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Mara Leticia Cruz Blas Laboratorio de Micologa

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PRCTICA No. 6
MICROCULTIVO

Objetivo general:

Que el alumno aprenda a realizar microcultivos, y los sepa emplear en la
diferenciacin de los hongos.

Fundamento.

El microcultivo permite la observacin de las estructuras microscpicas de
los hongos filamentosos, en particular las esporas asexuales, sin alteracin de
las mismas.

Esta tcnica resulta sumamente til para aquellos hongos en los que es
difcil observar la formacin de los conidios sobre los conidiforos y la forma y
estructura de stos; porque, al efectuar el preparado correspondiente, se
desprenden y/o se rompen. Mediante este mtodo se puede observar bajo el
microscopio, su crecimiento y esporulacin en todos sus detalles y as tener
elementos morfolgicos de estructuras somticas y reproductivas completas
para as poder hacer la identificacin con mayor confiabilidad y conocer a los
hongos como agentes causales de enfermedades.


Generalidades.

Las micosis son las enfermedades causadas por distintas especies de
hongos. Estas afecciones pueden ser superficiales y profundas.

Las micosis o dermatomicosis son procesos infectocontagiosos producidos
por distintos agentes micticos que fundamentalmente invaden piel y/o sus
anexos. No tienen carcter maligno y, en la mayora de los casos, solo afecta la
esttica.
Por lo general no hay repercusin sistmica y las lesiones aparecen como
procesos inflamatorios superficiales ante los cuales el organismo puede
responder, entre otras maneras, con la formacin de anticuerpos reagnicos o
clulas especficamente sensibilizadas, revelables mediante reacciones de
hipersensibilidad cutnea. Generalmente no se evidencian anticuerpos fijadores
de complemento ni precipitinas o aglutininas. El grado de inflamacin va desde
una reaccin nula, como en el caso de la pitiriasis versicolor, hasta reacciones
graves como el querion.
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Las micosis profundas pueden localizarse en dermis, msculos, huesos,
pulmones, hgado, cerebro, mucosas, etc. Se observan lesiones inflamatorias y
destructivas con la consiguiente difusin de los parsito a travs del sistema
hemtico o linftico o por continuidad. En este caso el organismo infectado
responde a la agresin originando anticuerpos especficos, fijadores del
complemento, precipitinas, aglutininas, etc.
La mayora de las micosis profundas revisten de tal gravedad que en
muchos casos llevan al paciente a la muerte.

CLASIFICACIN DE LOS EUMYCETES
Diferentes autores han trabajado arduamente tratando de ordenar
sistemticamente las distintas especies de hongos. A continuacin se transcribir
una clasificacin tentativa del ordenamiento lgico de los hongos.
CLASES SUBCLASES RDENES GNEROS

Phycomicetes

Archimycetes

Chytridiales

Chytridium
Micelio continuo.
Los unicelulares no se
reproducen por
brotacin.
Esporos asexuados en
esporangios.

Oomycetes

Peronosporales

Peronospora

Zigomycetes

Mucorales

Mucor


Ascomycetes

Hemiascomycetes

Endomycetales

Saccharomyces
Micelio tabicado.
Los unicelulares se
reproducen por
brotacin o
esquizogonia.
Esporos sexuados
internos en ascos.

Euascomycetes

Eurotiales

Aspergillus

Basidiomycetes

Heterobasidiomycetes

Ustilanginales

Ustilago
(carbn)
Micelio tabicado.
Esporos sexuados
externos sobre
bsides.

Homobasidiomycetes

Agaricales

Agaricus
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DEUTEROMYCETES Mycelia fructignea Moniliales Fusarium
Micelio tabicado.
Los unicelulares se
reproducen por
brotacin o
esquizogonia.
No se conoce
reproduccin sexuada.

Mycelia sterilia

Mycelia sterilia

Sclerotium

TERMINOLOGA DE LAS MICOSIS
La denominacin de las micosis vara segn el criterio adoptado para
clasificarlas: localizacin del proceso, hongo que se asla de la lesin y la
designacin que utiliza la literatura mdica.

De acuerdo con la localizacin del proceso, la enfermedad mictica puede
denominarse: dermatomicosis, micosis pulmonares o neumomicosis,
onicomicosis, otomicosis, etc.

De acuerdo al nombre del hongo responsable de la lesin se denomina:
aspergilosis, tricofitosis, coccidioidomicosis, candidiasis, etc., cuando los
agentes son Aspergillus, Trichophyton, Coccidioides y Candidas,
respetivamente.

En el caso de la terminologa mdica se emplean las siguientes
denominaciones: tias, pie de atleta, querion, piedras, etc.

MICROCULTIVOS

Se realizan para estudiar los detalles de la estructura de los hongos que
debido a las observaciones comunes se destrozan y desaparecen por accin de
los ganchos y de las agujas.

Material y reactivos.

Colonia de hongos
Asa de platino
Mechero bunsen
Porta y cubreobjetos
Caja Petri de vidrio
Tubo de vidrio o capilares
Gasa
Pinzas
Agua esterilizada
Microscopio
Bistur estril


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Tcnica.

1. Se esteriliza el material a ocupar, (caja Petri de vidrio, portaobjetos,
cubreobjetos, capilares o tubo de vidrio, agua destilada y el medio de
cultivo).
2. Se prepara la caja Petri con gasa un poco humedecida con agua
esterilizada y se coloca en el interior de la caja.
3. Se colocan dos tubos capilares o un tubo de vidrio doblado encima de la
gasa para que sirva de sostn al portaobjetos.
4. Se corta una seccin de un medio de cultivo agar Sabouraud ya
coagulado, ya sea un crculo o un rectngulo con el bistur y se coloca
sobre el portaobjetos dentro de la caja, con pinzas previamente
flameadas.
5. Se flamea el asa bacteriolgica y se toma una muestra del hongo o
cultivo del hongo en estudio y se siembra sobre el trozo de agar
Sabouraud y tambin en los costados del mismo.
6. Se coloca el cubreobjetos con una pinza previamente flameada, sobre la
superficie del agar.
7. Cerrar la caja Petri y sellar la circunferencia con papel parafil o
masking.
8. Se incuba de 25- 28C por 7 das.
9. Una vez desarrollado el hongo, se saca el cubreobjetos que lleva adherido
el crecimiento fngico y se coloca sobre un portaobjeto limpio con una
gota de colorante Gueguen o Lactofenol y se deja unos segundos a que
acte el colorante.
10. Se saca el trozo de agar Sabouraud con una pinza colocando luego una
gota de colorante y un cubreobjetos nuevo, obteniendo as dos preparaciones
listas para estudiar.
11. Observar a 40x.










d
b
c
c
a
a) Portaobjetos.
b) Cubreobjetos.
c) Zonas de siembra.
d) Medio de cultivo.

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Lmina anterior:
Tcnica de microcultivo.
A. Uso de tubo de prueba estril para obtener bloques de agar para la tcnica
de microcultivo.
B. Preparacin de una cmara hmeda estril usando una placa de Petri que
contiene agar simple al 2% sobre un portaobjetos estril.
C. Mtodo alternativo de preparar un microcultivo. Se colocan discos de papel
filtro en el fondo de la caja Petri y el portaobjetos se apoya en varillas de
vidrio. Los discos de papel filtro se mantienen hmedos con agua estril
durante el periodo de incubacin.
D. Colocacin del bloque de agar en la preparacin de un microcultivo.
Obsrvese que se han inoculado pequeas porciones del cultivo con un
gancho en cuatro cuadrantes del bloque de agar.
E. Inoculacin de la superficie de un bloque de agar en la preparacin de un
microcultivo. Obsrvese que se han inoculado pequeas porciones del cultivo
con un gancho en cuatro cuadrantes del bloque de agar.
F. Colocacin de un portaobjetos estril sobre la superficie del bloque de agar
inoculando antes de la incubacin.
G. Aspecto de un microcultivo tpico luego del periodo de incubacin apropiado.
Obsrvese el crecimiento micelial por debajo de la superficie de los
cubreobjetos.
H. Colocacin del cubreobjetos recogido del bloque de agar microcultivado en un
agota de lactofenol-azul de anilina en un portaobjetos para examen
microscpico.










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Observaciones.








La imagen muestra el microcultivo realizado,
observando de manera macroscpica el
crecimiento de una colonia de hongos, donde
se aprecia que dicha colonia creci tanto en
las orillas como en el centro, siendo esta de
color amarillo claro con naranja.
Observacin microscpica:

Medio de cultivo: Agar Sabouraud
Color: marillo
Aspecto: gelatinoso
Consistencia: blanda
Estructura: micelios con un conidiforo y
filides. Aspergillus flavus.
Visto a: 40x


Observacin microscpica:

Medio de cultivo: Agar Sabouraud
Color: amarillo claro
Aspecto:gelatinoso
Consistencia: blanda
Estructura: micelios y un conidio con
flides puede tratarse de Aspergillus flavus,
Teido: con azul de metileno
Visto a: 40x

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Conclusin.
Con esta prctica se aprendi a realizar el microcultivo, sta es una de las
mejores tcnicas a elegir en el aislamiento e identificacin de hongos patgenos
para el hombre, ya que nos permite una mejor visualizacin del crecimiento
macroscpico y microscpico, puesto que el mtodo con la preparacin
elaborada para ello se observa al microscopio ya estando montada en el
cubreobjetos y con esto se evita que se daen las estructuras como sucede
cuando se prepara la muestra a partir de una colonia asilada en caja.


Bibliografa.

Micologa Prcticas de Laboratorio, Koneman Roberts; Edit. Mdica
Panamericana.
Diagnstico Micolgico, Amadeo D Alessandro; Edit. Panamericana.
Microbiologa Clnica. Prats, Guillem; Edit. Mdica Panamericana. (2005).
Espaa.