Universidad Veracruzana

Facultad de Ciencias Qumicas

Ingeniera Ambiental

Uso de un hidrolizado de cscaras de naranja-toronja
y dos cepas de levadura para la obtencin de
bioetanol

Tesis
Que para acreditar la Experiencia Recepcional
Presenta:
Marina Guadalupe Moheno de la Cruz

Directora:
M.C. Yolanda Cocotle Ronzn







Dedicatoria:

Este trabajo no es el fruto de mi propio esfuerzo, los corazones de las personas
ms importantes de mi vida, palpitaron incesantes, esperando que este momento
llegara.
A la primera persona que crey en m, que me cuid y que estuvo conmigo hasta
el ltimo da de su vida mi pap Toms Moheno Alor.
A mi padre, Lzaro Moheno Velzquez, porque sin su ejemplo yo no podra ser
quien soy. Por la infinita confianza que ha depositado en m y sobre todo por el
amor que sentimos.
A mi madre, Regina de la Cruz lvarez, por ser mi fortaleza en los momentos de
desesperacin. Porque aunque estamos lejos, siempre te siento cerca, por ser la
mujer que yo un da ser.
A mi mam Agustina Velzquez Gallegos, por ensearme a ser terca y por todo
el apoyo que me ha brindado desde que inici este sueo.
A mis hermanos Toms y Abigail, por los momentos que hemos vivido juntos,
porque son un pedazo de mi alma.











Agradecimientos
A la M.C. Yolanda Cocotle Ronzn, por guiarme en este proyecto, por su apoya
y gran paciencia para conmigo.
A todos mis tos que siempre estuvieron al pendiente de m, por sus consejos y
buenos deseos, en especial a mi to Carmen Moheno Velzquez y a su familia por
abrirme las puertas de su casa todos estos aos.
Al Dr. Ernesto Jurez Loera
Al M. I. Cuitlhuac Garca Jimnez
Al Mtro. Francisco. E. Hernndez Ortiz























Este trabajo se realiz en el Laboratorio No. 34 Proyectos e Investigacin,
Facultad de Ciencias Qumicas, de la Universidad Veracruzana campus Xalapa en
colaboracin con en el laboratorio de Bioingeniera de la Unidad de Investigacin y
Desarrollo en Alimentos (UNIDA) del Instituto Tecnolgico de Veracruz.



Resumen


El procesamiento de los frutos ctricos genera anualmente millones de toneladas
de residuos, los cuales son vendidos a bajos precios como alimento animal o son
vertidos causando severos problemas de contaminacin. El hidrolizado obtenido
de este material lignocelulsico puede ser utilizado como un medio de
fermentacin para la produccin biotecnolgica de etanol. En este trabajo se
realiz un estudio preliminar con el objetivo de establecer un proceso para la
obtencin de etanol a partir de un hidrolizado cido de cscaras de naranja (Citrus
sinensis) y toronja (Citrus paradisi) y dos levaduras: Candida tropicalis y Pichia
stipitis, las cuales son capaces de fermentar xilosa, el carbohidrato ms abundante
en el hidrolizado. Se llevaron a cabo fermentaciones en lote de 48 horas en
matraces de 125 mL conteniendo 50 mL de medio de fermentacin los cuales
fueron inoculados con las cepas de las levaduras activadas de manera individual o
en cocultivo, en una relacin de 10
6
clulas /mL. Se incubaron a 30C, en agitacin
constante a 200 rpm y se tomo una muestra cada ocho horas para determinar por
HPLC los g/L de etanol, xilosa, xilitol, cido actico y glucosa. Tambin se hizo un
seguimiento del pH en el medio de fermentacin. Los resultados obtenidos
sugieren que el cocultivo es la mejor opcin para la obtencin del bioetanol ya que
se obtuvo una mayor eficiencia de bioconversin cuando se compara con la
obtenida con las levaduras probadas por separado.

i


1. INTRODUCCIN .............................................................................................. 1
2. MARCO TERICO .............................................................................................. 3
2.1 Biocombustibles ............................................................................................. 3
2.1.2 Biocombustibles lquidos ............................................................................. 5
2.1. 3 Panorama mundial de los biocombustibles ................................................ 7
2.2 Bioetanol ........................................................................................................ 8
2.2.1 Bioetanol de primera generacin ................................................................ 9
2.2.2 Bioetanol de segunda generacin ............................................................... 9
2.2.3 Bioetanol de tercera generacin ............................................................... 11
2.3 Produccin de bioetanol de segunda generacin ....................................... 11
2.3.1 Usos del etanol como biocarburante ........................................................ 12
2.4 Materias primas para la obtencin de bioetanol ........................................... 13
2.4.1 Materiales ricos en azcares..................................................................... 13
2.4.2 Materiales amilceos ................................................................................ 14
2.4.3 Materiales lignocelulsicos ....................................................................... 14
2.5 Pretratamiento de biomasa lignocelulsica .................................................. 15
2.5.1 Hidrolisis cida .......................................................................................... 16
2.6 Fermentacin ............................................................................................... 17
2.7 Microorganismos utilizados ............................................................................. 19
2.7.1 Pichia stipitis ............................................................................................. 22
2.7.2 Candida Tropicalis .................................................................................... 25
2.7.3 Fermentacin en sistema cocultivo .......................................................... 25
2.8 La agroindustria de naranja y toronja en Mxico ............................................. 26
2.8.1 Aprovechamiento y valorizacin de residuos de la agroindustria de ctricos
naranja-toronja ................................................................................................... 27
2.9 Composicin de residuos ctricos naranja-toronja como material lignocelulsico
........................................................................................................................ 29
2.9.1 Pectinas .................................................................................................... 30
2.9.2 Celulosa .................................................................................................... 30
2.9.3 Hemicelulosa............................................................................................. 31
ndice

ii

2.9.4 Lignina ...................................................................................................... 31
2.10 Uso de residuos de naranja y toronja para la obtencin de bioetanol ....... 32
3. JUSTIFICACIN ............................................................................................. 33
4. OBJETIVO GENERAL....................................................................................... 34
4.1 OBJETIVOS ESPECFICOS ........................................................................ 34
5. HIPTESIS ....................................................................................................... 34
6. MATERIAL Y MTODOS .................................................................................. 35
26.1 Obtencin de harina de cscaras de naranja toronja ................................. 36
6.2 Hidrlisis cida de la harina de cscaras de naranja-toronja ....................... 36
6.3 Microorganismos .......................................................................................... 37
6.3.1 Conservacin de las cepas ....................................................................... 37
6.3.2 Activacin de las cepas ............................................................................. 38
6.4 Medio de fermentacin .................................................................................... 38
6.5 Preparacin del inculo para fermentacin ..................................................... 38
6.6 Fermentacin .................................................................................................. 40
6.7 Determinacin de los componentes del hidrolizado de cscara de naranja-
toronja y productos de la fermentacin por HPLC .......................................... 40
7. Resultados ........................................................................................................ 41
7.1 Composicin del hidrolizado de cscara de naranja-toronja ........................ 41
7.3 Consumo de xilosa y glucosa por Candida tropicalis IEC5-ITV, Pichia stipitis
NRRL-Y7124 y el cocultivo de ambas ............................................................ 44
7.4 Produccin de xilitol por C. tropicalis IEC5-ITV, Pichia stipitis NRRL-Y7124 y
el cocultivo ...................................................................................................... 46
7.4 Consumo de cido actico por C. tropicalis IEC5-ITV, Pichia stipitis NRRL-
Y7124 y el cocultivo de ambas cepas ............................................................. 47
7.5. Rendimiento ................................................................................................ 50
7.5.2 Eficiencia de Bioconversin ...................................................................... 50
8. Conclusiones ..................................................................................................... 52
9. BIBLIOGRAFA ................................................................................................. 53




iii


Tabla 1. Los tipos de biomasa y sus caractersticas ............................................ 3
Tabla 2. Biocombustibles con una aplicacin real o potencial ............................ 5
Tabla 3. Caractersticas del bioetanol y biodiesel ................................................ 6
Tabla 4. Rendimiento de biocombustibles por hectrea ...................................... 8
Tabla 5. Contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina (como porcentaje en
peso de biomasa seca) de diferentes materiales lignocelulsicos. .................. 15
Tabla 6. Porcentaje de azcares en diferentes hidrolizados de residuos
agrcolas.................................................................................................................. 16
Tabla. 7 Principales microorganismos productores de etanol con aplicacin
industrial .................................................................................................................. 21
Tabla 8. Fermentacin microbiana de hidrolizados de diferentes materiales
lignocelulsicos ...................................................................................................... 24
Tabla 9. Porcentajes de Celulosa, hemicelulosa y lignina en desechos ctricos
................................................................................................................................. 30
Tabla 10. Medio de conservacin utilizado para C. tropicalis IEC5-ITV ........... 37
Tabla 11. Medio de conservacin para P. stipitis NRRL-Y7124 ....................... 37
Tabla 12. Composicin sel medio de activacin para C. tropicalis y P. stipitis 38
Tabla 13. Composicin del hidrolizado de cscaras de naranja-toronja .......... 41
Tabla14. Consumo de xilosa por Pichia stipitis NRRL-Y7124, Candida
tropicalis IEC5-ITV o un cocultivo de ambas en relacin 1:1 presente en un
hidrolizado de cscaras de naranja y toronja .............................................................. 44
Tabla 15. Valores de pH obtenidos en el caldo de fermentacin a base de
HCNT y dos especies de levadura ....................................................................... 48







ndice de Tablas

iv

ndice de figuras

Figura 1. Biocombustibles desde la materia prima hasta el final ................................. 4
Figura 2. Productores de bioetanol en miles de millones de litros ............................... 7
Figura 3. Procesos de fermentacin con sacarosa y con biomasa lignocelulsica. ... 10
Figura 4. Reaccin para la obtencin de bioetanol ................................................... 12
Figura 5. Proceso de fermentacin para la obtencin de etanol a partir de diferentes
sustratos. .................................................................................................................. 18
Figura 6. Representacin esquemtica del metabolismo de la D-xilosa en
levaduras. ................................................................................................................. 22
Figura 7. Diagrama de trabajo para la obtencin de etanol a patiir de un hidrolizado
de cscaras de naranja-tronja. .................................................................................. 35
Figura 8. Cscaras de naranja-toronja secadas en horno de conveccin ................. 36
Figura 9. Candida tropicalis IEC5-ITV (A) y Pichia stipitis NRRL-Y7124 (B) ............. 42
Figura 10. ................................................................................................................. 43
Figura 11. Consumo de xilosa por Pichia stipitis NRRL-Y7124 (A), Candida tropicalis
IEC5-ITV (B) o un cocultivo de ambas (C) en relacin 1:1 contenida en un hidrolizado
de cscaras de naranja y toronja .............................................................................. 45
Figura 12. Consumo de glucosa presente en un HCNT por Candida tropicalis IEC5-
ITV (A), Pichia stipitis NRRL-Y7124 (B) y un cocultivo con ambas cepas (C) ........... 46
Figura 13. Produccin de xilitol por Candida tropicalis IEC5-ITV (A), Pichia stipitis
NRRL-Y7124(B) y un cocultivo con ambas cepas (C) a partir de un hidrolizado de
cascaras de naranja-toronja...................................................................................... 47
Figura 14. Consumo de cido actico presente en un HCNT por Candida tropicalis
IEC5-ITV (A) ............................................................................................................. 48
Figura 15. Productividad volumtrica de xilitol (Q
P
) calculada para cada una de las
levaduras evaluadas: Ct= Candida tropicalis IEC5-ITV; Ps= Pichia stipitis NRRL
Y7124; Cc= cocultivo ................................................................................................ 49
Figura 16. Rendimiento (Y
P/S
) calculado para cada una de las cada una de las
levaduras evaluadas: Ct= Candida tropicalis IEC5-ITV; Ps= Pichia stipitis NRRL
Y7124; Cc= cocultivo ................................................................................................ 50
Figura 17. Eficiencia de bioconversin (%) calculada para cada una de las levaduras
evaluadas: Ct= Candida tropicalis IEC5-ITV; Ps= Pichia stipitis NRRL Y7124; Cc=
cocultivo ................................................................................................................... 51

1

1. INTRODUCCIN

Los biocombustibles han experimentado una fuerte expansin gracias a los
incentivos otorgados por los poderes pblicos y a algunas ventajas como la
capacidad para reducir la dependencia energtica exterior, la mayor creacin de
empleos, especialmente en zonas rurales e industriales, o el menor impacto
ambiental en comparacin con los combustibles fsiles.

En la actualidad la mayora de los biocombustibles lquidos se manufacturan a
partir de cultivos alimentarios, incluida la palma aceitera, la caa de azcar, el
maz, las semillas de colza, la soja, el trigo y otros cultivos. Por lo general, el
bioetanol de primera generacin se produce a partir de azcar vegetal o almidn y
el biogasleo, de aceite vegetal, (Organizacin de las Naciones Unidas para la
Agricultura y la Alimentacin, 2008).

Ante un panorama mundial creciente en cuanto a escasez de materias primas,
energa y fenmenos relacionados con la no biosostenibilidad, efecto invernadero
y problemas sociolgicos relacionados con el mundo agrario, forestal y rural, la
biomasa lignocelulsica, y en particular la de elevada capacidad de produccin, se
presenta como una fuente de materia prima sostenible cada vez ms necesaria.
En el mundo se producen aproximadamente 1600 millones de toneladas por ao
de residuos slidos (Buenrostro, 2006) los cuales generan graves problemas, no
slo por el deterioro progresivo del medio ambiente, sino tambin desde el punto
de vista econmico puesto que los costos de recoleccin, transporte y disposicin
final son cada vez mayores.

En Mxico segn las cifras del Plan Nacional de Desarrollo 2007-2012, indican
que al ao se generan en el pas alrededor de 40 millones de toneladas de
residuos, de los cuales 35.5 millones corresponden a residuos slidos urbanos, de
stos el 50% son residuos orgnicos. Por esta razn, se est impulsando el

2

estudio de la produccin de bioetanol de segunda generacin, el cual es producido
a partir de biomasa lignocelulsica residual, compuesta por dos polmeros de
carbohidratos: la celulosa (35-50%) y la hemicelulosa (15-25%), y un polmero
fenlico, la lignina (20-25%) (Olsson y Hahn, 1996).

En la agroindustria veracruzana, frutas como la naranja y toronja, tienen gran
influencia en el mercado, sus cscaras que representan entre el 45 y 60 % del
peso de la fruta, son utilizadas en la alimentacin de ganado pero
mayoritariamente son desechadas, desaprovechando as el valor que stas tienen
como fuente potencial de productos de valor agregado. En el presente trabajo se
establece de manera preliminar un proceso biotecnolgico para la obtencin de
etanol a partir de cscaras de naranja y toronja y dos cepas de levaduras que
fermentan xilosa, el componente mayoritario de los hidrolizados lignocelulsicos.













3

2. MARCO TERICO
2.1 Biocombustibles
Por su origen, se podra decir que los biocombustibles son una fuente de energa
renovable, ya que son una forma de energa solar transformada. Se identifican con
aquellas fuentes de energa obtenidas a partir de biomasa mediante su
procesamiento qumico, trmico o biotecnolgico. Entre ellos se puede mencionar
el biodiesel, bioetanol, biogs y biohidrgeno.
Hoy en da la biomasa abarca aproximadamente el 10% de la demanda mundial
de energa. Es una fuente renovable ya que es rica en carbohidratos y estos
pueden ser convertidos por microorganismos en biocarburantes, de los cuales solo
el bioetanol es producido a escala industrial. La biomasa puede clasificarse como
se muestra en la Tabla1
Tabla 1. Los tipos de biomasa y sus caractersticas
Tipo de biomasa Caractersticas

Biomasa primaria Materia orgnica formada directamente de
seres fotosintticos. Comprende biomasa
vegetal, residuos agrcolas y forestales.
Biomasa secundaria Producida por hetertrofos que utilizan en
su nutricin biomasa primaria. La
constituyen materia fecal o carne de
animales.
Biomasa terciaria Producida por los seres que se alimentan
de biomasa secundaria, restos y
deyecciones de animales carnvoros.
Biomasa natural Producida por ecosistemas silvestres; 40%
de la biomasa que se produce en la tierra
proviene de los ocanos.
Biomasa residual Se puede extraer de residuos agrcolas,
forestales y de actividades humanas.
Cultivos energticos Recibe esta denominacin cualquier cultivo
agrcola cuya finalidad es proporcionar la
biomasa para producir biocombustibles.
Fuente: Salinas y Gazca, 2009.

4


Pueden ser sustituidos de forma parcial o total en los combustibles de origen fsil,
aparecen como fuente de energa alternativa, para usarse en el caso de que los
precios de los hidrocarburos se eleven o a largo plazo se agoten. Una segunda
finalidad de su uso es que contribuyen a frenar el calentamiento global, ayudando
a reducir las emisiones de CO
2

Los biocombustibles se pueden clasificar segn la fuente de la cual se derivan:
productos forestales, agrcolas y pesqueros o desechos municipales, as como de la
agroindustria. Se clasifican tambin segn su tipo en: slidos, como lea, lquidos, como
etanol y biodiesel o gaseosos, como el biogs. Se utilizan principalmente como fuente de
energa de vehculos de motor y produccin de electricidad (Figura 1).


Figura 1. Biocombustibles desde la materia prima hasta el final
Fuente: FAO, 2008.

5

.2.1.1 Biocombustibles producidos por microorganismos.
Algunos biocombustibles, principalmente alcoholes y steres lquidos, pueden ser
producidos por microorganismos, y deben cumplir los criterios necesarios para los
combustibles modernos, es decir alta eficiencia energtica en motores de
combustin y capacidad para alimentar a un transporte (vehculo). Todos los
procesos de fermentacin microbiana requieren de una fuente de energa para
alimentar a los microorganismos, generalmente se suministra en forma de
azcares (Antoni et al., 2007). En la Tabla 2 se muestra una lista seleccionada de
biocombustibles generados por microorganismos con una produccin potencial, su
estatus y su aplicacin en la ingeniera.
Tabla 2. Biocombustibles con una aplicacin real o potencial
Biocombustible Proceso Estatus Aplicacin en
la ingeniera
Biometanol Termoqumico/microbiolgico Planta piloto Mezcla pura
Bioetanol Microbiolgico Industrial Mezcla pura
Biobutanol Microbiolgico Planta piloto Mezcla pura
Biometano Microbiolgico Industrial Mezcla pura
Biohidrgeno Microbiolgico Laboratorio Bioetanol
Biodiesel Fsico/qumico (enzimtico) Industrial Mezcla pura
Fuente: Antoni et al., 2007.
2.1.2 Biocombustibles lquidos

Los biocombustibles lquidos se utilizan principalmente en el sector de transporte,
aun cuando su produccin slo cubre una parte de la demanda mundial, se estima
que en un futuro su uso y produccin aumente en los siguientes aos. Los ms
importantes, debido al crecimiento de su produccin son el bioetanol y el biodiesel.

6

La produccin de bioetanol que utiliza como materia prima la biomasa
lignocelulsica ha tenido auge en los ltimos aos por ser un subproducto de valor
agregado (biomasa residual), entre estos se encuentran; residuos forestales,
pastos, bagazo de caa, entre otros. Por otro lado el biodiesel es producido a
partir de aceites vegetales y grasas animales, siendo la colza, el girasol y la soja
las materias primas ms utilizadas para este fin. En la tabla 3 se exponen algunas
de las caractersticas el bioetanol y el biodiesel como biocombustibles lquidos.

Tabla 3. Caractersticas del bioetanol y biodiesel
Bioetanol Biodiesel
Producido principalmente en pases
de Amrica; Brasil y EUA.
Utilizado en mayor proporcin como
aditivo en gasolina para sustituir el
MTBE. La gasolina aumenta de 35-
40% su octanaje y el combustible
mejora su eficiencia trmica.
En ciudades de Europa se usa el
trigo como materia prima para la
obtencin de bioetanol.
Mayor densidad de energa, menor
presin de vapor, menos
higroscpicos y por lo tanto menos
corrosivos. Estas propiedades son
las que permiten la mezcla con
combustibles convencionales.

Producido en pases de Europa;
Alemania y Francia.
Debido a la alta comprensin de los
motores diesel pueden ser de un
20 a 30% ms eficientes que los
motores de gasolina.
En ciudades tropicales como
Malasia e Indonesia el biodiesel se
produce a partir de aceite de palma.
Los terpenoides derivados de la
ruta de los isoprenoides, cidos
grasos, steres o alcanos de
cadena larga se han sugerido para
obtener biodiesel a partir de
microorganismos.
Fuente: Solomon, 2010.
Las propiedades del biodisel son prcticamente las mismas que las del gasleo
de automocin en cuanto a densidad y nmero de cetano. Adems, presenta un
punto de inflamacin superior. Por todo, el biodisel y el bioetanol pueden utilizarse

7

en mezclas para su uso en motores e incluso sustituirlo totalmente si se adaptan
stos convenientemente (Garca y Garca, 2006).
2.1. 3 Panorama mundial de los biocombustibles

El biodiesel y el bioetanol son biocombustibles que se producen en todo el mundo
en cantidades importantes. Cerca de 48,7 x 10
6
de m
3
/ao de bioetanol se
produjeron a nivel mundial en 2005, de los cuales, el 72% se gener en Brasil y
los E.U.A (Masiero, 2008). Este ltimo pas multiplic su produccin en la ltima
dcada y pas a ser el pas con la mayor produccin de etanol a nivel mundial en
2005. La Figura 2 se muestra los ocho pases ms importantes productores de
bioetanol como combustible carburante en 2005, que en conjunto son los
responsables de ms del 91% de la produccin mundial de este combustible.


Figura 2. Productores de bioetanol en miles de millones de litros
Fuente: Masiero, 2011
Los rendimientos de biocombustibles por hectrea se observan en la Tabla 4.
Estos datos se utilizaron para poder pronosticar los procesos industriales en la
obtencion de diferentes biocombustibles y determinar nuevas tecnolgias para su
113
165
170
245
390
1700
2296
16214
16067
Japn
Argentina
Arabia Saudita
Ucrania
frica del Sur
India
Unin Europea
Brasil
E.U.A

8

produccin, tambin se utilizaron para hacer un balance enrgetico de los gases
de efecto invernadero que se procucirn durante el ciclo de vida de los cultivos.
Tabla 4. Rendimiento de biocombustibles por hectrea
Tipo de
biocombustible
Pas Cultivo Combustible
(ha/ao)

Biodiesel E.U.A Colza 50.8
U.E Soja 16.3
Alemania Girasol/cebada 32.5/35.8
Tanzania Aceite de palama 50.4
Bioetanol E.U.A Maz 186.0
U.E Trigo 66.0
U.E Remolacha 52.9
Brasil/India Caa de azucar 137.5/112.1
Tanzania Caa de azucar 173.0
Alemania Trigo 54.1
Nueva zelanda Rastrojo de maz 36.2
Biometanol Alemania Trigo 84.6
Maz para encilaje 23.2
Pastos de cultivo 154.4
Cultivos energticos 115.3

Fuente: Antoni et al., 2007.
2.2 Bioetanol
El bioetanol es un producto qumico obtenido a partir de la fermentacin de los
azucares que se encuentran en productos vegetales, tales como cereales,
remolacha, caa de azcar o biomasa lignocelulsica. Estos azucares se
encuentran formando parte de la estructura de carbohidratos como sacarosa,
almidn, hemicelulosa y celulosa.

9

Lo que hace que el bioetanol usado como biocarburante tenga un equilibrio neto
de emisiones de CO
2
es que la materia prima utilizada para su produccin son
azcares que provienen de plantas que a su vez crecen gracias al proceso de
fotosntesis, en el que la luz del sol, el dixido de carbono de la atmsfera, el agua
y los nutrientes de la tierra forman molculas orgnicas complejas de azcar, los
hidratos de carbono y la matriz lignocelulsica que se concentra en la parte fibrosa
de la planta. Esto forma parte del balance energtico de la tierra, por ello cuando
se usa el bioetanol como carburante emite a la atmsfera el dixido de carbono
que utiliz la planta para crecer y es por eso que ayuda a reducir los niveles de
CO
2
en la atmsfera (Daz et al., 2011).
Las tres principales clases de materia prima para la produccin de bioetanol son el
azcar (melaza, jugo de caa), almidones (maz, trigo) y biomasa lignocelulsica
(paja de arroz, bagazos). Los almidones y azcares para base de etanol hacen
referencia a la primera generacin de bioetanol. Estos compuestos energticos se
transforman en azcares y a continuacin se convierten en etanol por medio de
fermentacin alcohlica. La lignocelulosa como materia prima puede ser adquirida
ya sea de cultivos de biomasa forestal o dedicada a los residuos de la agricultura.
2.2.1 Bioetanol de primera generacin

El bioetanol de primera generacin hace referencia a aquellos provenientes de
cultivos agrcolas destinados a la alimentacin humana.
2.2.2 Bioetanol de segunda generacin

El bioetanol de segunda generacin no compite con la produccin de alimentos ya
que para la produccin del mismo se ocupa biomasa residual que est compuesta
principalmente de materiales lignocelulsicos, tales como residuos forestales,
herbceos, desperdicios de papel etc.
El principal reto en la produccin de etanol a partir de biomasa lignocelulsica es
el pretratamiento e hidrlisis de la materia prima. El complejo lignocelulsico est

10

compuesto principalmente de una matriz de carbohidratos formada de celulosa y
lignina enlazada por cadenas de hemicelulosa. En la Figura 3, se muestra una
comparacin entre la fermentacin de bioetanol de primera generacin y la
fermentacin de etanol de segunda generacin.
















Figura 3. Procesos de fermentacin con sacarosa y con biomasa lignocelulsica.
Fuente: Jain et al., 2011.















Biomasa
lignocelulsica
Almidn
Pretratamiento
Hidrlisis
Hidrlisis Glucosa/fructuosa
Interrupcin
de la biomasa
Fermentacin
Glucosa,
xilosa,
otros
Bioetanol
Fermentacin
Bioetanol

11

2.2.3 Bioetanol de tercera generacin

Esta tecnologa consiste en la utilizacin de algas para producir bioetanol. Las
algas son organismos unicelulares procariotas y autotrficos que llevan a cabo la
fotosntesis oxignica y acumulan glucgeno (carbohidrato) como la principal
forma de carbono almacenado. El alga verdeazulada prolifera rpidamente y utiliza
de manera eficiente la radiacin solar, CO
2
y elementos inorgnicos, utiliza la
fotosntesis como medio para capturar de manera eficiente la energa del sol para
convertirla en azcar intracelularmente, lo que proporciona la energa para crecer
y reproducirse. Actualmente existen algas modificadas genticamente para la
produccin directa de etanol (Biofields, 2010).

2.3 Produccin de bioetanol de segunda generacin

El pretratamiento es la principal caracterstica del bioetanol de segunda
generacin, se realiza para desintegrar la matriz lignocelulsica de tal manera que
la celulosa reduzca su grado de cristalinidad y aumente la celulosa amorfa, que es
la ms adecuada para el posterior ataque enzimtico. Adicionalmente, la mayor
parte de la hemicelulosa se hidroliza durante el pretratamiento y la lignina se
libera o puede incluso descomponerse. En una etapa posterior, la celulosa
liberada es sometida a hidrlisis enzimtica con clulas exgenas, lo cual hace
que se obtenga una solucin de azcares fermentables que contiene
principalmente glucosa, as como pentosas resultantes de la hidrlisis inicial de la
hemicelulosa. Estos azcares son posteriormente convertidos en etanol mediante
microorganismos que pueden utilizar uno o varios azcares presentes en el
material lignocelulsico pretratado e hidrolizado (Olsson, Hahn 1996; Snchez y
Cardona, 2005; Ballat, 2011; Jain et al., 2011; Hallenbeck, 2012; Sakar et al.,
2012). La produccin del etanol a partir de glucosa se puede simplificar en la
reaccin que se muestra en la Figura 4.


12


C
6
H
12
O
6
2C
2
H
5
OH +2 CO
2
Figura 4. Reaccin para la obtencin de bioetanol


2.3.1 Usos del etanol como biocarburante

Existen tres formas de utilizar el etanol como biocarburante. La ms utilizada de
estas es cuando el bioetanol se emplea en mezclas con gasolina convencional
para sustituirla como carburante en mayores o menores proporciones; no sustituye
totalmente a la gasolina, ya que esta le da a la mezcla estabilidad y resta
volatilidad. Las mezclas pueden ser E5, E10, E20 y hasta E95 (Hallenbeck, 2012),
indicando en nmero el porcentaje de etanol empleado en la mezcla: en medida
que se aumenta el contenido de etanol en la mezcla se reduce el impacto
contaminante, ya que libera menos CO
2.

Otra manera de poder utilizar bioetanol como combustible es modificar las
caractersticas del motor del vehculo para usar mezclas con mayor contenido de
etanol. La tercera estrategia es utilizar el bioetanol como aditivo sustituyendo el
metil terbutil ter (MTBE) que es un aditivo utilizado para incrementar el nivel de
octanaje en la gasolina comn pero que es altamente contaminante. Brasil es el
principal pas pionero en la produccin y utilizacin de bioetanol como combustible
carburante, en 1975 el gobierno brasileo inici el programa Pro-alcohol para
desarrollar el uso de alcohol etlico como combustible, as poda ser utilizado para
reemplazar MTBE, a diferencia de este el etanol es menos agresivo con el medio
ambiente ya que hace que la gasolina aumente su grado de biodegradabilidad.
De 1975 a 2000 Brasil produjo aproximadamente 5.6 millones de vehculos con
motores a prueba de etanol, aparte de los automviles con motor capaz de
aceptar etanol, el gobierno aprob la mezcla de etanol con gasolina en un 25% en
cada litro de gasolina (Moawad, 2012). El aspecto positivo de esta mezcla es que

13

se evita la emisin de110 millones de toneladas de dixido de carbono en la
atmsfera.
De acuerdo con la Agencia para el Aceite de Brasil, en 2007, se han producido
492 toneladas de caa de azcar y una porcin de este material se utiliz para
generar 8.4 mil millones de litros de etanol puro y 13.9 millones de litros de etanol
hidratado. Es as como Brasil est a la vanguardia de desarrollo de
biocombustibles como fuente de energa alternativa renovable, as como Estados
Unidos y algunos pases asiticos (Masiero, 2011).
2.4 Materias primas para la obtencin de bioetanol
El bioetanol puede ser producido a partir de materias primas que contienen
azcares fermentables tales como caa de azcar y remolacha azucarera,
materiales que son ricos en sacarosa. Otras materias primas incluyen algunos
polisacridos que pueden ser hidrolizados para obtener azcares asimilables por
microorganismos productores de etanol. El almidn es el principal polmero
utilizado actualmente para la produccin de etanol, mientras que la biomasa
lignocelulsica es la materia prima ms promisoria debido a su gran disponibilidad
y bajo costo (Kovalev et al., 2012).

2.4.1 Materiales ricos en azcares

Como se ha mencionado, la caa de azcar y la remolacha azucarera son las
principales materias primas ricas en azcares asimilables para la fermentacin
etanlica. El jugo extrado durante su procesamiento y melaza obtenida como
subproducto de la generacin de azcares son los sustratos ms utilizados por las
industrias dedicadas a la generacin de bioetanol (Snchez et al., 2010). El cultivo
de la caa de azcar prevalece en los pases tropicales como Brasil, Colombia y
Mxico. Por su parte la remolacha azucarera es principalmente empleada por
pases europeos.

14

2.4.2 Materiales amilceos

El almidn es un polmero compuesto exclusivamente por unidades de glucosa, lo
que lo constituye una materia prima muy importante para la produccin de etanol.
Tradicionalmente esta materia prima se ha utilizado para la produccin de bebidas
alcohlicas fermentadas, pero para su conversin en bioetanol con rendimientos
elevados es necesaria la degradacin de almidn hasta glucosa.
Este tipo de materia prima es utilizado masivamente en Norte Amrica y Europa
donde se utiliza el maz, el trigo y otros cereales para la produccin de etanol va
fermentativa previo pretratamiento del material e hidrlisis del almidn. En pases
tropicales otros cultivos ricos en almidn como tubrculos, pueden ser
implementados a nivel industrial para la generacin de alcohol carburante, como el
caso de Mxico donde se reportan estudios sobre la obtencin de bioetanol
utilizando yuca como materia prima (Snchez et al., 2010).

2.4.3 Materiales lignocelulsicos

Los materiales lignocelulsicos son una fuente de gran disponibilidad, ya que es
un desecho agroindustrial, al igual que las materias primas amilceas requieren de
tratamientos preliminares para la degradacin de los polisacridos a unidades de
azcar asimilables por los microorganismos fermentadores. Los materiales ms
estudiados y cuya potencialidad ha sido determinada son el bagazo de caa, el
rastrojo de maz, pajas de cereales, residuos slidos urbanos, pastos, entre otros.
En la Tabla 5 se muestran datos de los principales residuos agrcolas utilizados
para la obtencin de bioetanol de segunda generacin, as como el contenido de
su matriz de carbohidratos.


15

Tabla 5. Contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina (como porcentaje en peso
de biomasa seca) de diferentes materiales lignocelulsicos.
Residuos
agrcolas
Celulosa Hemicelulosa Lignina
Mazorca de maz 33.7-41.2 31.9-36 6.1-15.9
Bagazo de caa
de azcar
40-41.3 27-37.5 10-20
Paja de trigo 32.9-50 24-35.5 8.9-17.3
Paja de arroz 36.2-47 19-24.5 9.9-24
Paja de cebada 33.8-37.5 21.9-24.7 13.8-15.5
Tallo de soya 34.5 24.8 19.8
Tallo de algodn 38.4 20.9-34.4 21.45
Fuente: Conde et al., 2012.
2.5 Pretratamiento de biomasa lignocelulsica

Los materiales lignocelulsicos como ya se haba mencionado antes estn
integrados principalmente por tres constituyentes polimricos: la celulosa,
hemicelulosa (que en conjunto se llama holocelulosa) y lignina los cuales estn
asociados los unos con los otros y son los que finalmente sirven de soporte
estructural de la pared celular. La celulosa es el compuesto orgnico de mayor
abundancia en la naturaleza, de gran importancia a nivel biolgico y un polmero
de inters industrial. Se le denomina pretratamiento al conjunto de acciones para
mejorar el rendimiento en la obtencin de azcares fermentables desde la
biomasa inicial.
En general existen dos formas de manejo de la biomasa lignocelulsica para
preparacin de azcares fermentables. El primero de ellos, tiene como objeto la
conversin de la biomasa lignocelulsica indirectamente obteniendo holocelulosa y
lignina por separado, material que luego es degradado a un sustrato fermentable,
el segundo tipo en el cual el material lignocelulsico es sometido a una digestin
para obtener directamente un sustrato fermentable (Guarnizo et al., 2009)

16

Los pretratamientos estn orientados hacia la modificacin de la estructura
supramolecular y de esta manera separar lignina y la holocelulosa y /o la hidrolisis
de la holocelulosa en azcares fermentables (Tabla 6).

Tabla 6. Porcentaje de azcares en diferentes hidrolizados de residuos agrcolas.
Hidrolizado
Xilosa
(%)
Glucosa
(%)
Arabinosa
(%)
Galactosa
(%)
Manosa
(%)
Bagazo de caa de azcar 75 14 11 - -
Paja de arroz 67 21 12 - -
Madera dura 27 11 5 14 43
Fibra de maz 16 71 11 2 -
Fibra de xilano aislada de maz
26-60 16-37 24-46 - -
Fuente: Rangaswamy, 2003.

2.5.1 Hidrolisis cida
Los pretratamientos cidos implican el uso de soluciones de cido sulfrico diluido,
usualmente al 5% con rendimientos del 100% a 160C, o concentrado al 77% a
ms baja temperatura, con lo que se logra por hidrolisis cida, la formacin de
azcares. Con el pretratamiento cido, adems de la hidrolisis ocurren reacciones
de condensacin y eliminacin que llevan a la formacin de sustancias txicas
para las levaduras como el hidroximetilfurfural. No obstante se han propuesto
pretratamientos con hidrlisis cida parcial para la obtencin de azcares
fermentables, por ejemplo, el pino (Loblolly pine) fue sometido a hidrolisis cida
obtenindose 75% de conversin en madera de azcares fermentables, el resto
del material no degradado se llev a hidrlisis enzimtica alcanzando un 95% de
conversin global (Arrizon et al., 2010).

17

2.5.2 Hidrolisis enzimtica
Despus del pretratamiento cido, alcalino o por hongos, la matriz lignocelulsica
puede sacarificarse enzimticamente para obtener azucares fermentables. Los
microorganismos son fuentes potenciales de celulasas y hemicelulasas, que
pueden ser utilizadas para la hidrlisis del material lignocelulsico pretratado. Las
celulasas y hemicelulasas son enzimas especializadas en descomponer celulosa,
estas enzimas las producen microorganismos como bacterias y hongos, que son
los principales agentes de descomposicin del planeta.
La mejora ms importante que ha tenido la hidrolisis enzimtica es la introduccin
de la sacarificacin y fermentacin simultnea. Este bioproceso consiste en tres
pasos en uno, que son: produccin de celulasas, hidrolisis enzimtica de la
lignocelulosa y la conversin del hidrolizado en etanol (Guarnizo et al., 2009).

2.6 Fermentacin

Bsicamente, la bioconversin del complejo lignocelulsico en etanol incluye tres
procesos: despolimerizacin estructural de polisacridos en azcares
fermentables a travs de procesos termoqumicos y rutas enzimticas,
fermentacin de estos azcares en etanol y recuperacin de etanol.
La produccin de etanol por accin de microorganismos sobre malta o extractos
de fruta ha sido llevada a cabo a gran escala por muchos aos y fue el primer
proceso industrial para la produccin de un metabolito microbiano. Es por va
fermentativa que se obtiene la mayor cantidad de etanol a nivel mundial. El 95%
del etanol en el mundo se obtiene por fermentacin a partir de materias primas
que contengan carbohidratos. Un esquema general de un proceso de
fermentacin se muestra en la Figura 5.
Existen bsicamente tres maneras de fermentacin con microorganismos, para la
obtencin de etanol, estas son: por lote, lote continuo y lote alimentado (Tejeda et

18

al., 2011). La seleccin del modo de fermentacin depende de los
microorganismos que se utilizarn.



.











Figura 5. Proceso de fermentacin para la obtencin de etanol a partir de
diferentes sustratos.
Fuente: Marriaga, 2009.

Fermentacin
Microorganismo Sustrato Micronutriente
s
Fermentacin Recuperacin
Identificacin
y aislamiento
de cepa
Preservacin
de la cepa
Propagacin
del Mo.
Inoculacin
del Mo.
Formulacin
del medio
Esterilizacin
y
acondiciona-
miento del
medio
Adicionar y
mezclar
Condiciones
estriles
Aire estril
Vapor
Control de
temp.
Control de
pH
Medicin
de O.D
Agitacin
Interrupcin
de actividad
celular
Operaciones
unitarias
diversas

19

El sistema por lotes es el mtodo ms simple que se suele utilizar, pero tiene
algunas limitaciones, una de ellas es que la glucosa puede suprimir la
fermentacin de xilosa, especialmente en la etapa inicial, porque la conversin de
xilosa se inhibe completamente cuando la concentracin de glucosa es de 2.3 g/L
y superiores. En cambio en el sistema de fermentacin por lote continuo la
concentracin de glucosa se puede mantener suficientemente baja como para no
reprimir la utilizacin de xilosa. La ventaja que tiene el sistema de lote continuo es
que se puede controlar la tasa de glucosa mediante disolucin para que la glucosa
se mantenga debajo de 2.3 g/L, por lo que la conversin de glucosa y xilosa es
rpida y simultnea. Sin embargo, este enfoque puede limitarse si la cantidad de
etanol producido a partir de glucosa excede la tolerancia al etanol del
microorganismo utilizado para la fermentacin de xilosa. Cuando la glucosa se
encuentra por agotarse, la alta concentracin de etanol (alrededor de 30g/L)
puede inhibir el proceso de fermentacin de xilosa (Jojima et al., 2010). La
fermentacin en lote continuo en flujo de salida puede evitar la acumulacin de
etanol y otros metabolitos inhibidores del sistema.

2.7 Microorganismos utilizados

Como se ha mencionado el hidrolizado del material lignocelulsico son mezclas
complejas de distintos monmeros como pentosas y hexosas (Tabla 7), junto con
otros compuestos que pueden actuar como inhibidores para los microorganismos.
La glucosa derivada principalmente de la fraccin celulsica, determina toda la
posicin de la estructura lignocelulsica, es el sustrato ms importante que
utilizan los microorganismos que pueden producir alcohol a nivel industrial como
Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Shaccaromyces cerevisiae y
Zimmomona mobilis, las especies de microorganismos que pueden degradar
glucosa en alcohol son ms comunes que los microorganismos que pueden ser
capaces de degradar azcares derivados de la hemicelulosa ( xilosa, arabinosa,
manosa, galactosa) adems son sustratos menos eficientes en trminos de
productividad y rendimiento (Jojima et al., 2010). Es por esto que se deben de

20

elegir microorganismos que posean las siguientes propiedades: fermentacin
eficiente de pentosas y hexosas de preferencia que sean capaces de digerir estos
azcares simultneamente, alta tolerancia a los inhibidores, resistencia contra
contaminacin microbiana, alta productividad y rendimiento.

Por otra parte algunas pentosas como la xilosa que es uno de los componentes
fundamentales de la hemicelulosa, son difciles de degradar por ciertos
microorganismos como bacterias. Existen pocas especies de bacterias que tienen
esta capacidad como el caso de Clostridium thermocellum (Weber et al., 2010).

De la misma manera se han evaluado microorganismos con capacidad de
hidrolizar la celulosa, de asimilar pentosas y de trabajar en condiciones
termoflicas, ya que el incremento de temperatura acelera los procesos
metablicos y disminuye las necesidades de refrigeracin. Entre los
microorganismos de este tipo se encuentran levaduras como Pichia stipitis,
Candida shehatae, Candida tropicallis y Pachysolen tannophilus. En la tabla 7 se
muestra los microorganismos que se han utilizado para la produccin industrial de
etanol.

La capacidad de los microorganismos para metabolizar pentosas, es
independiente del rendimiento de estos azcares y su productividad ya que tanto
el rendimiento como la productividad de etanol son bajos, esto se ha atribuido a
una variedad de fenmenos incluyendo la represin de catabolitos de carbono y
desequilibrio en el metabolismo celular redox de pentosas y la absorcin
ineficiente de algunos azcares (Jojima, et al., 2010). La importancia de cada uno
se estos varia con el microorganismo en cuestin.

21

Tabla 7. Principales microorganismos productores de etanol con aplicacin
industrial
Especie microbiana Microorganismo Sustratos
fermentables
Condiciones de
fermentacin

Levaduras Saccharomyces
cerevisiae
Glucosa
Fructuosa
Sacarosa
Maltosa
Anaerbico
30-37C

Saccharomyces pombe Anaerbico
30-35C
Kluyveromyces
marxianus
Glucosa Anaerbico
40-45C
Pichia stipitis Glucosa
Xilosa
Microaeroflico
26-35C
Candida shehatae Microaeroflico
20-31C
Candida tropicallis
Pachysolen tannophilus Xilosa
Glicerol
Glucosa
Microaeroflico
Bacterias Zymomona mobilis Fructuosa
Sacarosa
Anaerbico
30C
Clostridium
thermohydrosulfuricum
Glucosa
Celulosa
Anaerbico
55-65C
Clostridium
thermosaccharolyticum

Clostridium
thermocellum

Termoanaerobacter
thermosaccharolyticum
Xilosa Anaerbico
60C
Fuente: Elaboracin propia


22

La va de bioconversin de glucosa y xilosa a etanol presente en los
microorganismos utilizados se muestra en la Figura 6.


Figura 6. Representacin esquemtica del metabolismo de la D-xilosa en
levaduras.
Fuente: Silva et al., 2005.

2.7.1 Pichia stipitis

La levadura Pichia stipitis se aisl de madera en descomposicin y en las larvas
de los insectos que habitan en maderas, es uno de los microorganismos ms
estudiados en la fermentacin de xilosa. Las cepas de P. stipitis producen bajas
cantidades de celulasas y hemicelulasas (enzimas encargadas de descomponer
D-xilosa
Xilitol
D-xilulosa
NADPH
NADP
NADP
NADPH
D-xilulosa-5-fosfato
ADP
ATP
Va de las pentosas fosfato Va de la fosfocetolasa
Gliceraldehido-3-fosfato
Va de Embden-Meyerhoff
Etanol
Piruvato
Ciclo de Krebs
Acetaldehdo Etanol
CO2
NADH NAD

23

celulosa y hemicelulosa) para descomponer la madera en azcares monomricos.
Tambin es capaz de producir etanol a partir de glucosa, galactosa, manosa,
xilosa y celobiosa con altos rendimientos y baja cantidades de xilitol (Agbogbo y
Wenger, 2006).
Los resultados de la fermentacin de xilosa con esta levadura muestran que
pueden ser producidos 61g de etanol/L en medios sintticos y 41g/L en madera
de lamo pretratada. La productividad mxima de etanol es alrededor de 0,9 g/L
(La Grage, et al., 2010). Entre otras caractersticas que posee P. stipitis se puede
mencionar que tiene la capacidad de consumir cido actico y reducir el anillo de
furano en furfural e hidroximetilfurfural (HMF), por tanto puede limpiar algunas de
las toxinas que se generan en el pretratamiento de la biomasa celulsica
(Agbogbo, et al., 2008).
Recientemente fue publicado, la secuencia del genoma de P. Stipitis (Jeffries, et
al., 2007). Esta mostr numerosos genes para la bioconversin tales como:
xilanasa, endo-1, 4 -glucanasa, exo-1, 3- -glucosidasa, -manosiadasa, y -
glucosidasa. La presencia de estos genes en P. stipitis ofrece caractersticas muy
tiles para la sacarificacin y fermentacin simultnea de celulosa y hemicelulosa.
En comparacin con S. cerevisiae, las tasas de consumo de azcar en P. Stipitis
son menores y esto parece estar relacionado con el transporte de azcares. En
medios ptimos que contienen 150 g/L de xilosa se pueden obtener un mximo de
61 g/l de etanol con un rendimiento de 41% de etanol (Weber, et al., 2010). P.
stipitis muestra una produccin de etanol ptima en condiciones microaerfilas y
bajo condiciones aerbicas no hay produccin de etanol, incluso con exceso de
azcar. La productividad de etanol ha sido evaluada en diferentes hidrolizados con
rendimientos que oscilan de 31 a 48% de etanol (Agbogbo y Coward, 2008).
En la Tabla 8 se observa el rendimiento de etanol, producido por diferentes
microorganismos utilizando diferentes hidrolizados de materiales lignocelulsicos.



24

Tabla 8. Fermentacin microbiana de hidrolizados de diferentes materiales
lignocelulsicos

Complejo
lignocelulsico
Hidrolisis Azcar en
el
hidrolizado
(g/L)
Microorganismo Produccin
de etanol
(g/L)
Rendimiento
de etanol
(g/L/h)

Madera suave
Abedul Acida NA S. cerevisiae CBS 8066 NA 0.43
Sauce Explosin
de vapor
10 E. coli K011 4.6 0.51
lamo xido de
azufre
31 E. coli B(pLo1 297) 14.9 0.48
Madera dura
Picea cida NA S. cerevisiae CBS 8066 NA 0.44
Pino xido de
azufre
75.3 E. coli K011 32.0 0.43
Residuos
agroindustriales

Bagazo de caa
de azcar
Acida 30.29 C.shehatae NCIM3501 8.67 0.48
Paja de trigo Acida NA P. stipitis NRRL y-7124 0.41+- 0.01
Rastrojo de
maz
Acida 42 P. stipitis CBS 6054 15 0.37-0.44
Residuos
slidos
municipales

Peridico Enzimtica 38.21 S. cerevisiae 14.77 0.39
Fuente: Chandel y Singh, 2011






25

2.7.2 Candida Tropicalis

Una de las levadura recomendada para la fermentacin de mezclas de glucosa y
xilosa es C. tropicalis, este microorganismo es capaz de metabolizar compuestos
fenlicos, es decir, puede degradar cualquier compuesto proveniente de la lignina
lo que hace que no haya inhibicin por este tipo de compuestos en el proceso de
fermentacin.
Un estudio para la obtencin de bioetanol a partir de un hidrolizado de bagazo de
arroz y una cepa de C. tropicalis report que la concentracin de xilitol aumento
despus de 12 horas en fermentacin, esto debido a que las clulas, convirtieron
inicialmente la glucosa en etanol, despus de gastar la glucosa, dependan
nicamente de xilosa como fuente de carbono y es por esto que se produjo xilitol,
lo cual indica que las clulas de C. Tropicalis, pueden convertir eficientemente
nicamente el 75% del sustrato en etanol (Singh, 2010).
2.7.3 Fermentacin en sistema cocultivo
El sistema de fermentacin en cocultivo, se refiere a la fermentacin utilizando dos
microorganismos de diferentes especies. Cada par seleccionado de los
microorganismos tendr su propios parmetros ptimos tales como: temperatura,
pH, ambiente aerbico o anaerbico y tamao de inoculo. Por lo tanto es
importante encontrar los intervalos ptimos de funcionamiento para los parmetros
del proceso y los rangos aceptables de sustrato que puede permitir la actividad
ptima de cada cepa en el cocultivo. Ya que a diferencia de la produccin de
etanol con una sola cepa de microorganismo, los cocultivos pueden diferir
respecto al pH, temperatura y las necesidades de oxgeno.
Los retos para el uso de cocultivo a escala industrial son varios como lo es la
cofermentacin de hexosas y pentosas. Otro de los principales desafos en el
proceso de cocultivo es la tolerancia de etanol en la fermentacin de xilosa con
levaduras, un ejemplo de esto se da cuando se trabaja con P. stipitis ya que la
inhibicin de etanol se produce cuando se alcanza una concentracin de 30 g/L

26

(Jojima, et al., 2010). La rpida formacin de etanol a partir de glucosa en el
sistema cocultivo aumenta la posibilidad de fermentacin de xilosa a etanol. La
mejora para la produccin de etanol con glucosa y xilosa puede depender de la
disminucin de la influencia de etanol a travs de la seleccin de cepas ms
tolerantes al etanol o el uso de sistemas de eliminacin de etanol acoplados a la
fermentacin.
Por lo tanto los compromisos en los parmetros del proceso son muy necesarios,
por ejemplo la competencia por oxgeno result en la baja conversin de xilosa a
etanol en el cocultivo con S. cerevisiae y P. stipitis (Chen, 2011). El uso de una
cepa mutante de Saccharomyces, deficiente en respiracin (no consume oxgeno)
puede proporcionar condiciones favorables para que la levadura fermente xilosa.
La combinacin ms utilizada en la corriente del cocultivo es el par de P. stipitis y
S. cerevisiae; este par tiene mejor compatibilidad y mejor rendimiento de
fermentacin con respecto a la combinacin de levaduras y bacterias como Z.
mobilis
2.8 La agroindustria de naranja y toronja en Mxico

La naranja (Citrus sinensis) mexicana es uno de los productos de mayor
rentabilidad en los agronegocios, dado su importante consumo en el pas y en el
extranjero, as como su gran utilizacin industrial para la obtencin de jugos y
extractos. Actualmente junto con la toronja (Citrus paradasi), representan el 71.4%
de la produccin de ctricos en el pas, abarcando casi un tercio del total de reas
destinadas a la fruticultura (Escalante, 2009).

Mxico se coloca en la quinta posicin como productor de naranja y toronja en el
mundo con 4.4 millones de toneladas/ao, cifra que signific un record en el 2008,
segn la Secretara de Agricultura, Ganadera, Desarrollo Rural, Pesca y
Alimentacin (SAGARPA). Veracruz es la principal regin productora de naranja y

27

toronja ya que representa casi el 50% de la superficie total de naranja sembrada
en el pas. Los principales municipios citricultores que integran sta regin son:
lamo (27,000 ha de produccin), Tihuatln (8,900 ha), Castillo de Teayo (5,500
ha) y Tuxpan (3,600 ha), los cuales suman una superficie total aproximada de 40,
000 ha en produccin. Otros estados productores son San Luis Potos y
Tamaulipas y con menos produccin Sonora, Yucatn, Tabasco y Nuevo Len.

Por otra parte, es una realidad que por la estacionalidad de la produccin, el
mercado del producto fresco est saturado y por lo tanto la generacin de residuos
de este producto aumenta da con da, es por esto que se requiere de aplicar
tecnologa para un aprovechamiento integral del residuo, para obtener diversos
subproductos.
2.8.1 Aprovechamiento y valorizacin de residuos de la agroindustria de
ctricos naranja-toronja

La industria procesadora de ctricos (naranja y toronja) emplea grandes volmenes
de fruta, y sus desechos incluyen corteza, pulpa y semillas. Estos residuos en un
alto porcentaje se usan en algunos pases para la manufactura de una serie de
subproductos como aceites fijos y voltiles, ceras, resinas, productos pcticos,
celulosa, alimento para ganado, fertilizantes, cido actico, ctrico y lctico
(Gutirrez et al., 2002).
La industria farmacutica aprovecha los residuos ctricos fundamentalmente para
la extraccin de aceites esenciales, (terpenos del flavedo), pectina del albedo y
obtencin de flavonoides (hesperidina y naringenina) (Rincn et al., 2005).
En general los flavonoides pertenecen al grupo de los compuestos fenlicos y
frecuentemente se encuentran derivados de steres, teres y glicsidos. Los
compuestos fenlicos han mostrado una amplia variedad de actividades
biolgicas: antioxidante, antimicrobiana, antiinflamatoria, inmunomoduladora,
antiviral, antiproliferativa, antimutagnica, acciones vasodilatadoras, y prevencin
de enfermedades coronarias y desrdenes neurodegenerativos (Londoo, 2011).

28

Especficamente, en cuanto a los flavonoides, la naringenina es el mayoritario en
la toronja y la hesperidina lo es en la naranja. Otros metabolitos importantes en
stos ctricos son las cumarinas y cidos orgnicos como el cido ctrico y el
ascrbico.
Las aplicaciones teraputicas de algunos de estos compuestos son ya conocidas y
utilizadas en el mbito clnico. La mezcla micronizada de flavonoides Dafln, que
contiene 90% de diosmina y 10% de hesperidina es utilizada como un potente
medicamento flebotnico para el tratamiento de la insuficiencia venosa crnica.
Adems son numerosos los productos fitoteraputicos y alimentarios funcionales
comercializados en el mundo que contienen totalmente o como parte de sus
principios activos, una fraccin de flavonoide, comnmente llamada bioflavonoides
e incluso denominada genricamente como vitamina P (Londoo, 2011).
En cuanto a los mtodos de extraccin de flavonoides, han surgido procedimientos
para su obtencin a partir de cscara de ctricos aplicados en industrias
farmacuticas y de alimentos. Estos mtodos estn basados en el tratamiento
alcalino de las cscaras de ctricos y posterior precipitacin de hesperidina desde
soluciones acidificadas, con posteriores pasos de recristalizacin para aumentar la
pureza del producto comercial. Son varias las metodologas de extraccin de
antioxidantes a partir de cscaras de ctricos, entre ellas la extraccin con
disolventes, extraccin en medio alcalino, extraccin asistida por ultrasonido y
extraccin enzimtica (Londoo, 2011).
Otro subproducto de valor agregado que se obtiene de los residuos de naranja-
toronja son los aceites esenciales que son una combinacin de compuestos
secundarios de las plantas como terpenos y compuestos fenlicos. Los terpenos
son una familia de compuestos derivados del isopreno, sintetizada por la misma
planta, gracias a una serie de reacciones metablicas. Estas combinaciones de
sustancias no son de vital importancia para la planta pero son responsables del
olor caracterstico de estos ctricos. En el caso de la naranja y toronja (Ayala et
al., 2011) el compuesto de mayor presencia es el d-limoneno, y se reportan
concentraciones por alrededor del 90%.

29

Los mtodos de extraccin que generalmente se utilizan para obtener aceite
esencial son: hidrodestilacin o prensado mecnico. EL primero consiste en hacer
ebullir una solucin de CNR en agua, donde el vapor de la misma arrastrar
compuestos por afinidad, esta corriente posteriormente se hace pasar por un
intercambiador de calor y finalmente se separar por densidades quedando el
aceite esencial en la parte de arriba. En el caso del prensado se utiliza maquinaria
para romper la epidermis de la cscara donde se encuentra el aceite,
posteriormente comienzan a crearse reas con mucha presin por la accin de la
maquinaria, pero otras donde la presin es menor, provocando el flujo del aceite
por stas y finalmente, la cscara se raspa produciendo pequeos trozos de
residuos (Ayala et al., 2011).
Actualmente, existen varios estudios encaminados al aprovechamiento de la
fraccin slida de la naranja, como substrato de biorreaccin en fase slida para la
produccin a bajo costo de cidos orgnicos, particularmente cido lctico
(Heliodoro et al., 2008), el cual es ampliamente utilizado en la industria
alimentaria, mdica, farmacutica y cosmtica, como materia prima para sntesis
orgnica, como purgante en forma de lactato de calcio o lactato de magnesio,
como removedor de sales de calcio en el curtido de pieles, en la produccin de
plsticos biodegradables, agroqumicos, etc.
2.9 Composicin de residuos ctricos naranja-toronja como material
lignocelulsico

Los residuos ctricos estn compuestos principalmente de agua, azucares
solubles, fibra, cidos orgnicos, aminocidos, minerales, aceites esenciales,
flavonoides y vitaminas.
La fibra es el principal constituyente de los residuos de naranja-toronja y es un
material de la pared celular vegetal, en esta se puede encontrar: celulosa,
hemicelulosa, pectinas y lignina (Tabla 9). Las fibras son aquellos constituyentes
que dan firmeza, resistencia y textura fuerte a la estructura externa de las frutas.

30

Las pectinas conforman del 65 al 70% de la fibra total, la fibra restante est en
forma de celulosa, hemicelulosa y cantidades trazas de lignina (Milena et al.,
2008). En trminos generales se puede decir que la fibra consta de: polisacridos
estructurales o polisacridos no almidn (celulosa, hemicelulosa, pectinas,
rafinosa, estafinosa), polisacridos no estructurales (gomas y muclagos) y
sustancias estructurales no polisacridos (ligninas).

Tabla 9. Porcentajes de Celulosa, hemicelulosa y lignina en desechos ctricos
%(w/w) BS
Celulosa
%(w/w) BS
Hemicelulosa
% (w/w) BS
Lignina

Desechos ctricos
(bagazo y cscara)
20.63
16.2+-0.5
10.86
13.8+-0.3
2.62
1.0+-0.3
Fuente: Snchez et al., 2010
2.9.1 Pectinas
Las pectinas son polisacridos no estructurales que se componen principalmente
de unidades de cido galacturnico unidas por enlaces 1,4--glucosdicos. Son
sustancias blancas amorfas que forman en agua una solucin viscosa;
combinadas en proporciones adecuadas con azcar y cidos forman una
sustancia gelatinosa utilizada como espesante (Valencia y Romn, 2004).
2.9.2 Celulosa
Est conformada por subunidades de D-glucosa (monosacrido de gran
importancia en la fermentacin), unidas por enlaces 1,4-- glucosdicos. La
celulosa posee dos estructuras una cristalina (organizada) y otra amorfa. Las
capas de celulosa son empaquetados denominados fibrillas de celulosa. Ests

31

fibrillas de celulosa en su mayora independientes y dbilmente vinculados a
travs de puentes de hidrgeno (Conde et al., 2012)
Cada cadena de celulosa est ligada a otras por puentes de hidrgeno que le
aportan rigidez al material. Si los enlaces son pocos la celulosa se considera
amorfa, mientras que una disposicin especial de estos enlaces generan
diferentes formas cristalinas. As la celulosa puede presentarse en cuatro
macroestructuras cristalinas denominadas celulosa I, II, III y IV. La celulosa I es la
que normalmente se encuentra en la pared celular. La clase II, es la ms
termodinmicamente estable y resulta de la recristalizacin de la I o de su
mercerizacin en solucin de hidrxido de sodio. Ests dos son las ms
importantes al considerar los pretratamientos.
2.9.3 Hemicelulosa
Carbohidrato complejo y heterogneo ya que su estructura posee diferentes
polmeros conformados por pentosas (xilosa y arabinosa), hexosas (manosa,
glucosa y galactosa), entrelazados entre s glucosdicamente (Saha, 2003). La
hemicelulosa sirve de conexin entre la lignina y las fibras de celulosa.
La hemicelulosa suele ser un polmero de menor masa molar que la celulosa y
ms fcilmente hidrolizable debido a su estructura predominantemente amorfa.
Las hemicelulosas, al igual que la celulosa, se han perfilado como fuente de
azcares.
2.9.4 Lignina
Heteropolmero amorfo que consta de tres diferentes unidades de fenilpropano (p-
coumaril, coniferil y alcohol sinaplico) que se mantienen unidos por diferentes
enlaces. El heteropolmero amorfo no es soluble en agua y es pticamente activo;
todo esto hace que la degradacin de la lignina sea muy complicada. Su funcin
en el mbito estructural, es el de mantener unidos la celulosa y las hemicelulosas
entre s (Arrizon et al., 2010).


32

2.10 Uso de residuos de naranja y toronja para la obtencin de bioetanol

Las produccin de naranjas es de 70 millones de toneladas en todo el mundo,
constituyen el fruto ms consumido y representan el tercer fruto en extensin de
cultivo despus de los pltanos y de las uvas (Escalante, 2009). Hoy en da se
encuentran cultivadas en todos los continentes, en zonas donde se tenga un clima
propicio, es decir abundancia de sol, agua y poca humedad ambiental, es por esto
que la produccin de bioetanol a partir de residuos ctricos ha tenido mucho auge
en pases tropicales como los que se reportan a continuacin.
En 2009 la Universidad de Cartagena, Colombia, report un estudio sobre la
produccin de bioetanol, a partir de cscaras de naranja (Citrus sinensis) y pia
(Anans sativus). En este trabajo se detect el contenido de azcares reductores
de los materiales lignocelulsicos de cada uno de los sustratos, despus de un
pretratamiento cido de las cascaras para obtener un jarabe glucosado, se
ferment utilizando una cepa de Saccharomyces cerevisiae en un reactor de
agitacin durante 7 horas. Se determin el con tenido de etanol por cromatografa
de gases y se encontr finalmente que con las cscaras de naranja se obtuvo
mayor contenido de etanol que con las cscaras de pia (Tejeda, et al., 2009).
En Quito Ecuador, la Universidad Politcnica del Ejercito, hizo un estudio para la
obtencin de bioetanol a partir de residuos de naranja Citrus sinensis,
provenientes del proceso agroindustrial en la provincia de Bolivar. En este
proyecto de investigacin se realiz el pretratamiento de los desechos de naranja
con hidrlisis enzimtica, mediante la accin de enzimas producidas por el hongo
Aspergillus sp. En los ensayos para fermentar loa azcares provenientes de la
hidrlisis se ocuparon Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis.
Finalmente se determin mediante cromatografa de gases la concentracin de
etanol (Albn y Freire, 2009).



33

3. JUSTIFICACIN

En 2008, se expidi en Mxico la Ley de promocin y desarrollo de los
bioenergticos la cual tiene como objetivos principales, promover la produccin
de insumos para bioenergticos, a partir de las actividades agropecuarias y
forestales del campo mexicano as como desarrollar, comercializar y utilizar
eficientemente los bioenergticos, sin poner en riesgo la seguridad alimentaria del
pas.
La industria procesadora de ctricos, desecha grandes cantidades de cscaras de
naranja-toronja, que representan entre el 45 y 60% del peso total de la fruta, que
al no ser gestionados de manera conveniente provocan problemas ambientales
desaprovechando as el valor que stas tienen como fuente potencial de insumo
para la elaboracin de productos de valor agregado ya que contienen
compuestos como azcares fermentables solubles (glucosa, fructuosa y sacarosa)
y carbohidratos insolubles como pectinas, celulosa y hemicelulosa, los cuales
pueden ser hidrolizados a carbohidratos simples como, glucosa, galactosa,
arabinosa y xilosa. El uso de hidrolizados de residuos lignocelulsicos como las
cscaras de naranja-toronja para la obtencin biotecnolgica de etanol constituye
una alternativa de uso de gran importancia social y econmica






.


34

4. OBJETIVO GENERAL

Establecer de manera preliminar las condiciones para la obtencin de etanol
utilizando un hidrolizado de cscara de naranja y toronja y un cocultivo de Candida
tropicalis y Pichia stipitis
4.1 OBJETIVOS ESPECFICOS

Determinar las condiciones de hidrlisis de las cscaras de naranja y
toronja
Determinar la composicin qumica del hidrolizado de cscaras de naranja y
toronja
Establecer las condiciones de fermentacin del hidrolizado con Candida
tropicalis y Pichia stipitis.
Determinar la eficiencia de bioconversin de xilosa a etanol



5. HIPTESIS
Es posible establecer de manera preliminar las condiciones necesarias para
obtener bioetanol a partir de un hidrolizado de cscaras de naranja y toronja y un
cocultivo de Candida tropicalis y Pichia stipitis.







35

6. MATERIAL Y MTODOS

El presente trabajo se realiz en el laboratorio 34 de Proyectos- Investigacin de la
Facultad de Ciencias Qumicas- Xalapa de la U.V. En la figura 7 se muestra el
diagrama de trabajo propuesto en este trabajo para la obtencin de etanol a partir
de un hidrolizado de cscaras de naranja-toronja.















Figura 7. Diagrama de trabajo para la obtencin de etanol a partiir de un
hidrolizado de cscaras de naranja-tronja.





Obtencin de cscaras de
naranja y toronja
Secado y molienda
Hidrolizado de las cscaras
Fermentacin
Determinacin de la
composicin qumica del
hidrolizado
Cuantificacin de bioetanol
producido

36

26.1 Obtencin de harina de cscaras de naranja toronja

Las cscaras de naranja (Citrus sinensis) y toronja (Citrus paradasi), se
consiguieron en jugueras de la ciudad de Xalapa, Veracruz. Se les removi la
fibra, para que quedara unicamente la pared celular del fruto (cscaras). Despus
de esto se pesaron, secaron en un horno de conveccin Humboldt MFG.CO. y
finalmente se pulverizaron con ayuda de un mortero (Figura 8).



Figura 8. Cscaras de naranja-toronja secadas en horno de conveccin

6.2 Hidrlisis cida de la harina de cscaras de naranja-toronja

Se mezclaron cantidades iguales de harina de cscara de naranja y toronja y se
procedi a la hidrlisis en un matraz de 1000 mL, se aadi cido sulfrico al 2%
en una relacin 1:5 colocando el matraz en el autoclave a 130C durante 30
minutos. Se filtr y posteriormente se centrifug a 2500 rpm a temperatura
ambiente por 20 min (Tejeda et al., 2009).




37

6.3 Microorganismos

Se utilizaron dos levaduras: 1) Candida tropicalis IEC5-ITV aislada en el
Laboratorio de Bioingeniera de la Unidad de Investigacin y Desarrollo de
Alimentos del Instituto Tecnolgico de Veracruz a partir de bagazo de caa, 2)
Pichia stipitis NRRL-Y7124 proporcionada por el mismo laboratorio.
6.3.1 Conservacin de las cepas

Las cepas se resembraron mensualmente en medios de conservacin especficos,
el de Candida tropicalis IEC5-ITV contena xilosa como fuente de carbono (Tabla
10) y el medio de conservacin de Pichia stipitis NRRL-Y7124, glucosa (Tabla 11),
ajustando en ambos casos el pH a 5.5 y mantenindolas a una temperatura de
4C.
Tabla 10. Medio de conservacin utilizado para C. tropicalis IEC5-ITV
Componente Cantidad g/L
Agar 25.0
Extracto de levadura 10.0
D(+)Xilosa 20.0
Fuente: Gastlum,2007

Tabla 11. Medio de conservacin para P. stipitis NRRL-Y7124
Componente Cantida g/L
Agar 20.0
Extracto de levadura 10.0
D(+)Glucosa 20.0
Fuente:Gastlum, 2007


38

6.3.2 Activacin de las cepas

Las cepas de C. tropicales IEC5-ITV y P. stipitis NRRL-Y7124 se activaron por
separado inoculando tres asadas de la levadura en 50 mL de un medio sinttico
cuya composicin se muestra en la tabla 12 y para Saccharomyces cerevisiae en
la tabla 13, contenidos en un matraz Erlenmeyer de 125 mL, ajustando el pH a 5.5,
incubando a 30C, 24 horas a 150 rpm.
Tabla 12. Composicin sel medio de activacin para C. tropicalis y P. stipitis
Componente Cantidad (g/L)
D(+)Xilosa 20.0
KH
2
PO
4
5.0
(NH
4
)
2
SO
4
2.0
Mg(SO
4
).7H
2
O 0.4
Extracto de levadura 1.0
Fuente: Gastlum, 2007

6.4 Medio de fermentacin

El medio de fermentacin utilizado fue el hidrolizado de cscaras de naranja-
toronja enriquecido con extracto de levadura (1.0 g/L), urea(3.0 g/L) y K
2
HPO
4
(5.0
g/L). Para evitar una disminucin de la concentracin de los componentes en el
medio de fermentacin se esterilizaron por separado los azcares del extracto de
levadura y urea, con esto tambin se evitan reacciones del tipo Maillard.
6.5 Preparacin del inculo para fermentacin

Se activaron las levaduras en 50 mL de medio de activacin contenido en un
matraz Erlenmeyer de 125 mL, inoculando con tres asadas de levadura

39

proveniente del medio de conservacin e incubando a 30C durante 24 horas a
250 rpm de agitacin (Gastlum, 2007).
a) Determinacin de viabilidad

Despus de 24 horas de activacin, se tom una muestra de cada una de las
cepas cultivadas y se prepar una solucin 1:1 con azul de metileo al 2%. Se dej
reposar 10 min y posteriormente se llen por capilaridad la cmara de Thoma, con
cada una de estas soluciones, la cmara de Thoma permite hacer un conteo de
celulas vivas y muertas utilizando el microoscopio en objetivo 40x (seco medio).

Para determinar la viabilidad del medio de activacin se cuentan por separado las
clulas vivas, ests no se tien con el azul de metileno y las clulas muertas estan
completamente teidas. A cada cultivo se le determino el porcentaje de viabilidad,
contando las clulas en 5 cuadros de la cmara de Thoma y aplicando la siguiente
formula:

%viabilidad=(clulas vivas/clulas totales) (100)
Donde:
Clulas totales= clulas vivas + clulas muertas

La viabilidad del cultivo debe ser mayor del 80% para ser utilizadas en la
fermentacin.

b) Cuenta celular
El nmero de clulas se determin por conteo empleando una cmara de Thoma.
Se prepar una solucin 1:1 de medio de activacin de 24 horas con azul de
metileno y se dej reposar esta solucin por 10 min. Posteriormente se lleno la
cmara de Thoma con dicha solucin. Cada conteo fue realizado a partir de 5
cuadros de la cmara de Thoma. El volumen de cada cuadro es de 4x10
6
. La
concentracin de clulas (X) por mL de medio de fermentacin est dada por la
ecuacin:

40

X=(N)(D)(1x10
6
) / (4)(n)
Donde:
N = Nmero de clulas contadas.
D = Disolucin
n = nmero de cuadros grandes contados (5)

6.6 Fermentacin

Se inocularon 6 x 10
6
clulas viables/mL a un matraz de 125 mL que contenan 50
mL de medio de fermentacin enriquecido. Se realiz la fermentacin en lote en
un agitador rotatorio a 250 rpm y 30C por 48 horas. Los ensayos de fermentacin
se llevaron a cabo de acuerdo a las condiciones indicadas en la tabla 14.
6.7 Determinacin de los componentes del hidrolizado de cscara de
naranja-toronja y productos de la fermentacin por HPLC

Para la determinacin de los productos de la hidrlisis y fermentacin de la
cscara de naranja-toronja: xilosa, glucosa, arabinosa y etanol se emple un
cromatgrafo curter S, automuestreador 717 PLUS, controlador 600 con detector
de ndice de refraccin 2414 y adaptado a una columna Shodex 1011, usando una
fase mvil H
2
SO
4
0.1N y velocidad de flujo de 0.6 ml/min a 55C. Las muestras
fueron procesadas en el Laboratorio de Bioingeniera de la Unidad de Desarrollo
de Alimentos (UNIDA) del Instituto Tecnolgico de Veracruz.





41

7. Resultados

7.1 Composicin del hidrolizado de cscara de naranja-toronja

Las condiciones para obtener el hidrolizado de las cscaras de naranja-toronja
(HCNT) fueron similares a la propuesta para generar un hidrolizado de bagazo de
cscara de pia (Mndez, 2010). Se procedi a la cuantificacin de sus
componentes por HPLC, obtenindose los resultados que se muestran en la Tabla
13.

Tabla 13. Composicin del hidrolizado de cscaras de naranja-toronja
Componente Glucosa Xilosa Glicerol Acido
actico
Etanol

Hidrolizado de
cscaras

2.347

3.166

0

0.830

0

Aun cuando en la literatura consultada no se encontraron valores de referencia
con respecto al contenido de xilosa y glucosa en cscara de naranja y toronja se
puede establecer que los determinados en este trabajo son bajos con respecto a
lo reportado para hidrolizados lignocelulsicos provenientes de otras fuentes como
cscara de pia (Mndez, 2010) o bagazo de caa (Snchez,2005) en donde se
determinaron concentraciones de xilosa entre 20-30 g/L, lo anterior puede
deberse a que el tiempo de hidrlisis fue insuficiente para liberar los azcares
presentes en la celulosa y hemicelulosa. Como era lo esperado, la xilosa es el
principal carbohidrato presente en el HCNT, seguido de glucosa y cido actico
(Agbogbo y Coward, 2008). P. stipitis y C. guillermondii son levaduras que tienen
la capacidad de fermentar xilosa (Agbogbo, 2006).

42

7.2 Produccin de etanol por C. tropicalis IEC5-ITV, Pichia stipitis NRRL-
Y7124 y el cocultivo de ambas
Candida tropicalis IEC5-ITV (Figura 9 A) es una levadura autctona que fue
aislada de bagazo de caa, en el laboratorio de Bioingeniera de la UNIDA del
Instituto Tecnolgico de Veracruz. Esta cepa ha mostrado capacidad para
sintetizar xilitol, un edulcorante de amplia aplicacin en la industria alimentaria y
farmacutica, pero tambin etanol a partir de xilosa obtenida de hidrolizados de
bagazo de caa de azcar. Pichia stipitis por su parte (Figura 9 B) es capaz de
fermentar glucosa, xilosa, manosa, galactosa y celobiosa (Agbogbo y Coward,
2008).


Figura 9. Candida tropicalis IEC5-ITV (A) y Pichia stipitis NRRL-Y7124 (B)

Inicialmente se utiliz como medio de fermentacin el HCNT diluido en una
proporcin 1:1 con agua estril sin adicionar ningn nutriente, debido a que se
pens que el cido actico presente poda inhibir el crecimiento de las levaduras.
Despus de 24 h se encontr que no hubo crecimiento, por lo que se decidi no
diluirlo y adicionarles extracto de levadura, urea y fosfato monobsico que
estimularan el crecimiento microbiano. La decisin de adicionar estos nutrientes
A B

43

fue con base a la mejora de produccin de biomasa observada en Candida
tropicalis IEC5-ITV utilizando un hidrolizado de bagazo de caa (Gastlum, 2007)
y a lo reportado por Agbogbo y Coward (2008) quienes observaron un estmulo del
crecimiento de varias especies de Pichia por la adicin de varios compuestos
entre los que se encuentran los aqu agregados.

Cuando el medio de fermentacin fue HCNT enriquecido sin diluir se favoreci la
produccin de etanol (Figura 10) tanto en el caso en donde se utiliz una sola
cepa de levadura como en el cocultivo, el cual se inocul en una relacin 1:1.


Figura 10. Produccin de etanol por Pichia stipitis NRRL-Y7124 (A), Candida
tropicalis IEC5-ITV (B) o un cocultivo de ambas (C) en relacin 1:1 y
un hidrolizado de cscaras de naranja y toronja como medio de
fermentacin

44

En todos los casos la produccin de etanol, fue casi en la misma concentracin
(aproximadamente 1 g/L). Si bien los valores obtenidos son bajos, lo cual era
esperado puesto que la concentracin de xilosa presente en el hidrolizado de
cscaras de naranja y toronja era baja, resulta prometedor el uso de estos
microorganismos para la produccin de etanol si se considera que esta cantidad
se obtuvo a partir de 3 g/L de xilosa, Mndez (2010) utilizando hidrolizado de
cscara de pia obtuvo a partir de una concentracin de xilosa de 20 g/L, en el
mejor de los casos 5 g/L de etanol.
7.3 Consumo de xilosa y glucosa por Candida tropicalis IEC5-ITV, Pichia
stipitis NRRL-Y7124 y el cocultivo de ambas

El consumo de xilosa a las 48 horas, en todos los casos, fue superior al 80%
(Tabla 14), aparentemente P. stipitis la consumi ms rpido de manera individual
que en cocultivo. Los mayores rendimientos de etanol a partir de xilosa reportados
en la literatura se han obtenido con Pichia stipitis, C. shehatae y Pichia
tannophilus (Agbogbo, 2006).
Tabla 14. Consumo de xilosa por Pichia stipitis NRRL-Y7124, Candida tropicalis
IEC5-ITV o un cocultivo de ambas en relacin 1:1 presente en un
hidrolizado de cscaras de naranja y toronja
Levadura Consumo de xilosa (%)

C. tropicalis IEC5-ITV

90.9

Pichia stipitis NRRL-Y7124

96.7

Cocultivo

87.9


En la Figura 11 se puede observar que C. tropicalis consumi la xilosa presente
en el HCNT casi totalmente hasta las 24 h mientras que P. stipitis y el cocultivo a
las 8 h. Esto puede indicar que P. stipitis tiene como sustrato preferencial xilosa

45

mientras que en C. tropicalis lo es la glucosa, la cual una vez agotada es
sustituida por la xilosa como fuente de carbono.


Figura 11. Consumo de xilosa por Pichia stipitis NRRL-Y7124 (A), Candida
tropicalis IEC5-ITV (B) o un cocultivo de ambas (C) en relacin 1:1
contenida en un hidrolizado de cscaras de naranja y toronja


La glucosa, otro azcar presente en el medio de fermentacin, se consumi
totalmente a las 8 h en todos los casos (Figura 12). Esto se justifica ya que la
glucosa es una fuente de carbono preferente por los microorganismos (Weber,
2010) y estuvo presente en el medio de fermentacin en baja concentracin
(alrededor de 1-2 g/L).

46



Figura 12. Consumo de glucosa presente en un HCNT por Candida tropicalis
IEC5-ITV (A), Pichia stipitis NRRL-Y7124 (B) y un cocultivo con ambas
cepas (C)
7.4 Produccin de xilitol por C. tropicalis IEC5-ITV, Pichia stipitis NRRL-
Y7124 y el cocultivo

Dependiendo de las condiciones de cultivo, la xilosa puede ser bioconvertida por
algunas levaduras a etanol o xilitol. En este estudio tanto C. tropicalis como P.
stipitis tambin sintetizaron xilitol al inicio de la fermentacin (Figura 12), pero
aparentemente despus fue consumido. Lo anterior puede deberse a que el xilitol
pudo haber sido empleado por los microorganismos como fuente de carbono



47

7.4 Consumo de cido actico por C. tropicalis IEC5-ITV, Pichia stipitis
NRRL-Y7124 y el cocultivo de ambas cepas

El cido actico es otro compuesto que invariablemente se genera al hidrolizar
materiales lignocelulsicos, esto se debe a la liberacin de los grupos acetilo
unidos a la materia prima

Figura 13. Produccin de xilitol por Candida tropicalis IEC5-ITV (A), Pichia stipitis
NRRL-Y7124(B) y un cocultivo con ambas cepas (C) a partir de un
hidrolizado de cascaras de naranja-toronja

Algunos autores lo consideran como un compuesto txico a las levaduras
productoras de etanol (Rodrguez et al., 2001; Martnez et al., 2002), sin embargo
en este trabajo se encontr que P. stipitis y el cocultivo lo consumieron totalmente
en las primeras ocho horas mientras que C. tropicalis IEC5-ITV (Figura 14) lo hizo
a las 24 horas. Estudios previos con C. tropicalis IEC5-ITV (Snchez, 2010) han

48

mostrado que el cido actico no slo no le resulta txico sino que lo utiliza como
fuente de carbono; se ha reportado que Candida guillermondii tambin consume
cido actico cuando se utiliza como medio de fermentacin hidrolizado de
bagazo de caa (Daz, 2011). El consumo de cido actico estuvo relacionado con
un aumento de pH a lo largo de la fermentacin (Tabla 15).

Figura 14. Consumo de cido actico presente en un HCNT por Candida
tropicalis IEC5-ITV (A)

Tabla 15. Valores de pH obtenidos en el caldo de fermentacin a base de HCNT
y dos especies de levadura








0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0 8 16 24 32 40 48
A
c
i
d
o

a
c

t
i
c
o

(
g
/
L
)

Tiempo de fermentacin (g/L)
pH
Tiempo (h) C. tropicallis P. stipitis Cocultivo
8 5.2 5.5 5.1
16 5.3 5.5 5.3
24 5.3 6.1 5.6
32 6.2 5.4 6.3
40 5.8 6.7 6.3
48 5.5 7.6 6.3

49

8.5 Determinacin de parmetros fermentativos

Varios parmetros tales como la produccin de etanol, productividad volumtrica
de etanol y eficiencia de bioconversin de sustratos a productos, entre otras
medidas se utilizan para evaluar los procesos de fermentacin.

8.5.1 Productividad volumtrica

En la Figura 15 se observan los resultados de productividad volumtrica de etanol
(gramos de etanol obtenidos por litro de medio de fermentacin en una hora),
obtenidos con las dos levaduras de manera individual y en cocultivo No se
encontraron diferencias significativas de este parmetro en las diferentes
condiciones probadas en este parmetro. Los valores obtenidos con respecto a
este parmetro son bajos pero no se pueden comparar con los reportados en la
literatura debido a que las condiciones de fermentacin son diferentes.




Figura 15. Productividad volumtrica de xilitol (Q
P
) calculada para cada una de
las levaduras evaluadas: Ct= Candida tropicalis IEC5-ITV; Ps= Pichia
stipitis NRRL Y7124; Cc= cocultivo

0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
Ct Ps Cc
Q
p

(
g
/
L
.
h
)


50

7.5. Rendimiento

La Figura 16 muestra los resultados obtenidos al calcular el parmetro
rendimiento, es decir gramos de etanol obtenido por gramo de xilosa consumida
se observa que C. tropicalis muestra una mejor conversin de xilosa a etanol,
mejorndose de manera notable (28%) cuando se utiliza el cocultivo. los valores
obtenidos entran en los rangos reportados en la literatura (0.47-0.5 g/g).


Figura 16. Rendimiento (Y
P/S
) calculado para cada una de las cada una de las
levaduras evaluadas: Ct= Candida tropicalis IEC5-ITV; Ps= Pichia
stipitis NRRL Y7124; Cc= cocultivo

7.5.2 Eficiencia de Bioconversin

Este es el parmetro ms importante en los procesos de fermentacin ya que
indica de manera general la capacidad que tiene el sistema, bajo las condiciones
establecidas, de realizar la bioconversin de xilosa a etanol. En la Figura 17 se
presentan los resultados obtenidos.

0.43
0.35
0.55
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Ct Ps Cc
Y

(
g
/
g
)


51


Figura 17. Eficiencia de bioconversin (%) calculada para cada una de las
levaduras evaluadas: Ct= Candida tropicalis IEC5-ITV; Ps= Pichia
stipitis NRRL Y7124; Cc= cocultivo

Resulta interesante el hecho de que aparentemente Candida tropicalis IEC5-ITV,
Pichia stipitis NRRL Y7124 y el cocultivo producen casi la misma cantidad de xilitol
(1 g/L), sin embargo al observar las eficiencias de bioconversin es evidente que
el cocultivo es la mejor opcin para la generacin de etanol a partir de hidrolizado
de cscara de naranja y toronja, por lo que es necesario continuar con la
realizacin de estudios tendientes para la optimizacin del proceso que de manera
preliminar se ha propuesto en este trabajo







0
10
20
30
40
50
60
70
Ct Ps Cc

(
%
)


52

8. Conclusiones

Los resultados obtenidos con respecto a la composicin del medio de
fermentacin hace necesario mejorar las condiciones de hidrlisis.

La produccin de etanol fue similar tanto en el cocultivo como mediante el uso de
cada una de las levaduras probadas de manera individual sin embargo la
eficiencia de bioconversin fue mayor para el cocultivo.

El rendimiento en la obtencin de etanol a partir de cscaras de naranja y toronja
es muy bajo, sin embargo teniendo en cuenta que hubo una deficiente hidrolisis y
que as cscaras son un residuo no aprovechado a gran escala puede constituirse
en una alternativa de inters.












53

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