 p.

Shawkat, A. y Mirza B. 2006. Micropropagation of rough lemon (Citrus jambhiri
Lush.): type and hormone concentration. Acta Bot. Croat. 65 (2):137146.

Silva, A.L., Rogalski M., Moraes I.K., Feslibino C., Crestani I. y Guerra M. P. 2003.
Estabelecimento e multiplicao in vitro de porta-enxertos de Prunus. Revista
Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, 25(2):297-300.

Singh, S.K., Singh S.P. y Sharma H.C. 2001. In vitro Clonal Propagation of Guava
(Psidium guajava L.) from Field-Grown Mature Plants. 7(1): 33-138.

Skoog, F. y Miller C. 1957. Chemical regulation of growth and organ formation in
plant tissues cultured in vitro. Symp. Soc. Exp. Biol. 11: 118-131.

Tisserat, B. 1991. Embryogenesis, Organogenesis and Plant Regeneration. En:
Plant Cell Culture, a practical approach (Dixon R.A., Ed.). Irl Press. Oxford,
England. pp. 79-105.

Traore, A., Maximova S.N. y Guiltinan M.J. 2003, Micropropagation of Theobroma
cacao using somatic embryo-derived plants: In Vitro Cell. Dev. Biol.- Plant, 39:332-
337.

Vasil, I.K. 1994. Automation of plant propagation. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 39:
105-108.

Villalobos, A. V. M. 1990. Historia del Cultivo de Tejidos. En: Fundamentos Terico
Prcticos del cultivo de Tejidos Vegetales ( Rosell C.H. y Villalobos A. V. M.,
Eds), FAO, 105: 3-7.

Von Arnold, S. 1988. Tissue Culture Methods Propagation of Forest Trees.
Newsletter (Holland) 1(56): 1-13.

Woodward, B. 1997. Micropropagation. En: Advanced tissue culture course.
UNESCO/BAC BETCEN, Biotechnology Division ACR-Roodeplaat. Pretoria.
Editorial Trillas. Sptima reimpresin. pp. 9-40.
51


Zimmerman, J.L. 1993. Somatic embryogenesis: A model for early development in
higher plants. Plant Cell, 5: 1411-1423.