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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas


AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE ADN
Gonzlez Judd Pablo Miguel
Hernndez Acatitla Edwin Arturo
Grupo: 5QV1 Seccin: 1
Equipo: 5
Introduccin:
El desarrollo de la gentica como ciencia ha dado paso a otras ramas del conocimiento
que buscan aplicar las bases tericas dilucidadas por la gentica en cuestiones prcticas,
as a menos de 60 aos de propuesta la estructura fsica del ADN la biotecnologa y la
biologa molecular son realidades cercanas a nuestra vida cotidiana pues juegan cada vez
papeles ms grandes en temas centrales de la vida como la salud y la alimentacin, sin
embargo muchas de estas aplicaciones tecnolgicas requieren partir de ADN puro para
elaborar secuencias, para identificar y en su caso modificar genes entre muchas otras
aplicaciones, lo cual plantea una dificultad inicial en cualquier trabajo porque en la clula
el ADN no se encuentra libre, sino asociado a protenas y a ARN.
As y de manera paralela al desarrollo de estas aplicaciones tecnolgicas han aparecido
una gran cantidad de tcnicas para el aislamiento del ADN y no solo esto, sino que se han
ido adaptando las ya existentes para extraer ADN de distintas fuentes y con los mejores
resultados posibles, en general el aislamiento del ADN de las clulas y de otros
componentes celulares se puede dividir en cuatro etapas:
1) Interrupcin de las funciones celulares
2) Lisis celular
3) Desproteinizacin y remocin de otros componentes celulares
4) Recuperacin del ADN
Las cuales se logran con distintos tratamientos, entre los que conviene mencionar el
amplio uso que tienen las enzimas hoy da, para realizar varias de estas funciones, puesto
que tienen la ventaja de ser especficas, para la molcula, o tipo de molculas que se
desean retirar del medio de reaccin. Adicionalmente el hecho de que el ADN sea una
molcula muy tolerante a los cambios de pH permite usar procesos fisicoqumicos ms o
menos agresivos, como la desnaturalizacin de protenas para completar la eliminacin de
algunos componentes celulares.


Sin embargo, para obtener ADN de calidad que no se haya degradado durante el proceso
y que est libre de protenas es importante considerar ciertas precauciones generales,
adicionales a las buenas prcticas de laboratorio, tal y como son:
1. Usar en todo momento guantes, puesto que las nucleasas presentes en la piel y
otras impurezas podran degradar la muestra. Sin embargo, no es necesario
trabajar en condiciones de esterilidad puesto que a lo largo de la tcnica se usan
reactivos que destruirn a cualquier clula contaminante extrayendo tambin su
ADN, el cual en comparacin al extrado del cultivo origina, representar una nfima
proporcin.
2. Evitar contaminar o alterar los reactivos, lo cual se logra con un uso adecuado de
las micropipetas, con la preparacin y conservacin adecuada del material (ej.
mantener las enzimas usadas a temperaturas bajas).
3. Evitar movimientos bruscos o agitacin intensa, al igual que pipetear con
micropipeta soluciones donde se sepa o suponga hay ADN libre, puesto que las
fuerzas de friccin lo alteran rompindolo.
En el cuadro n 1, se resumen las principales operaciones desarrolladas durante la
prctica para el aislamiento de ADN, junto con un esbozo de su fundamento terico,
aunque recalcamos que la tcnica de aislamiento elegida depender de la fuente del ADN
y del propsito que se vaya a dar a este.
Cuadro. 1: Pasos de la tcnica de extraccin de ADN cromosmico, para un microorganismo Gram
negativo. Fundamentos tericos.
Reactivo u
operacin
Componente con
el que interacta
Fundamento terico Resultado
Centrifugacin del
cultivo
Clulas bacterianas
Permite separar por medio de la
fuerza centrfuga a las clulas del
medio de cultivo para concentrarlas
en un volumen menor y permitir el
posterior lavado
Paquete celular
compactado
Lavado con TE
(50mM/20mM)
Clulas bacterianas
Eliminar el medio de cultivo (1a
adicin de TE), lavando a las clulas,
para despus (2a adicin de TE y
resuspensin) proporcionar un medio
tamponado (pH constante) que
permita la accin de las enzimas a
utilizar.
Adicionalmente el EDTA secuentra
iones divalentes, que son requeridos
por muchas enzimas y en especial
por las nucleasas como cofactores, lo
que impide su accin sobre la
muestra.
Suspensin celular
en medio tamponado
RNAsa/Incubacin
Clulas
bacterianas/RNAsa
Las enzimas solo son funcionales en
un intervalo de temperatura, por lo
que la enzima, la cual se mantiene
refrigerada, se deja incubar, para
permitir que se active y realice
posteriormente su accin degradativa
sobre el RNA
Suspensin celular
RNAsa activa
Lisozima
SDS
Pared celular
Membrana celular
La lisozima interacta con la pared
celular hidrolizando el enlace B 1,4
entre los residuos de N-acetil
murmico y N-acetil-D-glucosamida,
lo que expone a la membrana, la cual
luego es degradada por el SDS que
por su naturaleza anfiptica
desestabiliza a los fosfolpidos de la
misma.
Simultneamente al liberarse el
contenido celular la RNAsa degrada el
RNA de la suspensin, dejando como
cido nucleico solo al ADN.
Suspensin de
componentes
celulares libres y sin
RNA
TE
NaCl 5 M
Suspensin de
componentes
celulares
La accin de la RNAasa y de los otros
reactivos utilizados puede o no
ejercer un efecto importante sobre el
pH del medio, por lo que se agregar
un exceso de regulador (a menor
concentracin, puesto que ya se
haba adicionado), para garantizar la
estabilidad del pH. Lo mismo ocurre
con el EDTA del regulador que
secuestrar a los iones divalentes de
la solucin, impidiendo la accin de
las nucleasas liberadas con la lisis
celular.
El cloruro de sodio por otra parte
garantiza la solubilidad del ADN, para
poderlo separar al realizar
extracciones con fenol.
Suspensin de
componentes
celulares libres,
tamponada y ADN
solubilizado
Fenol saturado/
extraccin
Protenas
Como cido orgnico fuerte y como
molcula polar muy estable, el fenol
interacta con las protenas
desnaturalizndolas.
De forma adicional en la fase
orgnica de la mezcla se desplazan
todos los componentes lipdicos de la
misma que son solo solubles en
compuestos orgnicos.
Solucin de ADN
libre de protenas y
restos celulares
Cloroformo-
alcohol isoamlico
Protenas
Este paso completa la remocin de
protenas, por la accin
desnaturalizante del cloroformo
Solucin libre de
protenas
(compuesto orgnico polar) y lava el
fenol utilizado en las extracciones,
Isopropanol ADN
Por su polaridad remueve las
azcares que pudieran quedar en
solucin y al modificar la constante
dielctrica de la solucin permite la
separacin del ADN, el cual al
centrifugarse se separa del seno de
la solucin.
ADN precipitado libre
Etanol 70% ADN
Resuspende al ADN y permite su
pufiricacin al evaporarse si se utiliza
en solucin, modifica la constante
dielctrica de la misma y permite
igualmente separar al ADN ya libre
de otros componentes.
ADN

Objetivos:
Aislar ADN cromosmico de peso molecular alto, a partir de un cultivo bacteriano.
Establecer el espectro de absorcin del ADN aislado.
Determinar la concentracin y grado de pureza del ADN obtenido.
Adicionalmente mediante el uso del programa DNAMAN se busc:
Construir diferentes secuencias de ADN.
Determinar para cada una de ellas, la temperatura media de desnaturalizacin.
Determinar para cada una de ellas la influencia de las caractersticas de la
secuencia en la desnaturalizacin del ADN.

Materiales y mtodos:
Confrntese el manual de laboratorio EXPERIMENTOS EN GENTICA MICROBIANA, para
vislumbrar el protocolo utilizado para la realizacin de la prctica el cual se sigui como se
cita, salvo, la acotacin puntualizada abajo.
Para la extraccin de ADN se sigui el apartado A, punto b. Cromosmico de un
microorganismos Gram negativo (ejemplo Escherichia coli) la nica modificacin a
introducida en el trabaja, se hizo en este apartado en el punto n 8, donde se
adicionaron, en lugar de proteinasa K, 50 L de lisozima.

Resultados:
Habiendo trabajado con la cepa W3350 de Escherichia coli, se aisl el ADN, segn el
protocolo indicado, el ADN seco fue re suspendido en 200L de agua estril, para medir
sus absorbancias por espectrofotometra de radiacin ultravioleta y con esos datos
calcular la pureza y al concentracin final de ADN, datos que se resumen en el cuadro 2.

Cuadro. 2: Absorbancia a distintas longitudes de onda, concentraciones y pureza del ADN obtenido
a partir de E. coli (Seccin 1, Gpo. 5QV1).
Concentracin de DNA g
Equipo A
260 nm
A
280 nm
Pureza Formula Relacin
1 0.1496 0.0848 1.76 6.64 7.48
2 0.095 0.028 3.39 4.22 4.75
3 0.1345 0.0843 1.59 5.97 6.72
4 0.822 0.384 1.94 36.5 41.1
5 0.1375 0.0753 1.82 6.11 6.87
Se denotan los resultados del equipo 5, donde se obtuvo una pureza de 1.82, la cual es apropiada para
trabajar, ntese adicionalmente la variacin que existe entre la concentracin de ADN calculada segn la
frmula y segn la relacin, que vara en un 10% aproximadamente.
Igualmente por espectrofotometra de radiacin ultravioleta se construy el espectro de
absorcin del ADN obtenido, haciendo un barrido de longitudes de onda desde los 220
hasta los 280 nm, en intervalos de 10 en 10 nm. Los resultados de este espectro de
absorcin se muestran en el cuadro 3 y en el grfico 1. Este espectro fue construido solo
por los equipos de trabajo 2 y 4, por lo que se muestran los resultados del equipo 4.
Cuadro. 3: Espectro de absorcin del ADN obtenido a partir de E. coli (Seccin 1, Gpo. 5QV1).
Longitud de onda Absorbancia
220 0.716
230 0.403
240 0.505
250 0.761
260 0.822
270 0.636
280 0.384


Grfico. 1: Espectro de absorcin del ADN obtenido a partir de E. coli (Seccin 1, Gpo. 5QV1).
Los resultados obtenidos haciendo uso del programa informtico DNAMAN se anexan tal y
como fueron arrojados por el mismo, al final de la prctica como anexo 1.
Discusin de resultados:
El trabajo realizo, puede evaluarse con respecto a dos parmetros, la pureza y la
concentracin del ADN en general, puede decirse que la tcnica siempre que sea
comprendida y por lo tanto aplicada al pie de la letra no presenta gran dificultad operativa
por lo que los errores que pudieras presentarse difcilmente pudieran achacarse al
operario, a menos claro que este no se hubiera familiarizado de antemano con la tcnica,
no la comprendiera o fuese en extremo descuidado.
Otros factores de variacin que pudieran introducirse en al tcnica sera la preparacin y
el manejo de los reactivos, como es el caso de las enzimas y su ya citada (cfr.
introduccin) termolabilidad, otro ejemplo notable de variaciones en este sentido, pudiera
introducirlo el SDS que no debe de almacenarse a bajas temperaturas por que en tales
condiciones precipita.
Los errores introducidos en las determinaciones por los instrumentos y equipos sera muy
difciles de detectar dado que las magnitudes de medida utilizadas escapan a la
percepcin humana, sin embargo, estos errores pudieras evitarse dado al equipo su
mantenimiento preventivo y cuidando al mximo las condiciones de trabajo, para usarlo
de la mejor manera.
Salvo las variaciones ya comentadas, en general el espectro obtenido, permite observar
que el ADN aislado tiene un alto grado de pureza, puesto que presenta un solo mximo de
absorbancia a 260nm, tal y como lo refiere la bibliografa, cuestin que adems se
complementa con el clculo terico de la pureza que al dar un valor de 1.82 indica que el
% de protenas existentes es muy bajo y permitira trabajar con la muestra como si fuera
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
220 230 240 250 260 270 280
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

Longitud de onda nm
ADN puro, puesto que este clculo no hace sino relacionar la cantidad de protenas con la
de ADN.
La cantidad de ADN aislada variar segn el clculo que se utilice para determinar dicho
valor, pues este se mide indirectamente por la absorbancia de la muestra a 260 nm, sin
embargo esta variacin no excede el 10% por lo que se puede decir que se aislaron entre
6.11 y 6.87 g de ADN.
Para la construccin de espectro se tom la muestra de mayor pureza, puesto que en alla
se esperaban menos interferencias, pero las conclusiones arrojadas por este espectro bien
son vlidas para nuestro equipo puesto que la pureza es similar. An as cabe hacerse
mencin de que para la construccin del espectro se tom la pureza ms alta, pero al
hacerse una segunda lectura con el mismo instrumento aparicin un segundo dato con
una pureza mayo cuestin que puede deberse al manejo del aparato que mostraba el
grfico de manera directa sin tomar individualmente las lecturas, an cuando con cada
cambio de longitud de onda debiera ajustarse la lectura a 0 con el blanco.
Finalmente y con respecto al uso del programa DNAMAN se encontr, tal y como lo
predice la bibliografa que a mayor % de G-C la Tm aumenta significativamente, cuestin
cierta, an para cambios en apariencia pequeos del % de G-C, toda variacin encontrada
aqu corresponder a la secuencia misma, obedeciendo en primer lugar al % de G-C y
despus a la longitud de la cadena, pues an para cadenas con secuencias diferentes pero
misma longitud y mismo % de G-C la Tm, permaneca en intervalos muy estrechos.
Como perspectivas de este trabajo sera interesante analizar computacionalmente
cadenas ms largas y experimentalmente probar distintas tcnicas de extraccin
comparndolas entre s a la hora de calcular rendimientos y pureza, para as proponer una
tcnica mejorada, para el trabajo rutinario en el laboratorio de gentica microbiana.
Conclusiones:
Se logr aislar ADN cromosmico de Escherichia coli, en cultivo.
Se logr construir el espectro de absorcin del ADN aislado encontrndose que
presenta un mximo de absorcin a 260 nm.
Se determin que se aislaron en total 6.11-6.87 g de ADN con una pureza de
1.82.
Mediante el uso del programa DNAMAN se construyeron 9 diferentes secuencias de
ADN a las cuales se les determin computacionalmente la temperatura media de
desnaturalizacin, encontrndose que esa aumenta conforme en la secuencia
aumenta la proporcin de G-C.

Referencias bibliogrficas:
1) Espinoza Lara A. et. Al. EXPERIMENTOS EN GENTICA MICROBIANA, IPN-ENCB, Mxico 2011.
2) Gonzlez de Buitrago TCNICAS Y MTODOS DE LABORATORIO CLNICO, 2 ed. Ed. Masson, 2005,
Espaa
3) Madigan M.T. et Al. BIOLOGA DE LOS MICROORGANISMOS. 12 edicin, Pearson, Mxico 2009.
4) Molina N. et. Al. COMPARACIN DE MTODOS DE LISIS Y EXTRACCIN DE ADN DE TROFOZOTOS DE
Giardia Lamblia. Parasitol Latinoam 61:133-137 2006, FLAP, en
http://www.scielo.cl/pdf/parasitol/v61n3-4/art06.pdf, sitio pblico en internet consultado el 24/VII/11
a las 23:55 hrs.
5) Sigma life sciences. MICROBIOLOGY MANUAL. Sigma-Aldrich corporation. 3
th
edition, 2009, U.S.A.
6) Tortora MICROBIOLOGY AN INTRODUCCIN. Ed. Benjamin Cummings, 9
th
edition, 2006, U.S.A.
7) http://www.uprm.edu/biology/profs/massol/manual/p4-dna.pdf sitio pblico en internet consultado el
25/VII/11 a las 00:12 hrs.
8) http://www.unicartagena.edu.co/librose/LABORATORIO%20N%C2%BA7%20AISLAMIENTO%20E%20I
DENTIFICACION%20DEL%20DNA.pdf sitio pblico en internet consultado el 1/IX/11 a las 23:55 hrs.
9) http://www.molecularstation.com/es/dna/genomic-dna-isolation/ sitio pblico en internet consultado
el 1/IX/11 a las 23:50 hrs.