CLONACIN DE EMBRIONES

Introduccin

En la actualidad se han desarrollado nuevas tecnologas en el campo de la
reproduccin animal que tienen como objetivo incrementar la capacidad reproductiva y
mejoramiento gentico. Entre las tcnicas utilizadas para alcanzar estos objetivos se
encuentran la superovulacin, transferencia embrionaria, congelacin de embriones, cultivo
in vitro de embriones, particin y clonacin de embriones.

Actualmente una de las tecnologas que est en pleno desarrollo a nivel mundial es
la clonacin, debido a que puede aplicarse tanto en animales de importancia econmica,
ecolgica e incluso en humanos. A pesar de que la eficiencia de esta tecnologa an es baja,
aun as constituye una alternativa en la solucin de los problemas reproductivos. Y a
medida que se avance en la optimizacin de esta tecnologa, es probable que en un futuro
cercano se logr utilizar para seleccionar y reproduccin animales de inters econmico y
ecolgico a gran escala.

La clonacin puede verse desde dos aspectos, el primero es en un sentido vertical,
en donde los individuos clonados por transferencia de ncleos sern semejantes al
individuo del que se obtenga la clula donadora de ste. En este caso se requiere de la
combinacin de dos clulas manipuladas: de una de ellas se tomara solamente el ncleo que
ser introducido en el citoplasma de otra (Campbell, et al. 1996). En el sentido horizontal,
la manipulacin se realiza en las edades tempranas del embrin para producir gemelos
idnticos. En este caso, no se requiere de una manipulacin tan elaborada como en la
transferencia nuclear.

La clonacin est limitada exclusivamente al conjunto de tcnicas que permiten la
manipulacin de una clula somtica para transferir posteriormente su ncleo a un
citoplasma adecuado e iniciar el desarrollo de un nuevo animal como un duplicado gentico
exacto al de la clula original de la cual se extrajo el ncleo (Campbell, et al. 1996). En
consecuencia los clones representan un grupo de organismos vivos que comparten el mismo
complemento de genes nucleares. Igualmente puede interpretarse como la reproduccin
asexual que da lugar a la formacin de individuos genticamente similares. En ella, la
clula inicial obtiene su informacin gentica del ncleo de una clula somtica de un solo
donador, en este contexto, el individuo clonado es casi idntico a este ltimo con
variaciones menores debidas a la presencia de informacin gentica contenida en las
mitocondrias (Merchant, 1997). Para otros autores, la clonacin no est limitada a la
transferencia de ncleos sino que consideran que los gemelos monocigticos, formados por
la separacin de las clulas que produce el huevo fertilizado despus de varias divisiones,
dado que se originan de un mismo genoma, esencialmente contienen la misma informacin
gentica, por lo que puede considerrseles como clones (Singla, et al. 1997).




Tcnicas de clonacin de embriones

De acuerdo a los conceptos descritos anteriormente, puede considerarse que existen
tres tcnicas que han sido utilizadas en animales de granja o de laboratorio para producir
embriones genticamente idnticos. En el concepto de la clonacin en un sentido horizontal
tenemos: la particin o divisin de embriones por microciruga y la separacin y cultivo de
blastmeros aislados por mtodos enzimticos o mecnicos (Rexroad, et al. 1997). La
tercera entra en el concepto de la clonacin en un sentido vertical: la transferencia nuclear a
partir de clulas somticas de adulto o embrionarias (Campbell, et al. 1996) o de
blastmeros de embriones (Lavoir, et al. 1997) entre otras clulas.


1. Particin o divisin de embriones

En la dcada de los 70 se pensaba que los embriones en fases tempranas de la segmentacin
no sobreviviran despus de una microciruga. Fue en los aos ochenta cuando se demostr
que las mrulas y blastocistos de los animales domsticos eran capaces de desarrollarse
despus de una particin y producir nacimientos viables (Rorie, et al. 1987). Actualmente la
particin de embriones permite la produccin de gemelos idnticos al dividir el embrin
original por mtodos microquirrgicos. Esta estrategia permite utilizar una de las secciones
para otros fines experimentales como la determinacin del sexo del embrin, mientras que
el resto se cultiva o se congela para despus transferirse a hembras receptoras previamente
sincronizadas para mantener la gestacin (King, et al. 1992). Los embriones en etapa de
blastocisto son seccionados de manera que se dividan en dos partes iguales tanto la masa
celular interna como el trofoectodermo. Una vez cortadas, las mrulas compactas y los
blastocistos no necesariamente deben ser introducidos a zonas pelcidas, teniendo una
sobrevivencia aceptable al ser transferidas en hembras receptoras.

2. Separacin y cultivo de blastmeros aislados

En algunas especies, como los equinos, se ha utilizado la separacin de blastmeros de
embriones previos a su implantacin para efectuar estudios de diagnstico de enfermedades
genticas. En ellos se ha determinado la viabilidad de los embriones analizados despus de
su transferencia en hembras receptoras, encontrndose tasas de gestacin de 21%
(Huhtinen, et al. 1997). En humanos la separacin y cultivo de blastmeros aislados
tambin han sido utilizados en estudios de biopsias de embriones en diferentes etapas de
segmentacin con la finalidad de dar alternativas a los estudios de diagnstico prenatal,
evaluando a su vez el desarrollo embrionario in vitro con el propsito de que se seleccionen
los mejores embriones capaces de desarrollarse en blastocistos y congelarlos mientras se
evalan sus blastmeros aislados (Geber, et al. 1999). La tcnica de separacin de los
blastmeros implica la remocin de la zona pelcida, ya sea por mtodos qumicos,
mecnicos o enzimticos, para posteriormente obtener los blastmeros mediante aspiracin
o extrusin o disminucin de sus interacciones en soluciones libres de Calcio y Magnesio
(Lavoir, et al. 1997).


3. Transferencia nuclear

La transferencia nuclear consiste en introducir el ncleo de una clula somtica o
embrionaria en el citoplasma de un ovocito previamente enucleado, dichas clulas formaran
el complejo cario-citoplasto, el cual posteriormente ser activado partenogenticamente
para iniciar el desarrollo embrionario. Los embriones generados pueden ser transferidos a
una hembra receptora para la obtencin de animales clonados de inters econmico o
ecolgico (Costa-Borges et al., 2006).
Las clulas somticas comnmente utilizadas como carioplastos son los fibroblastos
y las utilizadas como citoplastos sern ovocitos previamente enucleados. Ambas clulas
deben procesarse de manera distinta. Los fibroblastos, son tejido-especficos que
normalmente degradan y sintetizan constantemente los diferentes elementos de la matriz
extracelular (Leal et al., 2004). Estos debern ser derivados de tejidos (como la piel) y
reprogramados para cumplir con su funcin de clulas donadoras de ncleo o carioplastos.
Por su parte, el ovocito, que es el gameto femenino inmaduro y la clula gestora pilar del
desarrollo embrionario preimplantatorio, deber ser madurado, enucleado y evaluado para
cumplir su funcin de citoplasto y dar origen a los embriones (Pia-Aguilar, 2012).
El primer reporte que se tiene de un animal clonado por transferencia de un ncleo
dentro de un ovocito previamente enucleado, fue logrado por Briggs en 1952 quien lo
consigui al clonar una rana de la especie Rana pipiens. Utilizando una tcnica similar.
Gurdon en 1962 logr clonar al sapo Xenopus laesis, quien utiliz clulas intestinales como
donadoras de ncleo. Aunque se logr clonar a estos anfibios, la transferencia nuclear no
fue exitosa en mamferos sino hasta treinta aos despus. El primer mamfero obtenido por
clonacin utilizando clulas somticas adultas se logr en ovejas (Wilmut et al., 1997), a
partir de entonces, se ha logrado clonar de manera exitosa: vacas (Cibelli et al. 1998, Kato
et al. 1998, Vajta et al. 2003), ratones (Wakayama et al., 1998), cerdos (Polejaeva et al.
2000, Yin et al. 2002), cabras (Baguisi et al. 1999, Zou et al., 2001,), gatos (Shin et al.,
2002a), conejos (Chesne et al. 2002, Shin et al., 2002b), mulas (Woods et al. 2003),
caballos (Galli et al. 2003), ratas (Zhou et al. 2003) y perros (Lee et al. 2005). En cuanto a
especies silvestres se ha logrado clonar al Gaur (Bos gaurus) (Lanza, et al. 2000), Mouflon
europeo (Ovis orientalis musimon) (Loi, et al. 2001), Hurn (Mustela putorius furo) (Li, et
al. 2006), Bfalo (Bubalus bubalis) (Shi, et al. 2007) y Camello (Camelus dromedarius)
(Wani, et al. 2010). Sin embargo, la eficiencia de la clonacin por transferencia nuclear an
es baja, ya que dependiendo de la especie, del 1 al 6 % de los embriones desarrollados han
nacido vivos (Meissner, et al. 2006) y en muchos casos estos animales han presentado
problemas de desarrollo.
Los problemas en el desarrollo se observan desde la etapa fetal, produciendo un alto
ndice de abortos y un aumento en la muerte perinatal. An no se conoce a detalle si stos
se deben a una mala reprogramacin nuclear del carioplasto, la clula somtica donadora de
ncleos o por algn error en el procedimiento mismo (Han et al., 2003). Entre las
anormalidades reportadas en animales domsticos y silvestres, se encuentra el llamado
Large Offspring Syndrome o LOS (por sus siglas en ingls) tambin conocido como
Sndrome de Nacimientos de Cras Grandes. En los rumiantes, estudios sugieren que las
tcnicas de reproduccin animal asistida, sobre todo durante el cultivo in vitro de ovocitos
y embriones, se han asociado con la expresin aberrante de ciertos genes del desarrollo. Sin
embargo, los mecanismos exactos que conducen a la impronta genmica aberrante siguen
siendo desconocidos (Makoto et al., 2012).
Como tal el proceso de transferencia de ncleos cuenta con un paso crtico que es la
remocin del material gentico del ovocito maduro receptor (denominado enucleacin)
(Moro, et al., 2010). Dado que el ovocito no fertilizado cuenta con un nmero haploide de
cromosomas, ste podra conducir, en interaccin con el nmero diploide de cromosomas
del ncleo (carioplasto), a la formacin de embriones triploides. En consecuencia el
genoma del ovocito debe ser separado del plasma celular.
EL ADN del ovocito madurado se encuentra prximo al corpsculo polar, el cual
permite a travs de un mtodo de extraccin mecnico, eliminar el genoma citoplsmico.
Este se lleva a cabo aumentando, en primero lugar, la elasticidad celular con citocalasina B
y aspirando el corpsculo polar y el citoplasma contiguo. A travs de esta operacin es
eliminado el ADN endgeno en la mayor parte de los ovocitos (Stice y Robl, 1988). Este
mtodo mecnico de enucleacin, aunque es muy eficiente, es tcnicamente complejo y
traumtico para el ovocito (Li, et al., 2004). Adems, de que no solo le eliminan los
cromosomas, sino tambin el uso meitico y una porcin importante del citoplasma, lo que
puede resultar en la eliminacin de molculas y factores esenciales para la reprogramacin
nuclear, la activacin del ovocito y las primeras etapas del desarrollo embrionario
(Campbell, et al., 2005). Con el objetivo de optimizar y simplificar la enucleacin de los
ovocitos, se han desarrollado varias alternativas a la enucleacin mecnica tradicional. Una
de las ms atractivas por su simplicidad tcnica es la enucleacin de los ovocitos mediante
un tratamiento con agentes antimitticos para inducir la despolimerizacin de los
microtbulos. Este tratamiento induce la formacin de una protuberancia en la superficie
del ovocito que contiene los cromosomas compactados. Al ser visible al microscopio, esta
protuberancia permite la fcil localizacin de los cromosomas y puede ser directamente
eliminada por micro aspiracin. El volumen citoplasmtico que se pierde mediante este
proceso, denominado enucleacin qumicamente asistida, es menor que con el mtodo
mecnico tradicional (Kawakami, et al., 2003), por otra parte no se elimina el uso meitico
ni los factores asociados a l y no es necesario teir e irradiar los ovocitos, por lo que la
funcionalidad del citoplasto resultante no se ver tan afectada. Esta tcnica ha sido
aplicada en ovocitos de cerdo y de vaca, utilizando como antimitticos el colcemid o el
nocodazol, y ha permitido obtener vacas y cerdos clonados (Yin, et al., 2002. Kawakami, et
al., 2003. Vajta, et al., 2003). Una vertiente de la tcnica de enucleacin qumica, es la
denominada enucleacin qumicamente inducida, que consiste en aplicar el tratamiento con
antimitticos en ovocitos previamente activados, lo que afecta a la progresin meitica
normal del ovocito y provoca que toda la cromatina del ovocito resulte expulsada en el
segundo corpsculo polar. El ovocito queda as directamente enucleado, con una prdida
mnima de volumen de citoplasma y sin la necesidad de aplicar tcnicas de
micromanipulacin (Ibez, et al., 2003).
Este ovocito una vez enucleado, se fusiona con el carioplasto (fibroblasto de piel) y
se activa elctricamente, o por otros mtodos, para que comience la generacin de un
embrin que tendr un 98-99% de la informacin gentica procedente del ncleo del animal
a clonar y un 1-2% procedente del DNA contenido en las mitocondrias y otras organelos
presentes en el citoplasma del vulo receptor. Consecuentemente, el organismo resultante
no ser un clon exacto del animal donante del ncleo (Pearanda, et al., 2007).

Transferencia Nuclear Sin Micromanipuladores

Se han descrito dos mtodos para la transferencia nuclear: el mtodo convencional
(previamente descrito) y la clonacin hecha a mano (Handmade cloning) (Bosch, 2005). El
primero se basa en el uso de micromanipuladores; uno de ellos sujeta al ovocito por presin
negativa a travs de una micropipeta de vidrio y el otro controla el movimiento de una
micropipeta que se utiliza para enuclear al ovocito y colocar la clula somtica dentro de l
(Bosch, 2005).

En 2001, Vajta et al., desarrollaron el mtodo Handmade cloning caracterizado por no usar
micromanipuladores, hacindolo un mtodo sencillo y de bajo costo. El proceso de
enucleacin se hace manualmente utilizando una micronavaja que corta y separa la porcin
del ovocito que contiene la placa metafsica y el primer cuerpo polar (donde se encuentra
informacin gentica). El citoplasto resultante se fusiona con un carioplasto y con un
segundo citoplasto, formando as un triplete de clulas fusionadas que, activadas
qumicamente, producirn y desarrollarn in vitro al embrin clonado. ste podr ser
implantado en el tracto reproductor de una hembra estimulada hormonalmente para hacerla
la receptora de los embriones clonados, misma que continuar el desarrollo embrionario in
vivo, hasta obtener cras nacidas que sean clones del animal del que se obtuvo la clula
somtica donadora del ncleo (Vajta et al., 2003).


Ventajas y desventajas de las tcnicas de clonacin

La clonacin a partir de clulas de animales adultos tiene algunas ventajas y
desventajas dependiendo de la tcnica que se trate, aunque en general todas tendran la
ventaja de que al conocerse las caractersticas del donador permitiran seleccionar a los
individuos con alto valor biolgico o productivo si las caractersticas seleccionadas
dependen solo de factores genticos, lo que no es tan probable por el efecto de las
condiciones ambientales, de manera que se desconoce hasta qu grado es un clon realmente
idntico a su donador.

Una de las consideraciones que deben hacerse cuando se planea la clonacin por
transferencia de ncleos tornados de clulas de adultos, es que stos reflejan la edad
biolgica del donador. Esto ltimo parece ser trivial, sin embargo tiene importancia si se
analiza lo ocurrido con las regiones terminales de los cromosomas. En estas regiones se
encuentra ADN de secuencia altamente repetida y en forma general, por tripletes o ttradas
de nucletidos repetidos, dichas secuencias se conocen como microsatlites.
Experimentalmente se ha determinado que el nmero de repeticiones que debe tener es
importante para la funcin celular. Durante el envejecimiento, cada vez que la clula se
divide el nmero de estas repeticiones se hacen menores y permiten que se desarrollen
enfermedades propias de la edad adulta an en organismos "jvenes" Sin embargo, Lanza
et al. (2000) observaron que en bovinos clonados por transferencia nuclear a partir de
clulas somticas envejecidas in vitro, ocurra un aumento en la duracin de la vida
replicativa de la clula as como en la longitud de sus telmeros. Asimismo, las clulas
somticas que han estado expuestas a carcingenos qumicos y radiaciones durante
perodos prolongados, en este sentido, es posible que hayan acumulado mutaciones que
pueden manifestarse durante la gestacin, como malformaciones congnitas o
predisposiciones a diversas enfermedades en los recin nacidos. Con la clonacin queda
todava un buen nmero de problemas a resolver, como son la eficiencia de la tcnica de
transferencia nuclear, que actualmente es muy baja y demasiado costosa para aplicarla
comercialmente de manera rutinaria. Considerando que el patrn de desarrollo de los
cigotos es muy diverso, la adaptacin de las tcnicas a otras especies precisa an de una
extensa investigacin para cada una de ellas.


Aplicaciones de la clonacin de embriones

En el mbito cientfico, la clonacin ha abierto un nuevo campo de experimentacin
para abordar problemas fundamentales sobre los mecanismos que controlan la
diferenciacin celular en el inicio del desarrollo. Tambin es til en los estudios de
fisiologa, embriologa, gentica y crianza animal. Los individuos genticamente idnticos
pueden ser de sumo valor para los experimentos controlados en los que se evalen los
efectos ambientales, tales como nutricin, instalaciones y medicamentos. La transferencia
de genomas idnticos en diferentes tipos de citoplastos permitiran evaluar las interacciones
entre citoplasma y ncleo. Los clones transgnicos y los derivados de clulas primordiales
pueden ser incluidos en la investigacin de terapias celulares o genticas, principalmente si
se trabaja con primates no humanos, ya que esto ltimo salvara la distancia existente entre
las especies de roedores comnmente utilizadas en los laboratorios para desarrollo y prueba
de frmacos de uso en humanos.


1. Clonacin de embriones por generacin mltiple

La ltima meta de los proyectos de clonacin de embriones es producir gran nmero o un
nmero ilimitado de individuos idnticos a partir de un individuo original. Lo anterior ha
sido llevado a cabo a travs de la clonacin por generacin mltiple tambin conocido
como reclonacin, que utiliza embriones clonados por transferencia nuclear como
donadores de ncleos para producir la prxima generacin de embriones idnticos. De
manera que si el primer ciclo de transferencia nuclear produce 10 embriones clonados
viables, el siguiente ciclo posiblemente resultara en 100 embriones clonados en la segunda
generacin. Asimismo, la multiplicacin en serie de embriones mediante la clonacin ha
incrementado el nmero de progenie producida de un embrin donador determinado.
Mediante ciclos repetidos de transferencia nuclear, se han obtenido gestaciones de clones
de tercera generacin y se han producido embriones en etapa de blastocisto de clones de
quinta generacin. Los lmites de la clonacin en serie an no han sido definidos. Las tasa
de gestacin de los embriones en estado de mrula o blastocisto producidos por clonacin
en serie no difieren de las tasas de gestacin de los clones derivados de embriones frescos.

Se ha visto que los blastmeros provenientes de embriones clonados por
transferencia nuclear en etapas mas tempranas de la segmentacin, tienen mayores
probabilidades de fusionarse a los citoplastos que los provenientes de embriones clonados
en etapas mas tardas de la segmentacin, y que esto va relacionado con el tamao del
blastmero que se va a transferir. Las tasas de xito en la reclonacin difieren con relacin
en el tiempo de cultivo y el nmero generacional del clon.

Con el estudio profundo y el adecuado control de las deficiencias actuales de la
clonacin, en un futuro la clonacin en serie permitir a su vez, la clonacin de animales
transgnicos que contengan genes selectos. De ah se deduce que la clonacin ofrece una
enorme oportunidad para la ganancia gentica, el incremento en la eficiencia de la
produccin de alimentos de origen animal y los programas de investigacin.


2. Aspectos comerciales de la clonacin de embriones

Cuando la clonacin se aplica a los embriones de alto valor, la habilidad para producir
varios nacimientos por cada embrin ofrece suficiente ventaja econmica para recuperar los
costos involucrados, sobre todo si se utilizan procedimientos de sexado de embriones, de
manera que los nacimientos de individuos clonados sean de sexo predeterminado. Esto
pondra un lmite en el nmero de embriones de sexo masculino transferidos, lo cual
reducira el nmero de transferencias requeridas o permitira obtener una poblacin de pie
de cra efectiva con el mismo nmero total de transferencias. Sin embargo, la eficiencia con
la que se cuenta actualmente an no permite una produccin de embriones en masa a un
costo accesible para la produccin de animales comerciales. Es necesario que se
incrementen significativamente las tasas de xito para que el mercado de los embriones
clonados pueda hacerse realidad. Otra limitante es que los pesos de los individuos clonados
al nacimiento son anormales. Estos procedimientos dan lugar a una mayor incidencia de
distocias, aunque posterior al nacimiento las tasas de crecimiento no se afectan por este
procedimiento. Es necesario incrementar la eficiencia de este procedimiento para eliminar
el problema de gigantismo fetal que se ha encontrado en algunos becerros producidos por
transferencia nuclear. Es clara la necesidad de investigacin bsica, utilizando especies de
las que se tenga un conocimiento adecuado para los fines de la investigacin. Este tipo de
estrategias, por su accesibilidad y bajo costo, podran ser llevadas a cabo en animales de
laboratorio, explorando ms la tcnica en los mbitos celular y molecular, de manera que la
solucin a los problemas de las tasas de gestacin y pesos al nacimiento podra obtenerse
de los experimentos a partir de estas especies.


3. Aplicacin de la clonacin en la conservacin de especies

La reciente demostracin de la capacidad para clonar mamferos adultos, ha propiciado una
variedad de nuevas ideas de investigacin para los interesados en las especies en peligro de
extincin. La clonacin tiene el potencial de minimizar la prdida de recursos genticos, al
igual que rescatar la prdida de material gentico; por lo que permitira expandir el nmero
de taxas incluidos en los programas de supervivencia de especies, porque hara posible la
criopreservacin de embriones clonados; aunque habra que pensar con cuidado, en las
especies animales que podran ser utilizadas como las receptoras de los embriones de
especies en peligro de extincin que vayan a ser clonados, y considerando: que los tipos de
placentacin son diferentes para cada especie; que la transferencia embrionaria
interespecfica slo funciona en las especies en las que es posible crear hbridos; que hay
especies silvestres que no se reproducen en cautiverio, y tambin que el comportamiento
materno de las hembras receptoras hacia las cras nacidas a partir de embriones clonados de
especies no homlogas a ellas, podra afectar la supervivencia de los clones, etctera. El
grupo Lanza et al. (2000) efectuaron la primera clonacin de una especie en peligro de
extincin, obtenido por la transferencia de ncleos utilizando clulas de piel (fibroblastos)
de gaur macho y ovocito enucleado de vaca domstica, y cuyo embrin reconstituido fue
transferido en una vaca domstica.


Conclusiones

La clonacin implica la utilizacin de tcnicas que permiten la manipulacin de una clula
para que se desarrollen a partir de ella nuevos individuos con un duplicado gentico de la
clula original. Si bien la clonacin de embriones de mamferos superiores a travs de sus
diversas tcnicas tiene un potencial considerable en el mejoramiento de la produccin
animal y en el rescate de especies animales en peligro de extincin, es necesario buscar
mayores avances en dichas tcnicas para obtener un sistema eficiente de clonacin de
embriones, que reduzca al mximo las anormalidades cromosmicas, tales como las
aneuploidas o las anormalidades en los individuos clonados, tales como el gigantismo
fetal, y que se incremente la tasa de xito en la obtencin de individuos clonados. Por otra
parte, aun cuando la particin o divisin de embriones ya tiene aplicacin comercial en el
ganado, la separacin de blastmeros y la transferencia nuclear todava estn en etapa de
investigacin y perfeccionamiento de las tcnicas.




Referencias


Baguisi, A., Behboodi, E., Melican, D.T., Pollock, J.S., Destrempes, M.M., Cammuso, C., Williams, J.L.,
Nims, S.D., Porter, C.A., Midura, P., Palacios, M.J., Ayres, S.L., Denniston, R.S., Hayes, M.L.,
Ziomek, C.A., Meade, H.M., Godke, R.A., Gavin, W.G., Overstrom, E.W. & Echelard, Y. 1999.
Production of goats by somatic cell nuclear transfer. Nature Biotechnology, 17:456-461.

Bosch, P. Clonado de animales mediante transferencia nuclear, aplicaciones en ganadera y biomedicina.
Manual de Ganadera Doble Propsito. Department of Animal and Dairy Science, University of
Georgia, Athens. 2005. USA. Pg. 620-625

Briggs, R. & King, T.J. 1952. Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frogs eggs.
Prc Natl Acad Sci. USA. 38:455-463.

Campbell, K.H.S., McWhir, J., Ritchie, W.A., Wilmut, I. 1996. Sheep cloned by nuclear transfer from a
cultured cell line. Nature 380: 64-66.

Chesne, P., Adenot, P.G., Viglietta, C., Baratte, M., Boulanger, L., Renard, J.P. (2002). Cloned rabbits
produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nat. Biotechnol. 20:366-369.

Cibelli, J.B., Stice, S.L., Golueke, P.J., Kane, J.J., Jerry, J., Blackwell, C., Ponce de Leon, F.A. & Robl, J.M.
(1998). Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 280: 1256-
1258.

Costa-Borges, Santal J, Ibez E., 2006. Preparacin de citoplastos receptores para transferencia nuclear
mediante enucleacin qumica de ovocitos. Revista Iberoamericana de fertilidad. 23 (5): 301-309

Geber, S., Sampaio, M.: Blastomere development after embryo biopsy: a new model to predict embryo
development and to select for transfer. Hum. Reprod.14: 782-786,1999.

Gurdon, J.B. 1962. The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epitelial cells of feedin
tadpoles. Embryolo Exp Morph. 10:622-640.

Han, Y.M., Kang, Y.K., Koo, D.B. and Lee, K.K. 2003. Nuclear reprogramming of cloned embryos produced
in vitro. Theriogenology, 59, 33-44.

Huhtinen, M., Peippo, J., Bredbacka, P.: Successful transfer of biopsed equine embryos. Theriogenoiogy 48:
361-367, 1997.

Ibez E., Albertini D.F., Overstrm E.W. 2003. Demecolcine-induced oocyte enucleation for somatic cell
cloning: coordination between cell cycle egress, kinetics of cortical cytoskeletal interactions, and
second polar body extrusion. Biol. Reprod. 68: 1249-1258

King, W.A., Picard, L., Bousquet, D., Goff, A.K.: Sex-dependent loss of bisected bovine morulae after culture
and freezing. J. Reprod. Fertil. 96:453-459, 1992.

Lanza P. R., Cibelli J. B., Diaz F., Moraes C.T., Farin P.W., Farin C. E., Hammer C. J., West M.D., Damiani
P. (2002). Cloning of an Endangered Species (Bos gaurus) Using Interspecies Nuclear Transfer.
Cloning 2000(2)2: 79-90.

Lavoir, M.C., Kelk, D., Rumph, N., Barnes, F., Betteridge, K.J., King, W.A.: Transcription and translation in
bovine nuclear transfer embryos. Biol. Reprod. 57:204-213, 1997.

Leal, L., S. Perdomo, C. Spinel. 2004. Aislamiento y cultivo de fibroblastos endoneurales. Acta Biolgica
Colombiana. 9(2): 57-65

Meissner, A. and Jaenisch R. (2006). Mammalian nuclear transfer. Developmental dynamics. 235: 2460-2469.

Merchant, H.: Clonacin en mamferos: bases biolgicas e implicaciones tericas, prcticas y ticas. Ciencia
48:49-57, 1997.

Moro, L.N., Vichera, G., Olivera, R., Salamone, D. 2010. Evaluacin de la enucleacin asistida por
demecolcina como mtodo para evitar la exposicin a luz UV en la produccin de embriones bovinos
por tcnica de clonacin. InVet. 2010, 12(2): 195-204

Pia-Aguilar, R.E. 2012. El regreso del ovocito: de la olvidada transferencia citoplasmtica a la actual
transferencia del huso meitico. Revista Mexicana de Medicina de la Reproduccin. 4(3): 132-138

Polejaeva, l.A., Chen, S.H., Vaught, T.D., Page, R.L., Mullins, J., Ball, S., Dal, Y., Boone, J., Walker, S.,
Ayares, D.L., Coleman, A., Campbell, K.H.S. 2000. Cloned pigs produced by nuclear transfer from
adult somatic cells. Nature 407:86-90.

Rexroad, C.E., Powell, A.M: Culture of blastomeres from in vitro-matured, fertilized, and cultured bovine
embryos. Molec. Reprod. Dev. 48:238-245,1997.

Robledo Verduzco, J.M.;Herrera-Camacho, J.;Cajero-Jurez, M.;Navarro-Maldonado, M.C.;Garca-
Valladares, A. 2009. Evaluacin de dos medios de maduracin in vitro para la produccin de
embriones ovinos. Tropical and Subtropical Agroecosystems. 10 (1): 95-99

Rorie, R.W., Godke, R.A.: Bisection of bovine embryos. In: Embryotechnologies to domestic animals T.
Greve, editor. Codenhagen. 1-9, 1987.

Singla, S.K., Manik, R.S., Madan, M.L.: Application and commercial aspects of embryo cloning in cattle and
buffaloes-a review. Indian J. Dairy Sci. 50: 75-82, 1997.

Vajta G., Lewis I.M., Trounson A.O. 2003. Hand-made somatic cell cloning in cattle: analysis of factors
contributing to high efficiency in vitro. Biol. Reprod. 68: 571-578.

Vajta, G., Lewis, I.M., Hyttel, P., et al. (2001). Somatic cell cloning without micromanipulators. Cloning 3,
8995.

Wakayama, T., Perry, A.C., Zuccotti, M., Johnson, K.R., Yanagimachi, R. 1998. Full-term development of m
ice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 394:369-374.

Wani, N., Wernery, U., Hassan, F.A.H., Werney, R. and J.A. Skidmore. (2010). Production of the First
Cloned Camel by Somatic Cell Nuclear Transfer. Biology of reproduction 82, 373379.

Wilmut, I., Schnieke, A.E., McWhir, J., Kind, A.J. & Campbell, K.H. 1997. Viable offspring derived from
fetal and adult mammalian cells. Nature 385:810-813.