Amplificao heterloga e diversidade gentica em Tetragonisca angustula (Latreille, 1811) e Tetragonisca fiebrigi (Schwarz, 1938)
MARING PARAN BRASIL FEVEREIRO 2011
ALINE RIBEIRO BRONZATO
Amplificao heterloga e diversidade gentica em Tetragonisca angustula (Latreille, 1811) e Tetragonisca fiebrigi (Schwarz, 1938)
Dissertao apresentada Universidade Estadual de Maring, como parte das exigncias do Programa de Ps-Graduao em Gentica e Melhoramento, para obteno do ttulo de Mestre.
Orientadora: Prof a Dr a Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki.
MARING PARAN BRASIL FEVEREIRO 2011
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Para realizar grandes conquistas, devemos no apenas agir, mas tambm sonhar; no apenas planejar, mas tambm acreditar. (Anatole France).
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Aos meus pais, Maria das Graas Ribeiro Bronzato e Joo Vicente Bronzato, pelo amor, dedicao, por serem pessoas to maravilhosas e pelo apoio indispensvel em mais esta etapa da minha vida. Dedico.
v AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida e por sempre me guiar pelos melhores caminhos, concedendo-me tantas graas e permitindo que eu pudesse alcanar mais este objetivo. Universidade Estadual de Maring (UEM) e ao Programa de Ps- Graduao em Gentica e Melhoramento (PGM), pela estrutura oferecida para elaborao dos experimentos. Fundao Araucria pelo apoio financeiro cedido para elaborao desta pesquisa. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), pela bolsa de estudo concedida. Em especial a minha orientadora, professora doutora Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki, pelo valioso trabalho de orientao, pelas oportunidades de crescimento profissional e pessoal e pelos conhecimentos transmitidos. s Coorientadoras, professora doutora Maria de Ftima Pires da Silva Machado e professora doutora Claudete Aparecida Mangolin, pela pacincia e ajuda durante os experimentos e principalmente pela dedicao aos alunos. A todos os professores do Programa de Ps-Graduao em Gentica e Melhoramento, pela valiosa contribuio em minha formao profissional. Aos Secretrios do Programa de Ps Graduao em Gentica e Melhoramento, Francisco Jos da Cruz e Maria Valquria Magro. A todas as pessoas que contriburam com a coleta das abelhas, principalmente as alunas Arielen Casagrande e Letcia Oliveira Claudino. companheira de turma e amiga, Raquel Barel Matos, pelas conversas construtivas e ajuda na organizao do trabalho. Ao meu irmo, Leonardo Ribeiro Bronzato, pelos valiosos conselhos, pelas longas conversas e principalmente pela amizade. s minhas tias, madrinhas, padrinhos e primos. Em especial, Tia Alix Antunes Ribeiro, Renata Imprio, Laura HeIena Imprio Alvim, Luana Imprio Alvim e Adnia Gonalves, por sempre torcerem pelas minhas conquistas e pelos momentos de descontrao e alegria.
vi s minhas amigas-irms, Eliane Rodrigues Monteiro, Ana Clara Meirelles e Laura Aparecida Carvalho, pela insubstituvel convivncia durante estes ltimos anos e por me possibilitar os melhores momentos da minha vida em Maring. s minhas grandes amigas, Juliana Martellozo, Gisuelma Rosseto, Danyelle de Oliveira Claudino, Daniela Giacon, Silvia Torres e Carla Assis, que, apesar de distantes, sempre me deram a certeza de poder contar com as suas amizades e por simplesmente serem minhas melhores amigas. Aos meus amigos, Davi Santos, Allan Lobato, Hugo Zeni Neto, Boris Briez, Cinthya Maritza Pacheco e Lorena Lopes, pela amizade e pelos bons momentos que passamos juntos. famlia de colegas dos laboratrios 17 e 21 do Departamento de Biologia Celular e Gentica da UEM, que tornaram mais fcil esta caminhada. Em especial, amiga Simone Aparecida dos Santos, cuja ajuda e amizade foram indispensveis para a finalizao deste trabalho. s amigas de laboratrio, Juliana Mosconi Magro, Juliana Bueno Ruiz, Ana Lcia Paz Barateiro Stuchi e Denise Alves Lopes, pela incrvel convivncia e troca de conhecimentos. A tantos outros amigos no listados aqui, mas dignos de minha homenagem.
vii BIOGRAFIA
Aline Ribeiro Bronzato, filha de Maria das Graas Ribeiro Bronzato e Joo Vicente Bronzato, nasceu na cidade de So Paulo, estado de So Paulo, no dia 28 de setembro de 1984. Concluiu o Ensino Fundamental na Escola Estadual Professor Dr. Gensio Boamorte, na cidade de So Paulo, estado de So Paulo, em 1999. Finalizou, em 2002, o Ensino Mdio na Escola Tcnica Estadual Pedro Leme Brisolla Sobrinho, tambm na cidade de So Paulo. Em 2007, licenciou-se em Cincias Biolgicas, pelas Faculdades Integradas de Ourinhos (FIO), em Ourinhos, estado de So Paulo. Especializou-se em Biotecnologia Aplicada Agroindstria, pela Universidade Estadual de Maring (UEM), em 2009. Ainda em 2009, iniciou o Curso de Mestrado no Programa de Ps- Graduao em Gentica e Melhoramento (PGM), da Universidade Estadual de Maring (UEM), desenvolvendo linha de pesquisa em Gentica Animal (Gentica de Insetos) e realizando estudos na rea de apicultura.
viii SUMRIO
LISTA DE QUADROS ................................................................................................ ix LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... x RESUMO.................................................................................................................... xi ABSTRACT .............................................................................................................. xiii 1. INTRODUO ........................................................................................................ 1 2. REVISO DE LITERATURA .................................................................................. 4 2.1. Meliponneos Abelhas T. angustula ............................................................... 4 2.2. Importncia ecolgica e econmica das abelhas Jata ................................... 10 2.3. Gentica de populaes de T. angustula ........................................................ 11 2.4. Marcadores moleculares em T. angustula ...................................................... 13 3. MATERIAL E MTODOS ..................................................................................... 18 3.1. Coleta das abelhas T. angustula e T. fiebrigi .................................................. 18 3.2. Isolamento do DNA nuclear ............................................................................ 19 3.3. Amplificao dos locos microssatlites ........................................................... 20 3.4. Anlise dos dados .......................................................................................... 22 4. RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................................ 24 5. CONCLUSES ..................................................................................................... 33 6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ..................................................................... 34
ix LISTA DE QUADROS Quadro 1 - Coordenadas geogrficas dos pontos de coleta de T. angustula e T. fiebrigi, o tipo de ninho e a quantidade de ninhos amostrados para caracterizao dos locos microssatlites.............................................19 Quadro 2 - Origem e sequncia dos primers microssatlites testados para amplificao em T.angustula e T. fiebrig..............................................21 Quadro 3 Temperaturas de anelamento especficas (E), conforme recomendaes do autor, e temperaturas testadas (T), para adaptao dos primers na amplificao de DNA de T. angustula e T. fiebrigi...............................22 Quadro 4 - Reagentes utilizados na PCR para amplificao dos locos microssatlites......................................................................................23 Quadro 5 Programa Touchdown-PCR com temperatura variando de 65C a 55C........................................................................................................23 Quadro 6 - Temperatura de anelamento satisfatria para amplificao dos cinco primers escolhidos para T. angustula e T. fiebrigi................................25 Quadro 7 - Tamanho e frequncia dos alelos (F) microssatlites de T. fiebrigi e T. angustula das populaes dos estados de So Paulo e Paran...................................................................................................27 Quadro 8 - Valores de Heterozigosidades observada (Ho) e esperada (He) obtidas com marcadores microssatlites para T. fiebrigi e T. angustula dos estados de So Paulo e Paran...........................................................28 Quadro 9 - ndice de fixao (F is ), grau de diferenciao (F st ) e fluxo gnico (Nm) obtidos com marcadores microssatlites em T. fiebrigi e T. angustula dos estados de So Paulo e Paran.....................................................29 Quadro 1 - Valores da Identidade Gentica e Distncia Gentica de Nei (1978) obtidos pelo programa Popgene 1.31 para as populaes de T. angustula (T.a) e T. fiebrigi (T.f) analisadas com marcadores microssatlites......................................................................................30
x LISTA DE FIGURAS Figura 1 Vista lateral de trax de T. angustula (jata). A: Mesepisterno preto de T. a. angustula. B: Mesepisterno amarelo de T. a. fiebrigi. C: Mesepisterno de operria hbrida. (Fotos: Dra. Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki e Aline Ribeiro Bronzato)..........................................................................7 Figura 2 - Vista da entrada do ninho de T. angustula (Freitas e Soares, 2004).........................................................................................................8 Figura 3 Favos de cria e a rainha de T. angustula (Kerr,1996)............................9 Figura 4 Mapa geogrfico do Brasil mostrando os pontos de coleta das abelhas T. angustula e T. fiebrigi nos estados de So Paulo e Paran...................18 Figura 5 Amplificao do primer microssatlite T3-32 para T. fiebrigi (nmeros 1 a 10) e T. angustula (nmeros 11 a 20).....................................................24 Figura 6 Primer T7-5 e Mbi278, respectivamente exemplos de monomorfismo e amplificao no satisfatria da transferabilidade..................................26 Figura 7 Dendrograma baseado no complemento aritmtico da distncia gentica de Nei (1978), obtido por marcadores microssatlites. As populaes de T. fiebrigi e T. angustula foram agrupadas pelo mtodo UPGMA, utilizando o programa Popgene 1.31......................................................31
xi RESUMO BRONZATO, Aline R. MSc. Universidade Estadual de Maring, fevereiro de 2011. Amplificao heterloga e diversidade gentica em Tetragonisca angustula (Latreille, 1811) e Tetragonisca fiebrigi (Schwarz, 1938). Orientadora: Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki. Conselheiros: Claudete Aparecida Mangolin e Maria de Ftima Pires da Silva Machado.
As abelhas nativas do Brasil tm papel importante na polinizao de espcies de Angiospermas. Dentre estas abelhas destacamos o gnero Tetragonisca que composto por quatro espcies de distribuio neotropical. Duas dessas espcies so bastante conhecidas no Brasil: a T. angustula e a T. fiebrigi, popularmente conhecidas como jata. Devido a caractersticas morfolgicas, em especial a colorao do mesepisterno, elas podem ser classificadas como duas subespcies de T. angustula. Poucos marcadores moleculares so descritos para essas abelhas, mas recentemente esto sendo desenvolvidos marcadores microssatlites. A partir dessa informao so avaliados e padronizados primers microssatlites, denominados de heterlogos ou heteroespecficos para as Tetragonisca. A transferabilidade desses primers facilita o desenvolvimento de estudos de gentica de populaes e filogentica das abelhas nativas sem ferro. O objetivo desse estudo foi o de investigar polimorfismos e a gentica de populaes para T. fiebrigi e T. angustula. Para tanto foram coletadas operrias de ninhos localizados em Maring PR; e nas localidades de Dracena, So Carlos e Santa Cruz do Rio Pardo SP, num total de 20 ninhos. De cada ninho foram utilizadas 10 operrias adultas para isolamento de DNA nuclear. Inicialmente foram realizados testes com sete primers microssatlites heteroespecficos. Desse total foi obtido sucesso na amplificao e presena de polimorfismo com cinco primers: T3-32, Mbi33, Mbi215, Mbi254 e Mbi259. A transferabilidade desses primers contribui com o aumento do banco de primers para estudos populacionais, filogenticos e evolutivos das abelhas sem ferro. Para a espcie T. angustula foi observada a ocorrncia de um alelo especfico para a populao de Santa Cruz do Rio Pardo, que poder ser utilizado para diferenciar as T. angustula dessa localidade. Um alelo especfico de T. fiebrigi foi obtido com o primer T3-32. A anlise da gentica de populaes mostrou que os primers utilizados, apesar de polimrficos, no permitem separar as duas espcies
xii de Tetragonisca, ocorrendo apenas subdiviso em populaes. Os valores de F ST mostraram que as populaes esto diferenciadas, mas foi observado excesso de homozigotos, esse fato pode ser consequncia de consanguinidade, ou da ocorrncia de alelos nulos pela utilizao de primers heterlogos. A anlise da colorao do mesepisterno e os valores de distncia gentica indicam que provavelmente houve hibridizao entre as T. fiebrigi e T. angustula em So Carlos. As duas espcies de Tetragonisca analisadas provavelmente no esto completamente separadas ainda, portanto novos estudos com maior nmero de marcadores moleculares sero necessrios para compreender melhor os mecanismos evolutivos dessas espcies de abelhas.
Palavras-chave: Marcadores moleculares; microssatlites; variabilidade gentica; gentica de populaes.
xiii ABSTRACT BRONZATO, Aline Ribeiro. MSc. Universidade Estadual de Maring, february, 2011. Heterologous amplification and genetic diversity in Tetragonisca angustula (Latreille, 1811) and Tetragonisca fiebrigi (Schwarz, 1938). Adviser: Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki. Commitee Members: Claudete Aparecida Mangolin e Maria de Ftima Pires da Silva Machado.
The native Brazilian stingless bees have an important role in pollination of Angiosperms species. Tetragonisca genus, a stingless bee, is composed by four species of neotropical distribution. Two of them are well known in Brazil, the T. angustula and the T. fiebrigi, popularly known as jata. Due to their morphological characteristics, especially the coloring of the mesepistern, they can be classified as two sub-species of T. angustula. Few molecular markers are described for these bees, but recently microsatellite markers are being developed. From this information microsatellite primers, denominated heterologous or heterospecific for Tetragonisca, are evaluated and standardized. The transferability of these primers facilitates the development of population genetics and phylogenetic studies of native stingless bees. The purpose of this study was to study polymorphisms and population genetics to T. fiebrigi and T. angustula. Worker bees were collected from nests in Maring - PR; Dracena, So Carlos and Santa Cruz do Rio Pardo SP, totaling 20 nests. From each nest, 10 adult workers were used for isolation of nuclear DNA. Initially, seven heterospecific microsatellite primers were tested. Of this total, successful amplification and presence of polymorphisms were obtained in five primers: T3-32, Mbi33, Mbi215, Mbi254 and Mbi259.The transferability of these primers contributes for the primer bank increase for population, phylogenetic e evolutionary studies of stingless bees. A specific allele was observed for T. angustula in Santa Cruz do Rio Pardo population, which could be used as a marker to this population. A specific allele of T. fiebrigi was obtained with T3-32 primer. Analysis of Population genetics showed that used primers, although polymorphic, not were able to separate the two Tetragonisca species, occurring only subdivision in populations. The values of F ST
showed that the populations are differentiated, but an excess of homozygotes was observed, a fact that can be a consequence of consanguinity or from the occurrence of null alleles from the use of heterologous primers. Mesepistern coloring and the values of genetic distance indicate that hybridization probably happened between the
xiv T. fiebrigi and T. angustula from So Carlos. The two Tetragonisca species analyzed are not completely separated yet; therefore, new studies with more molecular markers will be necessary to better comprehension the evolutionary mechanisms of these stingless bees.
Key words: Molecular markers; microsatellite; genetic variability; population genetics.
1 1. INTRODUO Dentre as espcies animais que compem a biodiversidade brasileira encontramos inmeras espcies de insetos sociais, entre eles uma grande variedade de abelhas tais como a T. angustula, uma abelha sem ferro, conhecida popularmente como Jata (Nogueira-Neto, 1997). As abelhas sem ferro esto entre os polinizadores mais comuns nos ambientes tropicais (Macas-Macas et al., 2009). Estes insetos compem um grupo diverso, o qual inclui mais de 400 espcies que mostram uma alta variabilidade na fisiologia, morfologia e tamanho, indo de 0,2mm no gnero Tetragonisca a mais de 20 mm em algumas espcies de Melipona (Michener, 2000; Moure et al., 2008). A importncia das abelhas jata est relacionada com a facilidade da criao racional de abelhas que est ligada, principalmente, ao seu emprego como auxiliar na agricultura e em projetos de reflorestamento, em que numerosas espcies vegetais dependem de processo de polinizao cruzada (Proni, 2000). Alm da polinizao, as abelhas nativas como a jata produzem mel de sabor apreciado (Freitas e Soares, 2004) e de atribuies teraputicas nos tratamentos de oftalmias e molstias dos pulmes (Imperatriz-Fonseca et al., 1984). Em vrias partes do Brasil o mel das abelhas sem ferro tem maior procura e preo mais alto em relao ao mel de Apis mellifera, como por exemplo, na regio de Minas Gerais, So Paulo e Paran, onde h grande procura pelo mel de jata e mandaaia Melipona quadrifasciata (Kerr et al., 1994; Alonso, 1998). Entretanto, h uma grande preocupao acerca da sustentabilidade das populaes destes meliponneos em relao fragmentao de reas de florestas devido ao do homem, o que pode levar ao isolamento de subpopulaes e consequentemente deriva gentica e endogamia, fatores que podem ser fatais para essa espcie (Nogueira-Neto, 2002). O uso de marcadores moleculares vem sendo empregado no estudo da variabilidade e divergncia gentica fornecendo dados importantes principalmente para a manipulao de insetos sociais, como as abelhas sem ferro (Oliveira et al., 2004). Esses podem ser definidos como locos que apresentam variabilidade e ser utilizados para detectar diferenas entre dois ou mais indivduos, duas ou mais populaes. Eles apresentam altos nveis de polimorfismo, geralmente so
2 marcadores neutros em relao a efeitos fenotpicos e, na maioria das vezes, so co-dominantes, contendo maior quantidade de informao gentica por loco (Ferreira e Grattapaglia, 1998). Nos ltimos anos, marcadores do tipo microssatlite tm sido uma ferramenta molecular bastante utilizada em estudos ecolgicos e genticos. A anlise de locos microssatlites realizada por meio da tcnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) utilizando-se iniciadores (primers) complementares (18 a 25 bases) s regies que os flanqueiam (Zane et al., 2002). A caracterizao de marcadores microssatlites tem mostrado que estes so bastante eficientes em separar espcies de abelhas sem ferro e no estudo de evoluo desses insetos (Prez et al., 1998). A utilizao desses marcadores poderia contribuir ainda com o melhor entendimento sobre a taxonomia de T. angustula e T. fiebrigi, j que autores como Castanheira e Contel (1995) consideram a ocorrncia de duas subespcies de T. angustula. Contudo, poucos estudos moleculares foram desenvolvidos com essas abelhas nativas sem ferro. Castanheira e Contel (2005) encontraram correlao significativa entre a cor do mesepisterno, com o alelo Hk 88 da isoenzima hexoquinase. As autoras verificaram que esse alelo tem maior frequncia nas abelhas T. a. fiebrigi que apresentam mesepisterno amarelo. Oliveira et al. (2004), utilizando marcadores RAPD, separaram T. angustula em dois grupos distintos de acordo com a distribuio geogrfica natural. Contudo, Baitala et al. (2006), empregando este marcador molecular, mostraram grande variabilidade gentica entre as populaes, e no foi possvel separar as subespcies T. a. angustula e T. a. fiebrigi. Uma biblioteca genmica enriquecida foi construda para T. angustula por Brito et al. (2009). Nesse estudo a biblioteca foi selecionada por meio de sondas de oligonucleotdeos de duas repeties simples e 21 pares de primers microssatlites foram desenhados flanqueando sequncias repetitivas dentro de clones positivos. Do total de 21 locos analisados, 15 se mostraram polimrficos. Esses primers amplificaram microssatlites de outras espcies de abelhas sem ferro T. fiebrigi, T. weyrauchi, Lestrimelitta maracaia e Schwarziana quadripunctata. Koling e Moretto (2009) utilizaram o marcador molecular PCR/RFLP para estudar o DNA mitocondrial de T. a. angustula e T. a. fiebrigi no estado de Santa
3 Catarina. Nesse estudo foram obtidos marcadores de DNA mitocondrial para as duas subespcies dependendo da regio geogrfica, mostrando que h um fluxo gnico restrito entre os dois grupos. Devido ampla distribuio de T. angustula e mais restrita de T. fiebrigi e a hibridao que provavelmente ocorre entre as duas espcies, o objetivo deste trabalho foi de analisar a divergncia gentica entre populaes de T. angustula e T. fiebrigi oriundas dos estados do Paran e So Paulo mediante utilizao de marcadores microssatlites.
4 2. REVISO DE LITERATURA 2.1. Meliponneos Abelhas T. angustula As abelhas sociais nativas do Brasil, conhecidas popularmente por abelhas indgenas, apresentam o ferro atrofiado, o qual no pode ser usado como meio de defesa. Por isso so denominadas popularmente de abelhas nativas sem ferro ou stingless bees. Estudos demonstram que as abelhas sem ferro provm evolutivamente de um grupo de vespas que deixaram de transmitir caracteres genticos da formao do ferro a seus descendentes (Alonso, 1998). No Brasil, os grupos mais importantes de abelhas eusociais (altamente sociais) constroem seus ninhos em ocos de troncos de rvores, como as abelhas nativas sem ferro (Silveira et al., 2002). As abelhas sem ferro pertencem superfamlia Apoidea, que subdividida em oito famlias: Colletidae, Andrenidae, Oxaeidae, Halictidae, Melittidae, Megachilidae, Anthophoridae e Apidae. Os Apidae, por sua vez, se subdividem em quatro subfamlias: Euglossinae, Bombinae, Apinae e Meliponinae (Proni, 2000). As abelhas pertencentes subfamlia Meliponinae so distribudas na Zona Tropical e subtropical, nas Amricas do Sul e Central, Malsia, ndia, Indonsia, frica e Austrlia. Tais abelhas so conhecidas no meio cientfico como meliponneos. Pertencem Ordem Hymenoptera e segundo Moure (1961), a subfamlia Meliponinae ainda pode considerar duas tribos: Meliponini e Trigonini. Os Meliponini se caracterizam por no construrem clulas reais, assim, rainhas, operrias e machos nascem e desenvolvem-se at o estgio adulto em clulas de cria de igual tamanho. Os Trigonini, por sua vez, constituem um grupo muito diversificado, com dezenas de gneros, e constroem quase sempre clulas reais, sendo estas maiores que as outras clulas da colmia, de onde emergem as futuras rainhas (Nogueira-Neto, 1997). Segundo Camargo e Menezes-Pedro (1992), os meliponneos tiveram origem na parte oeste do continente Gondwana. Esta hiptese sustentada devido aos registros fsseis encontrados e pela biogeografia do local. Kerr et al. (1996) citam que um dos principais locais de ocorrncia dos meliponneos o Brasil. Estes so de grande importncia para a ecologia de diversos ecossistemas, j que tais insetos participam da polinizao de grande parte
5 da Mata Atlntica, pois essas abelhas so responsveis por 40% a 90% da polinizao das rvores nativas, enquanto outros animais, como aves, borboletas e alguns mamferos desempenham o papel polinizador restante. No total so conhecidas cerca de 400 espcies de meliponneos distribudas em aproximadamente 50 gneros (Velthuis, 1997). Tal nomenclatura se d devido ao fato de terem sido inicialmente manipuladas por povos indgenas e primitivos, como os maias pr-colombianos, que deixaram em seus cdices, explicaes sobre como manejar estas abelhas, e os ndios kaiaps, que demonstraram um vasto conhecimento sobre a anatomia e comportamento das espcies de abelhas sem ferro (Alonso, 1998). Estudos relativos ao comportamento dos meliponneos demonstram que estes so capazes de defender suas colnias fechando a entrada do ninho quando so atacados por outros insetos e, j que possuem ferro atrofiado, atacam os invasores com as mandbulas, enrolando-se nos plos, envolvendo-os com geoprpolis ou penetrando em orifcios dos inimigos de maior porte (Nogueira-Neto, 1997). De acordo com Proni (2000), as abelhas indgenas sem ferro so encontradas praticamente em todos os tipos de habitats, j que possuem diferentes espcies com hbitos muito variados de nidificao e, consequentemente, com grande variabilidade em sua biologia. Estas abelhas geralmente precisam de cavidades grandes para abrigar uma colnia. A maioria das espcies faz seus ninhos em buracos de rvores, entretanto algumas espcies ocupam ninhos abandonados por formigas e trmitas e, tambm, cavidades subterrneas dentro de razes de rvores, entre outros (Roubik, 1989). Um exemplo de abelhas Trigonini (abelhas que utilizam cera) so as abelhas T. angustula, que so conhecidas popularmente como jata (Moure, 1961), destacando-se como uma das mais comuns entre as espcies de meliponneos. Alguns estudos classificam a jata em diferentes nomenclaturas, dependendo do autor investigado. Moure (1961) classificou a jata como pertencente ordem Hymenoptera, famlia Apidae, subfamlia Meliponinae, Tribo Trigonini, gnero Tetragonisca. Contudo na literatura mais recente, que o catlogo de abelhas, Moure et al. (2008) consideram que o gnero Tetragonisca faz parte da tribo Meliponini. Esse gnero composto por quatro espcies T. buchwaldi, T. weyrauchi, T. angustula e T. fiebrigi
6 (Camargo e Pedro, 2008). Abelhas T. buchwaldi no ocorrem no Brasil, so encontradas na Costa Rica, Equador e Panam; T. weyrauchi pode ser observada na Bolvia, Peru e no Brasil esto restritas ao Acre, Mato Grosso e Rondnia (Camargo e Pedro, 2008). No Brasil as T. angustula so facilmente encontradas em todo o territrio, pois se adaptam bem s condies ambientais da regio neotropical. Estas abelhas ocorrem ainda do Mxico at a Argentina (Camargo e Menezes-Pedro, 1992). J as T. fiebrigi possuem uma distribuio mais restrita, sendo encontradas em parte da Argentina, Bolivia, Brasil (Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Paran, Rio Grande do Sul, So Paulo) e Paraguai (Camargo e Pedro, 2008). Castanheira e Contel (1995) sugerem que a espcie T. angustula seria composta por duas subespcies: T. a. angustula e T. a. fiebrigi. Estas duas subespcies podem ser separadas morfologicamente por meio da colorao do mesepisterno, a subespcie T. a. angustula possui o mesepisterno preto (Figura 1A) e T. a. fiebrigi possui o mesepisterno amarelo (Figura 1B). Castanheira e Contel (1995) ainda identificaram hbridos que possuam o mesepisterno amarelo com manchas pretas (Figura 1C) e mesepisterno preto com manchas amarelas. Para Nogueira-Neto (1997) e Velthuis (1997), essas abelhas se alimentam especificamente do plen e do nctar, fontes de protena e energia, respectivamente. A jata nidifica em cavidades de troncos vivos ou mortos, em paredes, no cho e em tubulaes, sendo uma espcie encontrada frequentemente em reas antrpicas, j que se adapta facilmente a diferentes condies de habitats (Freitas e Soares, 2004). Possui ainda um nicho ecolgico muito peculiar e convive bem nas Amricas com muitos meliponneos e com abelhas de outros grupos. Ela est bem adaptada, inclusive nas grandes cidades como So Paulo, onde h poucas abelhas nativas. Vive tambm, em lugares onde h muitas outras abelhas nativas e muitas colnias de Apis mellifera, como na regio sudeste do Brasil (Nogueira-Neto, 1997). O enxame de T. angustula constitudo por uma rainha responsvel pelo desenvolvimento da colnia, que realiza uma postura de at 50 ovos por dia na poca de boa florada, zanges que tm a funo de fecundar a rainha na poca de procriao, e pelas operrias que realizam todo o trabalho da colnia, semelhante s abelhas A. mellifera (Kerr et al., 1996).
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Figura 1 Vista lateral de trax de T. angustula (jata). A: mesepisterno preto de T. a. angustula. B: mesepisterno amarelo de T. a. fiebrigi. C: mesepisterno de operria hbrida. (Fotos: Dra. Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki e Aline Ribeiro Bronzato).
O enxame de T. angustula constitudo por uma rainha responsvel pelo desenvolvimento da colnia, que realiza uma postura de at 50 ovos por dia na poca de boa florada, zanges que tm a funo de fecundar a rainha na poca de procriao, e pelas operrias que realizam todo o trabalho da colnia, semelhante s abelhas A. mellifera (Kerr et al., 1996). O zango nasce de um ovo no fecundado, e tem como funo fecundar a rainha na poca de procriao, sendo mortos ou expulsos da colmia pelas operrias quando h falta de alimentos ou quando no mais so necessrios para a fecundao. As operrias realizam todo o trabalho da colmia, desde nutrizes e faxineiras at soldado e campeiras, semelhante a A. mellifera. As operrias de T. angustula nascem de um ovo fecundado em uma clula comum (Kerr et al., 1996).
8 Na maioria das espcies de meliponneos, a entrada do ninho guardada por abelhas sentinelas (Figura 2) que atacam inimigos quando estes tentam invadi- la, especialmente, abelhas de outras colmias e formigas. A morfologia e organizao do ninho de T. angustula so tpicas da espcie, a entrada do ninho formada por um tubo de cerume marrom-amarelado de 3 a 4 centmetros de comprimento, com pequenos orifcios na parede. A extremidade deste possui bordas que permitem a sada de vrias abelhas ao mesmo tempo (Cortopassi-Laurino e Nogueira-Neto, 2003). Em muitas espcies esta entrada circundada por uma resina pegajosa que dificulta o acesso de invasores, enquanto outras espcies se defendem fechando a entrada do ninho quando se sentem ameaadas por outros insetos (Freitas e Soares, 2004).
Figura 2 Vista da entrada do ninho de T. angustula (Freitas e Soares, 2004).
A abelha jata possui favos horizontais e apresentam um invlucro de cerume formado por vrias lamelas (Figura 3), que tem funo termorreguladora (Kerr, 1996). Quando prepara seu ninho para reproduo, este constitudo por uma mistura de cera e resina, conhecida como batume j que tem consistncia pegajosa. Esta mistura separa todo o ninho tanto na parte superior quanto na inferior
9 para formar uma proteo ao ncleo. Diferentemente do ocorrido nos ninhos de Apis, as clulas ou favos so construdos no sentido horizontal formando camadas sobrepostas. Dentro do ninho h uma sequncia na reproduo onde enquanto as clulas da parte superior ainda esto com ovos, s outras clulas da parte inferior eclodem para que as larvas possam conviver com as demais, formando assim um ciclo reprodutivo (Fabichak, 1987).
Figura 3 - Favos de cria e a rainha de T. angustula (Kerr,1996).
comum encontrar depsitos de prpolis dentro da colnia destas abelhas, que so utilizados juntamente com a cera, para fechar buracos e para construir as paredes das clulas do ninho no qual ficam os ovos e os potes de alimento (Kerr et al., 1996). Na entrada da caixa ou ninho construdo um tubo de cera, que fechado durante a noite deixando pequenos orifcios, como uma espcie de teia a fim de permitir o arejamento interno (Fabichak, 1987).
10 De acordo com Wille (1979), essas abelhas tm o costume de visitar frequentemente as flores nas altas copas, e na sua ausncia, as comunidades de rvores da floresta tropical pluvial podem ser bastante modificadas.
2.2. Importncia ecolgica e econmica das abelhas Jata Os meliponneos so considerados de importncia vital para o ecossistema, devido sua eficincia como polinizadores. A criao da maioria das espcies de abelhas est ligada, principalmente, ao seu emprego como auxiliar na agricultura e em projetos de reflorestamento, onde numerosas espcies vegetais dependem de processos de polinizao cruzada (Proni, 2000). Estudos referentes associao inseto-planta, mais especificamente entre meliponneos e vegetais nativos da regio de Manaus-AM, verificaram que a extino de espcies nativas de abelhas acelera o processo de extino de espcies vegetais, desequilibrando os ecossistemas (Keer et al., 1978; Absy et al., 1980). A jata apresenta algumas vantagens sobre as africanizadas ou europias pertencentes famlia Apidae, por ser uma abelha bastante rstica que tem grande capacidade para fazer ninhos e sobreviver em diferentes ambientes, inclusive em zonas urbanas (Cortopassi-Laurino, 2005). As abelhas indgenas, especialmente a jata, so criadas em praticamente todo territrio nacional, principalmente pela ausncia de agressividade, facilitando assim o seu manejo, bem como pelo fato de produzirem um mel bastante apreciado e valorizado (Nogueira-Neto, 1997). A jata possui destacada importncia econmica e ecolgica. O extrativismo de mel, cerume e resinas dessas abelhas so amplamente disseminados, principalmente no norte e nordeste do Brasil (Menezes-Pedro e Camargo, 2000). A criao de abelhas jata (T. angustula) uma boa opo aos meliponicultores. Imperatriz-Fonseca et al. (1984), coletaram amostras de mel e plen de colnias de T. angustula mantidas no campus da USP de So Paulo e concluram que estas abelhas visitaram 180 espcies vegetais pertencentes a 45 famlias distintas para a coleta do alimento. Malagodi-Braga e Kleinert (2004) encontraram diferena significativa na produo de morangos sob efeito da polinizao por jata, apresentando um aumento no nmero de vulos fecundados e frutos com maior peso. A jata T. angustula possui facilidade em ocupar lugares variados para
11 nidificao, adaptando-se s cidades, o que contribui para a manuteno da espcie mesmo com desmatamentos e queimadas nas florestas. Elas conseguem nidificar em buracos de muros, pedras, troncos ocos de rvores e caixas de luz (Freitas e Soares, 2004). A biologia, comportamento, aspectos morfolgicos e bioqumicos de T. angustula tm sido estudados desde o incio do sculo vinte (Oliveira et al., 2004). No Brasil existem inmeras espcies de abelhas sem ferro, havendo muito trabalho de pesquisa a ser feito para conhecer essa diversidade. H aquelas que produzem mel s para o consumo da colmia, enquanto outras produzem excedentes que podem ser aproveitados para o consumo humano (Lopes et al., 2005). Desta forma, toda e qualquer possibilidade de desenvolver estudos destinados a conhecer a biologia bsica dos meliponneos, poder trazer solues prticas na conservao e manejo dos ecossistemas atuais (Kerr et al., 1996).
2.3. Gentica de populaes de T. angustula O sistema de diferenciao sexual haplodiplide constitui a maioria dos Hymenoptera. Nesse caso os ovos fertilizados do origem a fmeas (diplides) e os no fertilizados originam machos (haplides). Essa assimetria reprodutiva pode causar a diminuio da variabilidade gentica nesses insetos. Tal afirmativa est associada ao fato da haplodiploidia promover a diminuio do tamanho efetivo da populao, aumento na fixao de alelos e preveno da produo de polimorfismos estveis. O gnero Tetragonisca corresponde a um grupo de abelhas que possuem haplodiploidia (Kerr, 1976). Contudo, estudos com grupos de Hymenoptera como espcies de Shymphyta (Sawflies) apresentam heterozigosidade similar a outros insetos diplodiplides (Boraschi e Del Lama, 2004); assim, tem sido demonstrado que somente a haplodiploidia no seria responsvel pela reduo da variabilidade gentica. Devido ao do homem que modifica o ambiente, fragmentando florestas, as abelhas nativas tm sofrido isolamento de subpopulaes, o que resulta em endogamia e deriva gentica (Nogueira-Neto, 2002). Tais fatores esto relacionados com a estrutura social dos ninhos e afunilamentos populacionais contribuindo para determinar os baixos ndices de variabilidade protica em Hymenoptera. A perda de
12 alelos por deriva gentica possivelmente definida por um nmero mnimo de indivduos que se reproduziram durante um perodo de afunilamento demogrfico, e estes alelos s podem ser recuperados por mutao, ou a partir de outras populaes, por meio de migrao (Allendorf e Luikart, 2007). Segundo o princpio da Deriva Gentica, uma populao pequena perde ao acaso alelos, tornando-se assim possuidora de poucos alelos diferentes disponveis, o que leva a um nvel baixo de variabilidade gentica, que pode determinar a extino desta populao se as condies ambientais mudarem (Allendorf e Luikart, 2007). Com o isolamento de populaes de abelhas jata em uma determinada regio, pode ocorrer o aumento da endogamia e como consequncia a produo de machos diplides. Quando h a produo de machos diplides numa colnia de meliponneo, a rainha eliminada pelas operrias e a colnia tende a morrer por falta de operrias e de rainha. Isso acontece devido ao cruzamento da rainha com zanges da mesma colnia, ou seja, cruzamentos consanguneos (Kerr, 1996). Populaes desta abelha estudadas por Castanheira e Contel (2005), apresentaram excesso de homozigose com relao a alelos relacionados enzima hexoquinase. As autoras mencionam que as colnias de T. angustula formam grupos ("clusters") distantes um do outro, o que pode explicar a homogeneidade allica encontrada entre as colnias de um mesmo grupo. A necessidade de conservao, manejo e recuperao de populaes degradadas requerem uma abordagem que envolva no somente aspectos demogrficos e ecolgicos, mas tambm a gentica de populaes. O enfoque gentico, pela caracterizao da estrutura gentica e do tamanho efetivo, em populaes com diferentes nveis de interveno antrpica, constitui uma abordagem adequada para ser utilizada neste tipo de estudo (Kageyama, 1987; Moran et al., 1989; Hall et al., 1996 e Nason e Hamrick, 1997). Frente ao que j conhecemos sobre a estrutura de populao dos meliponneos, seu nicho ecolgico e a frequente fragmentao de seus habitats naturais, o uso de marcadores moleculares torna-se importante para o entendimento da estrutura de populaes dessas abelhas contribuindo para o desenvolvimento de melhores prticas de manejo e conservao.
13 2.4. Marcadores moleculares em T. angustula Os marcadores moleculares so locos gnicos que apresentam variabilidade e podem ser utilizados para detectar diferenas entre dois ou mais indivduos, duas ou mais populaes. Eles apresentam altos nveis de polimorfismo e, na maioria das vezes, so co-dominantes, contendo maior quantidade de informao gentica por loco (Ferreira e Grattapaglia, 1998). Os primeiros a serem desenvolvidos foram os marcadores embasados em variantes allicos de isoenzimas, o que permitiu a ampliao do uso de marcadores de pelo menos uma ordem de magnitude em relao aos marcadores morfolgicos (Ferreira e Grattapaglia, 1998). O termo isoenzima define um grupo de mltiplas formas moleculares da mesma enzima que ocorre em uma espcie, como resultado da presena de mais de um gene codificando cada uma das enzimas (Moss, 1992). Vrios estudos com marcadores bioqumicos foram realizados em T. angustula. Estes estudos envolveram sistemas proticos como enzima mlica, esterases, fosfoglicomutase, glicerol-3-fosfato desidrogenase, isocitrato desidrogenase, malato desidrogenase, hexoquinase, peptidases, protenas totais e superxido desmutase (Falco e Contel, 1990, 1991; Machado e Contel, 1991; Castanheira e Contel, 1995, 2005). A anlise dos polimorfismos isoenzimticos em T. angustula e T. fiebrigi em duas localidades (Ivatuba e Altnia, PR) permitiram detectar a presena de um marcador isoenzimtico para essas duas subespcies de jata, a EST-2. Essa isoenzima est presente nas abelhas T. fiebrigi e no foi detectada nas T. angustula (Ruiz, 2006; Stuchi, 2010). Outras anlises de isoenzimas como as esterases tm demonstrado que T. a. angustula possui duas regies de esterase. A EST-1 uma -esterase e a EST-2 -esterase. J em T. a. fiebrigi foram detectadas trs regies estersicas. A EST- 1 uma -esterase, mas no corresponde quela da T. a. angustula, uma EST-2 - esterase e a EST-3 que uma -esterase e tem correspondncia com a mesma regio da T.a. angustula. Esses resultados mostram que h diferenas importantes entre essas duas abelhas (Ruvolo-Takasusuki et al., 2006). Stuchi (2010) caracterizou bioquimicamente esterases e mostrou que apenas a EST-4 comum s duas espcies. As EST-1 (T. fiebrigi) e EST-3 (T. angustula) provavelmente se diferenciaram por mutaes ao longo da evoluo das
14 duas espcies, e a EST-2 (T. fiebrigi) pode ter se originado por duplicao e mutaes posteriores. O desenvolvimento e aprimoramento das tcnicas de marcadores moleculares baseados em PCR tm possibilitado estudos de gentica quantitativa, tais como a determinao do nmero de genes afetando um carter, a localizao e o percentual da varincia explicada por tais genes, o tipo de ao gnica associada, a importncia da epistasia e o efeito ambiental em cada gene (Severson et al., 1993). Os marcadores moleculares tiveram sua utilizao iniciada na dcada de 1980, e com o aprimoramento das tcnicas de Biologia Molecular, o DNA passou a ser o foco para o desenvolvimento de novos marcadores que poderiam ser utilizados como ferramentas de investigaes moleculares. A tcnica viabiliza a caracterizao gentica de grande nmero de gentipos atravs de procedimentos relativamente simples e rpidos, podendo ser executada em qualquer estgio do ciclo de vida de um organismo (Oliveira et al., 2007). So capazes de detectar o polimorfismo diretamente ao nvel do DNA, no sofrendo qualquer tipo de influncia ambiental (Souza, 2001). Alm disso, so livres de efeitos epistticos e pleiotrpicos, permitindo, dessa forma, que qualquer nmero de marcadores seja monitorado em uma nica populao. Muitos marcadores de DNA apresentam expresso co- dominante, permitindo que gentipos sejam determinados (Kumar, 1999). Oliveira et al. (2004), utilizando marcadores RAPD, determinaram a distncia gentica entre populaes de T. angustula de 25 localidades em trs pases diferentes da Amrica Latina (Brasil, Argentina e Panam). Baseados na distncia gentica, calculada pela porcentagem de dissimilaridade encontrada (14%), os autores dividiram a populao de T. angustula em dois grupos: grupo 1 (oriental), formado com a subespcie T. a. angustula e grupo 2 (ocidental), formado com a T. a. fiebrigi. Dois primers utilizados nesta anlise geraram cinco fragmentos que foram utilizados como marcadores moleculares especficos, permitindo diferenciar estas subespcies. Baitala et al. (2006) utilizaram marcadores RAPD para avaliar a estrutura gentica em cinco populaes (14 colnias) de jata. Foram analisados 12 primers que reproduziram 171 fragmentos dos quais 150 foram polimrficos (87,72%). A estimativa da diversidade gentica pelo ndice de Shannon foi de 0,3929 ( 0,2329). O fluxo gnico (Nm) observado foi de 1,4474 e o valor de G ST foi 0,2568. Com os
15 valores de distncia gentica, foi verificado um isolamento entre as populaes do noroeste do Paran (Maring e Cianorte) da populao de Junqueirpolis (SP). Foram identificados seis marcadores que diferenciaram as populaes de T. angustula do estado de So Paulo e Paran, no entanto, esses marcadores no conseguiram separar as T. a. angustula e T. a. fiebrigi. Alves (2006) empregou RAPD para a anlise de trs populaes de jata no noroeste do Paran, Ivatuba, Umuarama e Altnia, sendo que em Ivatuba foram coletadas apenas T. a. angustula e em Umuarama e Altnia apenas T. a. fiebrigi. Tais resultados mostraram que as duas espcies de abelhas esto separadas com valores de distncia gentica que justificam a sua taxonomia, pois entre T. a. angustula e T. a. fiebrigi o valor de distncia gentica de acordo com Nei (1978) foi 0,23 e entre as duas populaes de T. a. fiebrigi foi de 0, 0507. Outro exemplo de marcador molecular baseado em tcnicas de PCR descritos para estudos de estrutura de populaes, sistemtica, variabilidade gentica e melhoramento gentico so os microssatlites. Regies microssatlites so regies no genoma que apresentam seqncias repetitivas (em tandem) de uma, duas, trs ou quatro seqncias de nucleotdeos, sendo a de duas sequncias a mais comum. A funo destas regies ainda desconhecida, mas os microssatlites se mostraram extremamente teis como marcadores moleculares no mapeamento gentico de vrios organismos. Por ser um marcador co-dominante, mostra-se bastante informativo para anlise de estrutura gentica de populaes (Zane et al., 2002). Os estudos genticos em abelhas com marcadores microssatlites foram iniciados com Estoup et al. (1993, 1995a 1995b), que desenvolveram vrios primers microssatlites para Apis mellifera e mamangava (Bombus terrestris). Os primeiros 25 pares de primers microssatlites especficos para o gnero Melipona foram desenhados por Peters et al. (1998) para a espcie Melipona bicolor. Destes, 18 locos foram polimrficos para esta espcie. Paxton et al. (1999) derrubaram a teoria de monandria no grupo dos meliponneos quando desenvolveram 7 pares de primers para a espcie Scaptotrigona postica. A anlise destes sete locos de microssatlites evidenciou frequncias de acasalamento com um a trs machos para M. beecheii e de um a seis machos para Scaptotrigona postica, demonstrando poliandria no grupo dos meliponneos.
16 Contudo, a caracterizao de marcadores microssatlites tem demonstrado que estes so bastante eficientes em separar espcies de abelhas sem ferro e no estudo de evoluo dessas abelhas. No ano de 1998, foi realizado o primeiro trabalho empregando microssatlites em abelhas da tribo Meliponini (Prez et al., 1998), desenvolvendo primers para M. bicolor. Green et al. (2001), tambm realizaram estudos para a obteno de marcadores microssatlites para Trigona carbonaria, uma abelha sem ferro da Austrlia. Francisco et al. (2006) caracterizou populaes de abelha Plebeia remota de diferentes localidades do Brasil utilizando dois marcadores moleculares, o DNA mitocondrial e microssatlites, com o objetivo de detectar aspectos evolutivos como estruturao e fluxo gnico entre elas. A importncia de marcadores microssatlites de abelhas sem ferro para estudos de evoluo foi discutida por Arias et al. (2006). Outros estudos tm descrito a importncia desses marcadores para o entendimento da sistemtica e evoluo de abelhas sem ferro (Costa et al., 2003; Moretto e Arias, 2005; Quezada-Eun et al., 2007). Apesar de extremamente eficientes, o uso de marcadores microssatlites em estudos de gentica populacional depende de uma etapa prvia, que consiste na caracterizao e descrio destes locos no organismo que se deseja estudar. Devido ao alto custo e tempo para o desenvolvimento de primers espcie- especficos para locos microssatlites, muitos estudos vm utilizando cada vez mais primers descritos para uma determinada espcie em outras espcies relacionadas que ainda no possuem sequncias microssatlites descritas e validadas (Oliveira et al., 2006). Essa transferncia de primers microssatlite entre espcies relacionadas uma vantagem para a utilizao desse marcador - esse processo denominado de transferabilidade ou amplificao cruzada. Isso permite que outra espcie seja avaliada com marcadores potentes, sem a necessidade de gastos com o desenvolvimento de primers. Os primers que se comportam desta forma so denominados heterlogos (Hoshino et al., 2002). A transferabilidade de locos microssatlites pode ser extremamente alta quando realizada em espcies ou gneros taxonomicamente relacionados. Dependendo de sua localizao (se o loco est ou no presente em uma regio codante do genoma) esta taxa pode ser ainda maior (Oliveira et al., 2006).
17 Os marcadores microssatlites permitem superar as deficincias dos outros marcadores por apresentarem altos nveis de variabilidade em estado diplide e serem altamente polimrficos (Tautz, 1989). Esses marcadores podero contribuir para solucionar ou permitir entender a taxonomia de T. angustula.
18 3. MATERIAL E MTODOS 3.1. Coleta das abelhas T. angustula e T. fiebrigi Operrias adultas de T. angustula e T. fiebrigi foram coletadas de ninhos provenientes de quatro localidades (Figura 4; Quadro 1) dos estados de So Paulo e Paran. De cada colnia foram coletadas, de forma aleatria, vinte abelhas na entrada do ninho. Cinco indivduos de cada ninho foram analisados sob estereomicroscpio Zeiss para verificar a colorao do mesepisterno. Os demais indivduos foram estocados a -20C por duas semanas.
Figura 4 Mapa geogrfico do Brasil mostrando os pontos de coleta das abelhas T. angustula e T. fiebrigi, nos estados de So Paulo e Paran.
19 Quadro 1 Coordenadas geogrficas dos pontos de coleta de T. angustula e T. fiebrigi, o tipo de ninho e a quantidade de ninhos amostrados para caracterizao dos locos microssatlites. N = nmero de indivduos coletados por ninho. C = nmero de ninhos amostrados por localidade
Municpio/Estado Coordenadas Geogrficas Tipo de Ninho T. angustula N (C) T. fiebrigi N (C) Dracena (SP) 21 28' 57" S; 5131' 58" O Natural 20 (1) 20 (4) Maring (PR) 23 25' 30" S; 5156' 20" O Natural/Racional 20 (4) 20 (1) Santa Cruz do Rio Pardo (SP) 22 53' 56" S; 4937' 58" O Natural 20 (5) ----- So Carlos (SP) 22 01' 04" S; 4753' 27" O Natural 20 (3) 20 (2) Total 20 260 (13) 140 (7)
3.2. Isolamento do DNA nuclear O DNA foi isolado do trax de doze indivduos de cada ninho. A extrao de DNA para o estudo de marcadores microssatlites foi realizada como descrito por Yu et al. (1993) com algumas modificaes para T. angustula e T. fiebrigi, como segue: Os trax das operrias foram macerados individualmente em tubos de 1,5mL contendo 300L de tampo de lise (EDTA 0,5M pH 8,0; NaCl 5M; SDS 0,5% [10%]; TrisHCl 1M pH 8,0) e 4L de Proteinase K. As amostras foram ento incubadas em banho-maria por 1 hora a 65C, os tubos foram agitados ocasionalmente para manter o substrato ressuspendido. Posteriormente as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 12.000rpm, o sobrenadante foi transferido para outro tubo de 1,5mL, e adicionado igual volume de clorofrmio: lcool-isoamlico (24:1). As amostras foram homogeneizadas invertendo os tubos delicadamente por trs minutos e centrifugados novamente por 10 minutos a 12.000rpm - esta etapa foi repetida duas vezes. O sobrenadante final foi transferido para outro tubo de 1,5mL e adicionando-lhe 250L de isopropanol (gelado), invertendo os tubos delicadamente por trs vezes para precipitao do DNA. Os tubos foram acondicionados em freezer a -20C por toda a noite (overnight). Posteriormente as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a
20 12.000rpm, o sobrenadante foi descartado e o DNA lavado com etanol 70% (gelado), centrifugado novamente nas mesmas condies. Aps isto, o sobrenadante foi descartado e o DNA deixado para secar a temperatura ambiente por aproximadamente 1 hora. Assim o DNA foi ressuspendido em 40L de TE (Tris- HCl 1M pH 8,0; EDTA 0,5M pH 8,0) e mantido a temperatura ambiente por 2 horas, posteriormente acondicionado em geladeira a -4C overnight. Aps esta etapa foi adicionado ao ressuspendido 3L de RNAse e acondicionado em geladeira a -4C por 3 dias. A integridade e pureza dos DNAs extrados foram verificadas em gel de agarose 0,8%, corados com brometo de etdeo e fotodocumentados no sistema EDAS - Kodak 1 D Image Analysis 3.5. A quantificao foi baseada na intensidade de banda quando comparadas com marcadores de peso molecular de DNA fago Lambda de 50ng e 100ng.
3.3. Amplificao dos locos microssatlites Inicialmente, utilizando cinco operrias de cada espcie provenientes de dois ninhos localizados no campus da Universidade Estadual de Maring - UEM, foram realizados testes para a amplificao de DNA empregando sete pares de primers microssatlites, variando a temperatura de anelamento na Reao em Cadeia da Polimerase (PCR). Dos primers escolhidos para teste, cinco foram desenvolvidos para M. bicolor e dois para S. postica (Quadro 2). As reaes do PCR foram realizadas em termocicladores Eppendorf, Applied Biosystems e Techine, conforme o protocolo original descrito por Paxton et al., (1999), com modificaes de temperatura na etapa de desnaturao de 92C para 94C e tempo de extenso final de 30s para 45s. O processo de amplificao foi iniciado por uma desnaturao inicial em 94C por 3 minutos, seguida por 40 ciclos de 30 segundos a 94C, 1 minuto a temperatura especfica para cada primer (Quadro 3), 45 segundos a 72C e 5 minutos a 72C para extenso final. As concentraes timas dos reagentes para a PCR de todos os locos foram idnticas para T. angustula e T. fiebrigi (Quadro 4), entretanto, alguns primers obedeceram a diferentes temperaturas de anelamento. Tambm foi testado o programa Touchdown-PCR para todos os primers (Quadro 5).
2 1
Quadro 2 Primers microssatlites testados para amplificao em T. angustula e T. fiebrigi. Espcie de origem, sequncia e tamanho dos fragmentos gerados nas espcies para as quais os primers microssatlites foram desenvolvidos
Loco Primer (5 3) Nmero de repeties Tamanho dos fragmentos (em pb) Espcie de origem do primer T3-32 GCGGGAGGGAAAGTCCTCTCG CGTCTTCGTCAGGCGTGC (CT)21
22 Os produtos das amplificaes foram submetidos eletroforese em gel de agarose 4%, a 60v, utilizando o volume total da reao (20L) adicionado a 2L de load (azul de bromofenol [0,25%] + glicerol [30%]). Para determinao do tamanho dos fragmentos amplificados foi utilizado o marcador de peso molecular Ladder 1Kb Invitrogen
. Os gis foram corados em
soluo de brometo de etdeo por 30 minutos para visualizao das bandas e fotodocumentados em sistema EDAS - Kodak 1 D Image Analysis 3.5.
3.4. Anlise dos dados As anlises dos dados moleculares envolveram a interpretao das bandas de DNA genmico obtidas e a heterozigosidade gentica foi determinada pela porcentagem de alelos polimrficos. Os coeficientes de diferenciao gentica foram calculados utilizando o programa POPGENE 1.31 (Yeh et al., 1999).
Quadro 3 Temperaturas de anelamento especficas (E), conforme recomendaes dos autores, e temperaturas testadas (T), para adaptao dos primers na amplificao de DNA de T. angustula e T. fiebrigi
Primers Temperaturas de anelamento E T T7-5 60C 1 Touchdown*/62C T3-32 60C 1 Touchdown* Mbi 33 60C 2 Touchdown* Mbi 215 57.5C 2 Touchdown*/60C/62C/64C/67C Mbi 254 55C 2 Touchdown* Mbi 259 57.5C 2 Touchdown* Mbi 278 60C 2 Touchdown* 1 Paxton et al., 1999; 2 Peters et al., 1998; Touchdown*- PCR Don et al., 1991.
23 Quadro 4 Reagentes utilizados na PCR para amplificao dos locos microssatlites
Reagentes Concentrao Enzima Taq Dna Polimerase (Platinum) 1u Cloreto de Magnsio (MgCl 2 ) 2,5mM Tampo da enzima Taq Platinum 2,0L Deoxinucleotdeos (dNTPs) 0,4mM Primers (Foward e Reverse) 0,4M DNA 10ng Total da Reao (L) 20
Quadro 5 Programa Touchdown-PCR com temperatura variando de 65C a 55C
Passo Etapa Temperatura Programa Towchdown 1 1 Desnaturao inicial 94C 1min 2 Desnaturao 94C 1min 3 Anelamento 65C (-1C/ciclo) 1min 4 Extenso 72C 2min 5 Volta ao passo 2, 9 vezes
6 Desnaturao 94C 1min 7 Anelamento 55C 1min 8 Extenso 72C 2min 9 Volta ao passo 9, 17 vezes
10 Extenso final 72C 2min 11 Imerso 15C - Don et al., 1991 1 .
24 4. RESULTADOS E DISCUSSO Os sete pares de primers testados para T. angustula e T. fiebrigi foram transferveis, j que resultaram em produtos amplificados. Entretanto apenas cinco primers (T3-32, Mbi33, Mbi215, Mbi254 e Mbi259) foram escolhidos para anlise destas espcies, pois demonstraram qualidade na amplificao dos locos microssatlites. Na figura 5 so mostrados os resultados da amplificao com o primer T3-32. Para anlise de divergncia gentica foram utilizados um primer de S. postica (T-32) e quatro primers de M. bicolor.
Figura 5 Amplificao com o loco microssatlite T3-32 para T. fiebrigi (nmeros 1 a 10) e T. angustula (nmeros 11 a 20).
Cada primer obteve uma temperatura tima de anelamento durante as reaes de amplificao nas populaes estudadas (Quadro 6). Entretanto depois de definida as melhores temperaturas, estas foram idnticas tanto para T. angustula quanto T. fiebrigi. Carvalho-Zilse et al. (2009) obtiveram resultados positivos na transferabilidade de primers de M. bicolor para M. scutellaris (conhecida popularmente como Uruu, nome indgena que significa abelha grande). Nesse estudo foram amplificados cinco. Resultados semelhantes foram obtidos por Brito et al. (2009) que desenvolveram primers microssatlites para T. angustula que foram transferveis para outras espcies de abelhas sem ferro como T. fiebrigi, T. weyrauchi, Lestrimelitta maracaia e Schwarziana quadripunctata. Nove locos microssatlites foram caracterizados em M. seminigra merrillae da
25 Amaznia Central os quais apresentaram transferabilidade para outras trs espcies de Melipona (Francini et al., 2009).
Quadro 6 Temperatura de anelamento para amplificao dos cinco locos microssatlites escolhidos para anlise de T. angustula e T. fiebrigi.
Loco Temperatura tima de anelamento T3-32 Touchdown Mbi 33 Touchdown Mbi 215 64C Mbi 254 55C Mbi 259 57.5C
O desenvolvimento de primers microssatlites para uma espcie de abelha sem ferro tem grande potencial para ser empregado em vrias espcies como tem demonstrado os estudos desenvolvidos com esse marcador molecular. O sucesso de amplificao declina de acordo com a distncia gentica entre os taxa (Primmer e Meril, 2000), ou seja, a proximidade filogentica o principal fator no sucesso da transferncia para uso de primers heterlogos. Porm, outros fatores como o tamanho e a complexidade do genoma e a localizao do microssatlite (se est em regio codificante ou no) tambm influenciam no processo de transferabilidade (Oliveira et al., 2006). Alm disso, a utilizao de primers heteroespecficos pode produzir alelos nulos, pois qualquer mutao que ocorra na sequncia de DNA complementar ao primer pode inibir ou impedir a ligao destes, levando a uma reduo ou perda completa do produto PCR (Callen et al., 1993). Esses fatores poderiam explicar a amplificao no satisfatria dos primers T7-5 e Mbi278, que apresentaram respectivamente monomorfismo e bandas inespecficas (Figura 6), o que no permitiu a definio dos locos microssatlites para anlise. A falta de compatibilidade no genoma para transferncia de microssatlites ocorreu no estudo realizado por Francisco et al. (2006) com o primer T7-5 com Plebeia remota, Partamona mulata e Partamona helleri.
26 A utilizao de primers heterlogos pode resultar em amplificaes de locos de sequncias com tamanho e/ou composio diferentes de bases entre as espcies (Brito et al., 2009).
Figura 6 Locos T7-5 e Mbi278, respectivamente exemplos de monomorfismo (A) e amplificao no satisfatria (B), a qual impediu a definio do loco
No quadro 7 pode ser observado que os cinco locos microssatlites analisados para T. angustula e T. fiebrigi, apresentaram nmero de alelos que variaram entre dois e quatro alelos, com tamanhos variando de 100pb a 500pb. O alelo que apresentou a menor frequncia foi o Mbi215-A de T. fiebrigi e o de maior frequncia foi o alelo Mbi33-A de T. angustula (Quadro 7). No estudo realizado por Paxton et al. (1999) foi identificado apenas um alelo para o loco T3-32 em T. nigra, enquanto em nosso estudo foram identificados quatro alelos para T. fiebrigi. Francisco et al. (2006) tambm encontraram um e dois alelos para o loco Mbi33 quando transferiram estes para uso em P. remota e Tetragona clavipes, respectivamente. O mesmo ocorreu com os locos Mbi215 e Mbi254, entretanto quando comparados os resultados para o locos Mbi259, este apresentou maior nmero de alelos (6) nas espcies estudadas por Francisco et al. (2006) do que para T. angustula (4). Nas abelhas M. scutellaris foram identificados 31 alelos no total, variando entre dois a 10 alelos por loco (Carvalho-Zilse et al., 2009). A B
27 Quadro 7 Tamanho e frequncia dos alelos (F) microssatlites de T. fiebrigi e T. angustula nas populaes dos estados de So Paulo e Paran. pb = pares de bases
T. fiebrigi T. angustula Loco Alelos (pb) F Alelos (pb) F T3-32 A 0,3000 A 0,1792 B 0,4000 B 0,5917 C 0,2000 C 0,2292 D 0,1000 Mbi33 A 0,8063 A 0,9792 B 0,1938 B 0,0208 Mbi215 A 0,0063 A 0,0125 B 0,0437 B 0,0667 C 0,1000 C 0,0875 D 0,8500 D 0,8333 Mbi254 A 0,0625 A 0,1833 B 0,4250 B 0,5833 C 0,4000 C 0,1375 D 0,1125 D 0,0958 Mbi259 A 0,4430 A 0,2689 B 0,1962 B 0,2521 C 0,3228 C 0,3782 D 0,0380 D 0,1008
Lopes (2008), empregando os primers Mbi215, Mbi254 e 1 em M. rufiventris e M. mondury, observou um menor nmero de alelos para estas espcies quando comparadas com M. bicolor. A anlise intrapopulacional de T. angustula permitiu verificar que o alelo Mbi259-A especfico da populao de Santa Cruz do Rio Pardo e que o alelo T3-32D foi detectado apenas em T. fiebrigi. Ser necessrio um estudo populacional mais abrangente com maior nmero de populaes, mas inicialmente podemos inferir que esses alelos podero ser utilizados como marcadores para identificao de populaes ou de espcie na localidade analisada. Os menores valores de heterozigosidade observados foram estimados para o loco Mbi33 de T. fiebrigi (0,0625) e T. angustula (0,0250) (Quadro 8). Os maiores valores foram observados no loco T3-32 para T. fiebrigi (0,2750) e Mbi215 para T. angustula (0,2333) (Quadro 8). Os valores de heterozigosidade
28 esperada maiores que os de heterozigosidade observada indicam que h falta de heterozigotos (Quadro 8), esses resultados foram confirmados com os valores de F IS (Quadro 9).
Quadro 8 Valores de heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He) obtidas com marcadores microssatlites para T. fiebrigi e T. angustula dos estados de So Paulo e Paran
Os valores positivos de F IS mostram que h excesso de homozigotos nas populaes analisadas (Quadro 9), somente o loco Mbi215 de T. fiebrigi apresentou F IS negativo, mas prximo zero (-0,0542). Nas duas espcies foi observado que as populaes analisadas esto moderadamente diferenciadas de acordo com os valores F ST mostrados no quadro 9. De acordo com Wright (1984) valores F ST entre 0,15 e 0,25 indicam populaes moderadamente diferenciadas. Nessa tabela pode ser observado tambm que no h fluxo gnico entre as populaes, pois foram obtidos pequenos valores de Nm. O maior valor de identidade gentica de acordo com Nei (1978) foi observado entre as populaes de T. angustula e T. fiebrigi de So Carlos (0,9906) (Quadro 10). Esses resultados tambm podem ser bem visualizados no dendrograma da anlise UPGMA Figura 8. A grande identidade gentica entre essas abelhas pode estar relacionada com a provvel hibridizao entre as duas espcies de jata nessa
29 localidade, pois nas anlises morfolgicas de operrias coletadas, foram observadas abelhas com mesepisterno marrom, amarelo e com as duas coloraes ao mesmo tempo (Figura 1). A hibridizao entre as duas espcies foi observada anteriormente por Castanheira e Contel (1995). Nesse estudo foi sugerida a ocorrncia de duas subespcies de Tetragonisca ao invs de duas espcies. Contudo, esse tipo de colorao no mesepisterno no foi observada nas demais populaes analisadas. Mesmo em Maring, onde encontramos as duas espcies, at o momento no foram observadas abelhas com colorao hbrida do mesepisterno.
Quadro 9 ndice de fixao (F IS ), grau de diferenciao (F ST ) e fluxo gnico (Nm) obtidos com marcadores microssatlites em T. fiebrigi e T. angustula dos estados de So Paulo e Paran
T. fiebrigi T. angustula Loco F IS F IT F ST Nm FI S F IT F ST Nm T3-32 0, 2733 0, 3977 0, 1712 1, 2103 0, 9347 0, 9516 0, 1389 1, 5493 Mbi33 0, 7230 0, 7736 0, 1827 1, 1182 0, 0123 0, 1036 0, 0924 2, 4545 Mbi215 -0, 0542 -0, 0061 0, 0456 5.2270 0, 2660 0, 3390 0, 0995 2, 2621 Mbi254 0, 6746 0, 7158 0, 1265 1.7256 0, 5602 0, 6211 0, 1384 1, 5560 Mbi259 0, 8766 0, 9297 0, 4303 0, 3310 0, 8526 0, 8923 0, 2692 0, 6788 Mdia 0, 5121 0, 6169 0, 2148 0, 9140 0,6 922 0, 7460 0, 1746 1, 1816
Os maiores valores de distncias genticas foram obtidos entre as populaes de T. fiebrigi de Maring e T. angustula de Dracena. Considerando essas duas localidades as duas espcies estariam totalmente isoladas. O agrupamento UPGMA mostrou que as duas espcies de Tetragonisca ainda no esto totalmente diferenciadas, pois houve agrupamento de T. fibebrigi e T. angustula das populaes de So Carlos, Maring e Dracena, bem como Santa Cruz do Rio Pardo e Maring (Figura 7). A populao de T. angustula de Dracena ficou mais prxima das populaes de So Carlos (T. angustula e T. fiebrigi) e Maring (T. angustula). A ocorrncia do alelo Mbi254-A nas populaes de T. angustula de Santa Cruz do Rio Pardo pode ter influenciado a sua separao das
30 populaes de T. angustula de Maring, So Carlos e Dracena, bem como de T. fiebrigi de So Carlos (Figura 7).
Quadro 10 Valores da identidade gentica (acima da diagonal) e distncia gentica (abaixo da diagonal) de Nei (1978) obtidos pelo programa Popgene 1.31 para as populaes de T. angustula (T.a) e T. fiebrigi (T.f) analisadas com marcadores microssatlites
O agrupamento de T. fiebrigi de Maring e T. angustula de Santa Cruz Do Rio Pardo (Figura 7) mostra que ser necessrio aumentar a amostragem para entender de forma mais completa a estruturao dessas populaes j que as duas espcies apresentaram baixos valores de distncia gentica (Quadro 10). Oliveira et al. (2004), utilizando marcadores RAPD, conseguiram separar T. angustula e T. fiebrigi em dois grupos. Estudo com o marcador RAPD desenvolvido por Baitala et al. (2006) demonstrou que a populaes de T. angustula e T. fiebrigi de Maring e Cianorte (PR) esto isoladas das populaes de Junqueirpolis (SP), devido ao valor G ST de 0,2568. Nessa pesquisa foram identificados seis marcadores RAPD que diferenciavam as populaes de jata, contudo no foram capazes de separar as espcies. Nesse estudo foi observado que as abelhas jata das duas localidades no esto diferenciadas, formando uma nica populao, apesar da distncia geogrfica entre elas. Em P. mulata e P. helleri a anlise microssatlite mostrou que as populaes dessas abelhas possuem baixo polimorfismo gentico e discreta
31 estruturao de populaes no relacionada com a distribuio geogrfica (Brito et al., 2009). Nesse estudo foi considerado ainda que essas caractersticas observadas poderiam estar relacionadas com a migrao de machos, degradao ambiental que ocasionou fragmentao ambiental, ou pela ocorrncia de alelos nulos decorrentes da utilizao de primers heteroespecficos.
Figura 7 Dendrograma baseado no complemento aritmtico da distncia gentica de Nei (1978), obtido por marcadores microssatlites. As populaes de T. fiebrigi e T. angustula foram agrupadas pelo mtodo UPGMA, utilizando o programa Popgene 1.31.
Nas populaes de T. fiebrigi e T. angusutla estudadas foi observado alto polimorfismo gentico, as populaes esto diferenciadas, mas com excesso de homozigotos. Os resultados obtidos com os dois gneros de Tetragonisca podem ser comparados com as consideraes feitas por Brito et al. (2009) para Partamona, pois as regies de coleta possuem degradao da mata original (atualmente so reas rurais ou urbanas), o que pode dificultar a migrao de machos, alm disso, os primers utilizados no presente estudo tambm so heterlogos o que pode ter ocasionado a ocorrncia de alelos nulos, subestimando a variabilidade gentica.
32 Na pesquisa realizada por Carvalho-Zilse et al. (2009) com M. scutellaris no nordeste brasileiro, foi verificada deficincia de heterozigotos. Nesse caso foi discutido que o excesso de homozigotos poderia ser decorrente de migrao no natural devido troca de abelhas entre meliponicultores dos estados de Pernanbuco e Alagoas. As abelhas jata sofrem forte influncia antrpica por serem de pequeno porte e fcil manejo, j que o ferro atrofiado; os ninhos podem ser levados para longas distncias e assim trocarem material gentico em regies que naturalmente no chegariam. Apesar do aparente isolamento de populaes como em Santa Cruz do Rio Pardo e Dracena, as T. fiebrigi e T. angustula provavelmente no esto totalmente isoladas reprodutivamente, pois as populaes de So Carlos mostraram fortes indcios de que houve cruzamento entre as duas espcies de jata. Assim, o desenvolvimento de primers heteroespecficos ou homoespecficos de grande importncia para o entendimento das relaes intra/inter populacionais e evolutivas dessas abelhas.
33 5. CONCLUSES a) O estabelecimento de primers microssatlites heteroespecficos para T. fiebrigi e T. angustula pode ser utilizado com bons resultados, pois foi observada ampla variabilidade gentica para os locos estudados; b) Os locos analisados no permitiram separar as duas espcies de Tetragonisca, sendo possvel apenas separar as populaes analisadas; c) As populaes analisadas esto diferenciadas, contudo foi detectado excesso de homozigotos que pode ser decorrncia de consanginidade entre os ninhos de cada localidade, ou da presena de alelos nulos devido utilizao de primers heterlogos; d) Os valores de distncia gentica e caractersticas morfolgicas indicam que houve hibridizao entre T. fiebrigi e T. angustula em So Carlos.
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