COPROCULTIVO

1 . OBJETIVO

Identificar las posibles especies patgenas de microorganismos presentes en las vas
gastrointestinales (Heces) a travs del coprocultivo y de sus reacciones bioqumicas.
2. INTRODUCCIN
Se denomina coprocultivo a la siembra de una muestra adecuada de heces en medios de
cultivo apropiados para el desarrollo de bacterias entricas patgenas. Muestra adecuada
es aquella que ha sido recolectada durante el periodo agudo de la enfermedad, cuando es
ms fcil comprobar presencia de pus, moco o sangre, y antes de la administracin de
antimicrobianos.
3- FUNDAMENTO
La porcin inferior del intestino tiene una flora bacteriana normal excesivamente amplia.
Los microorganismos con mayor prevalencia son los anaerobios ( Bacteroides, bcilos
gram positivos, Estreptococos), microorganismos entricos gran negativos y Enterococcus
faecalis. Cualquier intento por aislar bacterias patgenas de las heces implica la
separacin de las especies patgenas, usualmente a travs del empleo de medios
selectivos diferenciales y de cultivos enriquecidos. Las principales causas de trastornos
gastrointestinales agudos incluyen a los virus, las toxinas (de: Estafilococos, Vibriones,
Escherichia coli ), bacilos entricos gran negativos invasores, los fermentadores lentos de
la lactosa, la Shigella, la Salmonella y la Campilobacterias. La importancia relativa de
estos grupos tiene grandes discrepancias en las distintas partes del mundo.
Las heces y los raspados rectales son los especimenes de que se dispone con mayor
facilidad. Debe anotarse, en el examen macrocpico la presencia de sangre, moco o
helmintos en la inspeccin inicial. Se suspenden los especmenes en un caldo selectivo
como el Caldo de Tetrationato y se cultivan sobre medios ordinarios as como en medios
selectivos diferenciales, por ejemplo Agar EMB, Agar McConkey, Agar S-S, para permitir
la separacin de los bacilos gran negativos que no fermentan la lactosa de otras bacterias
entricas comunes.
Los frotis teidos pueden revelar una prevalencia de leucocitos y de ciertos
microorganismos anormales como Cndida o estafilococos, pero no pueden utilizarse
para diferenciar las bacterias entricas patgenas de las de la flora normal, por lo que
deben realizarse otro tipo de pruebas para discriminar los tipos de bacterias presentes en
la muestra como son las pruebas bioqumicas.
4.MUESTRA:
Muestra: heces de adulto.

5. MATERIAL

Agua destilada
Gradilla
Tubos de ensayo
Asa de siembra desechable y normales
Hisopo
Papel de filtro
Pipetas de vidrio
Medios de cultivo
Pinzas metlicas
Alcohol
Algodn graso
Vaso de precipitado
Mechero Bunsen
Portaobjetos
Cubreobjetos
Microscopio
Cubeta de tincin
Pinzas de madera
Frasco lavador
6. REACTIVOS:

Medios de cultivo
Para facilitar el aislamiento de bacterias entricas patgenas se utilizan medios de
enriquecimiento y medios selectivos. Los ms empleados son los siguientes:
1.-Medios de enriquecimiento
Caldo con tetrationato (Mueller y Kauffmann). Este mtodo posee la propiedad de
inhibir o destruir el crecimiento de Salmonella y Shigella. Contiene, entre otros, tiosulfato
de sodio, sales biliares y yodo, el cul acta sobre el medio para determinados gneros,
en especial Salmonella; de aqu su uso como paso previo a la siembra en placas de
medios selectivos.
Caldo con selenito (Leifson). Posee selenito, cido de sodio que inhibe parcialmente al
grupo coliforme durante las primeras horas de cultivo (12 a 24 horas), y permite el rpido
desarrollo de salmonelas y shigellas.
Selenito sdico 4 g
Peptona 5 g
Manitol 4 g
Fosfato disdico anhidro (Na2HPO4 ) 10 g
Agua destilada 1000 ml
2. Medios selectivos
Agar SS (salmonella-shigella). Este medio selectivo, empleado para aislar Salmonella y
Shigella ejerce una buena inhibicin sobre agentes coliformes, sin limitar el desarrollo de
los patgenos gramnegativos. Se utiliza especialmente junto al agar-sulfito de bismuto,
para siembra de materiales provenientes de medios enriquecedores, como caldo
tetrationato y caldo con selenito. Contiene sales biliares, lactosa, citrato y tiosulfato
sdico, citrato frrico, verde brillante y rojo neutro como indicador. Shigella y Salmonella,
como tambin otros agentes que no fermentan la lactosa, aparecen como colonias lisas,
transparentes a opacas; las pocas colonias fermentadoras de la lactosa que se pueden
desarrollar tienen color rojo y un centro negro. Conviene sealar que la bilis o las sales
biliares inhiben el crecimiento de microorganismos grampositivos y esporulados sin
interferir en el crecimiento de los bacilos gramnegativos.
Agar MacConkey. Es un medio selectivo-diferencial que contiene sales biliares, las
cuales inhiben la flora grampositiva. Los agentes del grupo coliforme dan colonias de color
rojo, debido a que fermentan la lactosa. En cambio, Salmonella y Shigella sp. forman
colonias incoloras.
Agar XLD (Xilosa-Lisina-Desoxicolato). Medio indefinido, mixto, slido y diferencial. En
l crecern microorganismos quimiohetertrofos formadores de sulfhdrico a partir de
sulfato. En la receta aparece rojo fenol, en el cual acta el indicador de pH.
Se pueden presentar tres tipos de anomalas intestinales:
Infeccin intestinal .-Debida a la produccin de cambios ecolgicos por la accin
directa del microorganismo.
Intoxicacin alimentaria .-Producida indirectamente por el microorganismo a travs de
la produccin de toxinas, antes de la ingestin por la persona.
Toxiinfecin alimentaria .-Producida por el microorganismo a travs de la produccin
de toxinas, despus de su ingestin por la persona.
Se debe tomar en cuenta la biota presente en condiciones normales. As:
Lactantes (alimentacin materna).
Altos niveles de Bifidobacterium
Bajos niveles de E.coli y Enterobacterias
Lactantes (alimentacin artificial)
Altos niveles de grampositivos
Bajos niveles de Bifidobacterium
Nios y adultos
Predominancia de Anaerobios
Anaerobios Facultativos y Aerobios:
% E.coli " 80%
% Enterococos " 14%
% Staphylococcus y Streptococcus " 4%
% Otros " 2%
" Dieta rica en protenas: predominancia de biota Grampositiva.
" Dieta rica en hidratos de carbono: predominio de Gramnegativa.
7.-REALIZACIN DE PRUEBAS BIOQUMICAS

Prueba KIA
Sembramos en picadura dos tubos con el medio KIA e incubamos a 37C durante 18-24
horas. Observar. Con la prueba bioqumica del KIA hemos detectado la capacidad que
tienen las enterobactericeas para metabolizar o no la glucosa y/o lactosa, produccin de
gas y de cido sulfhdrico.

B-GALACTOSIDASA
Nos indica si la bacteria en su metabolismo fermenta la lactosa. Esta prueba la
realizaremos preparando una suspensin densa del microorganismo en un tubo

donde aadiremos una gota de tolueno y mezclaremos para despus aadir el disco de
ONPG. Incubaremos a 37C y leemos antes de 24h el resultado.

OXIDASA
Esta prueba nos indica si el microorganismo contiene la enzima citocromo oxidasa
descartando que fuera un microorganismo anaerobio estricto pudiendo ser aerobio o
anaerobio facultativo. Se procede a impregnar una tira reactiva con una muestra de la
colonia crecida en la placa de Agar Sangre y observar la reaccin que produce cambiando
de color.

CATALASA
Para esta prueba se toma una colonia del microorganismo joven y se coloca sobre un
portaobjetos donde aadiremos una gota de perxido de hidrgeno observando si
produce o no burbujas.

UREASA
Esta prueba se realiza sembrando el microorganismo en medio Christensen en tubo
inclinado por la superficie en zigzag. El resultado se observa despus de una incubacin a
37C con un cambio de color del indicador.
8. PROCEDIMIENTO
El procedimiento fue el siguiente:
1. Recogida de la muestra
Preparacin o indicaciones del paciente:

Se debe seguir con el rgimen habitual de comidas.

a. para nios/as
Para bebs y nios pequeos que usan paales:
Se puede cubrir el paal con un envoltorio plstico. Si se coloca correctamente el
envoltorio plstico, separando las heces de la orina, se puede evitar que stas se mezclen
con el fin de obtener una muestra mejor.

b. para adultos

Hay muchas maneras de recolectar las muestras. Se pueden recoger las heces con la
ayuda de un envoltorio plstico que se coloca suelto sobre el inodoro y se sostiene en su
lugar con el asiento. Luego se coloca la muestra en un recipiente limpio. El equipo para
recoleccin de la muestra trae una gasa especial que se usa para recogerla y luego se
coloca la muestra en un recipiente limpio.


B. Condiciones para la toma de muestras
Heces que no tengan ms de media hora de obtenidas, o muestras tomadas directamente
del recto con un hisopo de algodn. Cuando las siembras no se pueden efectuar de
inmediato o la muestra demora en llegar al laboratorio, se aconseja emulsionar
aproximadamente 1g de heces en 1 ml de un lquido conservador, o bien, depositar en
ste el hisopo rectal.

Muestra de heces de 12 o 24 hrs.
Se recogern las heces en un frasco limpio con cierre hermtico, no es necesaria la
esterilidad. El anlisis se har en las 12 horas siguientes a la deposicin, guardando la
muestra en el frigorfico a 4-10 C. Si el anlisis se pospone ms de 24 horas se aadir
un volumen igual al de las heces de una solucin acuosa al 5% de formol comercial.

C. Procesamiento de la muestra una vez llega al laboratorio.

- Evitar contaminacin por material no estril.
- Uso de contenedores y medios de transporte apropiados.
- Etiquetar muestra adecuadamente.
- Temperatura de conservacin: 4C para evitar la proliferacin bacteriana.

2. Examen macroscpico de la muestra
Se comprueba su olor, consistencia, presencia de mucus, sangre, restos de alimentos sin
digerir.

3. Realizacin de medios de cultivo y siembra

1. Medios de cultivo utilizados y su utilidad.

Medios



Aislamiento

Agar Mac
Conkey







aislamiento de bacilos Gram negativos, aerobios
y anaerobios facultativos. diferencia bacterias
que utilizan o no, lactosa.

Agar entrico
Hektoen







Medio diferencial para aislamiento y
diferenciacin de gram-negativos entricos
(Salmonella y
Shigella spp)
Pruebas
bioqumicas


Agar
Christensen









diferenciar microorganismos en base a la
actividad uresica. Identificar bacterias que
hidrolizan urea, tales como Proteus spp., otras
enterobacterias y estafilococos.


KIA









determinar si un
Microorganismo es capaz de utilizar la lactosa,
produce gas o cido sulfhdrico.

Para la realizacin del medio Christensen, le aadimos 50ml al medio con la tcnica de
barry, para realizar la prueba de la ureasa.

6. Siembra e inoculacin de placas
Se procede a realizar la siembra, en estra mltiple, con la ayuda de un asa de siembra,
tomando una pequea cantidad de incculo de las heces, previamente diluido en suero,
teniendo en cuenta de trabajar en condiciones lo ms aspticas posibles. Se tapa la placa
y se mete en la estufa en un periodo de 24-48 horas.

1. Examen morfolgico del crecimiento de las colonias cultivadas
macroscpicamente y al microscopio.

Las caractersticas fsicas de las colonias son de gran ayuda en la identificacin. Cada
microorganismo crece de manera diferente formando colonias de distinto color, forma,
tamao, textura, olor, brillo, etc. Existen colonias ms o menos elevadas, con bordes
enteros, estrellados, deflecados, y un largo etc. El tiempo de incubacin necesario para
que aparezcan las colonias tambin puede tener valor en la identificacin. Las
caractersticas de las colonias tampoco ofrecen un diagnstico por si solas, pero dirigen
los esfuerzos hacia un grupo ms o menos amplio de microorganismos.

Hay colonias muy caractersticas, casi exclusivas de determinadas bacterias. Es el caso
de las especies de Proteus, que se extiende ampliamente por la placa formando un velo
muy caracterstico.
9. RESULTADOS
Examen macroscpico
color
olor
consistencia
restos de alimentos
ausencia o presencia de sangre
ausencia o presencia de mucus
Examen microscpico
B.1 Placa XLD: heces
Medio indefinido, mixto, slido y diferencial. En l crecern microorganismos
quimiohetertrofos formadores de sulfhdrico a partir de sulfato. En la receta aparece rojo
fenol, en el cual acta el indicador de pH.
Resultados ! Medio muy virado a rosa. Colonias negras.
B.2 Placa SS: heces
Este medio selectivo, empleado para aislar Salmonella y Shigella ejerce una buena
inhibicin sobre agentes coliformes, sin limitar el desarrollo de los patgenos
gramnegativos. Shigella y Salmonella, como tambin otros agentes que no fermentan la
lactosa, aparecen como colonias lisas, transparentes a opacas; las pocas colonias
fermentadoras de la lactosa que se pueden desarrollar tienen color rojo y un centro negro.
Resultados ! aparecen colonias transparentes o lisas con un punto negro por lo que son
lactosa negativa.
B.3 Placa XLD: E.coli
Resultados ! aparecen colonias incoloras negras, por lo que son lactosa negativa y
sulfhdrico positiva
B.4 Placa SS: E.coli
Resultados ! La mayora de las colonias estn muy aisladas y se ha formado sulfhdrico.
Aparecen de color negro con un halo blanco alrededor. Son lactosa negativa porque si
fuera lactosa positiva hubiera aparecido una tonalidad ms rosada. Prcticamente no hay
E.coli, es un medio muy selectivo, por lo que para coprocultivo se utiliza casi siempre
medio SS.
B.5 Placa MacConkey
Es un medio selectivo-diferencial que contiene sales biliares, las cuales inhiben la flora
grampositiva. Los agentes del grupo coliforme dan colonias de color rojo, debido a que
fermentan la lactosa. En cambio, Salmonella y Shigella sp. forman colonias incoloras.
Resultados ! Aparecen colonias incoloras por lo que son microorganismos lactosa
negativa. Podemos sospechar que se trata de Salmonella.

10. BIBLIOGRAFIA:
www.google.com
-http://html.rincondelvago.com/coprocultivo.html
-http://procedimientosmicrobiologicos.wikispaces.com/COPROCULTIVO