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ESCUELA SUPERIOR POLITECNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS
INGENIERIA QUIMICA

MICROBIOLOGIA

TINCION GRAM

INTEGRANTES:
CRISTIAN CHAMBA
LISZETH CRUZ
CINTHIA ESCOBAR
KAREN ALVARADO
JORGE JIMENEZ

2011-2012

TEMA:
TINCION GRAM
OBJETIVOS:
OBJETIVO GENERAL
Conocer el procedimiento para la tincin Gram, reconocer la morfologa e identificar las
bacterias como bacterias Gram positivas y negativas.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Determinar el tipo de pared celular de acuerdo a la coloracin que tome por la tincin gram.
Observar el tipo de las bacterias de acuerdo a la forma por medio de la tincin gram.
Conocer el procedimiento que se debe seguir para la determinacin de la morfologa de las
bacterias por la tincin gram.


MARCO TEORICO:

Tincin Gram (1)(2)(3)
La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa
para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Se utiliza tanto para poder
referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la
diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de
color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.
El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram positivas
como Gram negativas) a travs de la pared bacteriana.
El lugol es un compuesto formado por I
2
(yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual est
presente para solubilizar el yodo y acta de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con
mayor intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I
2
entra en las clulas y forma un complejo
insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega sirve para realizar la decoloracin ya que en la misma es
soluble el complejo I
2
/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que
los Gram negativos s lo hacen.
Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo como la safranina o la fucsina. Despus de la coloracin
de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen
azules.
La facultad de las clulas para tomar la coloracin Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino
que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. As vemos que las clulas de plantas y animales
superiores no conservan la primera coloracin; los mohos se tien con cierta irregularidad; los
grnulos de micelios propenden retener el colorante. La reaccin de Gram no es infalible ni
constante puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio y quiz por otras causas como:
I: Edad de la bacteria.
II: Errores del operador.
III: Uso de antibiticos
A pesar de la gran utilidad del la tincin de Gram, este mtodo debe ser valorado con precaucin ya
que la reaccin puede variar segn la edad de las clulas y la tcnica empleada, por ella junto a la
muestra deben teirse controles con grampositivas y gramnegativas.
TEORIA DEL PROCESO DE TINCION (1)(3)(4)
Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo
si sufre dao de la pared por una u otra causa se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de
la pared para la retencin o el escape del colorante.
Existen varias teoras para explicar el proceso de tincin gram, pero en mi grupo hemos tomado
como la ms acertada a la de Gram. Stearn que bas la suya en una combinacin qumica entre el
colorante y las protenas de las bacterias. Las protenas y aminocidos son cuerpos anfteros es decir
tienen la facultad de reaccionar con cidos y con bases gracias a sus grupos amino y carboxilo en
soluciones cidas.
Reaccionan con los cidos y en soluciones alcalinas lo hacen con las bases. De igual manera
comprobaron que la reaccin de tincin de las bacterias obedece en gran parte a su contenido
protenico estos microorganismos se conducen como cuerpos anfteros, al combinarse con
colorantes cidos en soluciones cidas y con los bsicos en medio alcalino. La combinacin con
ambos tipos de colorante no se produce en el punto isoelctrico. Como los microorganismos
contienen ms de una protena ese punto no tiene un valor preciso y definido sino que constituye
ms bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Segn Stern y Stearn, los
microorganismos grampositivos tienen una escala isoelctrica de pH inferior a la de los
microorganismos gramnegativos.
BACTERIAS RESISTENTES A LA TINCION GRAM (1)(3)
Las siguientes bacterias de naturaleza grampositiva tien como gramnegativas:
Mycobacterias (estn encapsuladas).
Mycoplasmas (no tienen pared).
Formas L (prdida ocasional de la pared).
Protoplastos y esferoplastos (eliminacin total y parcial de la pared, respectivamente).
UTILIDADES (1)(2)
La utilidad de la tincin se refiere a la rapidez con que se puede actuar frente a un agente
bacteriano patgeno, en ocasiones es urgente actuar frente a una infeccin por lo tanto el
mdico requiere conocer las caractersticas de la bacteria y as al saber si es gram positiva o
gram negativa determinar que tratamiento antibitico se debe seguir; muchas veces el
gram puede ser una informacin que puede salvar una vida.


Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos bacterianos
identificados en la tincin de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos
realizados en los cultivos. Si se observan mayor nmero de formas bacterianas que las
aisladas hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados as como la atmsfera de
incubacin.

MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES REACTIVOS
Muestras Bacterianas - Cristal Violeta
Microscopio ptico - Lugol
Guantes y Mascarilla - Safranina
Placas Portaobjetos - Solucin Decolorante
Hisopos Estriles - Aceite de Inmersin
Mechero o lmpara de alcohol
Soporte para placas

PROCEDIMIENTO
EXTENDIDO
Lavar el portaobjetos destinado para bacteriologia,
limpiar con un solvente organico (alcohol) para
eliminar grasa e impurezas.
Codificar con la palabra Gram e
identificar la muestra
Si la muestra es DIRECTA (un medio de cultivo, un
raspado, una mucosa), se realizara un extendido con
un aplicador o hisopo esteril
Si la muestra es LIQUIDA se dibujara un circulo
de 1 cm de diametro sobre el portaobjetos y
colocamos 50 ul de muestra y dejar secar.
Si la muestra es solida se hara una
suspension en 0,5ml de solucion
fisiologica y se tratar como si fuese
liquida.



FIJACION DE LA MUESTRA
Con metanol
someter a los
vapores
durante 30
minutos
Al calor usando un
mechero o lampara de
alcohol flameando la
placa portaobjetos
rompiendo la llama del
mechero de 3 a 4 veces

TINCION
Se tendra un soporte en donde va
a descansar la placa , se colocara
dentro de una cuba de tincion o el
lavamanos
Aadir gotas del cristal
violeta sobre el frotis y dejar
actuar durante 1 min
Eliminar el colorante y la lavamos
con agua corriente, no sobre el
frotis directamente sino por los
bordes
Eliminar el exceso de
agua y colocamos
gotas de lugol dejando
actuar 1 min.
Lavar con agua
corriente y eliminar
todo el colorante
Adicionar gotas del
colorante y dejar
actuar 30 min.
Lavar con agua
corriente, eliminar el
exceso de agua
Colocar gotas de safranina sobre
el frotis y dejar 1 min. Lavar con
agua corriente y dejar secar
hasta eliminar completamente el
agua
Dejar escurrir sobre
papel absorvente
durante 15 min o
abanicando al aire
Volvemos a codificar
Aadimos una gota de aceite de
inmersion y observamos con el
lente de 100x la forma y
coloracion de las bacterias
OBSERVACIONES

En la primera muestra se observo bacterias de forma esfrica, de manera de racimo y de
color moradas es decir bacterias con pared celular gram positivas.
En la segunda muestra se observo bacterias de color rosado fucsia es decir bacterias de
pared celular gram negativas y de forma de bastoncitos.
En la tercera muestra se observo levaduras de una forma ovoide irregular y estas tenan
un tamao mayor que las bacterias, fueron de color rosado fucsia es decir de pared
celular gram negativas

CONCLUSIONES

El color fucsia rosado determina que la pared celular es gram negativa y el color morado
determina que la pared celular es gram positiva.
Las bacterias de forma esfrica son denominados cocos, las de forma de bastoncitos son
denominados bacilos y las bacterias de forma encorvada se denominan de forma
helicoidal.
El procedimiento a seguir para la determinacin de la morfologa de las bacterias por
tincin gram es:
Se tendr un soporte en donde va a descansar la placa , se colocara dentro de
una cuba de tincin o el lavamanos
Aadir gotas del cristal violeta sobre el frotis y dejar actuar durante 1 min
Eliminar el colorante y la lavamos con agua corriente, no sobre el frotis
directamente sino por los bordes
Eliminar el exceso de agua y colocamos gotas de lugol dejando actuar 1 min.
Lavar con agua corriente y eliminar todo el colorante
Adicionar gotas del colorante y dejar actuar 30 min.
Lavar con agua corriente, eliminar el exceso de agua
Colocar gotas de safranina sobre el frotis y dejar 1 min. Lavar con agua corriente
y dejar secar hasta eliminar completamente el agua
Dejar escurrir sobre papel absorbente durante 15 min o abanicando al aire
Volvemos a codificar
Aadimos una gota de aceite de inmersin y observamos con el lente de 100x la
forma y coloracin de las bacterias

CUESTIONARIO
1.- Porque unas bacterias se colorean rosadas, y otra quedan azules despus de la coloracin de
Gram. Explique sustentadamente el fundamento de la tincin. (1)(6)(7)
La pared celular es una cubierta rgida y porosa que confiere a la bacteria su forma caracterstica y
proteccin fsica, incluso contra ruptura osmtica.
La bacteria produce su propia pared celular de peptidoglucano que consiste en cadenas paralelas de
polisacrido unidas transversal y covalentemente a pptidos. No todas las paredes celulares de
bacterias son iguales.
La tcnica de tincin de Gram consiste en la aplicacin del colorante cristal violeta, cuya reaccin con
la pared celular ha permitido tradicionalmente clasificar a las bacterias en dos grupos:

Bacterias Gram positivas. Poseen una pared celular gruesa con numerosas capas de peptidoglucano,
las cuales retienen el colorante cristal violeta. Algunas de estas bacterias se rodean adems de una
cpsula o cubierta gruesa y viscosa de polisacridos, cuya funcin puede ser adherencia, resistencia a
la desecacin, material de reserva o patogenicidad, como en Mycobacterium tuberculosis.

Bacterias Gram negativas. Poseen una pared celular fina y una segunda membrana lipdica
denominada membrana externa, la cual no retiene el colorante cristal violeta, como en Escherichia
coli, de ah que tome una tonalidad de color rosado.
2.- Investigue cinco nombres cientficos de bacterias Gram positivas y Gram negativas. (1)(2)(8)
GRAM POSITIVAS
1. Bacillus anthrasis
GENERO : Bacillus
ESPECIE: B. Anthracis

2. Clostridium
GENERO : Clostridium
ESPECIE: C. Botulinum

3. Lactobacillus Acidophilus
GENERO : Lactobacillus
ESPECIE: L. acidophilus

4. Listeria monocytogenes
GENERO : Listeria
ESPECIE: L. monocytogenes

5. Staphylococcus aureius
GENERO : Staphylococcus
ESPECIE: S. aureius
GRAM NEGATIVAS
1) Neisseria gonorrhoeae
GENERO : Neisseria
ESPECIE: N. gonorrhoeae


2) Haemophilus influenzae
GENERO : Haemophilus
ESPECIE: H. influenzae

3) Klebsiella pneumoniae
GENERO : Klebsiella
ESPECIE: K. pneumoniae

4) Escherichia coli
GENERO : Escherichia
ESPECIE: E. coli ( E. freundi)

5) Helicobacter pylori
GENERO : Helicobacter
ESPECIE: H. pylori

BIBLIOGRAFIA

LIBROS
1.) ROGER Y. Stanier, Microbiologa, Cuarta Edicin, Barcelona, 1992, pgina 155
2.) MURALI Dharan, Introduccin a la Microbiologa, Segunda Edicin, Mxico, 1982, pgina 121
INTERNET
3.) Tincin de Gram
http://www.ojocientifico.com/2010/10/23/las-bacterias-gram-positivas
130911
4.) Teora del Proceso de tincin
http://www.biologia.edu.ar/bacterias/micro4.htm
230711
5.) Utilidades de la tincin de Gram
http://danival.org/600%20microbio/6000notasmicro/tincion/tincion_gram-morfo.html
220611
6.) Fundamento de la Tincin
http://www.facultadsalud.unicauca.edu.co/Documentos2010/DptoMedInt/Tencion_de_gra
m.pdf
141011


7.) Coloracin de las bacterias Gram ( Fundamento de la tincin)
http://www.mendoza-sierra.org/ Mendoza, Biologa, Editorial Trillas
290811
8.) Nombres cientficos de Bacterias Gram Positivias y Gram Negativas
http://www.slideshare.net/jujenio/la-tincin-de-gram
190811
ANEXOS
Muestra 1: Cocos en forma de racimo.
Bacterias con pared celular Gram Positivas

Muestra 2: Bacillus
Bacterias con pared celular Gran Negativas

Muestra 3: Levaduras
Tiene pared celular Gram Negativas.

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