Preparacin inicial

Los cortes fueron depositados en tubos de microcentrfuga con capacidad de 1,5 ml. El
proceso de remocin de la parafina y digestin enzimtica se realiz segn el protocolo
de Rivero y colaboradores. (Rivero et al., 2006) con algunas modificaciones, de la siguien-
te forma:
Se tom el mismo nmero de cortes para cada muestra. Se aadi 1 ml de xilol
precalentado (aproximadamente 50 C) a cada microtubo y se mantuvo a 56 C por 10
minutos, luego se centrifug a 10000 rpm, temperatura ambiente, por 5 minutos. El
sobrenadante fue descartado, seguido de nuevos cambios de xilol precalentado, hasta
que la parafina se removiera completamente. El botn fue lavado con etanol en con-
centraciones descendentes (etanol absoluto, etanol al 95% y al 70%). Cada cambio fue
precedido por homogenizacin en vrtex y centrifugacin a 10000 rpm, temperatura
ambiente, por 5 minutos. Posteriormente se aadieron 400 l de tampn de digestin
proteinasa K g/l (NaCl 1 M, Tris-HCl 1 M, EDTA 0,5 M, pH 8; dodecilsulfato sdico
10%). La digestin en este caso se llev a cabo por 24 horas a 60 C, reduciendo el
periodo de digestin de 1 2 das, recomendando por Rivero y Cols. Al concluir este
proceso la proteinasa K fue inactivada por calor a 95 C por 10 minutos. Del material
obtenido luego de la desparafinizacin y digestin enzimtica se realiz la extraccin de
ADN mediante los tres mtodos sealados a continuacin. Todos los experimentos fueron
realizados por triplicado:

Extraccin de ADN por salting - out (Mtodo A)
Se sigui el mtodo planteado por Rivero y Cols (Rivero et al., 2006), reemplazando el
agente precipitante original (acetato de amonio 2 y 4 M) por NaCl 5 M, de la siguiente
manera: Una vez concluida la digestin enzimtica se aadieron 500 l de NaCl 5 M. Los
microtubos fueron agitados vigorosamente en un vrtex, se incubaron en hielo por 5 min y
posteriormente se centrifugaron a 13,000 rpm, temperatura ambiente, por 5 minutos. El
sobrenadante fue transferido a un tubo estril con 600 l de isopropanol, la mezcla se in-
cub en hielo por 10 minutos y se centrifug a 13,000 rpm, temperatura ambiente, por 5
minutos, consecutivamente se descart el sobrenadante y el botn de ADN fue lavado
con etanol al 70% y se centrifug a 13,000 rpm, temperatura ambiente, por 5 minutos. El
sobrenadante fue descartado y el ADN fue finalmente disuelto en solucin TE (Tris-HCl 10
mM, pH 1,4 y EDTA 1mM, pH 8) e incubado a 4 C por 24 horas.

Extraccin de ADN por mtodo modificado Preparation of Genomic DNA from
Mouse Tails y Other Small samples, segn Sambrook (Mtodo B)
Se sigui el protocolo No. 5 (Preparation of Genomic DNA from Mouse Tails y Other Small
samples) segn Sambrook (Sambrook, J, 2001) con modificaciones a la tcnica, as: Tras
inactivar la proteinasa K de la solucin de digestin, se obvi la utilizacin de fenol y se
aadi solo un volumen equivalente de cloroformo:alcohol isoamlico (24:1 v/v), agitando
suavemente por inversin. Las fases orgnicas y acuosas se separaron por centrifugacin
a 10000 rpm, temperatura ambiente, por 5 minutos. La fase acuosa superior se transfiri a
un nuevo tubo de microcentrfuga. El ADN fue precipitado aadiendo un volumen
equivalente de isopropanol, los tubos fueron incubados a -20 C por 10 minutos y
posteriormente centrifugados a 12000 rpm, temperatura ambiente, por 5 minutos. El
isopropanol fue descartado y se lav el botn con 500 l de etanol 70%, se centrifug a
12000 rpm, temperatura ambiente, por 5 minutos. Despus de descartar el sobrenadante
se secaron los botones en aire seco a temperatura ambiente, por 15 20 minutos. El ADN
fue rehidratado en solucin TE a 4 C por 24 horas.
Extraccin de ADN genmico a partir de muestras embebidas en parafina.

Para la realizacin de esta tcnica, nos basamos en los procedimientos descritos por
Wright DK-Manos MM (1990)4 y por el Instituto de Patologa de las Fuerzas Armadas de
los E.U. (1997)*, realizando ligeras modificaciones. Durante todo el procedimiento se
usaron guantes y se tuv la precaucin de limpiar la cuchilla del microtomo con xileno y
etanol al 100% entre cada muestra, para evitar cualquier contaminacin. Para iniciar la
extraccin de ADN, se colocaron en un tubo de microcentrfuga estril de 1.5 ml, dos
cortes de 6 um de grosor o bien cortes de 5-10 um. Se agreg 1 ml de xileno a cada tubo,
se cerraron los tubos y se mezclaron a temperatura ambiente durante 30 min o a 55C por
15 min, se centrifugaron a 14,000 rpm durante 2 a 5 min, se removi cuidadosamente el
xileno con una pipeta y se repiti el paso anterior. Despus se agregaron 500 ul de etanol
absoluto a cada tubo y se mezclaron por inversin. Se centrifugaron a 14,000 rpm durante
2 a 5 min, se retir cuidadosamente el etanol con una pipeta y se repiti nuevamente el
paso anterior. La pastilla obtenida se sec al vacio hasta que el etanol se evapor
completamente. Alternativamente, se agreg 1 gota (50 ul) de acetona a cada tubo. Se
dejaron abiertos los tubos y se colocaron en un bloque caliente (thermomixer) a una
temperatura de 50C para facilitar la evaporacin de la acetona. Despus de la
centrifugacin, la pastilla se resuspendi en 100 - 200 ul de buffer de lisis (NaCI 50 mM,
Tris-HC110 mM pH 8.3, EDTA1 mM, Tween 20 al 0.5 %, Nonident P-40 al 0.5%) y 3-6 ul
de proteinasa K (10 mg/ml)). La concentracin final de proteinasa K fue 0.3-0.5 mg/ml. Se
incubaron en thermomixer con agitacin vigorosa a 55 C durante dos das completos
para disminuir actividad de DNAsas, adicionando la misma cantidad de proteinasa K
a los tubos cada da que se mantuvieron en incubacin. Despus de la incubacin con el
buffer de lisis, se centrifugaron los tubos brevemente para remover cualquier lquido de
las paredes y se sigui con la inactivacin de la proteinasa K a 95 C durante 8 a 10 min y
despus se centrifugaron a 14,000 rpm durante 2 a 5 min. Se recuper el sobrenadante y
se almacen la pastilla que contena los restos celulares a -20 C. Previo a su
almacenamiento de procedi a determinar la calidad del ADN mediante un gel de agarosa
al 0.8% y se extrajeron alcuotas de 2.5 y 5 ul para la PCR.

Protocolos de extraccin:

Mtodo Shi: En un microtubo de 1,5ml se colocaron dos cortes de 10m de tejido
parafinado. Para desparafinarlos se agreg en dos ocasiones 1ml de xilol 100% por 30
minutos, se invirtieron los microtubos varias veces, se centrifugaron a 12 000g por 10
minutos en una Centrifuge 5415C eppendorf y se descartaron los sobrenadantes. Para
rehidratar gradualmente el tejido y retirar los excesos de xilol, se agreg 1ml de etanol al
100%, se invirtieron varias veces, se agitaron manualmente los microtubos y se dejaron
reposar por 30 minutos. Luego, se centrifugaron a 12 000g por 10 minutos y se
descartaron los sobrenadantes. Se llev a cabo el mismo paso con 1ml de etanol al 70%.
Acto seguido se lavaron las muestras dos veces con 1ml de PBS, se agitaron de la misma
manera y luego de 15 minutos se centrifugaron. Despus de descartar el PBS, se
agregaron 500l de amortiguador de lisis (50l de Proteinasa K 20mg/ml; 10l de Tris-HCl
1M; 2l de EDTA 0,5M; 100l de SDS 10% y 838l de agua destilada) y se incubaron las
muestras toda la noche a 52C bajo agitacin continua en un Thermomixer compact
eppendorf. Para obtener el ADN se fenoliz el tejido digerido con 500l de
fenol:cloroformo:isomilalcohol (25:24:1), se invirtieron varias veces los microtubos a
temperatura ambiente y se centrifugaron a 12 000g por 5 minutos. El sobrenadante
acuoso se removi a otro microtubo de 1,5ml; se le agreg 0,1 volumen de acetato de
sodio 3M y se agitaron manualmente los microtubos. Posteriormente se adicion un
volumen de isopropanol y se dej toda la noche a -20C. Luego el ADN precipitado se
centrifug a 12 000g a 4C, el sobrenadante se descart y el precipitado se lav una vez
con 1ml de etanol 70%. Despus de centrifugar a 12 000g por 10 minutos, se descart el
sobrenadante. El ADN seco se disolvi en 50l de agua bidestilada estril y se almacen
a -20C.

Mtodo Frank: Se colocaron 2 cortes de 5m en un microtubo donde luego se
agreg 100l de xilol y 100l de etanol 100%, se mezcl suavemente y centrifug
10 minutos a 12 000rpm en una Centrifuge 5415C eppendorf. Se decant la
mezcla xilol:etanol y se dej secar el tejido a 55C. Posteriormente se resuspendi
el botn en 250l de Tris pH 8,3 (200ng/l Proteinasa K) y se incub en este
amortiguador de lisis toda la noche a 37C en agitacin continua, en un
Thermomixer compact eppendorf. Despus de la incubacin se colocaron los
tubos por 8 minutos a 100C, para inactivar la enzima y se coloc el ADN extrado
5 minutos en hielo. Se utiliz para PCR sin purificar. Se almacen el extracto a -
20C.

Antes de empezar la desparafinacin, cada muestra se lav dos veces con PBS
estril pH 7,4 (137 mM de NaCl, 2,68 mM de KCl, 1,47 mM de Na2HPO4 y 9,03
mM de KH2PO4x2H2O) con el fin de eliminar restos del fijador y contaminantes
que pudieran inactivar la proteinasa K, utilizada en la etapa siguiente de digestin.
Para cada ensayo se utilizaron cuatro secciones de tejido de 4 m (1 cm2
aproximadamente) las cuales se transfirieron a un tubo de 1,5 ml.

Procedimientos de desparafinacin Xileno/etanol: se aadieron 200 l de xileno
a la seccin de tejido. Despus de calentar por 15 minutos a 37 C, se centrifug a
6.000 g por 15 minutos. Posteriormente se removi el sobrenadante y se repiti el
lavado con xileno. Se lav dos veces con 200 l de etanol absoluto a 37 C por 30
minutos. Se centrifug y se dej secar al aire. El tejido se resuspendi en 100 l
de PBS hasta la digestin.