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UNIVERSITE DE LIMOGES

Ecole Doctorale Gay Lussac, Sciences pour lEnvironnement



Facult des Sciences et Techniques

Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles

THESE
Pour lobtention du grade de
Docteur de lUniversit de Limoges
2009 n 22

Discipline : Chimie applique Chimie des Substances Naturelles

Prsente par

Aline BARBAT

Soutenue le 8 juillet 2009


EXTRACTION, CARACTERISATION CHIMIQUE ET
VALORISATION BIOLOGIQUE DE GLUCURONOXYLANES DE BOIS
DE CHATAIGNIER.

DEVELOPPEMENT DE NOUVEAUX PROCEDES DE
DELIGNIFICATION.

Directeurs de Thse : M. Vincent Gloaguen et M. Pierre Krausz,

Rapporteurs : M. Henri Morvan, Professeur, Universit dArtois
M. Bernard De Jso, Professeur, Universit de
Bordeaux
Examinateurs : M. Andr Ambls, Professeur, Universit de Poitiers
M. Carlos Vaca-Garcia, Professeur, INP de Toulouse
M. Vincent Gloaguen, Matre de Confrences-HDR,
Universit de Limoges
M. Pierre Krausz, Professeur, Universit de Limoges
Invit : M. Jacques Christen, Professeur Associ, Directeur de
lAgence de Valorisation de la Recherche Universitaire
en Limousin









UNIVERSITE DE LIMOGES

Ecole Doctorale Gay Lussac, Sciences pour lEnvironnement

Facult des Sciences et Techniques

Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles

THESE
Pour lobtention du grade de
Docteur de lUniversit de Limoges
2009 n 22

Discipline : Chimie applique Chimie des Substances Naturelles

Prsente par

Aline BARBAT

Soutenue le 8 juillet 2009


EXTRACTION, CARACTERISATION CHIMIQUE ET
VALORISATION BIOLOGIQUE DE GLUCURONOXYLANES DE BOIS
DE CHATAIGNIER.

DEVELOPPEMENT DE NOUVEAUX PROCEDES DE
DELIGNIFICATION.


Directeurs de Thse : M. Vincent Gloaguen et M. Pierre Krausz

Rapporteurs : M. Henri Morvan, Professeur, Universit dArtois
M. Bernard De Jso, Professeur, Universit de
Bordeaux
Examinateurs : M. Andr Ambls, Professeur, Universit de Poitiers
M. Carlos Vaca-Garcia, Professeur, INP de Toulouse
M. Vincent Gloaguen, Matre de Confrences-HDR,
Universit de Limoges
M. Pierre Krausz, Professeur, Universit de Limoges
Invit : M. Jacques Christen, Professeur Associ, Directeur de
lAgence de Valorisation de la Recherche Universitaire
en Limousin




Remerciements

Je remercie tout dabord le directeur du Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles Monsieur
Pierre Krausz, pour my avoir accueillie. Je vous remercie galement pour votre rigueur et pour votre
exigence en termes de rdacton notamment et qui ont permis indniablement damliorer la qualit de ce
travail.

Je tiens remercier trs chaleureusement Vincent Gloaguen qui ma encadre sur ce sujet
depuis le Master Recherche. Je vous remercie de mavoir fait confiance, de mavoir permis de faire
voluer ce sujet mais aussi pour lautonomie que vous mavez accorde et pour votre rigueur
scientifique. Merci aussi de mavoir rassur quand il le fallait et davoir fait profiter de vos
connaissances en biologie vgtale et en phytochimie. Durant ces quatre annes, jai pu apprcier
vos nombreuses qualits humaines ainsi que votre optimisme toute preuve.

Jadresse galement tous mes remerciements Monsieur Bernard De Jso, Professeur
lUniversit de Bordeaux et Monsieur Henri Morvan, Professeur lUniversit dArtois, qui ont
accept dtre rapporteurs de ce travail, Monsieur Andr Ambls, Professeur lUniversit de
Poitiers, qui a prsid ce jury et Monsieur Carlos Vaca Garcia, Professeur lINP de Toulouse qui
a accept dtre examinateur de cette thse.

Je remercie aussi Monsieur Jacques Christen pour son encadrement lors du nouveau chapitre
de thse ainsi que pour ses prcieux conseils concernant mon projet professionnel.

Je remercie Vincent Sol de mavoir suivi et davoir accept de minitier la synthse des
porphyrines. Merci pour votre gentillesse et votre disponibilit.

Jadresse mes plus sincres remerciements au Professeur Rachida Zerrouki pour sa rigueur,
sa disponibilit, ses conseils toujours pertinents et sa bonne humeur (contagieuse).

Merci aussi aux biologistes du laboratoire (Cline, Galle S, Sabine, Guy, Caroline, Philippe
et Galle B.) pour votre aide et pour avoir pris du temps pour rpondre mes questions.

Monsieur Granet, je vous remercie pour votre aide lors de la synthse des phtalocyanines et
pour mavoir fait profiter de votre grande culture scientifique.

Je tiens remercier le Professeur Michel Guilloton pour son esprit critique et pour tout le
temps consacr la rdaction et la correction de mes articles.

Je voudrais remercier David Ropartz et Hlne Rogniaux de la plateforme Biopolymres-
Intractions-Biologie Structurale de lINRA de Nantes pour les analyses de spectromtrie de masse
MALDI. Merci aussi Odile Sainte-Catheine et Michel Kraemer du Laboratoire dOncologie
Molculaire et Cellulaire de lUniversit de Paris XIII pour les tests dactivit biologique.
Mes remerciements galement Yves Champavier pour la ralisation de mes spectres RMN
et Sandra Alves pour les spectres de masse de mes macrocycles ttrapyrroliques.

Je te remercie aussi Vincent Chaleix pour ton aide, notamment pour la RMN. Merci toi
Charlotte pour lintrt que tu as port ce travail et pour tes remarques perspicaces le concernant.

Merci Michle Constantin pour stre occupe des commandes. Un grand merci Karine
Clris pour ton aide trs prcieuse lors de la mise en place et du bon droulement des TP (ah que la
cafine ne fut pas toujours si facile que a extraire et doser !!! mais au final que de bons
souvenirs !!!) et merci pour ta bonne humeur et ta jovialit. Merci aussi vous deux pour
lorganisation parfaite des barbecues et autres repas de Nol du laboratoire.

Je remercie tous les doctorants du LCSN (Gal, Florian, Yannick, Virginie (ah tes playlists
sont toujours aussi cultes et aussi demandes lors des repas du labo !), Marc, Franois, Cris,
Nicolas, Julien, Matthieu, Nama et tous ceux que jai pu oublier pour tous les bons moments
passs avec eux et pour leur contribution la bonne ambiance qui rgne dans ce labo. Je remercie
aussi les diffrents stagiaires qui ont de prs ou de loin contribu ce travail. Un merci paticulier
Karine Teste pour mavoir si gentiment aid sur la partie proprits biologiques mais aussi Carmen
pour les nombreuses discussions constructives que lon a eues quelles soient scientifiques (sur les
phtalocyanines et les polysaccharides) ou non dailleurs. Je te souhaite bon courage pour la fin de ta
thse. Je te remercie aussi Cyril pour ton aide sur les porphyrines, pour les bons moments passs
Lisbonne pour le congrs. Romain, merci pour ton aide, ton soutien et ta disponibilit au long des
ces quatre annes; sache quon apprcie aussi tes jeux de mots, ta bonne humeur et ton sens de la
rpartie (mme si ce nest pas toujours ce quon ta dit !).
Je tiens remercier plus particulirement mes collgues du Batiment de Biologie qui mont
support au quotidien. Merci toi Raphal pour ton soutien et pour tre rest disponible pour mes
questions de biologie vgtale, je te souhaite bon courage pour cette fin de thse. Merci Fred pour
ton soutien, ton professionnalisme mais aussi pour tes nombreuses facties qui ont gay mon
quotidien. Je remercie aussi Mr Delpek , Loc (merci pour tous les services informatiques que tu
mas rendus), et Cdric (Mr Tartuffe ) pour leur aide mais aussi pour leur bonne humeur. Je
remercie galement Stphanie pour avoir partag ces trois annes avec moi ; merci de mavoir initi
la science du bricolage (vidange des pompes, changement de fusibles, dmontage des syphons) et
qui aucune panne ne rsiste! Merci aussi pour tous les conseils donns, pour les nombreuses
discussions que nous avons eues et pour tous les bons moments passs dans et en dehors du labo.
Merci galement Muriel pour ton aide prcieuse lors de ces derniers mois. Merci vous tous pour
avoir pass tous ces moments avec moi.

Ma petite Priscilla, je ne toublie pas non plus dans mes remerciements ! Quil est long le
chemin parcouru depuis la prpa o lon sest connu et depuis le Deug o lon s tait dit que a
pourrait tre sympa de faire une thse !!! Merci pour ton amiti et ton soutien dans tous les
moments (bons comme moins bons) et merci aussi pour cette anne riche en motions sur un plan
plus personnel. Enfin bon courage pour ces derniers mois de labeurs avant la conscration !!!
Merci aussi toi Paul pour tous les agrables moments passs depuis la licence (et les
nombreuses parties de belote que tas perdues, souviens-toi !). Bon courage toi aussi pour la
rdaction de ta thse.

Je remercie le Conseil Rgional du Limousin pour le financement de ces trois annes de thse
sur le programme du Fond Social Europen, ce qui ma permis de travailler dans des conditions
optimales.

Je tiens remercier aussi mes amis denfance et de lyce (Audrey, Aurlie, Emmanuelle,
Cline, Elose, Manue, Fred, Seb, Virginie, Emilie) pour leur intrt port ce travail. Merci
pour votre amiti. Merci aussi mes amis du foot pour tous les excellents moments passs aux
abords et en dehors des terrains. Merci tous pour votre convivialit.

Enfin, je remercie mes proches. Merci mes parents sans qui tout cela naurait t possible.
Merci de mavoir permis daller aussi loin dans mes tudes et de mavoir soutenu et support tout au
long de ces annes. Merci aussi ma sur Clmence et PJ. Je noublie pas non plus le reste de la
famille : mamie, tontons, tatas, cousins, cousines et ma belle-famille ; merci pour votre soutien et
votre affection.

Merci Herv, pour avoir partag tous ces moments avec moi, pour mavoir rconfort mais
aussi pour ton soutien de tous les instants.





Liste des Tableaux
Liste des Figures
Abrviations
INTRODUCTION GENERALE..1
Premire partie : La paroi cellulaire vgtale, les polysaccharides, la lignine -
Etat de la question..........4
I.1. La paroi cellulaire vgtale ...................................................................................... 7
I.1.1. Les principaux constituants ......................................................................................... 8
I.1.2. La paroi secondaire des cellules de bois .................................................................... 14
I.2. Les xylanes du bois ................................................................................................ 23
I.2.1. Les traitements pralables lextraction ................................................................... 25
I.2.2. Les solvants dextraction des xylanes ....................................................................... 37
I.2.3. Les conditions dextraction ....................................................................................... 41
I.3. Caractrisation des hmicelluloses du bois ............................................................ 42
I.3.1. Dtermination de la composition chimique ............................................................... 42
I.3.2. Analyse structurale des oligosaccharides .................................................................. 50
I.4. Applications, proprits et valorisation des xylanes .............................................. 64
I.4.1. Xylanes natifs ............................................................................................................ 64
I.4.2. Xylooligosaccharides dintrt .................................................................................. 67
I.4.3. Etude de valorisation des xylanes de bois ................................................................. 70
Deuxime partie : Nouvelles stratgies de dlignification et dextraction des
xylanes de chtaignier (Castanea sativa Mill.)75
Chapitre I. Dlignification en milieu oxydant Extraction des hmicelluloses par des
mthodes classiques et non conventionnelles ...................................................................... 79
I.1. Dlignification standard par le chlorite de sodium ................................................ 79
I.2. Extraction alcaline des xylanes .............................................................................. 80
I.2.1. Conditions opratoires ............................................................................................... 80
I.2.2. Etude qualitative et quantitative du rsidu et de la fraction extraite .......................... 80
I.3. Prtraitements par les ultrasons ............................................................................. 81
I.3.1. Conditions opratoires ............................................................................................... 82
I.3.2. Analyses qualitative et quantitative des extraits ........................................................ 82
I.4. Extraction par micro-ondes ................................................................................... 83
I.4.1. Conditions opratoires ............................................................................................... 84
I.4.2. Etude qualitative et quantitative des rsidus et des fractions extraites ...................... 84
I.5. Extraction par les micro-ondes avec prtraitements pralables aux ultrasons ....... 85
I.5.1. Etude qualitative et quantitative des rsidus et des fractions extraites ...................... 85
I.6. Bilan sur lextraction par les micro-ondes et les ultrasons dans le DMSO ........... 87
Chapitre II. Dlignification enzymatique par le systme laccase/HOBt/H
2
O
2
.............. 89
II.1. Plan dexpriences .............................................................................................. 90
II.1.1. Principe du plan en carr grco-latin ......................................................................... 90
II.1.2. Mise au point du domaine exprimental.................................................................... 91
II.1.3. Construction du plan dexpriences .......................................................................... 91
II.2. Analyses des rsultats ......................................................................................... 93
II.2.1. Tableau de rsultats ................................................................................................... 93
II.2.2. Construction dune grille de dpouillement .............................................................. 94
II.2.3. Influence de la dure du procd ............................................................................... 96
II.2.4. Influence de la temprature ....................................................................................... 96
II.2.5. Influence de la quantit en enzyme ........................................................................... 97
II.3. Etude qualitative des rsidus et des fractions extraites ...................................... 97
II.3.1. Compositions monosaccharidiques des extraits et rsidus et degr de polymrisation
des xylanes extraits .................................................................................................................... 97
II.3.2. Caractrisation des rsidus par infrarouge................................................................. 98
II.4. Bilan sur la dlignification enzymatique ............................................................ 99
Chapitre III. Dlignification induite thermiquement par des macromolcules
ttrapyrroliques Analogues de peroxydases .................................................................... 100
III.1. Synthse des phtalocyanines ............................................................................ 101
III.2. Synthse des porphyrines ................................................................................. 101
III.3. Protocole de dgradation des lignines et dextraction des xylanes .................. 102
III.3.1. Etude quantitative de fractions extraites aprs la dlignification ............................ 104
III.3.2. Etude quantitative et qualitative des rsidus et extraits glucidiques ........................ 105
III.3.3. Optimisation des paramtres ................................................................................... 109
III.3.4. Hypothse relative aux mcanismes doxydation et leur rpercussion sur la structure
des molcules .......................................................................................................................... 112
III.4. Bilan sur le systme de dlignification MPcS ou MTPPS/H
2
O
2
..................... 117
Chapitre IV. Dlignification induite photochimiquement en prsence de porphyrines ou
de phtalocyanines ............................................................................................................... 118
IV.1. Synthse des photosensibilisateurs ................................................................... 118
IV.1.1. Synthse de la ttraphnylporphyrine sulfone ....................................................... 118
IV.1.2. Synthse des sulfophtalocyanines daluminium, de nickel et de zinc ..................... 118
IV.2. Protocole de dgradation des lignines et dextraction des xylanes .................. 119
IV.2.1. Etude qualitative et quantitative des extraits aprs dlignification photochimique . 119
IV.2.2. Etude qualitative et quantitative des xylanes extraits .............................................. 122
IV.2.3. Bilan de la dlignification photochimique ............................................................... 124
IV.3. Bilan gnral .................................................................................................... 124
Troisime partie : Quelques proprits oncologiques de xylanes de chtaignier
(Castanea sativa) 127
Chapitre I. Extraction, purification et caractrisation chimique de xylanes de bois de
chtaignier et de pricarpe dargan .................................................................................... 131
I.1. Extraction alcaline des xylanes de chtaignier et dargan ................................... 131
I.1.1. Extraction de xylanes de chtaignier ....................................................................... 131
I.1.2. Extraction de xylanes dargan ................................................................................. 132
I.2. Caractrisations chimiques .................................................................................. 133
I.2.1. Composition centsimale ......................................................................................... 133
I.2.2. Analyse Chromatographique en Phase Gazeuse ..................................................... 134
I.2.3. Distribution en masse .............................................................................................. 135
I.2.4. Etude de la distribution des acides uroniques .......................................................... 136
I.2.5. Analyse structurale (RMN) ..................................................................................... 139
I.2.6. Conclusion sur les caractrisations chimiques ........................................................ 142
Chapitre II. Evaluation des proprits biologiques des extraits en oncologie cellulaire et
molculaire......143
II.1. Effets sur la prolifration des cellules A431 .................................................... 143
II.2. Effets sur la migration des cellules A 431 ........................................................ 144
II.3. Effets sur linvasion des cellules A 431 ........................................................... 145
II.4. Effets sur lexpression des mtalloprotases .................................................... 146
II.5. Corrlation entre les effets biologiques et la structure des molcules ............. 147
CONCLUSION GENERALE.....................................................................149
Quatrime partie : Partie Exprimentale153
I.1. Ractifs et solvants .............................................................................................. 155
II.1. Analyse chimique ............................................................................................ 156
II.1.1. Analyses spectroscopiques ...................................................................................... 156
II.1.2. Chromatographie ..................................................................................................... 157
III.1. Extraction des xylanes ...................................................................................... 158
III.1.1. Prparation de lholocellulose ................................................................................. 158
III.1.2. Extraction des xylanes ............................................................................................. 160
III.1.3. Extraction des xylanes partir de pricarpe dargan ............................................... 161
III.1.4. Extraction alcaline des xylanes ............................................................................... 162
III.2. Caractrisations chimique des xylanes ............................................................. 162
III.2.1. Etude de la composition centsimale....................................................................... 162
III.2.2. Dosage des hydroxyles phnoliques totaux ............................................................. 165
III.2.3. Dosage du peroxyde dhydrogne rsiduel ............................................................. 166
III.2.4. Dosage des fonctions acides carboxyliques ............................................................. 166
III.2.5. Dosage des fonctions aldhydes (raction de Cannizarro) ...................................... 167
III.2.6. Etude de la composition monosaccharidique par CPG ........................................... 167
III.2.7. Evaluation du taux dactylation et dacide 4-O-mthylglucuronique .................... 168
III.3. Autohydrolyse des xylanes ............................................................................... 168
III.3.1. Protocole .................................................................................................................. 168
III.3.2. Sparation des oligosaccharides .............................................................................. 169
III.3.3. Purification des oligosaccharides ............................................................................ 169
IV.1. Synthses .......................................................................................................... 170
IV.1.1. Sel de sodium de lacide sulfophtalique .................................................................. 170
IV.1.2. 4,4,4,4-ttrasulfonylphtalocyanine de fer (FePcS) .......................................... 171
IV.1.3. 4,4,4,4-ttrasulfonylphtalocyanine de manganse (MnPcS) ........................... 172
IV.1.4. 4,4,4,4-ttrasulfonylphtalocyanine daluminium (AlPcS) ............................... 173
IV.1.5. 4,4,4,4-ttrasulfonylphtalocyanine de zinc (ZnPcS) ....................................... 174
IV.1.6. 4,4,4,4-ttrasulfonylphtalocyanine de nickel (NiPcS) ..................................... 175
IV.1.7. 5,10,15,20-ttra(4-sulfonatophenyl)porphyrine (H
2
TPPS) ...................................... 176
IV.1.8. 5, 10, 15,20-ttra(4-sulfonatophnyl)porphyrine de fer (FeTPPS).......................... 177
IV.1.9. 5, 10, 15, 20-ttra(4-sulfonatophnyl)porphyrine de manganse (MnTPPS) .......... 178
V.1. Evaluation des proprits biologiques de cytotoxicit des extraits .................. 179
V.1.1. Efficacit des xylanes en oncologie cellulaire et molculaire ................................. 179
V.1.2. Etude de la viabilit cellulaire ................................................................................. 180
Annexes203
Conduite de Projet de recherche. Un nouveau chapitre de la thse.207
Cadre gnral et enjeux de la thse209
Prsentation succincte du sujet de thse .................................................................................. 209
Contexte de la thse ................................................................................................................. 209
Gestion, volution et cot du projet...........................................................211
Prparation et cadrage du projet .............................................................................................. 211
Conduite du projet ................................................................................................................... 211
Evaluation et prise en charge du cot du projet ....................................................................... 212
Comptences et savoir-faire214
Rsultats, impacts de la thse 216


Liste des Tableaux

Tableau 1 : Composition relative des diffrents constituants du bois ........................................ 8
Tableau 2 : Pourcentages des liaisons les plus communes retrouves dans les lignines de
feuillus et rsineux ................................................................................................................... 12
Tableau 3 : Mthode de drivation des monosaccharides ........................................................ 47
Tableau 4 : Compositions monosaccharidiques des rsidus et du filtrat aprs extraction
alcaline ..................................................................................................................................... 81
Tableau 5 : Essais prliminaires des prtraitements ultrasons ................................................. 82
Tableau 6 : Rsultats des essais de traitements par sonication dans le DMSO ........................ 82
Tableau 7 : Compositions monosaccharidiques molaires des extraits aprs prtraitements aux
ultrasons ................................................................................................................................... 83
Tableau 8 : Suivi quantitatif des teneurs en acides uroniques et des rendements massiques
dextraction ............................................................................................................................... 84
Tableau 9 : Compositions monosaccharidiques molaires des extraits aprs traitement micro-
ondes ......................................................................................................................................... 85
Tableau 10 : Suivi quantitatif des teneurs en acides uroniques et des rendements massiques
dextraction ............................................................................................................................... 86
Tableau 11 : Compositions monosaccharidiques molaires des extraits aprs traitements
ultrasons et micro-ondes ........................................................................................................... 86
Tableau 12 : Dfinition des facteurs et des modalits .............................................................. 91
Tableau 13 : Plan dexpriences utilis pour la dlignification enzymatique des sciures de
chtaignier ................................................................................................................................ 92
Tableau 14 : Rsultats dessais de dlignification enzymatique .............................................. 94
Tableau 15 : Grille de dpouillement pour les phnols doss .................................................. 95
Tableau 16 : Compositions monosaccharidiques molaires des extraits et rsidus ................... 97
Tableau 17 : Quantification des phnols doss et de peroxyde consomm aprs ltape de
dlignification ......................................................................................................................... 104
Tableau 18 : Compositions centsimales des filtrats aprs extraction aqueuse ..................... 105
Tableau 19 : Compositions monosaccharidiques des fractions aprs extraction aqueuse en %
molaire .................................................................................................................................... 107
Tableau 20 : Compositions monosaccharidiques des rsidus aprs extraction aqueuse en %
molaire .................................................................................................................................... 108
Tableau 21 : Rsultats qualitatifs et quantitatifs pour les xylanes extraits sur du matriel de
granulomtrie 200 et 500 m ................................................................................................. 110
Tableau 22 : Rsultats qualitatifs et quantitatifs pour les xylanes extraits sur des sciures et de
lholocellulose 20 et 40C ................................................................................................... 111
Tableau 23 : Rsultats qualitatifs et quantitatifs pour les xylanes extraits sur de
lholocellulose des temps variables .................................................................................... 111
Tableau 24 : Rsultats qualitatifs et quantitatifs pour les xylanes extraits sur des sciures pour
des temps de dlignification oxydative de 24 et 100 h avec FePcS ....................................... 112
Tableau 25 : Donnes qualitatives des xylanes avant et aprs oxydation par le systme
FePcS/H
2
O
2
............................................................................................................................ 113
Tableau 26 : Rsultats des dosages des fonctions acides et aldhydes .................................. 114
Tableau 27 : Quantits estimes en phnols par dosages aprs dlignification photochimique
................................................................................................................................................ 119
Tableau 28 : Compositions centsimales des fractions aprs extraction aqueuse .................. 122
Tableau 29 : Compositions monosaccharidiques des extraits aprs extraction aqueuse ........ 123
Tableau 30 : Compositions monosaccharidiques des rsidus aprs extraction aqueuse des
xylanes .................................................................................................................................... 124
Tableau 31 : Rendements massiques dextraction en xylanes ............................................... 134
Tableau 32 : Compositions monosaccharidiques des diffrents extraits et rsidus pour le
chtaignier .............................................................................................................................. 134
Tableau 33 : Compositions monosaccharidiques des diffrents extraits et rsidus pour largan
................................................................................................................................................ 135
Tableau 34 : Dplacements chimiques (ppm) en RMN
1
H pour les glucuronoxylanes de
chtaignier et dargan ............................................................................................................. 140
Tableau 35 : Dplacements chimiques (ppm) en RMN
1
H pour lhomoxylane dargan ....... 141
Tableau 36 : Caractristiques chimiques des diffrents xylanes extraits ............................... 142
Tableau 37 : Effets des xylanes de chtaignier et dargan sur la prolifration, la migration et
linvasion des cellules A431 et sur lexpression des MMP9, ProMMP2 et des ProMMP9 .. 147


Listes des Figures

Figure 1 : Vue perspective dune paroi ligneuse ........................................................................ 8
Figure 2 : Liaisons hydrogne intra et intermolculaires dans la cellulose ............................... 9
Figure 3 : Exemples de structures dhmicelluloses : en haut un L-arabino-D-xylane (AX) et
en bas un D-galacto-D-mannane .............................................................................................. 10
Figure 4: Structure des monolignols ........................................................................................ 11
Figure 5 : Motifs typiques prsents dans la lignine .................................................................. 12
Figure 6 : Schma simplifi de la voie biosynthtique des lignines chez les angiospermes .... 16
Figure 7 : Reprsentation dun possible assemblage des polymres paritaux lors de la
formation de la paroi secondaire .............................................................................................. 18
Figure 8 : Structure de la paroi secondaire ............................................................................... 19
Figure 9 : Possibles liaisons covalentes entre les xylanes et les lignines dans la paroi vgtale
.................................................................................................................................................. 22
Figure 10 : Sparation des constituants du bois ....................................................................... 24
Figure 11 : Structures dhomoxylanes ..................................................................................... 25
Figure 12 : Structure du 4-O-mthyl-D-glucurono-D-xylane (MGX) ..................................... 25
Figure 13 : Unit C
9
phnylpropane ......................................................................................... 27
Figure 14 : Oxydation de la lignine par la manganse-peroxydase ......................................... 29
Figure 15 : Cycle catalytique de la lignine-peroxydase ........................................................... 30
Figure 16 : Proposition de mcanisme daction de la laccase .................................................. 31
Figure 17 : Principaux mdiateurs utiliss (daprs la littrature) .......................................... 31
Figure 18 : Exemples de mdiateurs naturels ........................................................................... 31
Figure 19 : Hme de type b ...................................................................................................... 32
Figure 20 : Structure gnrale des porphyrines ........................................................................ 33
Figure 21 : Structure gnrale des phtalocyanines ................................................................... 33
Figure 22 : Proposition de mcanisme de la conversion de la lignine par lozone .................. 35
Figure 23 : Proposition de mcanisme lors de la raction dune double liaison et de lozone
dans la lignine ........................................................................................................................... 35
Figure 24 : Formation de radicaux hydroxycyclohexadinyles ............................................... 36
Figure 25 : Le photosensibilisateur Rose de Bengale .............................................................. 36
Figure 26 : Le mthyltrioxorhnium ........................................................................................ 37
Figure 27 : Dgradation des units dacide uronique en milieu basique ................................. 39
Figure 28 : Dpolymrisation (peeling) des xylanes en milieu alcalin .................................... 40
Figure 29 : Exemples de chromognes utiliss pour les dosages colorimtriques ................... 43
Figure 30 : Drivs furfuriques obtenus par dshydratation des pentoses, des hexoses et des
acides uroniques ....................................................................................................................... 43
Figure 31 : Stabilit de la liaison uronosidyle lhydrolyse acide .......................................... 45
Figure 32 : Prparation des O-mthylglycosides ..................................................................... 46
Figure 33 : Equilibre mutarotationnel du xylose ...................................................................... 48
Figure 34 : Mthode de trimthylsilylation des O-mthylglycosides ...................................... 49
Figure 35 : Principe du dosage enzymatique des actyles ....................................................... 50
Figure 36 : Hydrolyse enzymatique de GX. ............................................................................. 52
Figure 37 : Mcanisme gnral de lhydrolyse acide des glycosides ...................................... 53
Figure 38 : Catalyse intramolculaire par un groupement carboxyle dune liaison 14
prcdant un acide uronique ..................................................................................................... 54
Figure 39 : Dpolymrisation en milieu basique ou peeling d'un glycane li en 14 ............ 55
Figure 40 : Dgradation alcaline en milieu rducteur dun polysaccharide acide ................... 56
Figure 41 : Libration des substituants R
1
, R
2
, R
3
en milieu acide aprs la -limination ...... 56
Figure 42 : Schma reprsentant les corrlations
3
J
H,C
carbone/proton observes partir du
proton H-1 dans une exprience HMBC. La corrlation la plus intressante est celle qui
indique la liaison glycosidique. ................................................................................................ 59
Figure 43 : Principe du MALDI ............................................................................................... 61
Figure 44 : Exemples dapplication des xylo-oligosaccharides ............................................... 68
Figure 45 : Xylanes fonctionnaliss ......................................................................................... 69
Figure 46: Hydrolyse des xylanes et exemples dapplications industrielles ........................... 71
Figure 47 : Formation dune ctone C-xyloside. .................................................................... 72
Figure 48 : Rduction de la ctone C-xyloside....................................................................... 72
Figure 49: Protocole dextraction de polysaccharides paritaux ............................................. 79
Figure 50 : Extraction alcaline de xylanes ............................................................................... 80
Figure 51 : Spectre RMN
1
H (D
2
O) du xylane extrait dans le DMSO aux micro-ondes aprs
prtraitement aux ultrasons. ..................................................................................................... 87
Figure 52 : Principe de la dlignification enzymatique ............................................................ 89
Figure 53 : Protocole dobtention de xylanes aprs dlignification enzymatique ................... 90
Figure 54 : Disposition des essais. ........................................................................................... 92
Figure 55 : Disposition des essais lorsque lon ne fait varier quun seul facteur la fois.. .... 93
Figure 56 : Trac des effets moyens sur la quantit en phnols ............................................... 95
Figure 57 : Trac des effets moyens des facteurs pour le rendement massique en xylanes ..... 96
Figure 58 : Spectre IR des rsidus aprs dlignification par le systme laccase/oxygne/HOBt
et par le chlorite de sodium ...................................................................................................... 98
Figure 59 : Catalyseurs utiliss pour loxydation ................................................................... 100
Figure 60 : Principe du systme utilis .................................................................................. 100
Figure 61 : Synthse de phtalocyanines sans solvant ............................................................. 101
Figure 62: Synthses des porphyrines .................................................................................... 102
Figure 63 : Protocole dextraction et de caractrisation des xylanes de chtaignier .............. 103
Figure 64: Principe de la dlignification par les phtalocyanines et les porphyrines. ............. 104
Figure 65 : Proposition de mcanisme pour le clivage de la liaison C
2
-C
3
dun anhydroglucose
................................................................................................................................................ 106
Figure 66 : Spectre RMN
1
H (D
2
O) du xylane extrait dans leau partir dun rsidu
holocellulosique dlignifi par le systme FePcS/H
2
O
2
. ....................................................... 109
Figure 67 : Raction de Cannizarro ........................................................................................ 113
Figure 68 : Spectre RMN
1
H (D
2
O) du xylane de chtaignier natif avant et aprs oxydation
par le systme FePcS/H
2
O
2
. ................................................................................................... 114
Figure 69 : Raction dquilibre dun aldhyde dans leau ................................................... 115
Figure 70 : Spectre IR des xylanes de htre et de chtaignier avant et aprs oxydation par le
systme FePcS/H
2
O
2
.............................................................................................................. 115
Figure 71 : Profils de masses de glucuronoxylanes de htre ayant ou non subi un traitement
oxydatif par le systme FePcS/H
2
O
2
...................................................................................... 116
Figure 72: Prsentation du systme de photooxydation. ........................................................ 118
Figure 73 : Filtrats correspondant aux dlignifications photochimiques. .............................. 120
Figure 74 : Protocole dextraction des xylanes de chtaignier MGX C
1
et MGX C
2
............ 132
Figure 75 : Protocole dextraction des xylanes dargan MGX A et HX ................................ 133
Figure 76 : Degrs de polymrisation des diffrents xylanes extraits .................................... 135
Figure 77 : Superposition des profils dlution obtenus par analyse HPLC des MGXs et du
HX. . ...................................................................................................................................... 136
Figure 78 : Distribution des acides uroniques des xylanes de chtaignier et dargan aprs
autohydrolyse et analyses par spectromtrie de masse MALDI. ........................................... 138
Figure 79 : Spectre RMN
1
H dun 4-O-mthylglucuronoxylane dans le D
2
O avec attribution
des signaux ............................................................................................................................. 141
Figure 80 : Corrlation de la cytotoxicit des xylanes sur la prolifration des cellules A 431
................................................................................................................................................ 144
Figure 81 : Effets du MGX C
1
sur la migration des cellules A 431 ....................................... 145
Figure 82 : Effets du MGX C
1
sur linvasion des cellules A 431.. ........................................ 145
Figure 83 : Effets du MGX C1 sur la scrtion par les cellules A 431 des ProMMP9, MMP9
et ProMMP2. .......................................................................................................................... 146
Figure 84 : Principe de la migration et de linvasion cellulaires en chambre de Boyden ...... 182


Abrviations

4-O-MeGlcA : Acide 4-O-mthylglucuronique
ABTS : Acide 2,2-azino-bis 3-thylbenzothiazoline-6-sulfonique
ACS : Actyl-CoA synthtase
AlPcS : Ttrasulfophtalocyanine daluminium
Ara : Arabinose
ATP : Adnosine-5-triphosphate
AU : Acide uronique
AX : Arabinoxylane
BSTFA : N,O-Bis-Trimthylsilyltrifluoroactamide
CDTA : 1,2 Diaminocyclohexane ttraactate
CoA : Coenzyme A
CPG : Chromatographie en phase gazeuse
CPG-SM : Analyse par couplage CPG- spectroscopie de masse
CS : Citrate synthtase
Da : Dalton
DMA : N,N- dimthylactamide
DMAP : 4-Dimthylaminopyridine
DMSO : Dimthylsulfoxide
DO : Densit optique
DP : Degr de polymrisation
DS : Degr de substitution
EDTA : Ethylne diamine ttraactate
f : Furanose
FePcS : Ttrasulfophtalocyanine de fer
FeTPPS : Ttraphnylporphirine sulfone de fer
Fuc : Fucose
Gal : Galactose
GalA : Acide galacturonique
GAX : Glucurono(arabino)xylane
Glc : Glucose
GlcA : Acide glucuronique
GX : Glucuronoxylane
H
2
TPP : Ttraphnylporphyrine
H
2
TPPS : Ttraphnylporphyrine sulfone
HOBt : 1-Hydroxybenzotriazole
HPLC : Chromatographie liquide haute performance
HX : Homoxylane
IR : Infrarouge
L-MDH : L-malate dshydrognase
MALDI : Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation
Man : Mannose
MGX : 4-O-mthylglucuronoxylane
MHDP : Mtahydroxydiphnyle
MnPcS: Ttrasulfophtalocyanine de manganse
MnTPPS: Ttraphnylporphyrine sulfone de mangnse
NAD : Nicotinamide-adnine dinuclotide
NiPcS: Ttrasulfophtalocyanine de nickel
ON : Oses neutres
p : Pyranose
PAHBAH : Parahydroxybenzoque acide hydrazide
Rha : Rhamnose
RMN : Rsonance magntique nuclaire
SR : Sucres rducteurs
ST : Sucres totaux
TEMPO : 2,2,6,6-ttramthylpipridin-1-oxyle
THF : Ttrahydrofurane
TMCS : Chlorure de trimthylsilane
TMS : Trimthylsilylation
US : Ultrasons
Xylp : Xylopyranosyle
Xyl : Xylose
ZnPcS : Ttrasulfophtalocyanine de zinc


1












INTRODUCTION GENERALE




2



3

La biomasse est une source abondante et renouvelable de biopolymres qui intressent
fortement les acteurs du dveloppement durable et de la Chimie verte. Les matriaux
lignocellulosiques, parmi lesquels la cellulose, les hmicelluloses ou encore les lignines,
comptent pour environ 80% de cette biomasse. Les hmicelluloses sont, aprs la cellulose, le
second polymre naturel la plus abondant sur Terre. En raison de leurs proprits chimiques
remarquables mais aussi de leurs activits biologiques diversifies, les hmicelluloses sont
aujourdhui considres, au mme titre que la cellulose et lamidon, comme des
polysaccharides dintrt industriel. Encore nettement moins utilises que leurs homologues,
elles sont considres comme des polymres en devenir si lon en juge par les valorisations
rcentes dans le domaine des biocarburants. Elles sont principalement prsentes dans les
crales ; le bois en contient galement des quantits significatives.

Avec une superficie de 155 000 km
2
, la fort franaise reprsente 28% du territoire ce
qui place la France au quatrime rang europen. Elle est aussi essentiellement boise par des
essences feuillues (63%), le chne tant lespce majoritaire. Si lon en revient une chelle
rgionale, un tiers de la superficie du Limousin - soit 5 850 km
2
- est boise dont 5 750 km
2
de
forts de production.
1
Cest dire limportance de lindustrie du bois dans cette rgion o le
chtaignier y est reconnu comme une essence emblmatique. Entre autres caractristiques,
lactivit forestire gnre des quantits considrables de dchets et produits connexes tels
que les branchages, les souches, les corces ou encore les sciures. Malgr des lgislations
rcentes et contraignantes, moins de 10% de ces produits connexes sont aujourdhui valoriss,
principalement dans le secteur nergtique (plaquettes) et la production de matriaux bois
(panneaux de particules, agglomrs...).

Cest dans ce contexte que depuis plusieurs annes, le Laboratoire de Chimie des
Substances Naturelles sintresse de nouvelles pistes de valorisation de la biomasse
forestire. Si la fraction cellulosique trouve dj un grand nombre d'applications
technologiques, les hmicelluloses sont, quant elles, peu exploites malgr leur grande
richesse structurale. Une tude rcente
2
du Laboratoire consacre lanalyse de la structure
du 4-O-mthyl-glucuronoxylane caractristique du bois de chtaignier, a permis den prciser
des proprits biologiques remarquables dans le domaine de loncologie cellulaire et
molculaire. Localise dans la paroi secondaire des cellules de bois, les hmicelluloses y sont
intimement associes la cellulose et aux lignines. Cette organisation chimique originale
explique des proprits mcaniques remarquables du bois ; elle soppose galement - et
malheureusement - lextractabilit de cette catgorie de molcule paritale et constitue donc

4

le principal frein leur valorisation. La dlignification pralable de la matire
lignocellulosique tout comme leur extraction alcaline sont, encore lheure actuelle, des
prrequis non cocompatibles lextraction des hmicelluloses. Cest la raison pour laquelle
nous avons engag cette tude en poursuivant un double objectif :

proposer de nouvelles approches de dlignification physique, biochimique et
chimique alternatives et plus respectueuses de lenvironnement suivie dune
extraction dans leau des hmicelluloses partir de sciures de chtaignier. Une
attention particulire sera porte cette occasion la mise en uvre de
photosensibilisants (porphyrine - phtalocyanine) synthtiss et tudis par ailleurs
au Laboratoire dans le domaine de la photothrapie dynamique.
prciser la relation structure activit qui explique la variabilit des proprits
biologiques des xylanes sur les cellules cancreuses A431 issues dun piderme
vulvaire.

Avec ces objectifs, nous proposons dapporter une contribution au dveloppement de
la valorisation chimique et biologique des xylanes sur le double aspect fondamental et
finalis.




















5









Premire partie : La paroi cellulaire vgtale, les
polysaccharides, la lignine - Etat de la question


6



7

Les hmicelluloses sont des polysaccharides de structures complexes et diversifis qui
restent malgr des perspectives attrayantes peu exploits lheure actuelle comparativement
dautres polymres naturels tels que la cellulose ou lamidon. Cette tude souhaite apporter
des rponses la question de la valorisation chimique et biologique du 4-O-
mthylglucuronoxylane, une hmicellulose majoritaire chez les bois issus de feuillus (chne,
chtaignier). Elle y est exclusivement localise au niveau des parois cellulaires primaires et
secondaires dont il convient au pralable de prsenter la structure et la formation biologique.
Une attention particulire sera porte la composition chimique et la structure de grandes
familles de molcules essentiellement polysaccharidiques qui la compose. Par ailleurs, les
multiples interactions chimiques qui y sont identifies, si elles structurent mcaniquement la
paroi cellulaire, sont aussi un frein pour lexprimentateur qui souhaiterait en valoriser le
contenu. Cest la raison pour laquelle il convient dapporter dans un deuxime temps des
rponses mthodologiques, slectives dune part et compatibles dautre part avec la notion de
chimie verte.
I.1. La paroi cellulaire vgtale

La paroi cellulaire vgtale est un difice multimolculaire qui assure la rigidit et qui
volue en fonction de l'ge des tissus vgtaux. Elle entoure chaque cellule vgtale et est
essentiellement constitue de polyphnols, protines et de glucides (90% de la masse de
matire sche) qui peuvent tre des hmicelluloses, des pectines ou de la cellulose.
3

Ces diffrents constituants forment un rseau complexe de macromolcules
responsable des proprits mcaniques de la paroi cellulaire. Elle a par ailleurs une double
spcificit : elle doit la fois tre rigide pour jouer le rle de squelette et de barrire et assurer
une certaine lasticit pour permettre la croissance du vgtal. Nanmoins, les changes
intercellulaires doivent pouvoir se faire. Ces contraintes paradoxales sont lorigine de la
complexit de la paroi vgtale dont lorganisation repose sur trois territoires bien identifis
(Figure 1) :
- La lamelle moyenne, jonction intercellulaire, permet la cohsion cellulaire. Elle est
riche en pectines et dpourvue de cellulose.
- La paroi primaire, est compose de pectines, de cellulose et dhmicelluloses. Sa
structure et sa composition chimique voluent au gr de la croissance cellulaire.
- La paroi secondaire est constitue des lments de la paroi primaire dans lesquels
s'est insre de la lignine. Elle est plus rigide que la paroi primaire et ne permet plus la
croissance cellulaire. On constate une plus grande proportion de cellulose, dont les

8

microfibrilles sont disposes en hlices et en strates (S
1
, S
2
et S
3
de la Figure 1 ). Elle
est situe en-de de la paroi primaire car elle est synthtise postrieurement celle-
ci.












Figure 1 : Vue perspective dune paroi ligneuse daprs Raven et al. (2007).
4


I.1.1. Les principaux constituants
Chimiquement, le bois est essentiellement compos de trois biopolymres : de cellulose,
dhmicelluloses, de lignine mais aussi dextractibles. La proportion relative des diffrents
constituants varie en fonction des essences de bois (Tableau 1) et de la localisation dans la
paroi cellulaire. La rpartition moyenne des polymres est prsente dans le tableau ci-
dessous.
5

Tableau 1 : Composition relative des diffrents constituants du bois

Rsineux (% en poids) Feuillus (% en poids)
Cellulose 42 2 45 2
Lignine 27 2 30 5
Hemicelluloses 28 3 20 4
Extractibles 3 2 5 3


I. 1. 1. a. La cell ulose
La cellulose est la molcule la plus abondamment synthtise sur Terre en reprsentant
au moins la moiti de la biomasse.
6
Cest aussi le polymre naturel le plus valoris, que ce
soit sous forme de fibres textiles, de papiers ou ltat modifi desters (actates ou nitrates
de cellulose) ou encore dthers. Cet homopolymre linaire a pour unit de rptition le
cellobiose, motif compos de deux D-glucopyranoses en conformation
1
C
4
lis par une liaison

9

glucidique (14). Le degr de polymrisation (DP) qui reprsente le nombre dunits
glucosidiques par chane de cellulose est trs difficile estimer et ce pour deux raisons. La
premire est la difficult de solubiliser la cellulose sans la dgrader. La seconde provient du
fait de la trs grande variabilit des DP selon la provenance et la situation de la cellulose au
sein de la paroi, allant de quelques centaines plusieurs milliers. La disposition des
hydroxyles libres des glucoses permet ltablissement de liaisons hydrognes
intramolculaires, stabilisant la cellulose dans son orientation linaire ce qui lui confre une
certaine rigidit, et des liaisons intermolculaires qui relient plusieurs macromolcules et les
maintiennent disposes paralllement (Figure 2). Ainsi, lassociation de nombreuses chanes
de cellulose favorise ltablissement dun tat solide ordonn, pseudocristallin et permt la
formation de microfibrilles. La structure fibrillaire trs condense de la cellulose explique sa
rsistance mcanique la traction, ainsi que son caractre non-soluble dans leau.
Pratiquement, la fraction cellulosique est considre comme tant le rsidu insoluble aprs
lextraction complte des autres polysaccharides de la paroi par des agents chlateurs et /ou
des bases minrales.
Figure 2 : Liaisons hydrogne intra et intermolculaires dans la cellulose

I. 1. 1. b. Les hmi celluloses
Les hmicelluloses dsignent lorigine les polysaccharides paritaux
alcalinosolubles ; cependant certains dentre-eux tels que les arabinanes et les
arabinogalactanes sont extraits par leau. Par extension, les hmicelluloses regroupent donc
tous les polysaccharides prsents dans les parois des cellules vgtales qui ne sont ni
cellulosiques, ni pectiques. Contrairement la cellulose, elles possdent une grande varit
structurale qui dpend de lorigine botanique, de lge des cellules et de leur localisation dans
la paroi vgtale. Leur DP est galement plus faible, dpassant rarement 200. Les units
glucidiques peuvent sagencer de multiples faons dans les hmicelluloses, ce qui explique
leur grande diversit. Toutefois, les hmicelluloses sont dcrites comme tant constitues
dun axe osidique principal linaire sur lequel peuvent tre fixs des motifs varis. Si

5
4
3
2
1
4
'
1
'
2
'
3
'
5
'
6
'
6
5
4
3
2
1
6
O
O
O
O
HO
O
H
H
H
H
O
O
O
HO
O
O
O
O
HO
O
O
O
H
H
O
O
O
O
H
H
H
H
O
O
O
O
H
H
O
HO
O
O
O
O
H
H
5
4
3
2
1
4
'
1
'
2
'
3
'
5
'
6
'
6
5
4
3
2
1
6

10

lenchanement est constitu dun seul type de monomre, il sagira dun
homopolysaccharide, sinon dun htropolysaccharide. Les liaisons qui unissent ces
monomres sont elles aussi trs varies. Concernant le nom donn aux hmicelluloses, le
suffixe-ane dsigne la nature polymrique de laxe osidique, prcd directement par le nom
de la chane principale. Les units la substituant tant signifies en premier. Par exemple, les
xylanes sont construits partir dune chane de xyloses et les xyloglucanes partir dune
chane de glucoses, plus ou moins substitue par des units de xylose. Les hmicelluloses
peuvent tre classes selon cinq grandes familles : les xyloglycanes (ou xylanes), les
mannoglycanes (ou mannanes) (Figure 3), les xyloglucanes, les -D-glucanes (avec des
liaisons mixtes 13 et 14) et les arabinogalactanes.
7




Figure 3 : Exemples de structures dhmicelluloses : en haut un L-arabino-D-xylane (AX) et en bas un D-galacto-
D-mannane(selon Ebringerov et al.,
7
)

Les O-actyl-4-O-mthylglucuronoxylanes sont les hmicelluloses majoritaires des
essences forestires de feuillus (chne, chtaignier) ou les glucomannanes, bien que
minoritaires, sont aussi caractriss frquemment. Les O-actyl-galactomannanes sont en
revanche les polysaccharides dominants dans le cas des rsineux avec une faible quantit
darabino-4-O-mthylglucuronoxylanes. Les xyloglucanes sont les principaux types
dhmicelluloses trouves dans la paroi primaire chez la plupart des rsineux.

I. 1. 1. c. Les pecti nes
Elles constituent lessentiel des lamelles moyennes qui assurent la cohsion entre les
cellules. On parle alors de ciment pectique. Les chanes principales des pectines sont
constitues de motifs dacides galacturoniques lis en -(14) (acides polygalacturoniques)
dans lesquelles sintercalent des rsidus de L-rhamnose lis en (14) et (12). Cette

11

insertion cre des dviations de la chane appeles coudes pectiques. A linstar des
hmicelluloses, la structure des pectines est trs varie puisque des chanes latrales comme
des arabinanes, des galactanes ou des arabinogalactannes peuvent se greffer sur le squelette
rhamnogalacturonique. Les fonctions acides sont souvent estrifies par des groupes mthyles
ou salifies par des ions mono ou divalents tels que le potassium, le sodium ou le calcium.
Ces structures donnent sous certaines conditions des gels. Le degr de polymrisation, de
mthylestrification et la distribution de ces groupes mthyles sont autant de paramtres qui
vont jouer sur la solubilit de ces molcules. Cest pour cela quelles sont classes selon leur
mode dextraction ; leau chaude pour les pectines hautement mthylestrifies, par des
agents chlateurs de cations divalents (EDTA, oxalate dammonium) pour les pectines
faiblement mthylestrifies et lacide dilu chaud pour la protopectine (acide
polygalacturonique).
8


I. 1. 1. d. Les l igni nes
Les lignines sont des polyphnols issus de la copolymrisation de trois alcools dits
phnylpropnoques ou encore appels monolignols: lalcool coumarylique, lalcool
conifrylique et lalcool sinapylique.
OH
OH
OMe
OH
OH
OMe MeO
OH
OH


Figure 4: Structure des monolignols

Elles sont le deuxime constituant du bois hauteur de 30% de la masse sche chez les
rsineux et de 20% chez les feuillus. Leur structure est trs complexe cause de la prsence
de nombreux types de liaisons (Figure 5) entre les diverses units C-9. Les pourcentages
correspondant ces liaisons trouves chez les feuillus et les rsineux sont prsents dans le
Tableau 2.
9



Alcool trans-conifrylique
Alcool trans-sinapylique Alcool trans-coumarylique

12

OR
OR
O
OR OR OR
OR
OR
OR
C
C
C
O
C
C
C
O
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
O
C



Figure 5 : Motifs typiques prsents dans la lignine

Tableau 2 : Pourcentages des liaisons les plus communes retrouves dans les lignines de feuillus et rsineux
9


Types de liaisons Rsineux
a
Feuillus
a

-Aryl ther (-O-4) 45-48 60
-Aryl ther (-O-4) 6-8 6-8
Diphnyl ther (4-O-5) 3,5-8 6,5
Biphnyl (5-5') 9,5-17 4,5
Diaryl propane (-1) 7-10 8
Phnylcoumarane (-5) 9-12 6
a
% total des units phnylpropane

Contrairement d'autres polymres vgtaux, tels que la cellulose, pour lesquels une
formule structurale gnrale existe, la structure des lignines ne peut pas tre dfinie de
manire claire par la rptition d'units caractristiques car elles sont lies entre elles de faon
multiple et plus ou moins alatoire.
Dans la paroi cellulaire, les monolignols peuvent tre oxyds en radicaux libres sous
linfluence denzymes (laccases et peroxydases), et ce, de faon alatoire expliquant ainsi la
grande diversit structurale des lignines. La proportion des trois monomres et les liaisons
-Aryl ther (-O-4)

-Aryl ther (-O-4)

Diphnyl ther (4-O-5)

Biphnyl (5-5)

Diaryl propane (-1)

Phnylcoumaran (-5)


13

intramolculaires sont trs variables selon lorigine botanique, le tissu et la localisation au
sein de la paroi. Chez les rsineux, la structure de la lignine drive plus de 95% de lalcool
conifrylique tandis que chez les feuillus, elle provient de lalcool conifrylique mais aussi de
lalcool sinapylique. Dans la lignine issue de paille de bl et des autres poaces, la prsence
dalcool coumarylique est typique.
10
La lignification est associe au dveloppement des
systmes vasculaires des plantes et cette polymrisation in situ saccompagne de liaisons
covalentes avec la cellulose et les hmicelluloses, ce qui assure la bonne rigidit de la paroi,
mais soppose une bonne extractabilit des constituants paritaux, en gnral et des
hmicelluloses, en particulier. Les lignines sont trs rsistantes de nombreux agents
chimiques et biochimiques. Comme on le verra en dtail plus loin, de nombreuses voies
dextraction et de dgradation des lignines existent ; elles sont souvent spcifiques de
diffrents types de liaisons du polymre. Leur caractrisation et leur analyse structurale
ncessitent lemploi de mthodes douces capables de dpolymriser le rseau tridimensionnel
sans pour autant dgrader les noyaux aromatiques, ni mme la chane propane. Cependant, du
fait des procds dextraction, les lignines isoles (lignines dextraction) sont souvent
diffrentes des lignines in situ (protolignines). Le terme de lignine de Klason est parfois
employ pour dsigner le rsidu obtenu aprs avoir dbarrass la paroi des extractibles
hydrophiles et lipophiles et des polysaccharides par de lacide sulfurique concentr.
Lorsqu'elles sont extraites par le bisulfite en milieu acide, les lignines conduisent des
composs nomms lignosulfonates, utiliss l'chelle industrielle comme plastifiant ou
complexant, par exemple. De manire gnrale, les lignines sont aussi utilises comme
additifs dans des matriaux adhsifs.

I. 1. 1. e. Autres constit uants
Les substrats lignocellulosiques renferment aussi les extractibles c'est--dire des
composs solubles dans des solvants organiques (ther de ptrole, mthanol, actone,
dichloromthane...) ou dans l'eau. Le terme d' extractibles peut englober les constituants du
bois autres que la cellulose, les hmicelluloses et les lignines. Ils comprennent un trs large
ventail de substances chimiques (plusieurs milliers de composs), souvent de faibles masses
molculaires. Ces substances peuvent tre lipophiles ou hydrophiles et isols par extraction.
Le terme rsine est souvent utilis pour englober tous les extractibles lipophiles
(exceptions faites des substances phnoliques) pouvant tre extraits par des solvants
organiques non polaires. De manire gnrale, les composants majeurs des rsines des bois
rsineux sont des acides gras ou leurs esters glycriques, et des terpnes. Les tannins sont des

14

oligomres de faibles poids molculaires. Ils reprsentent environ 2 5 % de la masse du
bois. Ils peuvent tre diviss en deux grands groupes : les tannins hydrolysables (mlange de
composs phnoliques simples) et les tannins condenss ou tannins cathchiques (constitus
partir de monomres appels flavonodes).

La paroi contient aussi gnralement des protines
(entre 3 et 6%) sous formes de glycoprotines comme les extensines ou des enzymes telles
que les peroxydases ou des glycosidases.
I.1.2. La paroi secondaire des cellules de bois
I. 1. 2. a. Prsentati on gnral e
La paroi secondaire se forme la fin du processus dlongation cellulaire de la paroi
primaire et se dpose lintrieur de celle-ci. Ses proprits mcaniques remarquables
permettent la plante de poursuivre sa croissance verticale tout en lui assurant une certaine
rigidit. Son rle est primordial dans le cas de cellules spcialises qui assurent entre autres
des fonctions de coordination ou de maintien. La paroi secondaire est sujette de nombreux
stress tels la tension ou la compression. Elle possde par ailleurs de nombreuses fonctions
parmi lesquelles ladhsion cellulaire, la rgulation de la croissance et un effet barrire contre
les pathognes.
11
Cest enfin le lieu de dpt des 4-O-mthyglucuronoxylanes, hmicellulose
modle de cette tude.
I. 1. 2. b. Aspect st ructural
La paroi secondaire reprsente environ 60% de la paroi cellulaire et est moins riche en
eau que la paroi primaire. Elle est constitue de trois sous-couches S
1
, S
2
et S
3
, que lon peut
distinguer visuellement grce lorientation diffrente que prennent les microfibrilles de
cellulose dans ces sous-couches. La couche S
1
reprsente 5 10% de lpaisseur total de la
paroi cellulaire et lorientation de microfibrilles de cellulose est de 60 80 par rapport
laxe longitudinal de la cellule. La couche S
2
compte pour 75 85 % de la paroi et est la plus
importante au vu des proprits mcaniques du bois. Ses microfibrilles de cellulose y ont une
orientation de 5 30 nettement plus prononc que dans la sous-couche S
3
(60 90) (Figure
1). Cette dernire sous-couche, la plus interne, est relativement fine.
La cellulose et les hmicelluloses y apparaissent nanmoins comme mieux organises
structurellement que dans la paroi primaire. Les parois secondaires sont organises de faon
hlicodale ce que Reis
12
explique au travers dune interaction avec les xylanes. En effet, dans
la paroi secondaire, il existe une troite corrlation entre la prsence des glucuronoxylanes et
lapparition dune organisation hlicodale. De plus la surface des microfibrilles de cellulose
des acides sont directement ponts suggrant que les microfibrilles sont cocristallises avec

15

les glucuronoxylanes et induisent larrangement hlicodal des microfibrilles. Plusieurs tudes
ont montr que la structure des xylanes tait elle-mme hlicodale par diffraction des rayons
X ou par calculs thoriques. Dans le cas du xylane natif (c'est--dire sans aucune substitution),
les hlices les plus stables sont des hlices droites en considrant au dpart quelles
contenaient 2 6 rsidus par tour dhlice.
13
Les rsultats obtenus ont montr que seules les
configurations avec un pas compris entre 10 et 15 (2 ou 3 rsidus par tour dhlice) sont
favorables nergtiquement. Ces rsultats sont en accord avec les rsultats de diffraction des
rayons X de Atkins.
14
Les arabinoxylanes possderaient quant eux une conformation semi-
flexible. Dans ce cas, la substitution de la chane de xylose par de larabinose naurait pas
dinfluence sur la conformation et les proprits macromolculaires des arabinoxylanes.
15
La
prsence de chanes latrales darabinose induit cependant une contrainte strique qui oriente
la conformation vers une organisation de type

three-fold helical

.
16


I. 1. 2. c. Biosynt hse de l a paroi secondaire
Le dpt de la paroi secondaire est un phnomne complexe dont le contrle et la
rgulation durant la croissance de la plante ne sont aujourdhui pas totalement expliqus.
17
De
nombreuses enzymes sont impliques dans la synthse, la modification et la dgradation des
oligo- et polysaccharides. La synthse des glycosides est ralise par des glycotransfrases,
leur modification par des carbohydrate-esterases et la rupture des liaisons glycosidiques par
des glycoside-hydrolases ou des polysaccharide-hydrolases.
Biosynt hse de l a cel lulose
Les chaines de -D-glucanes dont est compose la cellulose sont assembles chez les
plantes par la cellulose synthase, qui se prsente sous la forme de complexes enzymatiques
transmembranaires. Ces derniers sont organiss en structures hexagonales appeles rosettes
dont le diamtre est denviron 25 30 nm. Elles utilisent de lUDP-glucose (uridine-
diphosphoglucose) comme substrat de la raction afin dinduire la synthse de chaines de -
D-glucanes qui sorganisent ensuite ous forme de microfibrilles.
18

Biosynt hse de l a lignine
Les trois monolignols qui entrent dans la composition de la lignine ne diffrent que
par les substitutions sur le cycle aromatique. Ils provienent tous dun seul acide amin : la
phnylalanine. Dautres classes de molcules aromatiques contenues dans les plantes telles
que les flavonodes, les stylbnes, les coumarines et les drivs dacides benzoques, sont

16

aussi drives de la phnylalanine. Cette biosynthse est un processus multi-tapes qui fait
appel de nombreuses enzymes (lyases, transfrases, hydrolases) (Figure 6).

OH
OH
OMe
OH
OH
OMe MeO
N
O
OH
OH
OH
Phnylalanine
PAL
Cinnamate
C4H
4-Coumarate
4CL
p-Coumaroyl CoA
CCR
p-Coumaraldhyde
Caffeoyl CoA
C3H et HCT
Feruloyl CoA
CCoAOMT
CCR
Conifraldhyde
5-Hydroxy-
conifraldhyde
Sinapaldhyde
COMT F5H
Alcool p-Coumarique
Alcool Conifrilique
Alcool Sinapylique
Transport dans la paroi cellulaire
Polymrisation : peroxydases et laccases?
Lignines
CAD
CAD
CAD
SAD

Figure 6 : Schma simplifi de la voie biosynthtique des lignines chez les angiospermes daprs Boudet et al.,
19
.
Abrviations : PAL, phnylalanine ammonialyase ; C4H, cinnamate 4-hydroxylase ; 4CL, 4-coumarate CoA
ligase ; C3H, p-coumarate 3-hydrolase ; HCT, p-hydroxycinnamoyl-CoA :quinate shikimate p-
hydroxycinnamoyl-CoA transfrase ; CCoAOMT, caffoyl-CoA O-mthyltransfrase ; CCR, hydroxycinnmoyl-
CoA reductase ; F5H, frulate 5-hydroxylase ; COMT, acide caffique/acide 5-hydroxyfrulique O-
mthyltransfrase ; CAD, alcool cinnamylique dshydrognase ; SAD, alcool sinapylique dshydrognase.

En raison de leur toxicit, les monolignols ne peuvent saccumuler en grandes concentrations
dans la paroi cellulaire vgtale. Les groupes hydroxyles phnoliques de ces monolignols sont
alors glycosids pour donner des composs plus stables et non toxiques.
20



17

Biosynt hse des hmi celluloses
La biosynthse des hmicelluloses a lieu dans lappareil de Golgi et est suivie par le
dpt dans la paroi cellulaire par exocytose : des vsicules fusionnent avec la membrane
plasmique et leur contenu, ici les hmicelluloses, est relargu dans le milieu extracellulaire.
Dans le rgne vgtal, la diversit structurale des hmicelluloses est grande et dpend la fois
du type de plante et de sa localisation dans la plante. Cest pour cela que tout un panel
denzymes est ncessaire pour leur biosynthse ; des glycosyltransfrases principalement mais
des hydrolases, des lyases et des estrases peuvent intervenir afin de modifier la structure des
polysaccharides. Parmi les hmicelluloses, le galacto(gluco)mannane est celui dont la
biosynthse est la plus dtaille.
18
Dans le cas des arabinoxylanes, majoritairement prsents
chez les gramines, des activits de xylosyl-transfrases et darabonisyl-transfrases ont t
dtectes dans des fractions isoles de bl et lorge.
21
La biosynthse des glucuronoxylanes
requirt pour sa part une xylosyltransfrase. Le greffage latral des acides glucuroniques par
une glucuronyltransfrase tout comme lincorporation des groupes mthyliques nest ce
jour, pas compris.
22


Formation de la paroi secondaire
Lors de la formation de la paroi secondaire, la localisation et la fonction prcise de
chaque composant nest, l aussi, pas totalement compris. De nombreuses tudes proposent
des mcanismes de lignification de la paroi secondaire. Selon Awano et coll,
23
chez le htre
du Japon, les microfibrilles de cellulose nosynthtises sont dposes dans la couche la plus
interne de la paroi secondaire et recouvertes dune fine couche de xylanes dpose
ultrieurement. Par la suite, les dpts successifs de xylanes augmentent le diamtre des
microfibrilles leur donnant un aspect globulaire. La lignine se dpose simultanment avec les
xylanes de faon rendre homogne lapparence de la paroi cellulaire. Les complexes
lignine-hmicelluloses chez le ginko forment des tubules dont la taille dans la couche S
2
est
estime 16 nm de long, 25 nm de diamtre et 4 nm dpaisseur environ. Ils remplissent les
espaces entre les microfibrilles de cellulose
24
. Ruel et coll.,
25
prcisent ces modles chez le
peuplier (Figure 7). Ainsi les xylanes ne seraient pas dposs tous en mme temps lors de
lpaississement de la paroi cellulaire et donc pas rpartis de faon homogne. Une premire
partie des xylanes (xylanes 1 sur la Figure 7) est lie aux microfibrilles de cellulose
permettant leur agencement hlicodal.
12
Une premire couche de lignine condense est
ensuite dpose alors que les types non condenses sont dposs plus tard. La deuxime partie

18

des xylanes fortement lie la lignine saccumule avec cette dernire. Les cycles aromatiques
se positionnent de faon parallle aux microfibrilles de cellulose. Dans ce cas, les xylanes
sont des structures htes pour les prcurseurs de la lignine.
12
Lensemble des molcules de par
leur diversit structurale, leur localisation et fonction spcifique au sein de la paroi participe
la cohsion et la rigidit de la paroi secondaire.

Figure 7 : Reprsentation dun possible assemblage des polymres paritaux lors de la formation de la paroi
secondaire (daprs Ruel et al.,
25
).

La paroi secondaire se prsente alors comme un arrangement complexe et
tridimensionnel de macromolcules essentiellement polysaccharidiques, arrangement dont
Bidlack et coll.,
17
proposent une reprsentation dans le cas des poaces (Figure 8).


19




Figure 8 : Structure de la paroi secondaire chez les poaces (daprs Bidlack et coll.,
17
)








20


I. 1. 2. d. Int eracti ons entre l es pol yosides constit utifs de l a paroi
secondaire
Au sein de la paroi secondaire, les composants sont troitement associs et
interagissent via diverses associations physiques et chimiques. Ces liaisons quelles soient
covalentes, hydrogne ou ioniques ont un rle dans la structure et la stabilit de la paroi.
Cependant elles conditionnent aussi lextractabilit des polysaccharides constitutifs. Les
protocoles devront alors tre adapts selon la nature de la liaison et le type de polymre
parital extraire, la lignification de la paroi engendrant une difficult supplmentaire par
rapport la paroi primaire.
Int eracti ons cell ulose-hmi cellul oses
De nombreuses liaisons hydrogne peuvent se former entre les hmicelluloses de la
paroi et la cellulose par lintermdiaire de leurs groupements hydroxyle. Mais des liaisons
plus fortes peuvent exister. Gurjanov et coll.,
26
ont ainsi pu isoler un galactane fortement li
de la cellulose dans la paroi glatineuse de fibres de lin, paroi secondaire typique des fibres de
produits agricoles et des bois de tension. Le galactane a probablement t pig lors de la
cristallisation des microfibrilles de cellulose. Des interactions cellulose-galactomannanes ont
t caractriss par RMN
13
C
27
dans le caroube. Dans ce cas, il semblerait que les liaisons
impliqueraient uniquement les rsidus mannose. La nature de lhmicellulose intervient dans
linteraction avec la cellulose. En effet, Akerholm et coll.,
28
ont montr que le glucomannane
et le xylane, les deux hmicelluloses majoritaires du bois dpica, ne sont pas associs de la
mme faon la cellulose. Le glucomannane serait li de faon plus intime la cellulose que
le xylane, suggrant alors que ces deux polysaccharides nont pas le mme rle au sein de la
paroi vgtale du bois. Un tel constat est justifi par Tokoh et coll.,
29
qui suggrent que les
acides uroniques, que lon retrouve chez les glucuronoxylanes, empcheraient les interactions
avec la cellulose, conduisant alors des altrations de la structure pseudo-cristalline de la
cellulose.

Int eracti ons hmi cell ulose-ligni ne
Les lignines peuvent tablir des liaisons troites avec les hmicelluloses par
lintermdiaire de liaisons glycosidiques, benzyl ther et benzyl ester.
30
Dans le cas des
liaisons ester, elles stablissent souvent entre lun des groupes carboxyle dun

21

glucuronoxylane avec lun des groupes hydroxyle de la lignine.
31,32
Ces liaisons sont alcali-
labiles contrairement aux liaisons ther, plus stables tant en milieu acide que basique. Ces
dernires relient le carbone C2 ou C3 des units de xylose (dans le cas de glucuronoxylanes)
avec les carbones et du groupement phnylpropane de la lignine.
33 ,34
Dans le cas des
poaces lassociation covalente entre les arabinoxylanes, hmicelluloses majoritaires, et la
lignine se met en place via les acides phnoliques (notamment lacide coumarique, lacide
frulique et leurs dimres) qui substituent la chaine principale.
35
Les liaisons sont alors de
type ther via leur groupe hydroxy-phnol ou de type ester par lintermdiaire de leurs
fonctions carboxyliques puisque ces acides sont des molcules bifonctionnelles.
36
Il
semblerait que les liaisons engageant les acides fruliques et la lignine soient des liaisons
ther. Selon Jacquet,
37
lacide frulique serait li la position de lalcool conifrylique,
prcurseur de la lignine. Cela implique que les acides fruliques lis par des esters aux
arabinoxylanes soient co-polymriss de faon oxydative avec les prcurseurs des lignines, du
moins dans le cas des poaces. Ils apparaissent comme des points de daccroissement pour la
lignine ainsi fortement associe aux hmicelluloses. Des liaisons phnylglycosides formes
par la raction des units rductrices des xylanes avec les groupements hydroxyles
phnoliques de la lignine sont galement frquemment rencontres. Ce type de liaison est
facilement rompu en milieu acide. La structure des polysaccharides et en particulier des
hmicelluloses tout comme leur mode dassociation avec la lignine sont des facteurs
potentiellement dterminants de ldification comme de la structure finale ation de la paroi
vgtale lignifie.
La Figure 9 rsume les diffrents types de liaisons ester et ther rencontres dans les
parois lignifies. Les liaisons ester entre les fonctions carboxyliques des glucuronoxylanes,
par exemple, et les hydroxyles des lignines sont reprsentes, ainsi que les liaisons ther entre
polysaccharides et lignines. Des esters hydroxycinnamiques peuvent tre lis directement aux
polysaccharides. Un acide frulique bifonctionnel peut former des pontages covalents de type
ester-ther entre les polysaccharides et les lignines ou par lintermdiaire de lacide
dhydrodifrulique, former des ponts diester entre polysaccharides et tre thrifi la
lignine. Lacide para-coumarique nest pas impliqu dans de tels pontages. Il sassocie aux
constituants de la paroi aprs lignification sous forme de liaisons ther et surtout ester.


Figure 9 : Possibles liaisons covalentes entre les xy


Int eracti ons cell ulose
Les interactions entre la cellulose et la lignine sont
entre elles les hmicelluloses (liaisons hydrogne
covalentes) grce aux nombreux groupement
actuelle de lexistence dassociations entre la lignine et la cellulose lors de la formation de
paroi secondaire se limite principalement des
un certain niveau dorganisation des noyaux aromatiques de la
native. Ils sorienteraient prfrentiellem
cellulaire et proximit de la matrice cellulosique. Les prcurseurs de la lignine
sadsorberaient la surface des microfibrilles
influenant par la mme lorganisation spatia

22
: Possibles liaisons covalentes entre les xylanes et les lignines dans la paroi vgtale (daprs Iiyama et
coll.,
38
)
racti ons cell ulose-l igni ne
tre la cellulose et la lignine sont comparables
icelluloses (liaisons hydrogne, liaisons lectrostatiques et liaisons
nombreux groupements hydroxyles de la cellulose.
actuelle de lexistence dassociations entre la lignine et la cellulose lors de la formation de
principalement des calculs thoriques.
39,40
Ces calculs suggrent
un certain niveau dorganisation des noyaux aromatiques de la lignine dans la paroi cellulaire
Ils sorienteraient prfrentiellement de faon parallle la surface de la paroi
de la matrice cellulosique. Les prcurseurs de la lignine
sadsorberaient la surface des microfibrilles de cellulose au travers d
anisation spatiale de la lignine.

nes et les lignines dans la paroi vgtale (daprs Iiyama et
celles qui associent
, liaisons lectrostatiques et liaisons
.
30
La connaissance
actuelle de lexistence dassociations entre la lignine et la cellulose lors de la formation de la
Ces calculs suggrent
dans la paroi cellulaire
nt de faon parallle la surface de la paroi
de la matrice cellulosique. Les prcurseurs de la lignine
dinteractions fortes,

23

I.2. Les xylanes du bois
Les xylanes sont les hmicelluloses majoritaires du bois et en particulier des bois de
feuillus, dont fait partie le chtaignier. Ils nen sont cependant pas les seuls constituants.
Comme cela a t mentionn prcdemment, la paroi cellulaire est un compartiment
caractristique de la cellule vgtale riche en macromolcules de structures diversifies. Les
protocoles dextraction utiliser doivent donc tre suffisamment slectifs afin de permettre
lextraction dune catgorie de molcules tout en prservant lintgrit de leur structure. De
nombreux protocoles dextraction plus ou moins slectifs des xylanes sont dcrits dans la
littrature. Cependant selon lorigine du matriel vgtal et/ou la voie de valorisation
envisage pour les xylanes qui peuvent en tre extraits, les protocoles sont volutifs.
Dans le cas de lextraction partir du bois (Figure 10), des contraintes
supplmentaires existent. En effet, les xylanes de bois sont fortement lis la cellulose et aux
lignines. La dgradation oxydative des lignines, souvent utilis pour lextraction des xylanes,
ne permet pas disoler des structures natives. De nombreux auteurs prconisent la rupture
pralable des liaisons covalentes entre la lignine et les xylanes. La solution classique pour
extraire les xylanes est lextraction alcaline qui permet de rompre les liaisons esters entre
xylane et lignine et donc de rcuprer en solution les hmicelluloses. Dans ce cas,
lactylation native des xylanes nest toutefois pas conserve. Le schma gnral classique de
sparation des diffrents constituants du bois est prsent Figure 10.
















24




























Figure 10 : Sparation des constituants du bois (selon Baeza et Freer
41
)

Aprs les poaces o les xylanes peuvent reprsenter jusqu 50% de la masse de
certains tissus de grains de crales, le bois est la principale source de xylanes terrestres. Ils
pourront y reprsenter de 25 35 % de la matire sche du bois.
7
Les xylanes sont extraits
sous diffrentes formes structurales. Les homoxylanes (HX) composs de rsidus xyloses lis
par des liaisons -(13)(a), -(14)(b) ou mixtes -(13, 14)(c) en sont les reprsentants
les plus simples. Ils sont identifis principalement chez les algues. Cependant, Habibi et al.,
42
les ont rcemment identifis dans le pricarpe dargan.
Plus gnralement ces polymres dont les motifs D-xylopyranosyl de conformation
4
C
1
sont lis par des liaisons -(14) pouvant tre ramifis par de courtes chanes carbones
telles des acides glucuroniques, des 4-O-mthyl thers, des L-arabinose pour former des
arabinoxylanes (AX), des glucuronoxylanes (GX), ou encore des 4-O-
mthylglucuronoxylanes (MGX). Il existe galement des htropolysaccharides plus
complexes comme les glucurono-arabinoxylanes ou les arabinoglucuronoxylanes ayant la
mme structure que les AX ou les GX sur lesquels se greffent dautres monosaccharides sur
les chaines latrales.


Bois
Extractibles Bois dbarrass
des extractibles
Hydrosolubles
Solubles dans les
solvants organiques
Pectines
Rsidu
dpectinis
Extraction
Dlignification
Dpectination
Lignines Holocellulose
Cellulose
Hmicellulose
Extraction
alcaline

Eau et/ou solvants
organiques

25

O
O H
OH
O
O
O
O H
OH
O
O
O H
OH
O
O
O H
OH
O
O
OH
O H
O
O
O
OH
O H
O
OH
O H
O
O
O
OH
O H
O
O
OH
O H
O
O O
O
OH
O H O
O H
OH
O
O
OH
O H
O
a
c
b




Figure 11 : Structures dhomoxylanes (selon Ebringerova
43
)

Les glucuronoxylanes (GX) sont des hmicelluloses trs prsentes dans le bois
notamment de feuillus.
2
Ils possdent outre la chane xylane un groupement acide 4-O-
mthyl--D-glucopyranosyluronique li la chane principale en position 2. La proportion 4-
O-mthyl--D-glucopyranosyluronique/xylose est variable selon les conditions dextraction
utilises ; le ratio est en moyenne de 1 pour 10.
7

CH
3
O
O
O H
OH
O
HOOC
CH
3
O
O
O H
OH
O
HOOC
OH
O
O
O H
O
O H
OH
O
O
O
O H
O H
O
O H
OH
n


Figure 12 : Structure du 4-O-mthyl-D-glucurono-D-xylane (MGX) (selon Ebringerova
43
)

Cette structure appele 4-O-mthyl-D-glucurono-D-xylane (MGX) est lhmicellulose
principale du bois de chtaignier. A ltat natif, les xylanes sont O-actyls en position 2 et/ou
3.
44

I.2.1. Les traitements pralables lextraction
La grande diversit structurale de la paroi ainsi que du matriel vgtal (ici le bois)
partir duquel les xylanes sont extraits ncessitent au pralable divers traitements afin
damliorer lextractabilit de ces polysaccharides paritaux. Quils soient physiques (broyage
1
2
3

26

explosion la vapeur, ultrasons), ou chimiques (alcalis, chlateurs de mtaux, oxydants,
acides), ils ont pour but daltrer les proprits physiques, de rduire la surface de contact ou
dliminer certaines molcules non-dsirables (extractibles, lignines, )

I. 2. 1. a. Le broyage
La granulomtrie et la forme des particules solides ont une influence sur le rendement
dextraction. Il a t montr que le rendement dextraction en hmicelluloses est inversement
proportionnel la taille des particules solides. Le broyage rduit la taille des particules,
augmentant ainsi la surface dchange disponible pour le solvant dextraction par exemple.

I. 2. 1. b. Elimi nati on des ext racti bles
Dans le bois, les extractibles correspondent essentiellement aux tannins, aux composs
aromatiques, aux phnols, aux sucres circulants et aux flavonodes et peuvent donc tre
extraits par des mlanges de solvants tels thanol-eau, thanol-benzne ou thanol-tolune.

I. 2. 1. c. Elimi nati on des lipides
Lextraction des lipides au dichloromthane permet de les liminer pour faciliter la
rduction de la matire en farine notamment.

I. 2. 1. d. Dprot i nation
Les protines peuvent tre limines par une simple extraction leau chaude ou
leau froide, ce qui risque cependant de solubiliser une partie des hmicelluloses qui nous
intressent. Des protases peuvent galement tre utilises dans le cas de matriels fortement
protins.
I. 2. 1. e. Dpecti nati on
Les pectines sont extraites selon leur degr de mthylestrification. Les pectines
fortement mthylestrifies sont facilement extraites par leau chaude alors que lextraction
des pectines faiblement mthylestrifies ncessite lutilisation de chlateurs de calcium tels
le CDTA, lEDTA, limidazole ou encore loxalate dammonium. Le recours des enzymes
pectinolytiques peut galement tre envisag une chelle industrielle.


27

I. 2. 1. f . Dl ignif ication
La prsence dune trame phnolique intimement lie aux xylanes dans le bois ne
favorise pas leur extraction, do limportance de ltape de la dlignification. Celle-ci
augmente laccessibilit des ractifs aux constituants de la matire vgtale. Le rsidu obtenu,
constitu alors de cellulose et dhmicelluloses est appel holocellulose. Lors de ltape de
dlignification, on remarque un blanchiment du substrat caus par lextraction ou la
dgradation des lignines. Cette dcoloration recherche entre autres dans lindustrie papetire
est explique par la prsence dacides hexnuroniques qui contribue en partie la couleur de
ce substrat.
45,46

De nombreuses procdures de dlignification sont dcrites dans la littrature. Elles se
basent soit sur lextraction des lignines, soit sur leurs dgradations oxydatives. Dans ce
dernier cas, lunit C
9
phnylpropane (Figure 13) caractristique des monomres de lignine
nest pas conserve.

O H C C C


Figure 13 : Unit C
9
phnylpropane

La mthode daci dol yse
Ces mthodes non dgradatives des cycles phnoliques permettent dextraire les
lignines. Elles sont hydrolyses et il en rsulte la formation de produits homologues des trois
alcools monomres prcurseurs. Cette mthode est galement utilise pour caractriser les
lignines selon leurs proportions relatives en trois types de produits dacidolyse. Le systme de
solvant le plus utilis est le dioxane/HCl
47
o gnralement le dioxane est hauteur de 80-
85% et la concentration en HCl peut varier de 10 mM 2 M. Le dioxane peut galement tre
remplac par le THF moins nocif.
La mthode dactol yse
Cest une mthode de dgradation des lignines par lacide thioactique qui conduit
lhydrolyse les liaisons ther-benzyliques, et donc la dpolymrisation des lignines. Cette

1
2 3
4
5 6

28

mthode est utilise afin de caractriser la fois les units condenses et non-condenses de la
lignine.
47

Le syst me acide f ormique/ aci de actique
Ces mthodes base dorganosolvants sont des alternatives sans soufre pour la
dlignification du bois.
48
Lacide formique a t utilis comme agent de dlignification pour
la premire fois en 1917
49
mais ce nest que dans les annes 1980 que des tudes sy sont
rellement intresses. Mme si certains protocoles ne font appel qu de lacide formique
dilu,
50
la plupart ont recours des systmes de solvants acide formique/ acide actique/eau.
Lacide formique semblerait jouer le rle de donneur de proton,
32,51
ce qui aurait pour effet
dhydrolyser les lignines tandis que lacide actique solubiliserait les fragments. Cette
dissolution est possible suite au clivage des liaisons ther dans la lignine.
52

La mthode doxydat ion par le nitrobenzne
Depuis le milieu du XXme sicle o elle a t introduite, cette mthode fut lune des
plus utilises malgr la trs grande toxicit du nitrobenzne. Elle permet aussi de caractriser
les lignines mais de faon limite par rupture oxydative entre les carbones et de la chane
propane des units monomriques des phnylpropanes (Figure 13). Cependant ce systme ne
peut pas couper certaines liaisons ther des units condenses.
47

La doubl e oxydation par l e permanganat e et leau oxygne
Au pralable de cette oxydation, les fonctions phnoliques sont mthyles pour
prvenir la dgradation du cycle aromatique. Le permanganate de potassium rompt les
liaisons entre les carbones et des phnylpropanes. Aprs une seconde mthylation, leau
oxygne complte la dgradation de la chane propane en conduisant lobtention de
squelettes en C
7
pour les units non condenses et en C
14
pour les units condenses, ce qui
permet de caractriser les deux types dentits.
47,53

Oxydation par l e systme chlorit e de sodi um/aci de act ique
Cette mthode est sans doute la plus utilise. Elle a t dcrite par Green
54
et Adams
55

et fait intervenir une solution aqueuse de chlorite de sodium tamponne par de lacide
actique. En gnral deux traitements de deux heures 80C suffisent pour dlignifier des
sciures de bois. Bien que le chlorite lui-mme ne soit pas trop agressif, du chlore et lacide

29

hypochloreux, beaucoup plus ractifs, sont librs in situ, ce qui permet loxydation des
structures phnoliques et non phnoliques de la lignine par rupture de double liaison C=C.
Dautres mthodes plus douces ont recours une solution dilue dacide peractique.
Les mthodes enzymatiques
La lignine, de par sa structure, est trs rsistante de nombreux agents chimiques et
biochimiques et nest dgrade que par un petit nombre dorganismes comme certaines
bactries ou champignons. Ce sont en fait les enzymes extracellulaires biosynthtises et
scrtes par ces organismes qui parviennent dgrader la lignine en CO
2
et H
2
O.
Dcouvertes dans les annes 80, elles nont depuis cess dtre tudies pour des applications
industrielles pour le blanchiment de la pte papier. Il existe trois principaux types
denzymes appeles lignolytiques : les laccases, les manganse-peroxydases et les lignine-
peroxydases, caractrises par des potentiels redox levs.
56


- La manganse-peroxydase (MnP)
Cette enzyme agit sur la lignine via lion Mn
3+
sous forme complexe mais seule, elle
est incapable dattaquer la paroi lignocellulosique dans son intgralit. Elle a besoin pour cela
de laction synergique dautres enzymes. De plus son activit sur les polysaccharides est nulle
dans une gamme de pH comprise entre 3,5 et 7, mais des composs modles de la lignine sont
quant eux oxyds pH 4,5.
57
Les protocoles de la littrature (Figure 14) utilisent une
solution tampon de malonate pH 4,5 37C dans laquelle est ajout la manganse-
peroxydase, du MnSO
4
, un surfactant (le tween 80), un compos oxygn (O
2
ou H
2
O
2
) et la
lignine oxyder.
58,59









Figure 14 : Oxydation de la lignine par la manganse-peroxydase (Gold and Glenn.,
60
)


Lignine
ox
Lignine

Mn(II)

H
2
O
Mn(III)

MnP
MnP
ox

H
2
O
2

Malonate de Mn(III)
Malonate

30

- La lignine-peroxydase (LiP)
La lignine-peroxydase est une glycoprotine denviron 41 kDa contenant 1 mole de
protoporphyrine IX de fer par mole denzyme. Elle est capable doxyder les modles non-
phnoliques de lignine
56
un pH optimal de 3 en prsence de peroxyde dhydrogne selon
lquation 1
61
et schmatis par la Figure 15
62
mais elle est sensible un excs de ce dernier.

LiP(Fe
3+
)P + H
2
O
2
LiP-I-(Fe
4+
-O)P

+ H
2
O
LiP-I(Fe
4+
-O)P

+ R LiP-II(Fe
4+
-O)P + R

LiP-II(Fe
4+
-O)P + R + 2H
+
LiP(Fe
3+
)P + R

+ H
2
O

quation 1 : Oxydation de lignine par la lignine-peroxydase en prsence de peroxyde dhydrogne





















Figure 15 : Cycle catalytique de la lignine-peroxydase
62

- La laccase
Les laccases sont des oxydases trs largement rpandues dans le rgne vgtal et
fongique. Dcouvertes par Yoshida en 1893, elles sont sans doute les plus tudies.
63,64
Ce
sont des enzymes cuivre dont la premire caractrisation a t faite par Bertrand
65
en 1985.
Associes des mdiateurs, elles oxydent les cycles phnoliques des enzymes en utilisant
loxygne comme accepteur final dlectrons. Le site actif est compos de 4 atomes de
cuivre : le premier isol, est responsable de loxydation des phnols ; un cluster de 3 atomes
de cuivre, est responsable de lactivation du dioxygne.
66
Cependant, seule, elle ne peut
oxyder les composs non-phnoliques et pntrer dans la fibre du bois; le recours un
mdiateur est indispensable. Celui-ci jour le rle de navettes dlectrons qui, aprs tre oxyd
Enzyme

P

Fe
III
H
2
O
2
H
2
O
H
2
O
2
H
2
O
P
+
Fe
IV
O

Compos I
P

Fe
IV
O

Compos II
Lignine

Lignine
+

P

Fe
III
O
2
-
Compos III
Lignine

Lignine
+


31

par lenzyme, diffuse autour du site activ pour oxyder les substrats alors que lenzyme, de
par sa taille, ne pourrait entrer directement dans cette maille lignocellulosique. Cest une
raction radicalaire dont le principe est dcrit en Figure 16.
67










Figure 16 : Proposition de mcanisme daction de la laccase

Dans le cas doxydation des composs non-phnoliques ou pour le blanchiment de la
pte papier, la plupart des protocoles
68-70
utilisent la laccase en milieu tamponn (citrate,
tartrate ou actate de sodium) et oxygn (O
2
) un pH compris entre 4 et 5,5, une temprature
infrieure ou gale 50C de faon ne pas dnaturer lenzyme et entre 30 minutes et 24 h.
Les mdiateurs les plus souvent utiliss sont lABTS (acide 2,2-azino-bis(3-
thylbenzothiazoline-6-sulfonique)), lacide violurique et le HOBt (1-hydroxybenzotriazole)
(Figure 17) mais lutilisation de mdiateurs naturels
71
comme la vaniline et ses drivs ou
encore des di et trimthylphnols (Figure 18) permettent galement la dlignification mais
dans de moindres proportions que les prcdents mdiateurs.

S
HO
3
S
S
N
N N
N
SO
3
H
N
N
H
O
O
N OH
O
H
N
N
N
OH


Figure 17 : Principaux mdiateurs utiliss (daprs la littrature)

OH
O
OMe
OH
OH



Figure 18 : Exemples de mdiateurs naturels

ABTS Acide violurique HOBt
Substrat
ox
Med
ox
Med

Substrat

Laccase
Laccase
+

H
2
O
O
2
+ 2H
+

Vaniline 2,6-dimthylphnol 2,4,6-trimthylphnol

32

En matire de dlignification, la mthode enzymatique est sduisante dans la mesure
o elle est la fois simple mettre en uvre et quelle ne ncessite lutilisation daucun
produit chlor, polluant pour lenvironnement. Nanmoins, le cot des mdiateurs et de
lenzyme ainsi que la fragilit de cette dernire vis--vis des conditions drastiques sont deux
des inconvnients majeurs de cette mthode pour une utilisation lchelle industrielle dans
le cadre de la dlignification de bois ou le blanchiment de la pte papier.
En plus des mthodes classiques cites ci-dessus, il existe dautres systmes de
dlignification moins connus qui tendent nanmoins se dvelopper. Ces derniers prsents
ci-dessous sont des alternatives aux mthodes doxydation classiques.
Les phtalocyanines et les porphyrines
En raison notamment de leur sensibilit vis--vis dun excs doxydant, leur instabilit
et leur cot de purification, les enzymes peuvent tre aujourdhui remplaces par des
composs synthtiques de la famille des porphyrines et des phtalocyanines, des analogues des
groupes prosthtiques des peroxydases qui sont capables de mimer leur action catalytique. En
effet, des enzymes telles la lignine-peroxydase ou la manganse-peroxydase possdent un
centre actif constitu dun hme (Figure 19), c'est--dire un cofacteur contenant un atome de
fer servant accueillir un gaz diatomique (souvent le dioxygne).
N
N
N
N
HOOC
HOOC
Fe

Figure 19 : Hme de type b

En prsence de peroxyde dhydrogne, ce noyau porphyrinique complex du Fe III
ralise une oxydation un lectron sur les composs aromatiques de la lignine.
62
Dans le cas
des peroxydases, il sagit dune protoporphyrine IX de fer.

33

Rappelons que les porphyrines sont des macromolcules ttrapyrroliques qui peuvent
tre neutres (ttraphnylporphyrine, benzoporphyrine), cationiques (ttraalkylpyridinium
porphyrine) ou anioniques (ttrasulfophnylporphyrine).
62,72
En particulier dans ces deux
derniers cas, le caractre ionique des structures induit une importante hydrosolubilit. Avec
des groupements chlores ou fluors, elles miment de faon remarquable les lignine-
peroxydases en rompant les mmes liaisons (C

-C

(Figure 13), les liaisons -O-4,
hydroxylation des groupes mthyle benzne, la formation de glycol partir dune double
liaison C

=C

, loxydation des cycles aromatiques).


73
Elles peuvent tre aussi supportes sur
des argiles
74
et mtalles par tous les mtaux (Figure 20).
N
N
N N
N
N
N N
M
Porphyrine base libre Porphyrine mtalle

Figure 20 : Structure gnrale des porphyrines

Les mtallophtalocyanines (MPcS) (Figure 21) sont des molcules trs proches des
mtalloporphyrines dun point de vue structural mais qui ont lavantage dtre faciles
prparer et plus stables.
75
Leurs drivs sulfons, hydrosolubles, sont donc tout
particulirement tudis comme modle possible de peroxydase
76
mais galement pour
loxydation de polluants aromatiques chlors
77
ou encore la dgradation de composs modles
de la lignine comme le catchol.
78
Linfluence du mtal de la phtalocyanine est galement
tudie et comme pour les porphyrines, le fer et le manganse semblent plus efficaces mme
si le nickel, le cuivre ou le cobalt ont montr une certaine activit pour une oxydation par le
peroxyde dhydrogne.
76
Lors de la raction, les MPcS sont oxydes par leau oxygne pour
ensuite oxyder leur tour la lignine.
75

N
N
N
N
N
N
N
N
M

Figure 21 : Structure gnrale des phtalocyanines

34

Les protocoles de dlignification par les phtalocyanines et les porphyrines dcrits dans
la littrature sont assez similaires, la raction a lieu dans des solutions tampons en prsence de
la matire dlignifier et de H
2
O
2
avec des temps et tempratures variables.
Enfin, laction des peroxydases peut aussi tre mime par le ractif de Fenton, qui
reprend le mme mode daction ; il sagit dune solution contenant du peroxyde dhydrogne
et des ions ferreux (Fe
2+
) souvent introduits par lintermdiaire de FeSO
4
. Lion ferreux est
oxyd par le peroxyde dhydrogne et donne un ion et un radical hydroxyde. Lion ferrique
(Fe
3+
) est alors oxyd en retour pour donner un ion ferreux, un proton et un radical peroxyde
(HOO

).

Lozonol yse
Lozone est un gaz la fois considr comme un agent protecteur naturel trs prsent
dans la stratosphre mais aussi comme un polluant toxique pour les organismes vivant
prsents dans la troposphre.
79
Cette molcule est une substance hautement oxydante qui est
produite par dcharge lectrique dans du dioxygne. Cest un puissant agent de dlignification
notamment utilis dans lindustrie pour le blanchiment des ptes papetires.
80
Il ragit avec la
lignine provoquant une diminution de la viscosit des fibres qui saccompagne galement
dune dpolymrisation et de la dgradation des polysaccharides et parfois de la cellulose.
Cela est d sa faible slectivit en comparaison avec les produits chlors. En effet, durant le
processus de blanchiment on constate lapparition de radicaux hydroxyles hautement ractifs
et non slectifs. Pour minimiser cette raction, lozone peut tre utilis en milieu acide.
Lozonolyse a galement t utilise comme technique danalyse par Demin et al.,
81
afin de
prouver la nature aromatique de la lignine, dterminer les substituants des cycles aromatiques
et tudier la structure tri-dimensionnelle des chaines latrales des units phnylpropanes.
Cependant le mcanisme de dgradation de la lignine par lozone nest pas totalement lucid.
Il inclut des ractions de lozone avec les chanes latrales de la lignine. Ces ractions de type
radicalaires conduisent la formation de produits condenss de la lignine et de fonctions
hydroperoxydes.
79
Cest ce quillustre la Figure 22 o les noyaux aromatiques des lignines
sont convertis en un analogue de la quinone.
82


35

OH ou lignine
Lignine
OH
OMe MeO

O
3
R
O
OMe MeO
O
H
O
O
-
R
MeO
O
O
O
2
CH
3
OH
1
2
3
4
5
6
Lignine
+
+ +


Figure 22 : Proposition de mcanisme de la conversion de la lignine par lozone (selon Lyse
82
)

Dans le cas de lignine comprenant une unit phnylpropne ou des alcnes, lozonolyse se
fait sur la double liaison via une cycloaddition 1,3 dipolaire comme indique sur la Figure 23.
R
OH
OMe
O
3
OH
OMe
H
H
R
O
O
O
OH
OMe
H O
R C
H
O O
-
+
+
Lignine

Figure 23 : Proposition de mcanisme lors de la raction dune double liaison et de lozone dans la lignine (selon
Lyse
82
)

La raction de lozone via une addition 1,3 dipolaire sur une double liaison du cycle
aromatique dune unit C
9
(Figure 13) de la lignine conduit plus rarement son ouverture (1
cas sur 20).
82

La dlignifi cati on photochi mique
La lignine est un chromophore qui peut subir des ractions de photooxydation. Elle
absorbe dans la rgion 280-300 nm et la prsence de groupes fonctionnels absorbant entre 300
et 400 nm expliquent la couleur jaune que peut revtir le papier. La dgradation
photochimique de la lignine peut se faire selon plusieurs processus : lirradiation
photochimique directe ou lutilisation dune radiation (UV par exemple) pour produire des
radicaux et/ou de loxygne singulet. Dans le cas de lirradiation directe, plusieurs types
dappareillages sont utiliss comme les lampes mercure haute pression (dont la longueur
donde est coupe 300 nm),
83
les lampes halognes tungstne (lirradiation tant coupe
400 nm),
84
des lampes UV-visible plus large spectre ( : 350-700 nm,
max
=575 nm),

36

lirradiation se faisant le plus souvent entre 280 et 350 nm. Il est galement possible de
recourir des semiconducteurs comme catalyseurs de la dgradation chimique des
lignines
85,86
comme cest couramment le cas avec TiO
2
ou ZnO, le dernier tant le plus
efficace.
87
En milieu aqueux et en prsence du catalyseur, la lignine est dgrade plus
facilement, ce qui induit la nette diminution de lintensit de labsorption des longueurs
donde comprises entre 200 et 350 nm. Les radiations UV peuvent galement servir la
production doxygne singulet
1
O
2
ou des radicaux hydroxyles HO

. Ces derniers sont forms


notamment lors du clivage homolytique du peroxyde dhydrogne par action de la lumire
UV. Le radical form, une espce fortement oxydante (E = 2.32 V pH = 7) peut alors
directement ragir avec la lignine par addition sur les cycles aromatiques de faon former
des radicaux hydroxycyclohexadinyles
9
(Figure 24).
R
H
OH
R
HO
.
.

Figure 24 : Formation de radicaux hydroxycyclohexadinyles

Loxygne singulet
1
O
2
est linstar des radicaux hydroxyles une puissante espce
oxydante qui peut tre induite par transfert dnergie de groupes carbonyles excits ou de
doubles liaisons conjugus avec des cycles aromatiques vers de loxygne triplet
3
O
2
. Sous
leffet dune irradiation lumineuse (UV ou visible), en prsence de dioxygne et dun
photosensibilisateur comme le Rose de Bengale (Figure 25) par exemple, il est aussi possible
de produire de loxygne singulet.
9,83,84
Dautres photosensibilisateurs comme les porphyrines
base libre ou certaines phtalocyanines peuvent galement former de loxygne singulet aprs
irradiation.
88,89

O O
I
I I
ONa
I
Cl
Cl
Cl
Cl
NaO
2
C

Figure 25 : Le photosensibilisateur Rose de Bengale


37

Cest aussi le cas lors de lirradiation de peroxydes en milieu alcalin. Loxygne singulet
peut intervenir dans un trs grand nombre de ractions notamment dans les ractions de
cycloadditions avec les groupes lectroniquement riches comme les alcnes et les drivs
aromatiques. Malgr sa slectivit envers les noyaux aromatiques de la lignine, Hwang et
al.,
83
ont observ la dgradation concomitante de la cellulose aprs que la lignine ait t
dgrade hauteur de 50%.
Autres processus de dli gnifi cation
Dans le cadre de chimie verte, de nombreux processus totally chlorine free (TCF)
furent dvelopps en utilisant comme nous lavons dj prsent du peroxyde dhydrogne,
de loxygne ou de lozone comme oxydants. Cependant, leur principal inconvnient est un
manque de slectivit d aux radicaux forms, attaquant aussi bien la cellulose que la lignine.
Un nouveau catalyseur, le mthyltrioxorhnium (MTO), (Figure 26) est propos par Crestini
et al.,
90, 91
pour oxyder la lignine en combinaison avec le peroxyde dhydrogne.
Re
CH
3
O
O
O

Figure 26 : Le mthyltrioxorhnium

Le MTO a suscit en quelques annes un trs grand intrt en raison du nombre de ractions
quil peut catalyser comme loxydation des alcnes, des alcynes, des phosphines, des
composs soufrs Associ en milieu acide faible (acide actique) H
2
O
2
, il est capable
doxyder les composs aromatiques de la lignine quils soient phnoliques ou non
phnoliques. Les chaines alkyles latrales sont oxydes et fragmentes tandis que les parties
aromatiques sont hydroxyles, dmthyles et louverture du noyau ralise par des ractions
doxydation. Le MTO peut galement tre immobilis sur des polymres tels les
polyvinylpyridines ou des polystyrnes de faon pouvoir rutiliser ces catalyseurs.

I.2.2. Les solvants dextraction des xylanes
I. 2. 2. a. Les sol vant s organiques
Le dimthylsulfoxide (DMSO) et le dimthylformamide (DMF) ont t utiliss pour
lextraction des hmicelluloses. Par rapport aux solutions alcalines, ces solvants organiques

38

favorisent lextraction des hexosanes. Lextraction par le DMSO prsente lavantage de
prserver lactylation des xylanes
92-94
qui sont saponifis lors des extractions alcalines
aqueuses. Ce mode dextraction fournit donc des fractions trs proches de lhmicellulose in
situ, mais le rendement dextraction est relativement faible (<50%). Il a rcemment t utilis
par Teleman et al.,
94
pour lextraction de glucuronoxylanes de htre et de bouleau.

I. 2. 2. b. Les solut ions al cal ines
Les solvants dextraction les plus utiliss sont les solutions alcalines (soude, potasse,
chaux, ou encore carbonate de potassium, formiate de sodium et ammoniac). Cependant, si
lon excepte la potasse et la soude, les autres bases ne ragissent efficacement que lorsquelles
sont utilises en grande quantit pendant des temps relativement longs. Lutilisation de la
chaux Ca(OH)
2
permet en particulier le maintien dun pH constant au cours de la raction et
conduit lextraction de fractions hmicellulosiques de couleur blanche par rapport celles
extraites avec les autres bases.
95

La soude est la base la plus frquemment employe pour le traitement des produits
ligno-cellulosiques. Elle augmente la capacit dabsorption deau, provoque le gonflement des
fibres cellulosiques,
96
et augmente ainsi la surface spcifique par augmentation du volume du
solide amliorant laccessibilit des ractifs. Le mcanisme daction de la soude reste mal
connu ; plusieurs hypothses ont t formules : sous laction de la soude, la proportion de
liaisons hydrogne intermolculaires serait rduite par solvatation
96
ainsi que celle des
liaisons entre les hmicelluloses et la lignine. Par ailleurs, les alcalis hydrolysent notamment
les liaisons esters entre les polysaccharides et les acides hydroxycinnamiques.
97
Le rendement
dextraction augmente avec la concentration en soude ; cest pourquoi de nombreux
protocoles dextraction dits squentiels utilisent des bases de concentrations croissantes.
Les solutions de potasse sont galement utilises pour extraire les hmicelluloses. La
potasse apparat plus slective que la soude vis--vis de lextraction des xylanes, quils
proviennent de feuillus ou de rsineux.
98,99
De plus, lactate de potassium form au cours de
la neutralisation avec lacide actique est plus soluble dans lthanol utilis pour faire
prcipiter les hmicelluloses que lactate de sodium,
100
donc plus facilement limin.
Lutilisation de solutions alcalines prsente cependant des inconvnients. Outre le fait
quelle provoque la saponification des polysaccharides estrifis, lextraction par des bases
peut entraner llimination du groupement mthoxy en position 4 des acides uroniques pour

39

donner un intermdiaire acide 4-doxyhex-4-nuronique. Aprs -liminations successives, ce
driv se dcompose et est finalement limin (Figure 27). Il semble quune partie des acides
uroniques des 4-O-mthylglucuronoxylanes soit limine et dgrade
101
pour des extractions
alcalines des tempratures leves. Il est galement connu quen milieu alcalin, des
rarrangements peuvent survenir sur lextrmit rductrice des polysaccharides (Figure 28),
saccompagnant de phnomnes de peeling par des mcanismes de -limination.
102
En
effet, le rsidu situ lextrmit terminale rductrice dun polysaccharide peut, sous laction
dune solution alcaline dilue, subir une isomrisation partielle sur le C-2 pour donner le
ctose correspondant laldose pimre : cest la transformation de Lobry de Bruyn - Alberta
van Ekenstein. Ces ractions peuvent tre vites en oprant en milieu rducteur.
O
O
OH
OH
O
O
Xylane
OH
OH
OMe
COOH
O
O
OH
OH
O
O
Xylane
OH
OH
COOH
-CH
3
OH
O
O
OH
OH
O
O
Xylane
OH
OH
COOH
O
OH
O
COOH
O
OH
OH
O
OH
Xylane
+

Figure 27 : Dgradation des units dacide uronique en milieu basique (Lai
103
)
1
2
3
4
5

40

O
O
OH
O
OH
Xylane
OH
OH
OR
OH
O
R= Xylane
- H
2
O
OH
OR
OH
C
H
O
OH
OR
OH
COOH
OH
OH
OR
O
CH
2
OH
CH
2
OH
CHO
-
O OH
CH
2
OH
OR
CH
3
OH
COOH
OR
H
2
C
OH
CH
2
OH
O H O
OH
CH
2
OH
OH
COOH
RO-
OH
O H
CH
2
OH
O H O

CHOH
CH
3
COOH
CH
2



Figure 28 : Dpolymrisation (peeling) des xylanes en milieu alcalin (adapt de Lai
103
)

I. 2. 2. c. Leau
Les xylanes tant solubles dans leau, il apparat donc naturel denvisager leau
comme solvant pour leur extraction dautant quil prserve la structure native des xylanes et
quil est non polluant. Pourtant, trs peu de rfrences ont recours lextraction aqueuse des
xylanes car bien quhydrosolubles, ils nen demeurent pas moins faiblement extractibles par
leau.
104
Souvent, lutilisation de leau est couple une mthode physique comme les micro-
ondes
105
ou les ultrasons (US)
51, 106
ou un milieu acide.
107


41

I.2.3. Les conditions dextraction
La richesse de la paroi vgtale requiert la mise en uvre de techniques dextraction
slective des hmicelluloses qui devront tre adaptes chaque famille de substrats
lignocellulosiques. Ces techniques sont thermiques ou physiques.

I. 2. 3. a. Le chauffage classique
Quel que soit le solvant, le rendement dextraction en hmicelluloses augmente avec la
temprature. Cependant, au-del de 100C dans les solvants organiques (DMSO par
exemple), des dgradations, essentiellement des dpolymrisations, peuvent avoir lieu par
rupture des liaisons glycosidiques. Ainsi, lutilisation de solvants ncessite des conditions
moins drastiques, savoir des tempratures plus faibles et des temps de ractions plus longs.

I. 2. 3. b. Lextraction la vapeur
Lextraction la vapeur (steam explosion) est une mthode largement rpandue pour
sparer les diffrents constituants de la biomasse : la cellulose, les hmicelluloses et la
lignine. Laction de la vapeur rompt les liaisons hydrogne et les liaisons chimiques entre la
lignine et les autres constituants. Cette mthode prsente lavantage de ne pas dgrader
totalement les actyles des hmicelluloses contrairement la mthode alcaline. Cependant,
certains groupements sont hydrolyss sous laction de la pression pour donner de lacide
actique qui hydrolyse lui-mme les hmicelluloses extraites abaissant leur degr de
polymrisation et pouvant ainsi donner des oligomres.
108
Les paramtres opratoires de
dure, de temprature et de granulomtrie du matriel vgtal extraire sont importants afin
de ne pas totalement dgrader les hmicelluloses en drivs du furfural dans le cas de
conditions drastiques. Des xylanes de paille de bl,
109
dorge
110
et dpica ont dj t
extraits par cette technique qui prsente lavantage dtre non polluante pour lenvironnement.

I. 2. 3. c. Les ultrasons
Depuis une dizaine dannes, lutilisation des ultrasons pour lextraction des
hmicelluloses connat un dveloppement important selon la littrature. Leffet ultrason
trouve son origine dans la rupture de bulles de cavitation, formes par les vibrations
mcaniques, proximit de la paroi ce qui provoqueraient la lyse des cellules vgtales et
permettrait ainsi une bonne pntration du solvant.
111
Les extractions bases sur la sonication
sont employes pour de nombreux composs notamment issus des plantes comme les

42

principes actifs
112
et sont au moins comparables des mthodes plus classiques comme le
Soxhlet.
113
Ebringerov et Hromdkov se sont beaucoup intresses la sonication en milieu
alcalin pour lextraction des hmicelluloses et en particulier celle des xylanes
106, 114-116
de
mas, de sauge, de sarrasin ou de son de bl. Elle conduit non seulement de meilleurs
rendements dextraction mais aussi une meilleure qualit des extraits obtenus des
tempratures plus faibles et pour des dures dextraction plus courtes.

I. 2. 3. d. Les mi cro-ondes
Trs couramment employe en synthse organique, lutilisation des micro-ondes est
aujourdhui largie lextraction de polysaccharides. Le principe du chauffage micro-ondes
est bas sur leffet direct du rayonnement sur les molcules par conduction ionique et rotation
dipolaire. Ces deux phnomnes ont lieu simultanment. La conduction ionique est la
migration lectrophortique des ions quand un champ lectromagntique est appliqu ; la
rsistance de la solution au flux des ions rsulte en une friction qui chauffe alors la solution.
La rotation dipolaire est en fait le ralignement des diples avec le champ qui est appliqu.
117

Des xylanes de peuplier,
105
bouleau, dpica
118
et de lin
119
ont t extraits par les micro-
ondes dans leau. Il en rsulte une dpolymrisation partielle
118, 119
mais il apparat que peu de
groupements actyles et acides 4-O-mthylglucuroniques
105
disparaissent au cours du
traitement par les micro-ondes.
I.3. Caractrisation des hmicelluloses du bois
Ltude dun polysaccharide requiert lobtention des informations suivantes :
- La composition osidique la fois qualitative et quantitative
- La nature des liaisons glycosidiques (position de lanomrie)
- La quantification et la localisation des groupes actyles
- Le degr de polymrisation
- La structure tridimensionnelle du polysaccharide
I.3.1. Dtermination de la composition chimique
I. 3. 1. a. Compositi on cent si mal e
Les mthodes colorimtriques sont des techniques de dosage simples mettre en
uvre et rapides, qui sappliquent aussi bien des rsidus solides qu des extraits et
permettent de doser de manire globale les oses totaux et de manire spcifique les acides
uroniques.

43

O H OH
CH
3
OH
O
Phnol Anthrone
Orcinol

Figure 29 : Exemples de chromognes utiliss pour les dosages colorimtriques

Le principe des dosages colorimtriques repose sur la condensation, par estrification,
dun chromogne (Figure 29) avec les produits de dshydratation des pentoses, hexoses et
acides uroniques. En milieu acide fort et chaud, ces oses se dshydratent respectivement en
des drivs du furfural, 5-hydroxymthylfurfural et de lacide 5-formylfuroque (Figure 30).
O
H
O
O
O H
H
O
O
O H
OH
O
Furfural 5-hydroxymthyl furfural Acide-5-formylfuroque

Figure 30 : Drivs furfuriques obtenus par dshydratation des pentoses, des hexoses et des acides uroniques

Les chromophores ainsi forms absorbent dans le domaine du visible
proportionnellement avec la quantit doses prsents. Le dveloppement de la coloration, la
longueur donde laquelle on observe labsorption maximale, ainsi que lintensit de
labsorbance dpendent des ractifs, de la nature et de la structure dose dos (hexose,
pentose, acide uronique ou sucre rducteur) et des conditions de raction (temprature, temps
de raction et concentration de lacide).
Dosage des oses totaux
Le dosage de la quantit de oses totaux, mesure selon la mthode de Dubois et al.,
120

utilise le phnol plus sensible la dtermination quantitative des oses que des chromognes
tels que le naphtol ou lanthrone.
Dosage des acides uroniques
Le mta-hydroxydiphnyle en prsence de ttraborate de sodium a t utilis comme
chromophore slectif lors du dosage des acides uroniques.
121
Les concentrations relatives en
oses neutres et en acides uroniques des solutions polysaccharidiques ont t dtermines par
la mthode de correction dveloppe par Montreuil et Spick.
122
Il est alors possible de

44

corriger les interfrences des acides uroniques dans le dosage des oses totaux et
rciproquement.
Dosage des oses rduct eurs
Le pouvoir rducteur des glucides peut tre dtermin par la mthode de Somogyi
123

ou par celle lacide parahydroxybenzoque hydrazide (PAHBAH) de Lever
124
dcrite dans la
partie exprimentale. Le principe des dosages y est galement dtaill. Le rapport des
quantits des oses totaux et des oses rducteurs donne la valeur du degr de polymrisation
(DP).
I. 3. 1. b. Compositi on monosacchari dique
Pour dterminer la composition osidique dun polysaccharide, on opre le plus souvent
par sparation et dtection des monomres constitutifs aprs leur hydrolyse. La mthode
utilise pour rompre les liaisons glycosidiques doit permettre lhydrolyse complte des
liaisons tout en prservant les monomres obtenus de toute dgradation secondaire. Les
monosaccharides librs sont ensuite analyss avec ou sans drivation pralable aussi bien en
HPLC (chromatographie liquide haute pression) que par CPG (chromatoraphie en phase
gazeuse) ou CLG (chromatographie liquide gaz).
Hydrol yse des li aisons gl ycosidiques
Le principe consiste hydrolyser lchantillon analyser par un acide. La
dpolymrisation peut tre conduite avec des acides de forces et de concentrations variables
sous diverses conditions opratoires (temprature, temps de raction) selon la nature et la
structure du polysaccharide. En effet, les diffrents types de liaisons osidiques prsentent des
taux dhydrolyse variables en fonction de la stabilit relative des liaisons (1,6' > 1,4' > 1,3'
>1,2'). De mme, la nature des liaisons glycosidiques entre deux units osidiques contigus
prsente une diffrence de stabilit par rapport au cas usuel de deux units glucosidiques lies
en 1,4'. Les liaisons glycosidiques entre une unit osidique et une autre unit portant un
groupement carboxylique ou amine seront plus difficiles rompre que des liaisons entre un
ose et un autre sous la forme furanose, anhydro ou doxy. Des acides minraux forts peuvent
tre par exemple employs chaud pour ltude des drivs cellulosiques mais, en raison des
dgradations non spcifiques inhrentes la force de lacide, lacide trifluoroactique est
prfr lacide sulfurique. Il prsente de plus lavantage dtre simplement limin par co-
vaporation avec du mthanol.

45

Le rendement dhydrolyse est trs dpendant des conditions opratoires et de la nature
des polysaccharides. Certaines hmicelluloses contenant des acides uroniques sont plus
difficiles hydrolyser que des polysaccharides neutres. Ceci est d la rsistance particulire
de la liaison xylose-acide uronique lhydrolyse acide. Dans ces conditions, une telle
rsistance lhydrolyse conduit lobtention dun mlange de monosaccharides et dacides
aldobiuroniques (dimres constitus dun ose neutre et dun acide uronique). La stabilit
relative du disaccharide lhydrolyse acide sexplique par les effets du groupement carboxyle
en C-5 (Figure 31).
O
O H OH
O
O
O
H
R'O
R
H
O
O H OH
O
O
O
H
R'O
R
H
+
+
+

Figure 31 : Stabilit de la liaison uronosidyle lhydrolyse acide daprs Timell et coll.,
92

Le doublet de loxygne, dj engag dans une liaison hydrogne avec le carboxyle en
C-5, est moins disponible pour stabiliser, par dlocalisation, le carbocation qui se formerait
lors d'un mcanisme d'hydrolyse acide.
Une temprature trop leve du milieu ractionnel provoque la dgradation de certains
oses, notamment le xylose.
125
La force de lacide peut galement entraner une dgradation
des acides uroniques par dcarboxylation. La stabilit des monosaccharides libres en solution
variant fortement dun ose lautre ncessite la mise au point de conditions optimales
dhydrolyse pour chaque type de monosaccharides. Pour pallier les difficults dune
hydrolyse acide non quantitative, la mthanolyse a t choisie comme mthode de clivage
efficace des liaisons glycosidiques entranant peu de dgradation.
126
Ne pouvant tre
applique lanalyse dchantillons cristallins, la mthanolyse prsente nanmoins lavantage
dune conversion quasi-totale en mthylglycosides aprs 24 heures de raction 80C en
prsence de mthanol chlorhydrique 1M (Figure 32). Les mthylglycosides prsentent en
outre une trs forte stabilit en solution. Les liaisons uronosidyles sont alors rompues
probablement du fait de lestrification des units dacides uroniques. De plus ces acides
uroniques librs sont mieux prservs dans le cas de la mthanolyse tant donn quils sont
convertis en mthylglucuronosides trs stables.
127


46

O
O
O
O
OH
OH
O H
OH
OH
O H
n

CH
3
OH
O
O
O
O
OH
OH
O H
OH
OH
O H
n

H Cl
O
OH
OH
O H
O H
OH
O
OH
OH
O H

H
+
Cl
CH
3
CO H
+
O
OH
OH
O H
O H
OMe
OH
O
OH
OH
O H
OMe

C H
3
O
Cl
C H
3
OH
C H
3
O
O CH
3
H
Cl
C H
3
O
O
CH
3
H
Cl
C H
3
O
OMe
ClH
+
80C, 24 h
+
+
+
+ n
-
+ n
O-mthylglycosides
b: Libration des O-mthylglycosides
a: formation du ractif
+
+
+
+
Actate de mthyle


Figure 32 : Prparation des mthylglycosides selon la mthode propose par Kamerling et al.,
128


Mt hodes de drivati on des oses pour l anal yse par CPG
Lanalyse des mthylglycosides librs aprs hydrolyse peut tre ralise par les
techniques de chromatographie gazeuse ou liquide.
La chromatographie liquide haute performance permet de raliser directement, sans
modification de lchantillon, et faible temprature, la sparation des diffrents
monosaccharides.

47

La chromatographie en phase gazeuse est une technique danalyse rapide, qui du fait
de sa grande sensibilit, et de sa capacit sparer des mlanges complexes se rvle tre la
technique la plus adapte lanalyse qualitative et quantitative des mthylglycosides
trimthylsilyls des rsidus et extraits vgtaux. Lanalyse des monosaccharides par
chromatographie en phase gazeuse ncessite au pralable la drivatisation des
mthylglycosides en composs plus volatils. Pour cela, les techniques de drivatisation sont
nombreuses (Tableau 3). Les mthodes les plus courantes sont la pertrimthylsilylation des
monosaccharides (ou de leur mthylglycosides) et la rduction des monosaccharides en
alditols par le borohydrure de sodium suivie de leur actylation par lanhydride actique en
prsence de N-mthylimidazole. Les drivs aldonitriles actates et trifluoroactates ont t
galement couramment dcrits et les mthyloximes actates sont parfois employs. Les
produits volatils obtenus sont ensuite spars sur colonnes capillaires puis dtects par CPG
quipe d'un dtecteur ionisation de flamme (FID). Les phases stationnaires utilises pour la
sparation des drivs glucidiques sont apolaires et greffes par des drivs siloxanes.

Tableau 3 : Mthode de drivation des monosaccharides
Mthodes de drivation
Driv
Rfrences
Pertrimthylsilylation
TMS
Bleton et coll.,
129

Actylation
actates
Biermann
130

Trifluoroactylation
trifluoroactates
Englmaier
131

Rduction/actylation
alditols actates
Black and Fox
132

Oximation/actylation
aldonitriles actates
McGinnis
133

O-mthyloximation/actylation ou
trimthylsilylation

O-mthyloxime actates ou O-
mthyloxime TMS
Neeser and Schweizer
134



En fonction de la mthode d'analyse slectionne, les oses seront observs sous la forme d'un
ou plusieurs pics. En effet, en solution, les oses existent en quilibre dynamique entre leurs
formes cycliques et ouvertes. Lors de lquilibre mutarotationnel, deux anomres et
peuvent tre forms pour chacune des formes furanose et pyranose (Figure 33). Ainsi, jusqu
quatre isomres peuvent tre observs par monosaccharide.





48

H O
OH H
H O H
OH H
CH
2
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
CH
2
OH
OH
OH
OH
O
CH
2
OH
OH
OH
OH


Figure 33 : Equilibre mutarotationnel du xylose

La mthode des alditols actates ncessite la rduction pralable des monosaccharides
par le borohydrure de sodium puis leur actylation en prsence d'anhydride actique dans la
pyridine.
135
Cette mthode est trs souvent employe du fait de la stabilit des composs
forms et de leur bonne rsolution chromatographique. Dans ce cas, chaque monosaccharide
modifi sera identifi sous la forme d'un seul pic.
Une seconde mthode consiste partir du mlange isomrique brut qui est dans un
premier temps glycosyl par un groupement mthyle puis silyl. Cette mthode est cependant
souvent employe puisqu'elle prsente lavantage de permettre une identification simultane
des hexoses, doxyhexoses, pentoses, acides uroniques et osamines. Les drivs
trimthylsilyls sont obtenus selon la mthode de Kamerling et al.,
128
modifie par Montreuil
et al.,
136
par raction des O-mthylglycosides avec du BSTFA (N,O-bis-
trimthylsilylactamide) 95 % stabilis par du TMSCl (chlorure de trimthylsilane) 5 % dans
de la pyridine anhydre (Figure 34).
D-xylose
< 1%
-D-xylopyranose
< 1%
-D-xylopyranose
< 1%
-D-xylofuranose
35%

-D-xylofuranose
65%

49

O
O H
O H
OH
OH
OMe
O
(H
3
C)
3
SiO
(H
3
C)
3
SiO
OSi(CH
3
)
3
OSi(CH
3
)
3
OMe
OSi(CH
3
)
3
F
3
C NSi(CH
3
)
3
Pyridine, 20C, 2h sous argon

Figure 34 : Mthode de trimthylsilylation des O-mthylglycosides, daprs Kamerling et al.,
128



I. 3. 1. c. Dt ermination du taux et de la local isati on de lact ylati on
A ltat natif, les xylanes sont naturellement actyls et lanalyse par IR du polymre
confirme cette actylation par la prsence dune bande carbonyle intense 1745 cm
-1
.
Plusieurs mthodes mises en uvre pour la dtermination du taux dactylation sont dcrites
dans la littrature. La technique la plus largement utilise est la RMN du proton. Les signaux
2,0 ppm indiquent que les polysaccharides sont actyls.
94, 105
Pour Grondalh et al.,
137
le
degr dactylation DS
Ac
est dtermin selon la formule suivante :



La RMN
1
H et
13
C permet aussi de prciser la position de lactyle et dtablir le
pourcentage de xylane non actyl, de 2-O-actyl, 3-O-actyl et de 2,3-di-O-actyls.
105, 138,
139
Le recours des techniques en deux dimensions homonuclaire et htronuclaire permet
de confirmer et daffiner les structures actyls.
Le taux dactylation peut galement tre dtermin par HPLC aprs une saponification
par de la soude 0,4 M temprature ambiante pendant 3h30
140
ou une hydrolyse des
groupes actyles par de lacide oxalique 0,5 M.
139
Cest alors lacide actique libr qui est
dos.
Une autre mthode repose sur le dosage enzymatique qui permet de doser des
quantits dacide actique de lordre de quelques moles contre quelques mmoles dans le cas
du dosage par HPLC. Cette mthode est base sur le suivi de la rduction du NAD
+
en NADH
par spectrophotomtrie 340 nm (Figure 35). Aprs saponification des MGX, lacide actique
libr est converti en actyl-CoA en prsence de lenzyme actyl-CoA synthtase (ACS),
dadnosine-5-triphosphate (ATP) et de coenzyme A (CoA) (1). Lacetyl-CoA ragit ensuite
avec de loxaloactate pour former de lacide citrique en prsence de citrate synthase (CS) (2).
Loxaloacetate utilis pour la raction (2) est form partir de L-malate et de nicotinamide-
adnine dinuclotide (NAD
+
) en prsence de L-malate dshydrognase (L-MDH) (3). Au
cours de cette raction, NAD
+
est rduit en NADH.
DS
Ac
=
(intgrations des protons des actyles 2.0 ppm) x 6


(intgrations des protons du glucide entre 3.2 et 5.6 ppm) x 3


50

CH
3
COOH P
O
O
-O P
O
O
N
N
N
N
O
OH OH
NH
2
O O P
O
O
O
N
N
N
N
O
OH O
NH
2
C
H
2
P O
O
O
O
P O
O
O
P O
O
O
CH
2
CH
3
C H
3
O H
H O
N
H
N
H
SH
O
ACS
Actyl-CoA P
O
O
N
N
N
N
O
OH OH
NH
2
O O H P
2
O
7
COO-
O CH
2
COO-
COO-
CH
2
COO-
CH
2
O H
COO-
Actyl-CoA
Citrate
Oxaloacetate
CS
CoA
L-Malate
N
N
N
N
O
OH OH
NH
2
CH
2
N
+
O
OH OH
O
P O
O
O
P
O
O O
O
NH
2
L-MDH
Oxaloacetate NADH H
+
NAD+
ATP
CoA
AMP
+ +
+ +
4-
1
2 + +
+
+
H
2
O
3
+ +


Figure 35 : Principe du dosage enzymatique des actyles

Le nombre de moles dacide actique est enfin calcul selon les indications proposes
par la socit Boehringer (Annexe 2).
Enfin, la spectromtrie de masse MALDI-MS est un bon outil pour estimer la
distribution des actyles le long de la chane principale.
118
Gonalves et al.,
141
ont ainsi pu
dmontrer que la distribution des actyles sur les rsidus xylose tait trs alatoire. De plus
dans les rgions o il ny a pas de groupes acide 4-O-mthylglucuronique, le degr de
substitution en actyle est infrieur la moyenne.
I.3.2. Analyse structurale des oligosaccharides
Lanalyse structurale dun polysaccharide requiert lobtention dunits
oligosaccharidiques plus faciles caractriser par les techniques de RMN et de spectromtrie
de masse. Cependant, dans le cas des polysaccharides contenant des acides uroniques, la
stabilit de la liaison uronosidyle rend souvent dlicate lapplication des mthodes
classiquement utilises en glycochimie. Les liaisons engageant un ou plusieurs acides
hexuroniques peuvent en revanche constituer une zone de rupture privilgie. Cette proprit
est souvent mise profit pour le dveloppement de mthodes spcifiques applicables aux
polysaccharides natifs contenant des acides uroniques.

51


I. 3. 2. a. Hydrol yse des li aisons gl ycosidiques
Le dcoupage partiel des polymres des fins analytiques ncessite lhydrolyse des
liaisons glycosidiques. Nous prsentons ici diffrentes mthodes possibles.
Hydrol yse enzymat ique
Les mthodes les plus efficaces sont naturellement celles qui font appel aux enzymes
spcifiques qui vont permettre lobtention dunits de rptition plus facilement analysables.
Ce mode de prparation est particulirement bien adapt des polymres homognes tels que
les glucuronoxylanes (GX) qui sont composs denchanements homognes de rsidus D-
Xylp. La dgradation complte des GX en monomres ncessite laction combine dendo- ou
dexoenzymes qui non seulement hydrolysent les liaisons au sein de la chane principale, mais
galement librent les constituants des chanes latrales. Lensemble des activits ncessaires
la rupture des liaisons de la chane principale est regroup sous le terme gnral de
xylanases alors que celles qui liminent les chanes latrales sont parfois appeles enzymes
accessoires
142
(Figure 36). Les xylanases sont trs largement rpandues dans tous les
compartiments du monde vivant, notamment des microorganismes (bactries, levures et
champignons). Les endoxylanases (1,4--D-xylane-4-xylanohydrolase, E.C. 3.2.1.8) rompent
la liaison -(14) lintrieur de la chane principale de xylane. Elles librent des
oligomres linaires ou substitus de fort, puis de faible DP. Les spcificits de
reconnaissance des sites de coupure des endoxylanases sont multiples et variables selon les
sources. La majorit des endoxylanases dcrites dans la littrature sont capables dhydrolyser
une liaison dans un environnement non substitu. Cette rgle gnrale a pourtant des
exceptions. Citons, titre dexemple, une endoxylanase purifie de Bacillus subtilis qui
reconnat un rsidu acide glucuronique latral et hydrolyse la liaison -(14)-xylosyl du
xylose non substitu adjacent. Elle est ainsi dsigne sous le terme de glucuronoxylane
xylanohydrolase.
143
Les xylosidases (1,4--D-xylane-4-xylohydrolase, E.C. 3.2.1.37)
hydrolysent de petits oligomres librs par les endoxylanases, en xylose monomre. Dans le
cas des GX, les enzymes accessoires impliques dans la libration des substituants sont de
deux types. Les glucuronidases (xylane--D-1,2-glucuronohydrolase, E.C. 3.2.1.131) librent
lacide glucuronique ou son driv mthyl, lacide 4-O-mthylglucuronique, fixs sur la
chane de xylane par une liaison -(12).
144
Leur action se conjugue celle des
endoxylanases strictes pour lhydrolyse totale des xylanes. Les xylanes actylestrases (E.C.
3.2.1.6) sont encore peu dcrites dans la littrature. Elles sont capables de librer de lacide

52

actique partir dun xylane dont des rsidus xylose portent un groupement actyle sur les
carbones C-2 ou C-3. Elles sont importantes dans lhydrolyse des xylanes car la prsence de
groupements actyle sur le squelette principal est un obstacle ladsorption des
endoxylanases sur leur substrat.
145
Lhydrolyse enzymatique va conduire lobtention de
diffrents xylo-oligosaccharides neutres et acides.






Figure 36 : Hydrolyse enzymatique de GX (daprs Bonnin et coll.,
142
), a : 1,4 D xylane-4-xylanohydrolase,
E.C. 3.2.1.8 ; b : 1,4 D xylane-4-xylohydrolase, E.C. 3.2.1.37 ; c : xylane D 1,2 glucuronohydrolase, E.C.
3.2.1.31 ; d : actyl-estrase (E.C. 3.2.1.6).
Une nouvelle glucuronylestrase a t rcemment dcouverte par pnikov et
Biely.
146
Elle est capable dhydrolyser les esters mthyliques de lacide 4-O-
mthylglucuronique, qui les lie par exemples des alcools aromatiques de la lignine.
Hydrol yse acide mnage
Lhydrolyse acide mnage non slective constitue parfois une approche
complmentaire lhydrolyse enzymatique. Grce au caractre alatoire de lhydrolyse acide,
certains motifs structuraux du polysaccharide peuvent tre identifis dans plusieurs
oligosaccharides, ce qui peut permettre de reconstruire le polymre partir des structures
oligosaccharidiques. Quand les liaisons glycosidiques du polysaccharide sont comparables en
termes de stabilit, lhydrolyse acide fournit un mlange statistique doligosaccharides et de
monosaccharides ; cest le cas des polysaccharides neutres. Dans le cas des polysaccharides
acides, comme les glucuronoxylanes, la stabilit chimique des liaisons impliquant des acides
uroniques confre ces dernires une rsistance parfois importante aux acides forts tels que
HCl ou TFA, y compris une temprature leve. Cest pourquoi on obtient gnralement
une grande proportion dacides aldobiuroniques par hydrolyse acide de ces xylanes.
92

Lhydrolyse partielle est alors toujours statistique mais tient compte des stabilits relatives des
liaisons osidiques ; on parle alors dhydrolyse slective. Comme dans le cas de lhydrolyse
enzymatique, lhydrolyse chimique va conduire lobtention de diffrents xylo-
oligosaccharides neutres et acides.
d Ac
a
3
4)-D-Xylp(14)-D-Xylp(14)-D-Xylp(14)-D-Xylp(1
2
b
1
4-O-Me-D-GlcpA c
4)-D-Xylp(14)-D-Xylp

53

La Figure 37 illustre le mcanisme gnral de lhydrolyse acide des liaisons
glycosidiques, incluant 3 tapes successives : la protonation de loxygne anomrique, suivie
de la dcomposition de lacide conjugu pour former un ion oxonium, qui peut exister en
conformation demi-chaise ; cette tape est dterminante. La dernire tape est une addition
deau rapide pour rgnrer une extrmit rductrice. Des travaux ont montr que la prsence
dun groupement carboxylique en C-5 du mthylglucose (mthylglucuronoside) rduit la
vitesse de lhydrolyse de 50 70%. Entre les hydrolyses des liaisons glycosidiques du
cellobiose et de lacide cellobiuronique, la vitesse diminue de 97%. Cette diminution de
ractivit sexplique par les effets inducteurs et conformationnels du groupement carboxyle en
C-5, ce que nous avons dj expliqu prcdemment.

O
CH
2
OH
RO
OH
OH
O
R'
H
+
O
CH
2
OH
RO
OH
OH
+
C O
HO
HO
OR
CH
2
OH
+
O
CH
2
OH
RO
OH
OH
+
H
+
+
H
+
H
2
O
R'OH
O
CH
2
OH
RO
OH
OH
OR'
O
CH
2
OH
RO
OH
OH
OH
R, R' = Aglycone ou chane glucidique


Figure 37 : Mcanisme gnral de lhydrolyse acide des glycosides, daprs Bemiller
147

Autohydrol yse
Lautohydrolyse des polysaccharides est une mthode dhydrolyse douce, suivant le
mme mcanisme que lhydrolyse acide mais induite par les fonctions essentiellement
carboxyliques et/ou sulfates portes par les acides uroniques qui entrent dans la composition
du polysaccharide. Lautohydrolyse des polysaccharides consiste donc en leur hydrolyse par
leurs propres groupements acides. Cette mthode a t dveloppe pour ltude des
polysaccharides sulfats et de phycocollodes anioniques.
148

La slectivit de cette raction dautohydrolyse est base sur la diffrence de stabilit
des liaisons glycosidiques mises en jeu ; elle dpend galement de la distribution des
groupements acides autour de ces liaisons glycosidiques. Ainsi comme le montre la Figure 38,

54

la liaison glycosidique la plus labile dun polysaccharide acide est la liaison prcdent lunit
dacide uronique dans la chane polysaccharidique.
Figure 38 : Catalyse intramolculaire par un groupement carboxyle dune liaison 14
prcdant un acide uronique (daprs Ciancia et Cerezo)
148


Trs simple mettre en uvre, lautohydrolyse ncessite au pralable de convertir les
polysaccharides en leur forme acide par simple passage sur rsine changeuse dions. Les
protocoles se droulent ensuite dans des conditions de temprature et de pression dtermines
selon la nature du polysaccharide. Classiquement, les conditions retenues vont de la
temprature ambiante et pression atmosphrique jusqu des tempratures de 190C 13
bars. Une telle mthode conduit la libration doligosaccharides de DP variables.
Lautohydrolyse, mthode dhydrolyse peu agressive, permet de protger le polysaccharide
des dactylations ou dsulfatations possibles et ainsi de conserver des renseignements
prcieux quant la structure du polysaccharide.
Autres mthodes dhydrolyse
Dautres mthodologies sont employes pour obtenir une hydrolyse spcifique. Plus
dlicates mettre en uvre, ces mthodes de ruptures chimiques slectives, notamment des
acides uroniques, existent parmi lesquelles la dgradation alcaline en milieu rducteur qui
conduisent respectivement la libration doligosaccharides natifs et modifis.
-limination ou dgradation alcaline
La dgradation alcaline est une mthode antrieure aux mthodes danalyses lies la
mthylation et a t dveloppe au dbut du 20
me
sicle pour ltude structurale des
polysaccharides et notamment les xylanes et les xyloglucanes. En milieu alcalin, il est connu
qu'il peut survenir des rarrangements sur l'extrmit rductrice d'un polysaccharide,
s'accompagnant de phnomnes de "peeling" par des mcanismes de -limination. En effet,
sous l'action d'une solution alcaline, on observe une rupture des liaisons glycosidiques en C-4
dun ose en position terminale rductrice. Les hydroxyles en position terminale rductrice
jouent un rle cl dans la dgradation alcaline des polysaccharides. La raction de peeling,
O
C
OH
O
O
H
O
O
H
OH
H
H
H
H

55

comme indique Figure 39 pour la cellulose ou dautres polysaccharides lis en 14 est
initie par lnolisation de lhydroxyle en position terminale rductrice pour former les
intermdiaires nediol (a) et (b).
103
Lintermdiaire (b) subit alors le processus de -
limination rsultant du dpart du substituant en C-4. Le compos (c) peut conduire par
rarrangement de type benzylique lacide isosaccharinique (d) et lacide lactique (f) par
clivage de la liaison entre le C-3 et le C-4 de la forme (e) suivie dun rarrangement de type
benzylique.

OH
CH
2
OH
HO
O
HO
OH
CH
2
OH
OR
OH
O
OH
CH
2
OH
HO
O
OH
OH
CH
2
OH
COOH
CHOH
CH
3
HOOC
RO
-
O
OH
OH
RO
CH
2
OH
OH
O
OH
OH
RO
CH
2
OH
OH
O
OH
OH
RO
CH
2
OH
HO
-
H
2
O
OH
O
OH
OH
RO
CH
2
OH
O
O
OH
OH
RO
CH
2
OH
CH
2
OH
CH
2
OH
CH
2
OH
CH
2
OH
OH
OH
CH
2
OH
O
O
CH
2
OH
(a) (b)
(c)
(d)
(e)
Rarrangement
de type benzylique
Acide
isosaccharinique
Acide lactique
(f)
R = chane glucidique

Figure 39 : Dpolymrisation en milieu basique ou peeling d'un glycane li en 14 (d'aprs Lai
103
)

Le traitement alcalin dun polymre glucidique est susceptible dinduire de nombreuses
modifications structurales (peeling, clivage des liaisons glycosidiques, saponification). Afin
de limiter ces ractions parasites et de rendre slective la raction de dgradation, une solution
consiste travailler en milieu rducteur. La prsence de borohydrure de sodium dans le milieu
ractionnel permet de rduire les oses en position terminale rductrice, limitant ainsi les

56

ractions de peeling tout en orientant la slectivit de la raction vers les acides uroniques. En
effet, un groupement carboxylique est un centre lectroattracteur qui en prsence d'une base
permet une raction de -limination conduisant la libration du substituant en C-4.
L'application de cette mthode au niveau d'un acide uronique d'un polysaccharide a t
effectue pour la premire fois par Mc Cleary et al.,
149
en 1967 puis par Lawson et
al.,
150
en 1969. Le mcanisme dcrit Figure 40 a t dtaille par l'quipe de Lindberg.
151

R
1
, R
2
, R
3
, R
4
: H ou unit osidique
O
OR
1
OR
4
OR
3
OR
2
HO
-
O
OH
O
OR
1
OR
4
OR
3
OR
2
O
O
-
HO
- O
OR
1
OR
4
OR
3
OR
2
O
O
-
H
R
4
O
-
(NaBH
4
) (NaBH
4
)
(NaBH
4
)
HO
-
O
OR
1
OR
3
OR
2
O
O
-
+
Acide uronique modifi
(sous forme rduite)

Figure 40 : Dgradation alcaline en milieu rducteur dun polysaccharide acide (daprs Lindberg et al.,)
151


Si dans un second temps, une hydrolyse acide mnage est ralise la suite de la dgradation
alcaline, les units osidiques engages en C-1, C-2 et C-3 de l'acide uronique modifi sont
libres selon le schma ractionnel suivant (Figure 41).
O
OR
1
OR
3
OR
2
O
O
-
Acide uronique modifi
H
3
O
+
CHO
O
R
1
OH OR
3
OR
2
O
OH
+
H
3
O
+
concentr
O
OHC
COOH
+ R
2
OH + R
3
OH
R
1
, R
2
, R
3
, R
4
: H ou unit osidique

CHO
OH
OR
3
OR
2
O
O
-

Figure 41 : Libration des substituants R
1
, R
2
, R
3
en milieu acide aprs la -limination
(d'aprs Lindberg et al.,
151
)



57

I. 3. 2. b. Sparat ion des oligosaccharides
La sparation des mlanges doligosaccharides aprs hydrolyse est certainement
ltape la plus fastidieuse de ltude structurale dun polysaccharide. Les fractions
oligosaccharidiques peuvent tre spares par chromatographie dexclusion strique en
fonction de leur masse molculaire ou plus exactement en fonction de leur volume
hydrodynamique ; dautres mthodes de sparation sont lies la charge des molcules
(chromatographie dchange dions), leur polarit (chromatographie en phase inverse), et
plus rarement leur structure (chromatographie daffinit).

I. 3. 2. c. Mt hodes spectroscopiques et dt ermi nati on st ructural e
des oli gosaccharides
Les mthodes prcdemment dcrites permettent lobtention doligosaccharides plus
faciles analyser par spectroscopie.
Infrarouge
La spectroscopie infrarouge est une mthode d'analyse physique rapide, simple
mettre en uvre et ne ncessitant que peu de quantit de matire analyser. Base sur les
transitions entre les tats vibrationnels et rotationnels d'une molcule, elle peut tre employe
tout aussi facilement sur des chantillons bruts ou purifis. Certains groupements ou liaisons,
considrs comme marqueurs (fonction C=O des acides uroniques, liaisons C=C
aromatiques), peuvent rvler la prsence de catgories de polysaccharides (hmicelluloses,
pectines, lignines). A titre dexemple, des bandes vers 1510 et 1595 cm
-1
sont caractristiques
des cycles aromatiques de la lignine et les bandes (CH
2
) 1250 et 1465 cm
-1
sont
caractristiques des xylanes.
Spectroscopie de rsonance magntique nucl ai re (RMN)
La spectroscopie RMN permet de dterminer la structure primaire complte dune
chane oligosaccharidique. Elle mne en outre lidentification de chacun des
monosaccharides et prcise lenchanement des monomres, les points de branchement et les
anomries.
Le spectre RMN monodimensionnel du proton donne des informations primaires sur la
valeur des dplacements chimiques des protons identifiables et permet de les comparer avec
ceux dj dcrits dans les banques de donnes. Il renseigne galement sur le nombre de

58

rsidus monosaccharidiques par lintgration des protons anomriques qui se prsentent sous
forme de doublets entre 4,4 et 5,4 ppm. Les constantes de couplage peuvent tre mesures
discriminant lanomrie ou des sucres.
Llucidation des structures glycosidiques rsulte ensuite de lutilisation de diffrentes
squences dimpulsions qui dans une premire tape permettent une attribution complte des
dplacements chimiques des protons et carbones de la molcule. Les spectres COSY
(Correlation SpectroscopY) homonuclaire (corrlation
1
H-
1
H) permettent de mesurer toutes
les constantes de couplage (J) et les dplacements chimiques des protons qui rsonnent dans
la bulk region , entre 3,2 et 4 ppm, renfermant de nombreux protons avec des frquences
de rsonance proches ce qui rend leur distinction trs difficile. Nanmoins, il est possible de
distinguer les protons ports par les carbones impliqus dans une liaison osidique qui sont
gnralement dblinds. La nature du cycle (pyranose ou furanose) et lanomrie peuvent
galement tre prcises par le couplage
3
J des protons anomriques. La distinction entre un
-pyranose et un -pyranose sera fonction de la valeur de la constante de couplage entre le
proton anomrique et le H-2. Une constante de couplage comprise entre 2 et 4 Hz, dans le cas
dun H-2 axial est spcifique dun -pyranose alors que la constante de couplage dun
-pyranose varie entre 7 et 9 Hz. Pour un proton quatorial en position 2, les variations sont
rduites.
Les emplacements des liaisons sont ensuite prciss par les dplacements chimiques
des
13
C rsonnant entre 3 et 10 ppm, mais lorsquils sont engags dans des liaisons 1x ils
sont dblinds. Dune manire gnrale, les carbones anomriques des cycles sous forme
pyranose portant un substituant axial rsonnent vers 100 ppm. Les autres cycles pyranoses
rsonnent vers 105 ppm tandis que les formes furanoses sont caractristiques des
dplacements chimiques autour de 110 ppm.
La squence de la chane oligosaccharidique peut ensuite tre dtermine par
diffrentes mthodes. Classiquement, elle peut tre dduite des interactions dipolaires entre le
proton anomrique et les protons adjacents de lunit osidique (NOE, ROESY). Leffet NOE
(Nuclear Overhauser Enhancement) fourni gnralement des pics de corrlation intenses entre
les protons H1 et Hx de deux oses relis par une liaison 1x. Au travers du ROESY
(Rotating Frame Overhauser Spectroscopy), il est possible de visualiser les corrlations
dipolaires proton-proton entre deux voisins proches dau plus de 5 . Lexprience TOCSY
(Total Correlation SpectroscopY) permet le transfert de la magntisation sur tous les protons
dun monosaccharide mais prsente une lecture dlicate des constantes de couplage.
Dabrowski a propos en 1989 de combiner les squences ROESY et TOCSY afin de relier

59

tous les protons anomriques et ainsi dterminer la squence des units osidiques. Les
spectres HMQC (Heteronuclear MultiQuantum Coherence) permettent de corrler chaque
proton avec le carbone auquel il est li. Dans ce cas, outre lidentification des carbones et la
dtermination de leurs dplacements chimiques, lobservation dun dblindage des carbones
permet de dterminer la substitution, cest--dire les points de branchements des
monosaccharides.
Les spectres HMBC (Heteronuclear Multiple-Bond Correlation) donnent les corrlations
1
H-
13
C et les constantes
3
J associes. Il est alors possible de corrler les noyaux distants de 3
liaisons covalentes, notamment les constantes
3
J
H1-Cx
o x est la position du carbone du
monosaccharide voisin inclus dans la liaison glycosidique (Figure 42). Ainsi, on peut prciser
lenchanement des monosaccharides et donc, la squence de loligosaccharide.
O
C
5
H
HO
H
HO
H
H
OH
H
C
3
OH
O
C
4
H
O
H
HO
H
H
OH
H
OH
HO

Figure 42 : Schma reprsentant les corrlations
3
J
H,C
carbone/proton observes partir du proton H-1 dans une
exprience HMBC. La corrlation la plus intressante est celle qui indique la liaison glycosidique.
Spectromtrie de masse
La spectromtrie de masse est une technique danalyse complmentaire la RMN, aux
applications varies et qui na vu son champ dutilisation stendre aux macromolcules que
depuis peu de temps. Cette technique tait employe lorigine pour caractriser les thers
mthyliques rsultant des expriences de permthylation, la position des groupements
mthyle de chaque monosaccharide issu dune hydrolyse acide tant caractristique des
liaisons entre monomres. Mais ce rsultat ne permet pas daccder la squence
oligosaccharidique.
Mme si la mthode est destructive pour lchantillon, la spectromtrie de masse
prsente lavantage de ne ncessiter que de trs faibles quantits de matriel (10 1000 fois
moins que pour la RMN). La cl de lanalyse des oligosaccharides par spectromtrie de masse
rside dans le choix de la technique dionisation.

60

Ionisation par MALDI
Le MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionisation) est une mthode
dionisation introduite par Karas et Hillenkamp en 1988.
152
Permettant danalyser des
molcules de masse molculaire suprieures 300 kDa, elle est particulirement adapte
l'tudes des N- ou O-glycanes. Actuellement, le mcanisme exact du MALDI nest pas dcrit
avec prcision. Un chantillon solide est cocristallis avec une matrice puis irradi par des
photons mis par un laser dont la longueur donde est situe dans la bande dabsorption de la
matrice. Les matrices sont des chromophores faible enthalpie de sublimation devant
absorber lnergie du laser tout en favorisant lionisation par transferts de protons et assurant
une bonne sparation des molcules en rduisant les forces intermolculaires. Les matrices les
plus utilises sont les drivs des acides cinnamiques et benzoques.
Le choix de la matrice est important puisquil permet de jouer d'une part sur la
production des ions et, dautre part, sur la rsolution du spectre dans des gammes o on
observe un bruit de fond important d la matrice. L'acide 2,5-dihydroxybenzoque est
particulirement adapt l'tude des oligosaccharides puisqu'il permet de minimiser la
dgradation de l'chantillon provoque par l'absorption de l'nergie du faisceau laser incident.
Lnergie transmise par le laser est absorbe par la matrice et cet apport dnergie provoque
son expansion en phase gazeuse en entranant les molcules dchantillon analyser (Figure
43). Lchantillon est alors ionis majoritairement par transfert de protons, soit avant
dsorption dans la phase solide, soit par collision aprs dsorption avec la matrice excite ou
avec dautres molcules du plasma tels que les sels de sodium. Les ions sodium favorisent
lionisation des polymres par complexation.

61


Figure 43 : Principe du MALDI (d'aprs Karas et al.,
152
)

Les complexes chargs ainsi forms sont acclrs et envoys dans un tube de vol jusquau
dtecteur. En gnral, la source MALDI est utilise avec un analyseur temps de vol (Time
Of Flight). Celui-ci est proportionnel la racine carre des rapports m/z. Outre sa grande
sensibilit (0,01 % partir de moins dun picomole de produit), cette technique permet
danalyser des molcules natives pures ou en mlange.

Ionisation par lectrospray
Le principe de llectrospray (ES) repose sur la cration dun brouillard
lectriquement charg partir dun flux continu de liquide dans une enceinte pression
atmosphrique. Une solution dchantillon est introduite dans un capillaire dont une extrmit
est soumise un fort champ lectrique. Ce champ lectrique intense provoque la formation
dun nuage de gouttelettes charges qui traversent simultanment un gradient de champ
lectrique et de pression dans la direction de lanalyseur du spectromtre de masse. Le
brouillard rsultant est entran par un gaz vecteur qui limine progressivement le solvant des
gouttelettes. La diminution du rayon des gouttelettes augmente leur densit de charge
lectrique et induit une dsorption des ions dans la phase gazeuse. Les mesures de masse sont
ensuite effectues au travers du rapport m/z. Ainsi, dans le cas dune molcule possdant
plusieurs sites ionisables ou polaires, les ions forms sont multichargs et la gamme de
masses accessibles est grande sur un instrument donn. Comme pour le MALDI,

62

llectrospray bnficie dune excellente rsolution de lordre de 1 Da pour 10 000, dune
grande sensibilit (de lordre de la picomole) et engendre peu de fragmentations.

Coupl age spectromt rie de masse daut res techniques
La chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse (CPG-SM)
constitue lun des outils les plus puissants danalyse de mlanges complexes de molcules
organiques ou biochimiques. Dans cette application on rvle le spectre des fractions au fur
et mesure de leur sortie de la colonne de chromatographie. Cette technique est
classiquement utilise pour lanalyse des squences oligosaccharidiques par lidentification
des drivs thers mthyliques sous forme alditols ou mthyl-glycosides partiellement
mthyls et actyls.

La spectromtrie de masse en tandem (SM-SM), qui consiste coupler deux
spectromtres de masse, est galement utilise pour llucidation de mlanges
doligosaccharides. Dans cette technique, le premier spectromtre de masse sert produire et
sparer les ions molculaires des diffrents composants du mlange et le second,
fragmenter successivement ceux-ci et enregistrer les spectres des ions parents
correspondants. La dtermination complte de squences oligosaccharidiques est alors
possible en combinant une technique dionisation FAB avec la spectromtrie de masse en
tandem.
153


I. 3. 2. d. Anal yse et dtermi nation structural e des pol ysaccharides
Une autre alternative lanalyse structurale des polysaccharides en gnral, de GX en
particulier, est ltude des molcules sous leur forme native. Dans ce cas, lutilisation de la
spectroscopie RMN (
1
H- et
13
C- RMN) va fournir des indications concernant la nature de la
chane principale, le taux de branchement par lacide 4-O-mthylglucuronique ainsi que sur
limportance et la position des groupes O-actyle. Rcemment, des tudes de RMN
bidimensionnelles homo- et htronuclaires de type COSY, TOCSY, HSQC ou NOESY ont
apport des informations complmentaires qui permettent, sur la base de signaux
caractristiques, lidentification des diffrentes structures de GX natifs.


63

La spectromtrie de masse MALDI peut galement tre applique aux
macromolcules de haut poids molculaire si leur polydispersit nest pas trop importante
(infrieure 1.1). Lutilisation de cette technique pour lanalyse des polysaccharides
polydisperses requiert le couplage avec une sparation pralable par chromatographie
dexclusion strique. Ainsi on diminue la polydispersit des chantillons jusqu des valeurs
compatibles avec lanalyse MALDI.
154


I. 3. 2. e. Profil de masse et poids mol culai re
Le poids molculaire est une proprit cl dun polymre car il influence directement les
proprits physiques comme la solubilit, la viscosit Une estimation du degr de
polymrisation et donc a fortiori du poids molculaire peut tre faite par le dosage des oses
rducteurs.
124
Globalement les xylanes ont un dgr de polymrisation relativement faible (en
gnral infrieur ou gal 200). Mme si la connaissance du poids molculaire moyen est une
donne intressante, cest surtout la distribution en masse qui caractrise un polymre. En
effet, les polysaccharides vgtaux peuvent prsenter une polydispersit importante. Une des
techniques les plus rpandues pour ce type danalyse est la chromatographie dexclusion
strique qui permet de sparer les macromolcules en fonction de leur poids molculaire, ou
plus exactement en fonction de leur volume hydrodynamique qui prend en compte la
conformation des molcules. La calibration peut tre effectue avec des dextrans de poids
molculaire connu, sils prsentent une forte similitude avec les polysaccharides tudis
laide dun rfractomtre comme dtecteur. La spectromtrie de masse MALDI est une
alternative dont le dveloppement semble limit.
Depuis quelques annes, une nouvelle technique est disponible pour dterminer la masse
molculaire de polysaccharides ; cest le dtecteur MALLS (Multi-Angle Laser Light
Scattering) que lon couple classiquement une chromatographie dexclusion strique (SEC).
Le principe est simple ; un faisceau de lumires polarises est envoy sur lchantillon et la
dispersion de la lumire est dtecte. Dans le cas du MALLS, la dispersion de la lumire est
dtecte diffrents angles de faon simultane et lintensit de la lumire chaque angle est
proportionnelle la masse molaire et la concentration de la molcule. Pour les
macromolcules plus petites sans dpendance angulaire de la lumire disperse, la dtection
dun seul angle est suffisante. Cependant quand les molcules sont de tailles plus importantes,
davantage de lumire est diffuse dans toutes les directions et alors le MALLS devient
indispensable. Dans ce systme SEC-MALLS, les macromolcules polysaccharidiques sont
dabord fractionnes conformment leur volume hydrodynamique, puis lintensit de la

64

lumire disperse et la concentration de la fraction lue sont mesures simultanment. La
masse molculaire absolue de la fraction est alors donne directement. Ce systme est capable
de couvrir une trs large fourchette de masses molculaire et mme descendre sous les 580
Daltons selon les affirmations des fabricants.
155


I.4. Applications, proprits et valorisation des xylanes
La biomasse reprsente une importante source renouvelable de polymres pouvant tre
diversement valoriss. Lutilisation de ces ressources reste ngligeable en comparaison avec
les produits issus de lindustrie ptrolire. Les phycocollodes dalgues, la cellulose et
lamidon sont les principaux polysaccharides dorigine vgtale usage industriel exploits
dans des secteurs varis tels que lagroalimentaire, le textile ou lindustrie pharmaceutique.
Cependant depuis quelques annes, les hmicelluloses qui reprsentent prs de 50% de la
biomasse vgtale,
7, 156, 157
suscitent un intrt croissant, cest en particulier vrai pour les
xylanes. De par leurs proprits rhologiques, physico-chimiques et biologiques, le domaine
dapplication des xylanes est trs vaste. Ils sont utiliss ltat natif mais les principales voies
de valorisation de ces polysaccharides reposent soit sur leur hydrolyse pour former des
prcurseurs utiliss dans lindustrie chimique, soit sur leur fonctionnalisation qui permet
denvisager de nouvelles applications pharmaceutiques ou cosmtiques.

I.4.1. Xylanes natifs
I. 4. 1. a. Proprits rhologi ques
Les proprits physico-chimiques originales des xylanes les rapprochent des
hydrocollodes. Ces derniers dsignent des polysaccharides dorigine naturelle ou leurs
drivs, qui se dissolvent ou se dispersent dans leau pour former des solutions ou
suspensions visqueuses. Les hydrocollodes ayant une grande affinit pour leau, affectent la
texture du milieu auquel ils sont ajouts et modifient la perception du consommateur vis--vis
dun produit, do leur utilisation notamment dans les secteurs agroalimentaire, cosmtique et
pharmaceutique, en tant qupaississant, mulsifiant ou glifiant. Ces polymres possdent en
solution une faible viscosit sous contrainte et une forte viscosit au repos concentration
leve. Le xylane pur ne forme pas dhydrogel en solution. Lajout de chitosane est ncessaire
la formation de gel dont les proprits de gonflement sont intimement lies la part de
chitosane dans le mlange.
158
La formation de lhydrogel est attribue au domaine cristallin
du xylane li aux chaines de chitosane ainsi quaux interactions lectrostatiques entre lacide

65

glucuronique du xylane avec les groupes amines du chitosane.
159
Il existe diffrentes
mthodes de formation des hydrogels. Une premire consiste chauffer un mlange de xylane
et de chitosane en milieu acide avant vaporation aprs casting.
158
La polymrisation
dhmicellulose et de hydroxylthylmthacrylate en prsence de sels de sulfate et de sulfite
comme systme initiateur de la raction en condition aqueuse conduit galement la
formation dhydrogels.
160
Ainsi les gels forms peuvent tre employs en tant quagents de
texture dans les produits dsinfectants ou les pansements.
161
Par ailleurs, leurs proprits
liantes ont t exploites en tant quadditifs dans la prparation des ptes papier. Ils
apportent une meilleure flexibilit aux fibres et amliorent la rsistance mcanique du
papier.
162


I. 4. 1. b. Acti vit s biologi ques
Les parois cellulaires vgtales sont des rservoirs potentiels de polysaccharides
biologiquement actifs.
163
La littrature est abondante ce propos et tmoigne de lintrt des
hmicelluloses et en particulier des xylanes dans ce domaine. De nombreux articles attestent
des proprits immunomodulantes ou immunostimulantes des xylanes. Ebringerov et coll.,
7

ont utilis le test mitognique des lymphocytes T pour vrifier les proprits du MGX extraits
de graines de sarrasin. Ce test avait dj t utilis pour dterminer ces mmes proprits sur
des xylanes dpis de mas
164
et de plantes mdicinales (Rudbeckia fulgida, Althea officinalis
et Mahonia aquifolium)
165, 166
mais aussi sur des oligosaccharides de coquilles damandes.
167

Des htoxylanes de grand plantain (Plantago major) se sont rvls avoir de fortes activits
anti-complmentaires.
168
Des proprits antioxydantes de xylanes ont t rapportes sur des
extraits de sauge,
169
de diverses plantes mdicinales (guimauve officinale, rudbeckie et
mahonia),
170
de coquilles damandes,
171
de riz et dleusine (varit du millet).
172
Dans ces
deux derniers cas, il sagissait darabinoxylanes fruloyls possdant de trs fortes activits
antioxydantes pouvant tre 500 fois plus leves que celles de polysaccharides sulfats. Les
auteurs expliquent quen plus de lacide frulique, un acide phnolique rpandu dans les
crales et possdant un fort pouvoir antioxydant, la prsence des oses avec des groupes C=O
ainsi que le degr et la nature de la polymrisation ont un impact important sur lactivit
antioxydante de ces AX. Dautres glucuronoxylanes et des htroxylanes issus de plantes
mdicinales ont respectivement prsent des activits anti-toussives
173
et des effets anti-
ulcrants.
174
Les xylanes sulfats, prsentent, quant eux, des proprits anti-coagulantes et
anti VIH.
175, 176



66

I. 4. 1. c. Proprits nutriti onnell es
Les xylanes sont employs en tant que fibres alimentaires. Ils ne sont pas dgrads par
les enzymes digestives humaines et permettent ainsi dacclrer le transit intestinal. En outre,
leur ingestion diminuerait de manire significative laccumulation des lipides dans le foie et le
taux de cholestrol sanguin.
177


I. 4. 1. d. Micro et nanoparti cules de xyl anes
Comme nous lavons mentionn prcdemment, les xylanes ne sont pas dgrads lors
de la digestion et peuvent franchir la barrire intestinale. Cette particularit est un facteur
intressant dans le cadre de son utilisation potentielle dans lindustrie pharmaceutique. Ainsi,
les xylanes notamment issus dpis de mas sont utiliss pour la synthse de micro et
nanoparticules. Les micro et nanoparticules peuvent tre utilises en tant quagent denrobage
pour ladministration orale de mdicaments. Elles sont ralises par neutralisation avec du
HCl dune solution alcaline de xylanes en prsence de tensioactif.
178
La taille des particules
croit avec la concentration en polymres. Les particules magntiques sont utilises comme
agents de contraste et marqueurs pour limagerie en rsonance magntique. Elles sont
synthtises par mulsion entre une solution alcaline de xylanes et une solution magntique
de fer dans un mlange chloroforme/cyclohexane (1/4, v/v)
179
de faon former des particules
dont le diamtre est estim par diffraction laser environ 25 m. Les particules magntiques
de polymres sont nettement plus rsistantes la dissolution des pH proches de celui de
lestomac que les particules magntiques non enrobes de xylanes.

I. 4. 1. e. Les mat ri aux plasti ques partir de xyl anes des cral es
Les polysaccharides, en particulier les xylanes peuvent galement tre valoriss en les
utilisant comme substrats de base pour llaboration de films plastiques potentiellement
biodgradables. Face lpuisement des ressources ptrolires, les scientifiques sintressent
la synthse de ces nouveaux films dorigine vgtale. De nombreuses tudes dcrivent
lutilisation dautres ressources naturelles ou de co-produits comme matire premire pour la
synthse de plastiques. Cest le cas pour la paille de bl,
180
les polysaccharides dalgues
rouges,
181
la cellulose
182
ou encore les hmicelluloses.
183
Les xylanes ont t trs largement
tudis. Dans le cas darabinoxylanes dorge, il est possible de former des films sans lajout
de plastifiant.
184
Les films alors obtenus par casting, sont rigides, assez cassants,
hygroscopiques et amorphes. Sternemalm et coll.,
185
ont par la suite tudi linfluence de la
substitution en arabinose sur les proprits des films forms en dramifiant larabinoxylane

67

avec de lacide oxalique. Les matriaux prpars partir darabinoxylanes dbranchs (de
ratio Ara/Xyl compris entre 0.3 et 0.52) sont transparents et aucune diffrence dans
lapparence, la structure et la fragilit nest observe. Cependant, un fort taux dhumidit,
une relation existe entre le taux de substitution en arabinose et lhygroscopicit du matriel.
Lanalyse des proprits mcaniques indique que llvation de la teneur en arabinose induit
un net effet plastifiant. Les xylanes peuvent galement tre additionns au gluten de bl en
prsence de glycrol pour former des films biodgradables.
186
Lajout de xylanes de bouleau
dans des films de gluten de bl permet de rduire ses cots de production sans pour autant en
altrer ses qualits, ce qui en fait un excellent additif.

I.4.2. Xylooligosaccharides dintrt
Les xylanes natifs peuvent tre hydrolyss pour obtenir des oses lmentaires qui
fourniront aprs fermentation, dshydratation ou rduction par hydrognation catalytique,
toute une gamme de produits dont certains prsentent une haute valeur ajoute. Ces
hydrolyses peuvent tre de plusieurs ordres : enzymatiques, chimiques ou la combinaison des
deux selon la finalit du produit et lchelle laquelle il est produit.

I. 4. 2. a. Le cas des xylo-oli gosaccharides(XOs) dintrt
biologique
Les xylo-oligosaccharides sont naturellement prsents dans les fruits, les lgumes, les
vgtaux, le lait et le miel.
187
Ils sont majoritairement produits partir de matires
lignocellulosiques contenant des xylanes comme cest le cas pour le bois deucalyptus, des
pis de mas, des fibres de lin, des coquilles damandes, des cosses de riz ou de sarrasin ou de
la paille de bl. Ils peuvent tre obtenus par des mthodes chimiques (autohydrolyse dans
leau par chauffage micro-ondes ou la vapeur, hydrolyse par des acides, les alcalis), par
hydrolyse enzymatique directe ou par une combinaison des deux.
188
Les xylo-
oligosaccharides sont utiliss de nombreuses fins quelles soient alimentaires ou non (Figure
44).




68



Figure 44 : Exemples dapplication des xylo-oligosaccharides (daprs Vquez et coll.,
187
)

Cependant les applications prsentes en Figure 44 ne sont pas exhaustives. Moure et coll.,
188

ont rapport labondance de la littrature propos des effets et des applications relatifs aux
oligosaccharides de xylanes. Ces effets sont souvent dordre biologique et ces molcules se
voient donc valorises comme additifs alimentaires, nutraceutiques ou pharmaceutiques. Les
proprits de ces oligomres peuvent tre en plus des exemples cits ci-dessus, antioxydantes,
antimicrobiennes,
189
prbiotiques,
190
anti-inflammatoires ou encore cytotoxiques envers les
cellules de leucmie aigu lymphoblastique.
191
Aujourdhui encore, malgr les effets
bnfiques sur la sant, lutilisation de xylo-oligosaccharides lchelle industrielle reste trs
limite. Le march japonais, en incorporant des xylo-oligosaccharides dans lalimentation ds
1996,
192
fait figure de pionnier dans le domaine. LEurope commence se positionner sur le
march. Lintrt pour les XOs dans lindustrie alimentaire et le dveloppement de
lalimentation fonctionnelle ne se dment pas, ouvrant de nombreuses opportunits de
valorisation des xylanes.
Additifs
alimentaires
Applications alimentaires
Ingrdients alimentaires

Synbiotiques
Alimentation spciale
-antiobsit
-antidiabtique
Prvention et
traitement des
infections
gastrointestinales
Agent actif contre :
- lostoporose
- otites
- problmes de
peaux et capillaires
- acclre et stimule
la croissance
- agent de
murissement
- amliore le
rendement
Applications non alimentaires
Pharmaceutique

Alimentation animale Agriculture
- animaux domestiques
- poissons


69

La drivation des xylanes tout comme leur fonctionalisation offre de nouvelles pistes de
valorisation. Mme si jusqu prsent les applications des produits ainsi obtenus restent trs
limites, lintrt port ces polymres est grandissant. Les principaux drivs chimiques des
xylanes
193
sont prsents Figure 45.




Figure 45 : Xylanes fonctionnaliss (daprs Ebringerov et al.,
193
)

La prparation de ces drivs met en jeu des ractions doxydation, de sulfatation,
dalkylation, dthrification et destrification. Comme nous lavons dit au paragraphe
I.4.1.b, les xylanes sulfats, de par leur activit anticoagulante, prsentent des proprits
comparables celles de lhparine,
194
ce qui laisse entrevoir des dbouchs dans le domaine
mdical et pharmaceutique. Ils diminueraient aussi le taux de cholestrol et de triglycrides
dans le sang ainsi que la formation de calculs rnaux. Parmi les produits dthrification, le
carboxymthylxylane est employ en tant que drogue antitumorale, adhsif, dtergent
195
ou
additif dans la pte papier.
196
Des drivs carboxythyls et carbamoylthyls bifonctionnels
(thrification avec de lacrylamide en milieu alcalin) ont galement t synthtiss
rcemment par Ren et al.,
197
en vue dune valorisation dans lindustrie papetire. Lalkylation
par des groupements ammonium quaternaires comme le hydroxypropyltrimthylammonium
O
O
O
O H
O H
O
O
O
H O O C - H
2
C - O
O C H
2
C O O H
O
O
O
O H
O
B S A - N H
2
O
O
O
O
O
Cl
O
O
O
O H
N
N H
2
Cl
Cl
N
Cl
N
O
O
O
B S A
O
O
O
O H
N
B S A
O
O
O
O H
N H
O
O
O
O
O
O
N H
O
N H
N C O
O
O
O
H O
3
S O
O S O
3
H
N H
2
Cl
O
O
O
( C H
3
)
3
N ( C H
2
)
3
O
O ( C H
2
)
3
N ( C H
3
)
3
Alkylation par des
ammoniums quaternaires
Drivs TMAHP
carboxymthylxylane
Ethrification
Base de Schiff
Oxydation par le brome
Oxydation periodique
Ligand pour la coordination des ions Cu (II)
Estrification
Xylanes polysulfates (PPS)
Carbamates de xylane
Sulfatation
+
+

70

(TMAHP) ou lpoxypropyltrimthylammonium (ETA) conduit des drivs utiliss comme
additifs dans la fabrication de la pte papier. Schwikal et Heinze
198
ont prpar des xylanes
dialkyloamins (dimthylaminothyl, dithylaminothyl et diisopropanylaminothyl)
sensibles au pH et amphotriques grce la prsence simultane dacides uroniques et de
groupes amines. Lintroduction de longues chaines sur un glucuronoxylane via une raction
de O-alkylation mne des composs amphiphiliques trouvant leurs applications comme
mulsifiant ou tensio-actifs.
156
Loxydation priodique des xylanes, suivie dune amination
rductrice, peut donner des molcules ayant galement des proprits tensio-actives. Enfin
lestrification des xylanes par des groupements carbamates conduit des matriaux
thermoplastiques.
199


I.4.3. Etude de valorisation des xylanes de bois
Nous venons de dtailler les applications des xylanes en gnral, nous allons plus
particulirement nous intresser la valorisation de glucuronoxylanes de bois. Les
applications sont sensiblement identiques mais lavantage de lutilisation de co-produits de
bois est quil ny a pas de conflit dintrt avec une autre industrie, comme cela peut ltre
pour les produits craliers.
I. 4. 3. a. Acti vit s ant itumoral es
Si des proprits immunomodulantes ont t remarques sur des xylanes de htre,
165

par contre peu de donnes ont t publies sur lactivit antitumorale de xylanes
contrairement aux -D-glucanes.
200-203
Hashi et Takeshita
204, 205
ont rapport linhibition du
sarcome-180 par un 4-O-mthylglucuronoxylane de htre japonais. Les auteurs expliquent ce
phnomne par la stimulation indirecte du systme immunitaire non-spcifique. Plus
rcemment le LCSN a prsent la caractrisation structurale dun MGX de chtaignier ainsi
que ses proprits cytotoxiques envers la ligne cancreuse A 431.
206, 207
Dans ce cas, le MGX
inhibe la prolifration et la migration des cellules A 431 ce qui peut sexpliquer par la
diminution de lexpression de mtalloprotases (MMP2 et MMP9), enzymes responsables de
la dgradation de la matrice extracellulaire. Ltude des mcanismes cellulaires semble
indiquer que linhibition de la prolifration des cellules A 431 est relative linduction de
lapoptose plutt que linhibition du cycle cellulaire.


71

I. 4. 3. b. Transf ormations des xylanes de bois aprs hydrolyse et
appli cat ions indust ri ell es
La Figure 46 rsume schmatiquement des exemples de valorisation des xylanes de
bois dans le domaine de lindustrie chimique aprs une hydrolyse.

Figure 46: Hydrolyse des xylanes et exemples dapplications industrielles (daprs Popa
208
)

Les drivs furaniques et le xylitol sont les produits dhydrolyse les plus importants
obtenus partir des xylanes. Les drivs furaniques sont les prcurseurs pour la synthse de
nombreuses molcules et le xylitol est obtenu par rduction de la fonction aldhyde du xylose.
Il peut tre produit industriellement partir de matires riches en xylanes comme certains bois
(corces) aprs hydrolyse des xylanes. Le xylitol (ou E967) est un dulcorant quivalent
semblable au saccharose (mme pouvoir sucrant), mais prsentant un faible apport calorique
car il est absorb plus lentement et partiellement mtabolis par lorganisme. Il peut se
trouver ltat naturel dans de nombreux fruits (fruits rouges, prunes) et lgumes (chou-
fleur). Il possde par ailleurs un caractre inhibiteur vis--vis du dveloppement des caries car
les bactries sont incapables de le mtaboliser contrairement aux sucres en C6. Il est
actuellement utilis comme additif dans de nombreux produits de lindustrie alimentaire
(chewing-gums, chocolats, confiserie, biscuits, aliments dittiques), pharmaceutiques
(pastilles sucer, sirops), dans les cosmtiques (savons, crmes) et dans les dentifrices et
Xylanes du bois
xylitol
acides uroniques
xylose
Hydrolyse
Dshydratation
acide actique
furfural
Rduction
2-mthylfurane lysine
Fermentation
polyols, butanol, thanol actone
acrylates
dulcorant
furane
ttrahydrofurane
adiponitrile
nylon
acide glutamique
alcool furfurylique
alcool
ttrahydrofurfural
mousses
polyurthane
rsines et plastiques
drivs nitrs et
halogns
mdicaments
Xylanes du bois
xylitol
acides uroniques
xylose
Hydrolyse
Dshydratation
acide actique
furfural
Rduction
2-mthylfurane lysine
Fermentation
polyols, butanol, thanol actone
acrylates
dulcorant
furane
ttrahydrofurane
adiponitrile
nylon
acide glutamique
alcool furfurylique
alcool
ttrahydrofurfural
mousses
polyurthane
rsines et plastiques
drivs nitrs et
halogns
mdicaments

72

bains de bouches.
209
Le furfural, obtenu par dshydratation des pentoses, est un produit de
base de lindustrie chimique. Il est le prcurseur dune large gamme de monomres, tel que
lalcool furfurylique, des drivs vinyliques, acryliques et mtacryliques ou poxydes,
capables de polymriser.
210, 211
Entre autres, lalcool furfurylique, obtenu par rduction du
furfural, est largement exploit pour lobtention de rsines furaniques caractrises par une
trs grande rsistance la temprature et aux agents chimiques agressifs (solvants, acides et
bases).
Plus rcemment une autre molcule issue de produits dhydrolyse des xylanes a fait
son apparition sur le march. Il sagit du Pro-Xylane
TM
un glycoside dvelopp selon des
process de chimie verte partir de htre et lanc sur le march en septembre 2006. Il est
synthtis en deux tapes partir du xylose.
212
La premire tape (Figure 47) est la
condensation du xylose avec une dictone en milieu basique. Les bases utilises peuvent tre
de la soude, du bicarbonate de sodium ou de lhydroxyde de lithium.

O OH
OH
OH O H
O O
O
OH
OH O H
O
+
eau
Base


Figure 47 : Formation dune ctone C-xyloside.


La deuxime tape (Figure 48) est la simple rduction du compos prcdemment obtenu
dans lisopropanol ou en milieux aqueux.

O
OH
OH O H
O
O
OH
OH O H
OH
NaBH
4
eau ou isopropanol


Figure 48 : Rduction de la ctone C-xyloside.

Le Pro-Xylane
TM
rencontre un franc succs dans lindustrie cosmtique de par ses proprits
biologiques anti-ge sur les fibroblastes, des cellules prsentes dans le tissu conjonctif. En
effet il stimule la synthse des glycoaminoglycanes sulfats (GAGs) trs impliques dans
ltat dhydratation de la peau. Biodgradable et produit partir de ressources renouvelables,
il est enfin non cotoxique.


73

I. 4. 3. c. Les bioplasti ques
Comme nous lavons vu prcdemment au paragraphe I.4.1.e, un intrt grandissant est
port cette nouvelle catgorie de matriaux. Dans le cas de notre laboratoire, la valorisation
de xylanes de bois par lobtention de matriaux plastiques par estrification a fait lobjet de
deux thses,
2, 213
dune publication
214
et dun brevet.
215
Les matriaux plastiques ont t
obtenus par acylation de xylane de htre commercial ou dhtroxylane de mas dans le
systme DMA/LiCl en prsence ou non de DMAP par chauffage classique ou activation
micro-ondes.
2
Les films plastiques de xylanes esterifis par de lacide laurique prsentent une
meilleure rigidit que ceux obtenus avec de la cellulose degr de substitution (DS)
quivalent. Grndahl et al.,
216
ont prpar des films uniquement partir de glucuronoxylanes
de peuplier tremble. Ces matriaux taient trs cassants et se fragmentaient pendant le
schage. Lajout de sorbitol ou de xylitol permet dobtenir des films transparents avec de
bonnes proprits mcaniques en abaissant la temprature de transition vitreuse. De plus la
faible permabilit loxygne de ces films en fait de bons candidats pour lemballage
alimentaire.

Concernant notre travail proprement dit, lobjectif de cette tude est de proposer de
nouvelles mthodes de dlignification de sciures de chtaignier et dextraction de xylanes
partir de ces mmes sciures et dans la mesure du possible selon des conditions de chimie
verte, plus respectueuse de lenvironnement. Dans un second temps, il sagira dvaluer les
proprits biologiques de ces xylanes.


74



75










Deuxime partie : Nouvelles stratgies de dlignification et
dextraction des xylanes de chtaignier (Castanea sativa Mill.)

76



77


Les travaux initis au laboratoire par Moine
2
dans le domaine de lextraction et de
lanalyse structurale des xylanes de bois ont montr que les bois issus de feuillus sont
particulirement riches en hmicelluloses. Les extraits alcalins issus de sciures de chtaignier
et de chne notamment, sont composs presque exclusivement de xylanes homognes dune
trs grande puret. En raison de son importance conomique en Rgion Limousin, nous avons
slectionn le bois de chtaignier comme modle pour notre tude dont lobjectif principal est
rappelons-le de dvelopper de nouvelles mthodologies de dlignification permettant
lextraction par leau des xylanes dintrt. La qualit des extraits ainsi que les rendements
dextraction ont t valus et compars ceux obtenus selon des approches plus
conventionnelles (dlignification par le chlorite de sodium et extraction par la potasse). Les
sciures de chtaignier ont subi au pralable une extraction par lthanol chaud puis par de
loxalate dammonium afin dliminer successivement les sels minraux, les petites molcules
organiques ainsi que les pectines.
217, 218
Plusieurs mthodes ont ensuite t prospectes :
- la dlignification classique par lhypochlorite de sodium suivie dune extraction
alcaline en tant que procd de rfrence ;
- des prtraitements physiques pralables par les ultrasons ;
- une extraction des xylanes par les micro-ondes ;
- la dlignification enzymatique par les laccases ;
- la dlignification chimique en prsence en prsence de composs ttrapyrroliques
(porphyrine, phtalocyanine) ;
- la dlignification photochimique




78


79

Chapitre I. Dlignification en milieu oxydant
Extraction des hmicelluloses par des mthodes
classiques et non conventionnelles
Classiquement, la dlignification utilise une solution tamponne de chlorite de sodium
dans lacide actique 75C pendant 3 heures.
55
Le renouvellement de lopration permet de
diminuer de faon consquente le taux de lignine. Comme nous lavons indiqu
prcdemment dans la partie bibliographique, cette mthode de dlignification permet
doxyder les cycles phnoliques par le chlore et lacide hypochloreux, librs in situ dans le
milieu ractionnel, qui sont des espces molculaires beaucoup plus ractives que le chlorite
lui-mme. Cette tape de dlignification est prcde par une limination des sucres circulants
et tannins lthanol chaud et dune dpectinisation par de loxalate dammonium.

I.1. Dlignification standard par le chlorite de sodium
Le protocole de Adams
55
(Figure 49) a t adapt pour les sciures de chtaignier.

Figure 49: Protocole dextraction de polysaccharides paritaux adapt de Bailey
217
et Carpita
218

La dlignification est ralise dans une solution de chlorite de sodium 0,6 g par gramme de
matire sche initiale tamponne par de lacide actique glacial hauteur de 0,2 mL par
gramme de matire sche. La solution est porte 80C pendant 1 h et lopration de
Sciures de chtaignier
Rsidu
soxhlet

Rsidu
dpectinis
Holocellulose
(cellulose+hemicellulose+restes de lignine)

Elimination des sucres
circulants et des tannins
Dpectinisation
Dlignification
2
Ethanol 80%, 80C, 7h

Oxalate dammonium 1%, 80C, 2h
Chlorite de sodium+acide actique, 80C, 1h

80

dlignification est ritre une seconde fois. Le rsidu final obtenu compos essentiellement
de cellulose et dhmicelluloses est appel holocellulose.

I.2. Extraction alcaline des xylanes
I.2.1. Conditions opratoires
Comme nous lavons mentionn dans la premire partie, les hmicelluloses en gnral et
les xylanes en particulier, sont extraits facilement, partir dholocellulose, par des alcalis. En
effet ceux-ci sont capables de rompre des liaisons hydrogne, les liaisons covalentes du type
ester par saponification ainsi que les interactions ioniques galement prsentes au sein de la
paroi vgtale. Les protocoles classiques dextraction prsents dans la littrature sont dits
squentiels car ils ont recours lutilisation de bases de concentrations varies (KOH 0,43 M,
KOH 4,3 M, NaOH 4,3 M) pour permettre dobtenir des fractions plus homognes. Les bases
KOH et NaOH sont additionnes dun agent rducteur le NaBH
4
3 mg.mL
-1
et sont
employes sous atmosphre dazote afin de prvenir tout risque de dgradation (notamment
dpolymrisation ou peeling).





Figure 50 : Extraction alcaline de xylanes

Les conditions opratoires optimales ont t dfinies au laboratoire par Moine
2
et
reposent sur lextraction alcaline par de la potasse 4,3M sans imprgnation pralable (c'est--
dire sans extraction par KOH 0,43 M) pendant 24 h temprature ambiante (Figure 50).

I.2.2. Etude qualitative et quantitative du rsidu et de la fraction extraite
Le Tableau 4 prsente la composition de lholocellulose, du rsidu dextraction et du
filtrat. Avec des teneurs en xylose de plus de 70% et dacide 4-O-mthylglucuronique de prs
de 10%, cette analyse confirme que lholocellulose de chtaignier est naturellement trs riche
en xylanes. Avec prs de 90% de xylane (Xylose + 4-O-MeGlcA), lextrait hmicellulosique
apparat comme trs homogne et reprsentatif des MGX du bois de chtaignier. Cette
Extrait hmicellulosique
Holocellulose
Rsidu cellulosique
R
cell
Extraction KOH 4,3M, 24h, t.a, NaBH
4
(3mg.mL
-1
)

81

dernire remarque souligne la bonne slectivit de lextraction alcaline qui est par ailleurs
confirme par la teneur trs faible en xylose dans le rsidu R
cell
(8% molaire). Dans ce cas, les
MGX sont extraits de faon quantitative puisque seule une infime partie subsiste dans le
rsidu final.
Tableau 4 : Compositions monosaccharidiques des rsidus et du filtrat aprs extraction alcaline

Composition molaire (%) monosaccharidique
Rha Fuc Ara Xyl Man Glc Gal GalA GlcA
4-O-
Me
GlcA
Xylane
Holocellulose 2,0 0,1 1,5 72,4 2,8 2,8 4,6 4,2 0,6 9,0 81,3
R
cell
(a)
0,7 0,1 0,4 8,0 10,1 72,8 2,3 3,0 0,3 2,2 10,2
Extrait hmicellulosique 1,2 0,7 0,5 76,8 1,3 0,8 2,5 3,1 0,5 12,6 89,4
(a) Rsidu cellulosique

Le rendement dextraction en hmicelluloses ainsi que le degr de polymrisation
(DP) des molcules sont dtermins par dosage colorimtriques spcifiques des oses neutres
de Dubois,
120
des acides uroniques de Blumenkrantz
121
et des oses rducteurs de Lever.
124

Avec un rendement massique dextraction de 19% et un degr de polymrisation (DP) moyen
de 200, cet extrait prsente toutes les caractristiques attendues pour un 4-O-
mthylglucuronoxylane (MGX) de bois.
7
Ce rsultat est conforme avec les donnes de la
littrature, il confirme galement la bonne slectivit de cette extraction alcaline que nous
nous proposons dutiliser comme rfrence. Cependant ce protocole qui impose lutilisation
de fortes concentrations en alcalis ne prserve pas lactylation des molcules. Cest pourquoi
nous avons souhait dvelopper et mettre en uvre de nouvelles mthodologies prparatives
reposant sur de prtraitement physique, biologique ou chimique des sciures de chtaignier.

I.3. Prtraitements par les ultrasons
Nous nous intressons ici des mthodes non conventionnelles dextraction des
xylanes par les ultrasons.
Rappelons que le prtraitement par ultrasons a pour but de perturber la structure de la
paroi cellulaire (paragraphe I.2.3.c) afin de favoriser limprgnation par le solvant et ainsi
augmenter lextractabilit des polysaccharides qui la composent. Le DMSO, en raison dune
part, de sa capacit extraire slectivement les xylanes
92
et, dautre part, en prserver
lactylation est utilis comme solvant de rfrence.

82

Lnergie ultrasonique haute frquence 20 kHz est obtenue partir de lnergie
lectrique par un convertisseur. Les vibrations mcaniques sont amplifies par la sonde et
provoquent une extrmit la formation de microbulles de vide qui librent une nergie
considrable lorsquelles explosent.
I.3.1. Conditions opratoires
Des essais prliminaires ont t raliss dans le DMSO sur lholocellulose en faisant
varier les conditions opratoires du traitement ultrasons tant en puissance quen dure.
Tableau 5 : Essais prliminaires des prtraitements ultrasons
Essais 1 2 3 4 5 6 7 8
Temps 2,5 min 2,5 min 5 min 5min 10min 10 min 20 min 20 min
Puissance 50 W 150 W 100 W 200 W 50 W 200 W 100 W 150 W

Ainsi 4 modalits de dure (2,5, 5, 10 et 20 minutes) et 4 modalits de puissance (50,
100, 150 et 200 Watts) ont t tests (Tableau 5).

I.3.2. Analyses qualitative et quantitative des extraits
I. 3. 2. a. Anal yse quantitat ive des extraits
Les fractions recueillies prsentent des compositions centsimales homognes avec en
moyenne 13% molaire en acides uroniques (Tableau 6). Les rendements dextraction compris
entre 1 et 3% ainsi que les DP sont cependant trs faibles suggrant que dans notre cas, les
ultrasons employs seuls ne sont pas mme de permettre lextraction des xylanes dans le
DMSO. Les conditions opratoires de rfrence retenues pour la suite sont 20 minutes pour
150 Watts de puissance de sonication puisquelles conduisent au meilleur rendement
dextraction (3%).
Tableau 6 : Rsultats des essais de traitements par sonication dans le DMSO
Essai
(a)
Acides
uroniques (%
molaire)
DP
Rendement
massique (%)
1 13,2 21 1,0
2 12,3 30 1,0
3 12,9 18 1,6
4 12,9 14 1,1
5 13,3 33 1,4
6 10,8 39 1,3
7 17,8 28 2,4
8 13,0 32 3,0
(a) voir Tableau 5

83

Les donnes de la littrature indiquent que lefficacit de lextraction est dpendante
des agents et des conditions dextraction.
116
Les alcalis comme la soude et la potasse sont
dans la plupart des cas utiliss pour lextraction dhmicelluloses. Ils permettent de faibles
concentrations (1-5%) dabaisser le temps dextraction (de 60 5 minutes),
116
la temprature
et parfois dobtenir de meilleurs rendements
219
quavec la mthode classique mais ne
conservent pas lactylation native des molcules extraites comme cest le cas avec le DMSO.
De plus, des conditions trop drastiques conduisent la dpolymrisation des
polysaccharides.
220


I. 3. 2. b. Compositi on saccharidique mol aire des extraits
Lanalyse par CPG des extraits est ralise aprs hydrolyse et drivation par silylation
(Tableau 7). Nous nous sommes particulirement intresss aux pourcentages molaires en
xylose et en acide 4-O-mthylglucuronique, marqueurs des xylanes. Les rsultats indiquent
que le DMSO est un solvant adapt lextraction des xylanes puisque le xylose et lacide 4-
O-mthylglucuronique, reprsentent un peu plus de 80% de la composition molaire. La
prsence dautres oses (rhamnose, fucose) peut tre considre comme contaminante.

Tableau 7 : Compositions monosaccharidiques molaires des extraits aprs prtraitements aux ultrasons
Essai
(a)
Rha Fuc Ara Xyl Man Glc Gal GalA GlcA
4-O-Me
GlcA
1 1,6 0,2 2,3 79,5 2,8 3,2 3,5 3,2 0,4 3,3
2 1,5 0,2 2,2 81,7 3,4 3,2 2,9 2,1 0,5 2,2
3 1,6 0,3 2,3 75,9 5,0 4,6 3,9 3,0 0,3 3,1
4 1,6 0,2 2,1 82,5 2,4 3,0 3,0 2,2 0,7 2,3
5 1,5 0,3 2,0 79,7 5,7 3,1 2,6 3,8 0,1 1,2
6 1,4 0,0 2,1 78,3 5,2 3,7 2,8 2,9 1,3 2,4
7 1,9 0,0 2,4 77,8 3,2 2,2 3,3 5,7 0,3 3,1
8 1,9 0,0 2,5 75,2 4,4 2,6 3,7 6,0 0,2 3,4
(a) voir Tableau 5

Par ailleurs, la modification des paramtres au cours des diffrents essais na pas
dinfluence significative sur la composition monosaccharidique des extraits recueillis,
globalement homognes.
I.4. Extraction par micro-ondes
Le rayonnement micro-ondes est une mthode d'activation des ractions chimiques
que le faible niveau de consommation d'nergie rend trs attractif par rapport au chauffage

84

classique (paragraphe I.2.3.d). Cest pour cette raison que le rayonnement micro-ondes est
souvent cit dans le domaine de la chimie durable.

I.4.1. Conditions opratoires
Dans notre cas, les extractions ont t ralises dans un micro-ondes (Milestone) avec
des consignes de puissance et de temps classiquement utilises au laboratoire : une puissance
de 200W et une dure de 10 minutes. Les extractions ont t ralises aux tempratures
dbullition des solvants (189C pour le DMSO, 165C pour le DMA et 100C pour leau).

I.4.2. Etude qualitative et quantitative des rsidus et des fractions
extraites
I. 4. 2. a. Etude quantitat ive des extraits
Les rsultats prsents Tableau 8 portent sur la partie quantitative de lanalyse. Ils
montrent que les teneurs en acides uroniques sont nettement plus leves dans les extraits eau
(30,5%) et DMA (29,1%) que dans les extraits DMSO (20% maximum). Lanalyse de ces
rsultats montre que contrairement au DMA et leau, le DMSO est plus spcifique des
xylanes.

Tableau 8 : Suivi quantitatif des teneurs en acides uroniques et des rendements massiques dextraction
Conditions d'extraction
Acides uroniques
(% molaire)
DP
Rendement
massique (%)
H
2
O (pH 5.5) 100C 30,5 14 0,9
DMA 165C 29,1 9 1,3
DMSO 189C 10,6 20 9,2
DMSO 145C 12,7 24 3,4
DMSO 110C 20,4 21 1,8
DMSO 80C 19,9 15 1,1

Tandis que des rendements modestes sont observs lors de lutilisation du DMA
(0,9%) et de leau (1,3%) comme solvants, dans le cas du DMSO, llvation du rendement
va de pair avec celle de la temprature, atteignant prs de 10% 189C. Les fractions
extraites sont homognes en taille mais trs nettement infrieures celles observes lors de
lextraction alcaline (DP de lordre de 200).


85

I. 4. 2. b. Etude de la composit ion sacchari dique des extraits
Les compositions monosaccharidiques (Tableau 9) indiquent que les extraits sont
riches en xylanes avec des teneurs dau minimum 60%, mais la slectivit du DMSO est
nanmoins suprieure par rapport aux deux autres solvants que sont leau (57%) et le DMA
(66%). On remarque galement que llvation de la temprature dextraction pour le DMSO
conduit une lgre baisse de la teneur en xylanes qui passe de 71% 189C 77% 80C.

Tableau 9 : Compositions monosaccharidiques molaires des extraits aprs traitement micro-ondes
Conditions
opratoires
Rha Fuc Ara Xyl Man Glc Gal GalAU GlcA
4-O-
Me
GlcA
H
2
O 100C 2,7 0,6 4,0 53,6 11,1 5,3 9,0 9,4 0,9 3,4
DMA 165C 3,7 0,6 5,5 61,5 1,9 2,3 7,9 11,2 0,4 4,9
DMSO 189C 2,1 0,2 2,1 68,6 5,7 8,8 7,4 1,3 0,4 3,4
DMSO 145C 2,3 0,2 2,6 69,8 4,8 3,7 7,0 4,0 0,5 5,1
DMSO 110C 1,4 0,6 1,7 73,1 7,6 5,0 4,0 2,4 0,4 3,9
DMSO 80C 1,3 0,2 1,5 77,0 6,8 5,6 3,5 1,3 0,4 2,4

Si lon compare cette mthode dextraction par les micro-ondes celle par les ultrasons
prcdemment utilise, les rendements obtenus en hmicelluloses sont trs nettement
suprieurs avec les micro-ondes (9,2% contre 3% au maximum pour les ultrasons).

I.5. Extraction par les micro-ondes avec prtraitement aux
ultrasons
En couplant les deux mthodes prcedemment prsentes, nous esprons ainsi augmenter
le rendement dextraction en xylanes.
I.5.1. Etude qualitative et quantitative des rsidus et des fractions extraits
I. 5. 1. a. Etude quantitat ive des extraits
La mise en uvre de cette approche dextraction par les micro-ondes prcde dun
traitement aux ultrasons conduit, lorsque le DMSO est utilis comme solvant, un rendement
massique dextraction de prs de 8%, lgrement infrieur celui obtenu sans prtraitement
ultrasons (9,2%). Le remplacement du DMSO par le DMA ou leau induit une baisse
significative des rendements qui tombent respectivement 1,3% et 0,9% soulignant un effet
de solvant. Enfin, il est possible de constater un effet de temprature qui lorsquelle est

86

abaisse de 145 80C induit une diminution des rendements dextraction qui passent de 3,8
1,2% (Tableau 10).

Tableau 10 : Suivi quantitatif des teneurs en acides uroniques et des rendements massiques dextraction
Conditions d'extraction
Acides uroniques
(% molaire)
DP
Rendement
massique (%)
H
2
O (pH 5,5) 100C 22,3 30 0,9
DMA 165C 28,7 9 1,3
DMSO 189C 11,6 28 7,8
DMSO 145C 13,3 30 3,8
DMSO 110C 12,4 46 2,4
DMSO 80C 17,3 31 1,2

Except pour lextrait DMA qui possde une plus faible valeur de DP, la taille des
molcules recueillies est homogne avec une valeur moyenne de 30. Il sagit donc de petits
polymres qui ont t extraits
I. 5. 1. b. Etude de la composit ion sacchari dique des extraits
Comme le montre le Tableau 11, quel que soit le solvant dextraction utilis, les
fractions recueillies prsentent des compositions monosaccharidiques caractristiques des
MGX et sont semblables celles obtenues aprs extraction par les micro-ondes seuls. En
effet, les extraits DMSO ont toujours une composition molaire en xylanes de 80% en
moyenne, tandis quelle nest que de 60% pour les extraits H
2
O et de 65% pour les extraits
DMA. Le traitement au pralable de la solution par les ultrasons na donc pas dinfluence sur
la quantit et la qualit des extraits recueillis.

Tableau 11 : Composition monosaccharidique molaire des extraits aprs traitements ultrasons et micro-ondes
Conditions
opratoires
Rha Fuc Ara Xyl Man Glc Gal GalA GlcA
4-O-
Me
GlcA
H
2
O 100C 3,6 0,9 4,2 56,9 6,7 4,4 9,1 9,1 0,9 4,3
DMA 165C 4,2 0,3 5,6 59,2 1,5 1,8 9,0 9,5 2,4 6,6
DMSO 189C 1,8 0,2 2,4 75,4 3,8 2,5 6,7 1,6 0,6 5,1
DMSO 145C 2,1 0,3 2,6 67,7 6,6 4,1 6,4 4,7 0,6 4,8
DMSO 110C 1,4 0,6 2,2 74,8 5,7 4,4 4,1 2,7 0,3 3,9
DMSO 80C 1,5 0,2 2,3 79,9 5,6 4,6 3,5 0,6 1,0 1,0

Lanalyse par RMN
1
H, prsentant des signaux 2 ppm
94
(Figure 51) confirme le
maintien de lactylation des xylanes extraits selon cette approche. Par ailleurs, lanalyse de
ce spectre en comparant lintgration des bandes correspondant aux protons glucidiques (entre

87

3 et 5,5 ppm) et lintgration des protons de lactyle ( 2 ppm) nous donne un degr de
substitution (DS) en actyle de lordre de 0,35. Ce rsultat est conforme avec les DS
classiquement prsents (0,4-0,45) dans la littrature pour les xylanes de feuillus.
44, 94


Figure 51 : Spectre RMN
1
H (D
2
O) du xylane extrait dans le DMSO aux micro-ondes aprs prtraitement aux
ultrasons.

I.6. Bilan sur lextraction par les micro-ondes et les
ultrasons dans le DMSO
Le DMSO comme solvant dextraction pour les micro-ondes, en comparaison leau
ou au DMA apparat comme un bon compromis tant sur la quantit que sur la qualit des
extraits recueillis. En effet, un rendement de lordre de 8-9% et une teneur en xylanes de 80%
sont observs. Si lon compare cette mthode lextraction alcaline, les rendements sont
modestes mais la composition monosaccharidique des extraits est semblable, avec en plus la
conservation de lactylation. Malheureusement une baisse des DP est constate, qui passent
de 200 (paragraphe I.2.2) pour lextraction alcaline 28 dans le cas de lutilisation du DMSO
189C au micro-ondes (Tableau 11). La mise en uvre pralable dun traitement physique
par les ultrasons avant lextraction aux micro-ondes ne semble gure amliorer lextractabilit
CH
3
CO
Protons glucidiques

88

des MGX tant dun point quantitatif que du point de vue de la composition glucidique
molaire. Dans ce cas, la teneur en AU (environ 11% pour le DMSO 189C) et la valeur du
rendement massique (de lordre de 9% 189C) restent similaires ou infrieures aux valeurs
recueillies par extraction aux micro-ondes sans prtraitement ultrasons. Ce constat est
galement vrai pour les autres solvants employs (eau et DMA). Lutilisation seule des
ultrasons est le systme le moins intressant pour lextraction des xylanes, ne conduisant qu
des rendements dau maximum 3%.
Les rsultats pour lextraction micro-ondes sont encourageants mais il semble que
lobtention des xylanes dans ces conditions soit limite par la prsence de lignines
persistantes y compris partir du rsidu holocellulosique ayant subi une dlignification. Nous
avons donc choisi dorienter nos mthodologies vers des stratgies de dlignification des
sciures selon une approche biochimique reposant sur une dlignification enzymatique par le
systme laccase/HOBt/H
2
O
2
.



























89

Chapitre II. Dlignification enzymatique par le systme
laccase/HOBt/H
2
O
2

Comme nous lavons mentionn dans la premire partie, de nombreuses tudes ont montr
que les laccases et les peroxydases scrtes par des champignons taient capables de
dgrader la lignine dans le bois. Cest partir des annes 80 que des progrs significatifs ont
t raliss sur la comprhension des mcanismes molculaires de cette biodgradation des
lignines.
221
Plus rcemment, elles ont connu un regain dintrt car elles constituent une
alternative cologique aux produits chlors habituellement utiliss dans lindustrie papetire.
Cependant, notre connaissance, peu dtudes sur la dlignification enzymatique de sciures
sont reportes. Pour cela, nous nous proposons, en nous appuyant sur la littrature se
rapportant aux ptes papier de dlignifier par voie enzymatique des sciures de chtaignier
selon le schma propos Figure 53. Les deux premires tapes (limination des oses circulants
et dpectinisation) sont identiques celles dcrites au chapitre I. La raction de dlignification
se fait selon le principe prsent Figure 52 dans un milieu tamponn dactate de sodium
50 mM et sous atmosphre oxygne en prsence de la laccase et du mdiateur, le HOBt
(hydroxybenzotriazole) 2% (m/m). Ce dernier joue le rle de navettes dlectrons, la laccase
ne pouvant pntrer les fibres de bois. La mthodologie des plans dexpriences a t adopte
pour optimiser la dlignification. Par la suite, les xylanes ont t extraits leau.

Figure 52 : Principe de la dlignification enzymatique

Polysaccharides Lignines dgrades
+
HOBt
Laccase
O
2

Polysaccharides
Lignines

90


Figure 53 : Protocole dobtention de xylanes aprs dlignification enzymatique

II.1. Plan dexpriences
II.1.1. Principe du plan en carr grco-latin
La ralisation dun plan dexpriences apparat ncessaire lorsque lon souhaite
raliser une tude qui met en jeu un grand nombre de facteurs qui ne nous permettent pas
dtablir un classement objectif de ces effets. Le plan dexpriences a pour but dapporter des
rponses dune part sur le rle des facteurs (temprature, temps de raction, nombre
dquivalents de ractif) et dautre part sur loptimisation dun ou plusieurs critres.
Lun de ces plans assez utilis est le plan dexpriences en carr grco-latin ayant pour
but de chercher quantifier ou hirarchiser la contribution de chacun des facteurs de la
raction sur les grandeurs quantit de phnols doss et rendement massique dextraction aprs
Sciures de chtaignier
Rsidu
soxhlet

Rsidu
dpectinis
Holocellulose

Xylanes

Rsidu cellulosique

Elimination des sucres
circulants et des tannins
Dpectination
Dlignification
enzymatique
Ethanol 80%, 80C, 7h
Oxalate dammonium 1%, 80C, 2h
Actate de sodium + laccase +HOBt + O
2
Extraction aqueuse H
2
O
2
, 100C, 1h
Lignines dgrades

91

extraction aqueuse. On aboutit alors une grille de dpouillement qui permet de tracer les
effets moyens des facteurs sur les diffrentes grandeurs mesures.

II.1.2. Mise au point du domaine exprimental
Pour optimiser la raction de dlignification enzymatique, nous avons fait varier la
temprature (entre 25 et 45C), le temps de raction (entre 1 h et 4 h) ainsi que la quantit
denzyme de 5 40 U.g
-1
.
Tableau 12 : Dfinition des facteurs et des modalits
Facteurs
Modalits
1 2 3
Temprature 25C 35C 45C
Temps 60 min 150 min 240 min
Qt en enzyme 5 U.g
-1
20 U.g
-1
40 Ug
-1

Nous avons ainsi dfini 3 facteurs ayant chacun 3 modalits (Tableau 12). Le domaine
exprimental est dfini par lensemble des combinaisons ralisables soit 27 (3
3
)
combinaisons.

II.1.3. Construction du plan dexpriences
Le nombre total de combinaisons tant trop important, la construction du carr-latin
qui consiste faire intervenir chacun des facteurs un mme nombre de fois suivant lensemble
de ses modalits est un arrangement orthogonal. Dans notre cas, il est facile de construire un
tableau de 33 cases par permutation circulaire rpondant cet objectif (Tableau 13).
Lapplication dun plan en carr-latin pour cette tude ncessite donc la ralisation de 9
expriences.









92

Tableau 13 : Plan dexpriences utilis pour la dlignification enzymatique des sciures de chtaignier
Essai Temprature Temps
Quantit de laccase (U.g
-1

de sciures)
1
25C
60 min 5
2 150 min 20
3 240 min 40
4
35C
60 min 20
5 150 min 40
6 240 min 5
7
45C
60 min 40
8 150 min 5
9 240 min 20

Cet arrangement particulier est appel arrangement orthogonal. Il consiste faire
intervenir chacun des facteurs un mme nombre de fois suivant lensemble de ses modalits.
Aucune modalit particulire nest privilgie : les effets moyens des facteurs sont donc
estims avec la mme incertitude, et cette incertitude est minimale. Il est alors possible de
matrialiser ces diffrentes combinaisons sur une reprsentation graphique simple du domaine
exprimental, comme le montre la Figure 54.

Figure 54 : Disposition des essais (symboliss sur la figure par ces points ) dfinis partir dun carr latin dans
le domaine exprimental. Les points dsignent les essais qui nont pas t raliss.

On construit alors un cube dont chacun des axes correspond un des trois facteurs. Il
est donc possible dobtenir une reprsentation des 27 combinaisons ralisables partir de trois
facteurs 3 modalits, dans laquelle les combinaisons repres en noir reprsentent les essais
dfinis par le plan dexpriences. Comme on peut le constater, ces essais sont rpartis
A1 A2 A3
B1
B3
B2
C1
C3
C2
A1 A2 A3
B1
B3
B2
C1
C3
C2

93

uniformment dans le domaine exprimental contrairement la mthodologie classique
consistant faire varier une une les modalits des facteurs (Figure 55).

Figure 55 : Disposition des essais (symboliss sur la figure par ces points ) lorsque lon ne fait varier quun
seul facteur la fois. Les points dsignent les essais qui nont pas t raliss.

II.2. Analyses des rsultats
II.2.1. Tableau de rsultats
Les valeurs pour la quantit en phnols et le rendement massique aprs extraction
aqueuse sont regroupes dans le Tableau 14. Ce dosage permet de connatre la quantit de
phnols -sans distinction- rlargue en solution pendant la raction doxydation ; cest donc
une estimation directe de la qualit de loxydation mise en uvre. Ce dosage propos par
Pereira
222
repose sur une raction doxydo-rduction du ractif de Folin-Ciocalteu constitu
par un mlange dacide phosphotungstique et dacide phosphomolybdique. Ces derniers qui
sont rduits lors de loxydation des phnols donnent un mlange doxydes bleus de tungstne
et de molybdne possdant une absorption maximale aux environs de 750 nm avec pour
rfrence une gamme talon dacide gallique.

A1 A2 A3
B1
B3
B2
C1
C3
C2
A1 A2 A3
B1
B3
B2
C1
C3
C2

94

Tableau 14 : Rsultats dessais de dlignification enzymatique

Essai Temprature (C) Temps (min)
Quantit en
laccase (U/g)
Quantit
estime en
phnols (mg)
Rendement massique
en xylanes (%)
1 25 60 5 3,3 0,9
2 25 150 20 3,5 1,0
3 25 240 40 3,6 0,7
4 35 60 20 5,3 0,8
5 35 150 40 4,7 0,8
6 35 240 5 6,6 0,5
7 45 60 40 4,5 0,8
8 45 150 5 6,3 0,7
9 45 240 20 3,1 0,6




Globalement la quantit en phnols (en moyenne de 4,5 mg) ainsi que le rendement
dextraction en xylanes (0,8%) nvoluent pas de faon significative. Lanalyse des grilles de
dpouillement permettant le trac des effets moyens devrait nous en dire plus sur les rsultats
obtenus.

II.2.2. Construction dune grille de dpouillement
Les rsultats sont ensuite analyss laide dune grille de dpouillement qui permet
une analyse rapide des rsultats et qui est adapte aux arrangements orthogonaux comme cest
le cas dans notre tude. Nous dtaillerons ici seulement lexemple de la grille de
dpouillement associe aux phnols doss aprs dlignification enzymatique (Tableau 15).
Lautre grille de dpouillement concernant le rendement massique dextraction des xylanes
est obtenue de la mme faon.


95

Tableau 15 : Grille de dpouillement pour les phnols doss
Temprature (C) Temps (min) Qt laccase (U /g de sciures)
Essai
Qt dose
(mg)
25 35 45 60 150 240 5 20 40
1 3,32 3,32 3,32 3,32
2 3,55 3,55 3,55 3,55
3 3,63 3,63 3,63 3,63
4 5,33 5,33 5,33 5,33
5 4,71 4,71 4,71 4,71
6 6,63 6,63 6,63 6,30
7 4,51 4,51 4,51 4,51
8 6,30 6,30 6,30 6,30
9 3,09 3,09 3,09 3,09
Total 41,07 10,50 16,67 13,90 13,16 14,56 13,35 15,92 11,97 12,85
Nombre 9 3 3 3 3 3 3 3 3 3
Moyenne 4,56 3,50 5,56 4,63 4,39 4,85 4,45 5,31 3,99 4,28

Lanalyse des donnes pour toutes les autres rponses observes permet de dgager les
facteurs les plus influents et de construire le trac des effets moyens des facteurs. Pour cela, il
faut reporter sur un graphique les valeurs moyennes calcules sur la dernire ligne de la grille
de dpouillement en regard de chacune des modalits des facteurs (Figure 56 et Figure 57).


Figure 56 : Trac des effets moyens sur la quantit en phnols

3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
6,00
25 35 45 60 150 240 5 20 40
Temprature (C) Temps (min) Qt laccase (U/g)
M
a
s
s
e

m
o
y
e
n
n
e

d
e
s

p
h

n
o
l
s

(
e
n

m
g
)
Modalits des facteurs

96


Figure 57 : Trac des effets moyens des facteurs pour le rendement massique en xylanes

Une analyse rapide des graphiques montre que les trois facteurs qui gouvernent la raction
ont, dans le domaine choisi, une influence significative sur les rponses surtout sur la masse
moyenne des phnols doss par la mthode de Folin-Ciocalteu.

II.2.3. Influence de la dure du procd
Mme si ces faibles rendements dextraction en xylanes (infrieurs 1%) et degrs
de dgradation de la lignine, les rsultats sont relativement peu significatifs, il semble
apparatre quun contact prolong (240 minutes) diminue ces rendements (0.6% pour le
rendement dextraction). Ce phnomne est probablement li soit une inactivation de
lenzyme, soit une raction concomittante apparaissant dans ce processus complexe.

II.2.4. Influence de la temprature
Au risque davancer un lieu commun, rappelons que les enzymes en gnral, les
laccases en particulier sont extrmement sensibles la temprature. Une analyse comparative
des rsultats de la littrature
56, 66, 68-70
montre que la laccase, en prsence de HOBt comme
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
25 35 45 60 150 240 5 20 40
Temprature (C) Temps (min) Qt laccase (U/g)
R
e
n
d
e
m
e
n
t

m
o
y
e
n

m
a
s
s
i
q
u
e

e
n

x
y
l
a
n
e
s

(
e
n

m
g
)
Modalits des facteurs

97

mdiateur a un fonctionnement optimal entre 25C et 45C. Dans notre systme, le rendement
dextraction, trs modeste, est optimis (0,8%) 25C.
II.2.5. Influence de la quantit en enzyme
La quantit denzyme utilise ne semble pas avoir dinfluence significative sur le
rendement dextraction en xylanes, mais modifie fortement la quantit de phnols doss aprs
dlignification. Dans ce dernier cas, quand la quantit denzyme passe de 5 U.g
-1
20 U.g
-1
,
la quantit de phnols extraits elle, dcroit de 5,3 4 mg.g
-1
.

II.3. Etude qualitative des rsidus et des fractions extraites
II.3.1. Compositions monosaccharidiques des extraits et rsidus et degr
de polymrisation des xylanes extraits
Les filtrats et les rsidus issus de lextraction aqueuse aprs dlignification
enzymatique ont t caractriss par chromatographie en phase gaz aprs hydrolyse et
drivation (Tableau 16).

Tableau 16 : Compositions monosaccharidiques molaires des extraits et rsidus
Conditions Rha Fuc Ara Xyl Man Glc Gal GalA GlcA
4-O-Me
GlcA XYLANE
1 4,0 0,4 11,0 34,1 9,3 9,6 17,2 9,8 0,9 3,7 37,8
F 2 3,8 0,8 9,5 29,8 10,4 22,0 12,4 5,6 1,0 4,6 34,4
I 3 4,5 0,3 11,3 27,8 13,4 16,3 14,7 7,3 1,1 3,2 31,0
L 4 4,1 0,5 10,8 33,8 12,1 11,7 14,8 6,8 0,9 4,7 38,5
T 5 3,5 1,0 9,4 43,1 8,8 7,7 12,0 6,2 0,9 7,5 50,6
R 6 4,2 0,6 12,2 34,7 13,2 10,5 13,4 5,9 0,6 4,8 39,5
A 7 4,1 0,6 10,9 33,4 13,6 11,8 12,9 6,6 1,0 5,1 38,5
T 8 4,8 0,5 11,7 31,2 11,7 10,8 16,3 7,5 1,0 4,7 35,9
S 9 5,0 0,7 13,7 25,0 15,1 11,1 16,3 7,4 0,9 4,9 29,9


1 2,2 0,1 1,9 71,3 2,5 2,3 45,0 4,9 0,5 9,3 80,6
R 2 2,0 0,1 1,9 70,5 2,4 2,8 4,9 4,5 0,4 10,5 81,0
E 3 2,1 0,1 1,8 72,3 2,5 2,1 4,6 4,0 0,5 10,2 82,5
S 4 2,4 0,1 2,1 70,5 2,5 2,9 5,8 6,0 0,6 7,1 77,6
I 5 2,1 0,1 1,8 68,7 2,7 6,5 4,4 4,7 0,7 8,3 77,0
D 6 2,2 0,2 2,1 74,3 2,3 2,1 5,4 4,6 0,5 6,3 80,6
U 7 2,3 0,1 2,2 73,8 2,3 2,2 5,8 4,3 0,6 6,4 80,2
S 8 2,3 0,1 2,0 71,1 2,5 2,6 5,7 4,4 0,8 8,6 79,7
9 4,0 0,3 3,8 63,3 4,6 3,7 0,6 7,6 0,4 11,7 75,0

98


Avec en moyenne 35% molaire en xylanes, la composition des filtrats indiquent une
faible slectivit du protocole dextraction. Cette dernire remarque est confirme par la
composition molaire des rsidus qui contiennent encore des quantits significatives de
xylanes (de 75 82%). Ceci peut sexpliquer dune part par le fait que de nombreux xylanes
restent retenus par les lignines toujours prsentes. La dlignification enzymatique ne semble
pas tre adapte des matriaux lignifis tels que les sciures de bois comme nous lavait
prcdemment laiss supposer les faibles rendements dextraction en xylanes. Par ailleurs, le
solvant utilis, leau, est certes non polluant et peu agressif, mais il ne semble pas tre le plus
appropri pour extraire slectivement les xylanes contrairement au DMSO ou au KOH qui
permettent lextraction plus spcifique de ces mmes xylanes hauteur de plus de 70%
molaire.
140
L'extraction par l'eau des xylanes d'intrt aprs dlignification enzymatique des
sciures de bois ne conduit donc pas leur extraction quantitative et qualitative.

II.3.2. Caractrisation des rsidus par spectroscopie infrarouge
Lanalyse qualitative de la dlignification a t effectue par spectroscopie infrarouge
par comparaison entre le spectre obtenu avec un traitement classique (chlorite de sodium) et
notre systme (Figure 58).

Figure 58 : Spectre IR des rsidus aprs dlignification par le systme laccase/oxygne/HOBT (en haut) et par le
chlorite de sodium (en bas)

4000.0 3000 2000 1500 1000 400.0
0.0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100.0
cm-1
%T
1505.9
1590.7
1505.9
1590.7

99

La dlignification par le chlorite de sodium de sciures de bois conduit la disparition
des bandes aromatiques (1590 cm
-1
et 1505 cm
-1
), caractristiques des cycles phnoliques. Ces
dernires sont prsentes aprs traitement avec notre systme, confirmant sa faible efficacit.


II.4. Bilan sur la dlignification enzymatique
Dans une optique de chimie verte, nous nous tions limits leau comme choix du
solvant utiliser pour obtenir des xylanes. Une telle extraction savre dautant plus difficile
que les lignines, de par leur complexit structurale et leur interaction troite avec les xylanes,
en limitent lextractibilit. Toutefois, mme si les rendements sont faibles (au plus 1%), cette
mthode dextraction leau constitue une premire approche qui prsente lintrt de
prserver lintgrit des structures. Cependant elle ne semble pas convenir aux sciures de
bois, matrice probablement trop complexe car peu de lignines ont t oxydes (au maximum 7
mg de phnols ont t doss aprs dlignification). Les lignines persistant encore dans les
sciures ont ainsi constitu un frein l'extraction ultrieure des xylanes, d'o les rendements
dextraction et les degrs de polymrisation faibles.
Dautres essais doptimisation ont t raliss. Ils concernaient la granulomtrie des
sciures et des temps de raction plus long. Les rsultats obtenus, similaires ceux dj
recueillis, nont pas justifi quils soient prsents dans ce paragraphe.
Si lon sen rfre la littrature, de nombreuses tudes utilisent ces systmes avec
succs mais sur des modles simplifis
67, 223
de la lignine comme le catchol, ou pour le
blanchiment de la pte papier, ce qui contribue expliquer les diffrences de rsultats
observes avec nos travaux.
Si la dlignification enzymatique des sciures de bois ne permet pas lextraction slective
et quantitative des MGX, elle nous a permis denvisager une nouvelle de stratgie de
dlignification chimique du bois partir de molcules photosensibles telles les
sulfophtalocyanines et les porphyrines mtalles comme nous allons le voir dans la partie
suivante.

100

Chapitre III. Dlignification induite thermiquement par
des macromolcules ttrapyrroliques Analogues de
peroxydases
Devant lchec relatif de la dlignification enzymatique, nous nous sommes proposs
dutiliser lexprience du laboratoire dans le domaine de la chimie des macrocycles
ttrapyrroliques. Il est maintenant tabli que ces derniers peuvent induire thermiquement ou
photochimiquement des ractions doxydations. Nous nous sommes alors demands dans un
premier temps si des porphyrines ou des phtalocyanines mtalles par le fer ou le manganse
en prsence de peroxyde dhydrogne ne pouvaient pas mener une telle finalit, ces
molcules tant connues comme analogues des peroxydases (voir premire partie). Pour cela,
deux ttrasulfophtalocyanines et deux ttrasulfoporphyrines mtalles ont t synthtises
(Figure 59). Le fer et le manganse sont les deux mtaux choisis car selon la littrature
62, 72, 76,
78
en prsence de peroxyde dhydrogne, ils sont capables doxyder des composs phnoliques
comme les lignines et sont utiliss comme composs mimant lactivit oxydative denzymes.
SO
3
Na
SO
3
Na
NaO
3
S
N
N
N
N N
N
N M
N
NaO
3
S
N
N
N N
SO
3
Na
SO
3
Na
NaO
3
S
SO
3
Na
M
M = Fe ou Mn
MPcS
MTPPS

Figure 59 : Catalyseurs utiliss pour loxydation

Lors de ltape de dlignification, le systme utilis est une solution aqueuse de
peroxyde dhydrogne dans laquelle est introduit sont le matriel dlignifier ainsi que les
phtalocyanines ou les porphyrines (Figure 60).




Figure 60 : Principe du systme utilis

MPcS ou MTPPS
H
2
O
2
/H
2
O
Polysaccharides
Lignines
Polysaccharides Lignines dgrades
+

101

III.1. Synthse des phtalocyanines
Nous avons tout dabord synthtis les phtalocyanines sulfones de fer (FePcS) et de
manganse (MnPcS) (Figure 59). Bien que ces produits soient commerciaux, dans le cadre de
notre stratgie de synthse sans solvant il nous a sembl intressant dutiliser cette mthode
propre. A cet effet, nous avons utilis le systme mono sel de lacide
sulfophtalique/ure/molybdate dammonium/sulfate de fer ou de manganse pendant deux
heures 200C (Figure 61).
224
Par rapport aux mthodes classiques en milieu homogne
225
, et
dans le cas de FePcS, cette stratgie augmente sensiblement le rendement (qui passe de 14
76%) tout en diminuant le temps de raction (2 h au lieu de 6 h).
SO
3
Na
SO
3
Na
NaO
3
S
N
N
N
N N
N
N M
N
NaO
3
S
NaO
3
S
OH
O
O
OH
N H
2
NH
2
O
NH
4
Cl
FeSO
4
MnSO
4
+
(NH
2
)
6
Mo
7
O
24
, 4 H
2
O
200C, 2 h
ou
5.3 q
32.2 q
M = Fe, Mn


Figure 61 : Synthse de phtalocyanines sans solvant

Les rendements bruts obtenus sont respectivement de 76% et 15% pour la formation
des phtalocyanines de fer et de manganse. Les spectres UV-Visible de ces deux composs
sont conformes ceux prsents dans la littrature.
226,227


III.2. Synthse des porphyrines
Les ttraphnylporphyrines sulfones de fer (FeTPPS) et de manganse (MnTPPS) ont
t synthtises partir de la ttraphnylporphyrine (H
2
TPP) qui a t sulfone par du H
2
SO
4

concentr. Lintroduction du mtal se fait classiquement partir dun sel (Figure 62).

102

Figure 62: Synthses des porphyrines

La disparition de deux bandes Q sur le spectre UV-visible de FeTPPS et de MnTPPS
par rapport au spectre de la ttraphnylporphyrine sulfone (H
2
TPPS), tmoigne de la
mtallation.

III.3. Protocole de dgradation des lignines et dextraction
des xylanes
Les lignines sont dgrades par oxydation de la matrice vgtale (1% m/V) de
granulomtrie 500 m induite par les porphyrines ou les phtalocyanines (0.056% m/V)
comme catalyseur et le H
2
O
2
(4%, V/V au dbut de la raction)

comme oxydant. Le temps de
rfrence pour la raction de dlignification des sciures dpectines est fix 100 h contre 24
h pour lholocellulose. Ce temps est donc plus long pour les sciures dans la mesure o elles
nont pas subi de dlignification pralable par le chlorite de sodium (comme cest le cas de
N
N
N N
N
N
N N
SO
3
Na
SO
3
Na
NaO
3
S
SO
3
Na
H
2
SO
4
N
N
N N
SO
3
Na
SO
3
Na
NaO
3
S
SO
3
Na
M
FeCl
2
Mn(OAc)
2
MTPPS
H
2
TPP
H
2
TPPS
95%
80C, 20H
ou

103

lholocellulose), elles sont plus riches en lignines. Lajout du peroxyde dhydrogne est de 1
mL lors de la dlignification de lholocellulose et de 4 mL pour celle des sciures dpectines.
Les MGX sont ensuite isols par simple extraction leau chaude (Figure 63) partir du
rsidu dlignifi obtenu prcdemment (rapport solide/liquide : 1/50).

Linfluence de la
temprature, du temps, de la granulomtrie de la matire vgtale oxyder ainsi que la nature
du mtal de la porphyrine ou de la phtalocyanine sont tudis sur le rendement dextraction, la
composition et la caractrisation des xylanes extraits.























Figure 63 : Protocole dextraction et de caractrisation des xylanes de chtaignier

Dtermination des
phnols et dosages
iodomtriques
H
2
O, 100C, 1h

250 mg sciures ou holocellulose (500 m)

Rsidu R
1
Lignines oxydes en
solution
MPcS ou MTPPS, (M=Fe ou Mn)
H
2
O
2
dans H
2
O,
24h ou 100 h, 20 C

Rsidu R
2
Xylanes
Composition
monosaccharidique
Composition
monosaccharidique
Dtermination des oses
neutres, des acides
uroniques et des oses
rducteurs


104

Le principe de la dlignification pour les phtalocynines ou porphyrines est dcrit par la Figure
64.




Figure 64: Principe de la dlignification par les phtalocyanines et les porphyrines. (M=Fe, Mn)

III.3.1. Etude quantitative de fractions extraites aprs la
dlignification
Aprs ltape de dlignification, nous procdons la caractrisation de filtrats ainsi
obtenus par diffrents dosages colorimtriques et iodomtriques.
III. 3. 1. a. Dosage des phnols
Les rsultats concernant la quantit de phnols doss par le ractif de Folin-Ciocalteu
selon la mthode de Pereira
222
sont prsents dans le Tableau 17.
Tableau 17 : Quantification des phnols doss et de peroxyde consomm aprs ltape de dlignification
Catalyseur Substrat Temps T (C)
Qt estime en
phnols (mg)
% H
2
O
2

consomm
FePcS Holocellulose 24 h 20C 1,5 68,9
FePcS Sciures dpectines 100 h 20C 2,0 93,9
MnPcS Holocellulose 24 h 20C 1,1 77,3
MnPcS Sciures dpectines 100 h 20C 2,5 59,7
Fe TPPS Holocellulose 24 h 20C 2,1 99,9
Fe TPPS Sciures dpectines 100 h 20C 2,2 91,2
MnTPPS Holocellulose 24 h 20C 0,2 99,9
MnTPPS Sciures dpectines 100 h 20C 2,9 79,0

Les valeurs obtenues varient de 0,2 2,9 mg, on note cependant une valeur plus leve
en phnols pour les filtrats issus de sciures dpectines comparativement ceux issus
dholocelluloses. Ceci est logique dans la mesure o les holocelluloses ont dj subi une
premire dlignification et sont donc moins riches en polyphnols.

III. 3. 1. b. Quantifi cati on du pourcent age de peroxyde dhydrogne
consomm
La quantit rsiduelle de H
2
O
2
est dtermine par iodomtrie (voir partie
exprimentale). La raction de dlignification ncessitait la prsence de peroxyde
MPcS ou MTPPS
H
2
O
2
, H
2
O
Lignines dgrades
Holocellulose
Sciures
dpectines
ou
Produits de
dlignification
+

105

dhydrogne. Dans la plupart des cas, cette consommation en H
2
O
2
est suprieure 80% ; il
est donc lgitime de penser que la quantit apporte tait adapte aux conditions
exprimentales. Cependant elle est sans doute limitante dans les cas o la consommation de
peroxyde tait estime 99,9%.

III.3.2. Etude quantitative et qualitative des rsidus et extraits
glucidiques
III. 3. 2. a. Compositi ons cent si mal es
Ces compositions sont dtermines aprs dosages colorimtriques spcifiques des oses
neutres
120
, des acides uroniques
121
et des oses rducteurs
124
(voir partie exprimentale) et sont
prsentes sur le Tableau 18. Les rendements massiques dextraction sont trs disparates dun
catalyseur lautre et varient entre 1,9 et 12,1%. Ils sont globalement plus levs lorsque les
xylanes sont extraits partir de rsidus holocellulosiques et lorsque le catalyseur contient du
fer. Notons que pour la FeTPPS, les rendements sont identiques indpendamment du substrat.
Si ces valeurs sont trs encourageantes au vu de celles obtenues prcdemment avec la
mthode de dlignification enzymatique, elles restent cependant en de des 19% obtenus lors
de lextraction alcaline. Les teneurs en acides uroniques sont majoritairement regroupes dans
une fourchette de 15 17%, ce qui est conforme lide que lon se fait de lacidit de la
fraction hmicellulosique de bois de feuillus mais galement similaire notre extrait alcalin
de rfrence. Les valeurs plus leves indiquent peut tre la co-extraction de protopectines,
hypothse qui pourra tre confirme par lanalyse monosaccharidique des ces extraits.

Tableau 18 : Compositions centsimales des filtrats aprs extraction aqueuse

Catalyseur
(a)
Substrat
(a)
AU (en %) DP
Rendement massique
d'extraction en xylanes
(en %)
FePcS Holocellulose 16,6 6 10,5
FePcS Sciures dpectines 16,3 3 3,9
MnPcS Holocellulose 16,6 8 4,6
MnPcS Sciures dpectines 42,4 3 2,6
Fe TPPS Holocellulose 14,9 5 12,0
Fe TPPS Sciures dpectines 17,4 3 12,1
MnTPPS Holocellulose 22,1 18 5,1
MnTPPS Sciures dpectines 19,9 5 1,9
(a) Conditions exprimentales : 250 mg de substrat, 14 mg de catalyseur dans 25 mL dune solution
aqueuse de peroxyde dhydrogne.


106

Les degrs de polymrisation (DP) sont en revanche trs faibles (moins de 20 units
monosaccharidiques) et loin du DP 200 obtenu pour les xylanes extraits avec la mthode
classique par la potasse. Les molcules recueillies sont donc des oligosaccharides. Plusieurs
hypothses peuvent tre avances : cette stratgie de dlignification naffecterait quune
fraction peu retenue de MGX paritaux de bas poids molculaires. Elle pourrait affecter
galement la structure dautres constituants de la paroi cellulaire. Ce serait par exemple le cas
des hmicelluloses qui subiraient une hydrolyse de la liaison glycosidique et conduirait la
libration de rsidus oligosaccharidiques. Enfin une autre hypothse plausible est louverture
des cycles de certains xyloses conduisant la formation daldhydes. En effet le systme
phtalocyanine/peroxyde dhydrogne a galement t utilis par Kachkarova-Sorokina et
al.,
228
comme premire tape de la fonctionnalisation de polysaccharides suivant le schma
ractionnel propos (Figure 65).
O
O
O H
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
O
O
OH
H
-O
O
O
O
O
O
OH
H
O H
O
Fe
III
-O-O
-
Fe
III
PcSFe
III
OO
-

Figure 65 : Proposition de mcanisme pour le clivage de la liaison C
2
-C
3
dun anhydroglucose par Kachakarova-
Sorokina et al.
228


La prsence de nouvelles fonctions aldhydiques peut fausser le dosage des oses rducteurs,
qui nous permet destimer le degr de polymrisation de nos polysaccharides, et qui consiste
doser les fonctions aldhydiques rductrices. Le DP serait alors sous-estim. Nous essaierons
par la suite de valider cette dernire hypothse par des expriences supplmentaires. De la
mme faon, la cration de nouvelles fonctions acides peut interfrer avec le dosage des

107

acides uroniques. Cependant, il faut que loxydation soit suffisante puisque la fonction alcool
secondaire est en premier oxyde en aldhyde, puis laldhyde en acide.

III. 3. 2. b. Compositi ons monosaccharidi ques
Comme dans les systmes enzymatiques, les filtrats et rsidus issus de lextraction
aqueuse aprs dlignification ont t caractriss par chromatographie en phase gazeuse aprs
hydrolyse et drivation. Les rsultats obtenus sont prsents dans le Tableau 19. Lextraction
de xylanes partir de rsidus holocellulosiques aprs dlignification oxydative conduit
globalement une meilleure slectivit. En effet, avec des valeurs comprises entre 60 et 85%
de xylose et dacide 4-O-mthylglucuronique, les teneurs en xylanes sont proches de celles
obtenues par extraction alcaline de sciures dlignifis par le chlorite de sodium. On constate
galement que la dlignification ralise avec les composs de fer donne de meilleurs rsultats
quen prsence de macrocycles de manganse. Enfin pour un mme mtal, lutilisation de
catalyseurs porphyriniques semble moins efficace pour lextraction qualitative des xylanes.
Lorsque que les teneurs en xylanes sont faibles, c'est--dire essentiellement pour les extraits
issus de sciures (Figure 17), les autres monosaccharides principalement identifis dans les
extraits sont le glucose, le galactose et lacide galacturonique. Ce dernier indique que des
protopectines, pectines trs intimement lies la paroi cellulaire et non solubilises lors de
ltape de dlignification, ont t extraites ici, comme ce fut dj le cas pour les fractions
hmicellulosiques recueillies aux micro-ondes dans leau et le DMA (paragraphe I.4.2.b).

Tableau 19 : Compositions monosaccharidiques des fractions aprs extraction aqueuse en % molaire
Catalyseur
(a)
Substrat
(a)
Rha Fuc Ara Xyl Man Glc Gal GalA GlcA
4-O-
Me
GlcA
Xylane
(b)
FePcS Holocellulose 1,2 0,2 0,9 75,5 4,4 4,3 1,6 2,0 0,4 9,5 85,0
FePcS Sciures dpectines 1,5 0,5 2,4 58,7 11,3 12,7 2,2 3,4 0,9 6,5 65,2
MnPcS Holocellulose 1,3 0,3 2,1 61,9 9,6 12,9 1,5 2,9 0,7 6,8 68,7
MnPcS Sciures dpectines 6,0 0,6 7,9 21,9 10,3 5,9 15,9 26,2 2,6 2,7 24,6
Fe TPPS Holocellulose 1,6 0,6 0,9 66,8 6,0 8,7 1,2 2,0 1,4 10,9 77,7
Fe TPPS Sciures dpectines 2,4 0,7 2,9 50,1 7,6 21,7 1,7 3,7 2,4 6,7 56,8
MnTPPS Holocellulose 3,9 0,3 2,7 50,9 6,4 4,7 6,7 13,3 1,6 9,6 60,5
MnTPPS Sciures dpectines 5,8 0,7 8,9 23,0 13,2 9,0 16,7 15,8 2,7 4,4 27,4
(a) Ces conditions concernent ltape de dlignification pralable lextraction des xylanes.
(b) La colonne correspond la somme des teneurs en xylose et acide 4-O-mthylglucuronique.

Les compositions monosaccharidiques ont galement t ralises dans le cas de
rsidus et les rsultats sont prsents sur le Tableau 20. Les teneurs en xylanes dans les
rsidus restent trs leves (80% en moyenne) en comparaison avec les 10% du rsidu

108

holocellulosique issu de lextraction alcaline. Cette dernire remarque est conforme avec les
rendements dextraction qui sont - dans les meilleurs des cas moiti moindre que pour
lextraction alcaline prcde de la dlignification au chlorite.

Tableau 20 : Compositions monosaccharidiques des rsidus aprs extraction aqueuse en % molaire
Catalyseur
(a)
Substrat
(a)
Rha Fuc Ara Xyl Man Glc Gal GalA GlcA
4-O -
Me
GlcA
Xylane
(b)
FePcS Holocellulose 1,0 0,3 0,6 77,2 3,3 6,6 1,2 1,8 0,2 7,9 85,1
FePcS
Sciures
dpectines
1,0 0,4 0,7 78,7 2,4 4,7 0,8 1,0 1,1 9,3 88,0
MnPcS Holocellulose 1,8 0,3 1,4 76,1 2,3 2,4 2,9 3,6 0,3 8,4 85,1
MnPcS
Sciures
dpectines
2,7 0,2 1,6 70,7 3,1 2,8 3,3 6,3 1,1 8,2 78,9
Fe TPPS Holocellulose 1,2 0,5 0,5 57,6 4,4 22,1 0,9 2,1 0,8 10,1 67,7
Fe TPPS
Sciures
dpectines
2,4 0,7 2,9 50,1 7,6 21,7 1,7 3,7 2,4 6,7 56,8
MnTPPS Holocellulose 2,4 0,3 1,2 68,5 2,7 3,9 3,3 5,9 0,8 11,1 79,6
MnTPPS
Sciures
dpectines
1,9 0,4 0,7 70,5 1,9 9,4 0,9 3,1 0,8 10,5 81,0
(a) Ces conditions concernent ltape de dlignification pralable lextraction des xylanes.
(b) La colonne correspond la somme des teneurs en xylose et acide 4-O-mthylglucuronique.

Cependant, dans le cas des rsidus dlignifis par les porphyrines de fer, les teneurs en
xylanes, de lordre de 70%, sont plus faibles. En effet dans ce cas, les rendements dextraction
en xylanes sont les plus levs, de lordre de 12%, ces rsultats sont parfaitement transcrits
par lanalyse des compositions monosaccharidiques par CPG.

III. 3. 2. c. Act ylati on des xylanes extraits
Une analyse RMN
1
H sur lextrait de xylane issu dun rsidu holocellulosique
dlignifi par FePcS a t ralise afin dinfirmer ou de confirmer la prsence de groupes
actyles. La prsence du massif 2,2 ppm spcifique des groupements actyles localiss en
C
2
et/ou C
3
des rsidus xylose confirme lextraction de xylanes actyls (Figure 66). Le degr
de substitution (DS) est estim 0,34 en suivant la mthode de calcul prsente au paragraphe
I.3.1.c. et est conforme avec ceux classiquement annoncs dans la littrature pour les xylanes
de feuillus.
44, 94



109


Figure 66 : Spectre RMN
1
H (D
2
O) du xylane extrait dans leau partir dun rsidu holocellulosique dlignifi
par le systme FePcS/H
2
O
2
.

III.3.3. Optimisation des paramtres
La faisabilit technique de la mise en uvre dune approche de dlignification de
sciures par les phtalocyanines ou les porphyrines ayant t dmontre, nous avons souhait
optimiser les protocoles utiliss. A cette fin, nous avons procd de nouveaux essais en
faisant varier la granulomtrie, la temprature et le temps de raction.
III. 3. 3. a. La granul omtri e
Il est largement connu que, en milieu htrogne, la taille dune particule tant comme
substrat que catalyseur a une influence significative sur le droulement dune raction. Une
granulomtrie trop petite augmente la surface de contact et par consquent la qualit de
limprgnation mais la diminution trop importante de la taille des particules peut induire la
formation dagglomrats qui au contraire ralentissent la raction. Dans notre cas, nous avons
dlignifi des substrats de granulomtrie 500 m et 200 m. Les rsultats sont prsents sur le
Tableau 21.

CH
3
CO
Protons glucidiques

110

Tableau 21 : Rsultats qualitatifs et quantitatifs pour les xylanes extraits sur du matriel de granulomtrie 200 et
500 m
Catalyseur
(a)
Substrat
(a)

AU (en %) DP
Rendement massique
d'extraction des
xylanes
Composition molaire
en xylanes (en %)
500 m 200 m 500 m 200 m 500 m 200 m 500 m 200 m
FePcS Holocellulose
(b)
16,6 11,2
6
8 10,5 9,0 85,0 82,4
FePcS Sciures dpectines
(c)
16,3 19,6
3
2 3,9 6,2 65,2 73,2
MnPcS 3 Holocellulose
(b)
16,6 43,2
8
14 4,6 4,9 68,7 54,0
MnPcS 3 Sciures dpectines
(c)
42,4 35,3
3
5 2,6 2,4 24,6 25,8
Fe TPPS Holocellulose
(b)
14,9 17,0
5
4 12,0 14,2 77,7 74,4
Fe TPPS Sciures dpectines
(c)
17,4 20,1
3
3 12,1 8,9 56,8 53,0
MnTPPS Holocellulose
(b)
22,1 27,1
18
24 5,1 4,6 60,5 54,8
MnTPPS Sciures dpetines
(c)
19,9 21,3
5
5 1,9 1,9 27,4 24,9
(a) Ces conditions concernent ltape de dlignification pralable lextraction des xylanes
(b) 24 h de dlignification
(c) 100 h de dlignification

Globalement, les rsultats obtenus avec ces deux granulomtries sont comparables,
tant qualitativement que quantitativement. Seuls les rendements dextraction en xylanes
partir de sciures (et dlignifi avec FePcS) et partir dholocellulose (et dlignifi avec
FeTPPS) ont vu leur taux augmenter par rapport la granulomtrie 500 m passant de 12
14,2%. La taille des molcules extraites nvolue pas, la majorit tant des oligosaccharides
dont le DP est infrieur 10. La granulomtrie nest donc pas un facteur dterminant dans le
cadre exprimental que nous nous sommes fixs.

III. 3. 3. b. La temprature
Initialement la temprature de rfrence pour les tapes de dlignification est de 20C
(temprature ambiante). Une augmentation de la temprature est souvent associe
lamlioration de lefficacit et donc des rendements dextraction. Afin de ne pas provoquer
une dgradation des hmiceluloses dintrt, nous avons optimis la temprature et opr de
nouveaux essais 40C. La raction de dlignification oxydative a t ralise sur des rsidus
de sciures dpectines ou dholocelluloses, avec la phtalocyanine de fer et dans les conditions
standard dfinies au paragraphe III.3. Les rsultats sont regroups dans le Tableau 22.



111

Tableau 22 : Rsultats qualitatifs et quantitatifs pour les xylanes extraits sur des sciures et de lholocellulose
20 et 40C
Substrat
(a)
Temprature(C)
(a)
AU (en %) DP
Rendement massique
d'extraction (en %)
Composition
molaire en
xylanes (en %)
Holocellulose 20 16,6 6 10,5 85,0
Holocellulose 40 14,3 6 8,1 84,9
Sciures
dpectines
20 16,3 3 3,9 65,2
Sciures
dpectines
40 12,7 3 6,3 71,9
(a) Ces conditions concernent ltape de dlignification pralable lextraction des xylanes.

Pour les rsidus holocellulosiques et les sciures, llvation de la temprature ninduit pas
de modification sensible. Cependant il est possible de constater dans le cas des holocelluloses,
une diminution du rendement dextraction qui passe de 10,5% 8% ; le phnomne est
invers dans le cas de sciures. Ces dernires sont trs lignifies et la chaleur doit favoriser
dans ce cas le processus de dlignification oxydative, et donc ensuite faciliter lextraction des
hmicelluloses dans leau.

III. 3. 3. c. Temps de raction
Linfluence du temps a galement t tudie sur notre systme avec la FePcS comme
catalyseur sur lholocellulose et une temprature de 20C. Des dures de dlignification
oxydative de 1, 24 et 100 h sont testes (Tableau 23). Pour les rsidus holocellulosiques,
llvation du temps conduit de changements non ngligeables. Llvation du temps
ractionnel de 1 24 h permet une aumentation du rendement dextraction qui passe de 6,3
10,5%. Un allongement supplmentaire du temps de 24 100 h ninduit pas dvolution en
termes de rendement massique et est mme dfavorable concernant la qualit des extraits (la
composition molaire en xylanes diminuant). Un temps de raction de 24 h semble optimal
pour la dlignification de lholocellulose par le systme phtalocyanine/H
2
O
2
. Dans tous les
cas, les molcules extraites sont des oligosaccharides, les DP tant compris entre 3 et 8.

Tableau 23 : Rsultats qualitatifs et quantitatifs pour les xylanes extraits sur de lholocellulose des temps
variables (aprs dlignification avec FePcS comme catalyseur)
Temps (en h)
(a)
AU (en %) DP
Rendement
massique
d'extraction (en %)
Composition
molaire en
xylanes (en %)
1 29,6 8 6,3 70,6
24 16,6 6 10,5 85,0
100 12,7 3 10,2 76,6
(a) Cette condition concerne ltape de dlignification pralable lextraction des xylanes.

112

Dans le cas des sciures, compte tenu de leur lignification plus leve, seules les
conditions de temps 24 et 100 h on t testes. Les rsultats sont prsents Tableau 24.

Tableau 24 : Rsultats qualitatifs et quantitatifs pour les xylanes extraits sur des sciures pour des temps de
dlignification oxydative de 24 et 100h avec FePcS

Temps (en h)
(a)
AU (en %) DP
Rendement
massique
d'extraction (en %)
Composition
molaire en
xylanes (en %)
24 20,6 3 1,9 54,3
100 16,3 3 3,9 65,2
(a) Cette condition concerne ltape de dlignification pralable lextraction des xylanes.

Le constat est le mme que prcdemment puisque lallongement du temps permet de
doubler le rendement dextraction qui passe de 1,9 3,9%. Une dure prolonge de
dlignification permet une meilleure dgradation des lignines et donc une meilleure extraction
des xylanes auparavant lis la lignine. Le rendement demeure toutefois modeste bien que la
slectivit soit amliore. De ce fait, il ne semble pas que ce systme soit adapt des
matrices telles que les sciures.

III.3.4. Hypothse relative aux mcanismes doxydation et leur
rpercussion sur la structure des molcules
Prcdemment, nous avons mis plusieurs hypothses pour expliquer le faible degr
de polymrisation des molcules extraites. Nous avons suppos que lapparition de fonctions
aldhydes cause par le protocole de dlignification mis en uvre faussait le dosage des
sucres rducteurs qui tient compte des fonctions aldhydiques rductrices. De ce fait, le
protocole de dlignification a t renouvel directement sur 250 mg de xylanes de deux
types : des xylanes de htre commerciaux (Sigma) et des xylanes de chtaignier extraits selon
le protocole propos au paragraphe I.1. Loxydation est ralise temprature ambiante, dans
25 mL deau distille en prsence de 14 mg de FePcS et de 1 mL de peroxyde dhydrogne
pendant 24 h.

III. 3. 4. a. Dosages col ori mt ri ques
Les dosages colorimtriques spcifiques des acides uroniques
121
et des oses
rducteurs
124
nous donnent une premire information qualitative sur les xylanes aprs leur

113

oxydation. Si globalement, les teneurs en acides uroniques nont pas ou peu vari, le degr de
polymrisation estim par colorimtrie sest trs nettement abaiss passant de 200 20
(Tableau 25). Ce constat laisserait penser que le systme oxydant utilis est en mesure de
rompre les liaisons glycosidiques du xylane conduisant ainsi leur dpolymrisation.

Tableau 25 : Donnes qualitatives des xylanes avant et aprs oxydation par le systme FePcS/H
2
O
2
Types de xylanes Conditions AU (%) DP
Xylanes de htre
commercial
Avant oxydation 9,0 160
Aprs oxydation 9,0 14
Xylanes de
chtaignier
Avant oxydation 12,3 200
Aprs oxydation 9,1 26

Nanmoins, comme le montre la Figure 65, le systme oxydant cre des fonctions
aldhydes qui pourraient interfrer lors du dosage des fonctions aldhydiques rductrices. Le
DP sera alors sous-estim
III. 3. 4. b. Dosages des fonct ions acides carboxyliques et aldhydes
Afin dvaluer limportance du phnomne doxydation sur le glucuronoxylane, la
quantit de fonctions aldhydes et carboxyliques a t dose sur les polysaccharides avant et
aprs oxydation. Pour le dosage des fonctions carboxyliques, le polysaccharide est plac en
milieu lgrement basique et lexcs de soude est dos par de lacide chlorhydrique. Pour
celui des fonctions aldhydes, la mthode utilise celle de Pommerening.
229
Le principe du
dosage est assimil au dosage de Cannizarro et met en jeu la dismutation des fonctions
aldhydes sous laction de la soude. La moiti des aldhydes est oxyde en acide et lautre
moiti rduite en alcool (Figure 67).
O
R
H
O
R
OH
RCH
2
OH
NaOH
+
2

Figure 67 : Raction de Cannizarro

Le nombre de moles cres pour chaque fonction est calcul par les formules donnes
aux paragraphes III.2.4 et III.2.5 et les rsultats sont exprims en millimoles par gramme de
polysaccharides (Tableau 26). Si la quantit de fonctions carboxyliques reste faible, la
quantit de fonctions aldhydiques cree est importante. Cela sexplique par le fait quune

114

fonction carboxylique est obtenue par oxydation dune fonction aldhyde ; ces dernires sont
les premires formes et donc les plus nombreuses surtout chez le xylane de chtaignier.

Tableau 26 : Rsultats des dosages des fonctions acides et aldhydes
Varits de xylanes
n
COOH
cres en
mmol/g de
polysaccharide
n
CHO
cres en
mmol/g de
polysaccharide
Xylanes de htre
commercial
0,7 1,2
Xylanes de chtaignier 0,2 4,3

Les valeurs ainsi obtenues confirment lapparition des fonctions carboxyliques et
aldhydiques et supportent lhypothse selon laquelle les fonctions aldhydiques doses dans
cette tude puissent ltre galement lors de lestimation des oses rducteurs.

III. 3. 4. c. RMN
1
H et
13
C
Afin de confirmer la cration de ces fonctions acides et aldhydes, une tude RMN a
t effectue. En proton ou en carbone les signaux concernant ces fonctions sont
suffisamment dblinds pour tre identifiables sans ambigut. Dans les spectres RMN
1
H, le
signal le plus dblind aux alentours de 5,5 ppm correspond au proton anomrique de lacide
4-O-mthylglucuronique (Figure 68), mais aucun ne correspond des fonctions aldhydes.


Figure 68 : Spectre RMN
1
H (D
2
O) du xylane de chtaignier avant ( gauche) et aprs oxydation par le systme
FePcS/H
2
O
2
.

Lanalyse RMN
13
C conduit au mme rsultat. Chez les xylanes natifs, les 5 signaux
101, 76, 73, 72 et 69 ppm correspondent respectivement aux carbones C-1, C-4, C-3, C-2 et

115

C-5 des units de xylose non substitu. Cependant sur les spectres des xylanes oxyds aucun
signal 170 et 180 ppm, caractristiques des acides carboxyliques et des aldhydes nest
identifi. Ceci peut sexpliquer par la prsence dun quilibre entre les formes aldhydique et
dialcool dans leau, ce qui masque la prsence de ces fonctions aldhydiques (Figure 69).
O
R
H
CH R
OH
OH
+
H
2
O

Figure 69 : Raction dquilibre dun aldhyde dans leau

III. 3. 4. d. Anal yses par inf rarouge
Pour dtecter lventuelle prsence de fonctions aldhydiques, une analyse infrarouge
est faite sur les deux xylanes. Le spectre IR montre lapparition dune bande vers 1720-1730
cm
-1
caractristique de la fonction C=O dun aldhyde confirmant loxydation du
polysaccharide par le systme FePcS/H
2
O
2
. Les aldhydes ont aussi une bande (C-H) vers
2700-2800 cm
-1
.

Figure 70 : Spectre IR des xylanes de htre et de chtaignier avant (spectres noirs) et aprs oxydation (spectres
rouges) par le systme FePcS/H
2
O
2


4000.0 3000 2000 1500 1000 400.0
cm-1
%T
1730.8
4000.0 3000 2000 1500 1000 400.1
cm-1
%T 1723.5
Xylane de htre
Xylane de chtaignier

116

III. 3. 4. e. Profil s de masse mol culai re par HPLC
Afin de contrler leffet du systme oxydant sur le profil de masse molculaire des
glucuronoxylanes, une analyse par HPLC sur colonnes dexclusion strique a t ralise. La
superposition des deux profils, en mettant en vidence lapparition dun dcalage du profil du
xylane oxyd vers des masses molculaires plus faibles laisse supposer quune
dpolymrisation partielle a eu lieu.

Figure 71 : Profils de masses de glucuronoxylanes de htre ayant ou non subi un traitement oxydatif par le
systme FePcS/H
2
O
2


III. 3. 4. f. Bilan sur l ef fet du syst me oxydant MPcS/H
2
O
2
sur les
xylanes
Il semblerait que le systme oxydant tudi dans cette partie soit responsable de la
cration de fonctions aldhydes et, dans une moindre proportion de fonctions acides. La
prsence de ces fonctions fausserait lestimation de la taille des molcules dont les DP ne
seraient pas aussi faibles que ceux annoncs. Toutefois le profil de masse molculaire indique
quune dpolymrisation se produit galement. Ainsi le systme MPcS/H
2
O
2
non seulement
oxyderait les lignines comme cela tait notre objectif mais il altrerait la structure de nos
hmicelluloses dintrt dune part en les oxydant et dautre part en provoquant la rupture de
liaisons glycosidiques de la chane principale de xylose.

0,0 1,3 2,5 3,8 5,0 6,3 7,5 8,8 10,0 11,3 12,5 13,8 15,0 16,3 17,5 18,8 20,0 22,0
-0,50
-0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
xylane htre aprs oxydation
RIU
min
2
1
xylane htre
V
0


117

III.4. Bilan sur le systme de dlignification MPcS ou
MTPPS/H
2
O
2

Ltude du systme de dlignification MPcS ou MTPPS/H
2
O
2
dmontre quil est
possible de concurrencer les systmes classiques de dlignification par le chlorite de sodium
et dextraction alcaline de matriaux trs lignifis telles les sciures de bois. Nous avons
obtenu des rendements massiques en xylanes de lordre de 14% aprs dlignification avec
notre systme et extraction aqueuse alors que pour la dlignification au chlorite et lextraction
alcaline il est de 20%. Les rsultats prliminaires obtenus avec ces procds sont moins
performants que le systme classique au chlorite de sodium mais prsentent lavantage
dutiliser des produits rputs propres. La qualit des extraits reste comparable en termes de
compositions monosaccharidiques par rapport une extraction alcaline classique, avec une
slectivit en xylanes aussi leve. Cependant nous avons observ une diminution des DP
ainsi que lapparition probable de fonctions aldhydes et acides.
















118

Chapitre IV. Dlignification induite photochimiquement
en prsence de porphyrines ou de phtalocyanines
Poursuivant la recherche de nouveaux systmes de dlignification, nous nous sommes
alors attachs utiliser des macrocycles ttrapyrroliques comme photosensibilisateurs. En
effet les porphyrines comme les phtalocyanines sont fortement colors en raison de leur
aromaticit. Ces produits prsentent un caractre de photosensibilateurs si leurs tats excits
ont une dure de vie suffisante.
Pour les phtalocyanines utilises lors de cette tude nous avons choisi le zinc, le nickel et
laluminium car au regard de la littrature, ce sont de bons candidats pour la production
doxygne singulet.
89, 230
Le Rose de Bengale est lui aussi un photosensibilisateur efficace
pour les ractions de photo-oxydation en produisant de loxygne singulet avec de forts
rendements.
88

Les photosensibilisateurs sont utiliss dans leau en prsence de substrats dlignifier
sous atmosphre oxygne et sous irradiation lumineuse afin de dgrader photochimiquement
les lignines, selon le principe prsent Figure 72.




Figure 72: Prsentation du systme de photooxydation. (M=Al, Ni, Zn)

IV.1. Synthse des photosensibilisateurs
IV.1.1. Synthse de la ttraphnylporphyrine sulfone
Elle est obtenue selon le schma de synthse prsent Figure 62. Le rendement aprs
purification est de 87%. La masse obtenue en MALDI-TOF (m/z = 935,24) et la RMN
1
H
confirme la structure du produit attendu.
IV.1.2. Synthse de la sulfophtalocyanines daluminium, de nickel et
de zinc
Elles ont t synthtises selon la mme mthode que les phtalocyanines de fer et de
manganse (Figure 61) en utilisant des chlorures hydrats daluminium, de zinc et de nickel et
sont utilises sans purification supplmentaire. Elles ont t caractrises par UV-Visible, par
MPcS, H
2
TPPS ou
Rose de Bengale
O
2
, h
Lignines dgrades
Holocellulose
Sciures
dpectines
ou
Produits de
dlignification
+

119

spectromtrie de masse MALDI-TOF et par RMN
1
H, et les rsultats de ces analyses
confirment les structures attendues.

IV.2. Protocole de dgradation des lignines et dextraction
des xylanes
Le matriel dlignifier (1% masse/volume) est plac en milieu aqueux en prsence
de 0,056% (m/v) de photosensibilisateur. Aprs saturation du milieu en oxygne, celui-ci est
ferm hermtiquement et plac sous irradiation lumineuse. Lirradiation apporte est de la
lumire blanche sous forme de deux lampes de 100 Watts afin de produire loxygne singulet.
Les matriaux dlignifier sont des lots dholocellulose et de sciures de chtaignier de 500
M. Les xylanes sont ensuite extraits simplement reflux dans leau.

IV.2.1. Etude qualitative et quantitative des extraits aprs
dlignification photochimique
IV. 2. 1. a. Dosage des phnols
Nous dosons les phnols comme prcdemment avec le ractif de Folin-Ciocalteu
(Tableau 27). Avec les phtalocyanines daluminium et de zinc comme photosensibilisateurs,
on constate que la quantit de phnols doss et relargus dans le milieu sont identiques quel
que soit le substrat qui subit la dlignification (0,7 mg pour AlPcS et 1,1 mg pour ZnPcS).

Tableau 27 : Quantits estimes en phnols par dosages aprs dlignification photochimique
Photosensibilisateur Substrat Quantit en phnols (en mg)
H
2
TPPS
Sciures 1,0
Holocellulose 1,9
AlPcS
Sciures 0,7
Holocellulose 0,7
NiPcS
Sciures 0,9
Holocellulose 3,3
ZnPcS
Sciures 1,1
Holocellulose 1,2
Rose de Bengale
Sciures 0,8
Holocellulose 1,8


120

Dans le cas de la porphyrine de fer, la phtalocyanine de nickel et le Rose de Bengale,
les quantits de phnols librs sont nettement suprieures (au moins le double) lors de la
dlignification des sciures que de lholocellulose, ce qui semble logique puisque
lholocellulose a dj t dlignifie et quelle contient donc moins de polyphnols
IV. 2. 1. b. Racti on secondaire de photobl anchi ment
Au cours de la raction, un photoblanchiment des photosensiblisateurs est observ de
faon plus ou moins prononce selon le type de photosensibilisateurs. La turbidit des
solutions aprs photooxydation ne nous permettait pas dobtenir, mme aprs centrifugation,
les spectres UV-visible de labsorbance. Nous avons donc choisi dvaluer visuellement ce
phnomne (Figure 73).























Figure 73 : Filtrats correspondant aux dlignifications photochimiques. Photo 1 : H
2
TPPS. Photo 2 : AlPcS.
Photo 3 : ZnPcS. Photo 4 : NiPcS. Photo 5 : Rose de Bengale.
(a) Solutions aprs dlignification de lholocellulose. (b) Solutions avant photooxydation. (c) Solution
aprs dlignification de sciures dpectines.


La couleur initiale de H
2
TPPS (Photo 1) solubilise dans leau est violette. Au bout de
huit jours de raction, les couleurs des solutions sont vertes. Les porphyrines peuvent tre
1
3 4
5
2
a b c
a b c
a b c a b c
a b c

121

utilises comme indicateurs colors car en milieu acide elles deviennent vertes et sont
violettes au pH de leau. Le pH des solutions est de 5,85 pour la solution porphyrinique avant
la dlignification ; il nest plus que de 3,35 pour les deux autres solutions, ce qui explique le
changement de coloration. Labaissement du pH au cours de la raction est sans doute caus
par le relargage dans le milieu de polyphnols ou de structures similaires lors de la
dlignification. La solution ayant contenu lholocellulose a subi un photoblanchiment tandis
que la solution de sciures semble avoir une couleur aussi intense que la solution initiale de
H
2
TPPS.
Pour les dlignifications photochimiques avec AlPcS (Photo 2) et ZnPcS (Photo 3), un
photoblanchiment est observ, ce dernier tant plus prononc pour le filtrat contenant
lholocellulose. Kluson
230
note que la dcomposition des phtalocyanines daluminium et de
zinc est insignifiante mais la raction na lieu que sur 200 minutes contre 100 h dans le cas de
notre tude, ce qui explique la diffrence de photostabilit.
Pour la phtalocyanine de nickel (NiPcS), il y a seulement un lger photoblanchiment qui
nous permet de dire que NiPcS est trs rsistant la photooxydation comme cela a dj t
prcdemment observ par dAlessandro.
231
Il affirme aussi que cette stabilit est thermique
puisque des essais montrent quau bout de 24 h 80C, pas de changements sont perceptibles
aprs analyses UV.
Pour le Rose de Bengale, le photoblanchiment parait trs marqu car les filtrats aprs
dlignification sont quasi transparents mais il savre que la coloration a plutt imprgn les
rsidus holocellulosiques et les sciures. En effet, lors du rinage, une importante et persistante
coloration rose est apparue dans les eaux, ce qui laisse supposer que le Rose de Bengale nest
pas aussi instable et sensible la lumire que ne le suggre la photo.

IV. 2. 1. c. Int erprtation
Tous nos photosensibilisateurs produisent de loxygne singulet (
1
O
2
) partir de
loxygne molculaire comme cela a t vrifi par le test lactate dergostrol. Ce dernier
est utilis comme accepteur doxygne singulet afin de former lendoperoxyde dactate
dergostrol. Lanalyse des produits forms met en vidence, aprs quinze minutes
dirradiation, la prsence de lendoperoxyde et donc la formation doxygne singulet pour
tous les macrocycles tests. Cest cet oxygne singulet qui provoque la dgradation de la
lignine ainsi que les ractions secondaires de photoblanchiment.
88
Il semblerait que les
photosensibilisateurs ne subissent pas tous avec la mme intensit ce phnomne. Ainsi la
H
2
TPPS, la NiPcS et le Rose de Bengale semblent les plus rsistants leur dgradation et sont

122

ceux qui dans le cas des matriaux bruts telles les sciures dgradent le plus la lignine si lon se
rfre au dosage des phnols. Un tel constat est conforme avec lide selon laquelle un
photosensiblisateur qui se dgrade facilement produit moins doxygne singulet et prsentera
en consquence des capacits plus faibles oxyder la lignine.

IV.2.2. Etude qualitative et quantitative des xylanes extraits
Ltude des compositions centsimales et monosaccharidiques des fractions extraites
dans leau aprs dlignification vont nous permettre dapprcier la qualit de la dgradation
photochimique des lignines.
IV. 2. 2. a. Compositi on cent si mal e
Concernant la H
2
TPPS, les rendements dextraction (Tableau 28) en xylanes sont
similaires et de lordre de 4% quels que soient les substrats de la dlignification. Pour les
autres photosensibilisateurs, ils sont globalement au moins trois fois plus levs lorsquelle a
lieu sur de lholocellulose que sur des sciures dpectines.
Tableau 28 : Compositions centsimales des fractions aprs extraction aqueuse
Photosensibilisateur
Substrat ayant subi la
dlignification
photochimique
AU (en %) DP
Rendement
massique
d'extraction en
xylanes (en %)
H
2
TPPS
Holocellulose 39,2 5 3,8
Sciures dpectines 24,6 19 4,2
AlPcS
Holocellulose 24,0 26 6,9
Sciures dpectines 22,0 12 2,1
ZnPcS
Holocellulose 17,1 37 5,2
Sciures dpectines 20,1 10 1,6
NiPcS
Holocellulose 17,6 9 4,3
Sciures dpectines 16,4 12 1,1
Rose de Bengale
Holocellulose 14,4 15 5,3
Sciures dpectines 36,9 10 1,6


Ltape de dlignification mise en place ici ne semble pas suffisante pour les sciures
dpectines et ne permet pas dextraire quantitativement les xylanes paritaux.
Qualitativement, les xylanes extraits sont des oligosaccharides de DP variables, avec une
moyenne de 15 units par xylane.

123


IV. 2. 2. b. Compositi on monosacchari dique
Les rsultats des compositions monosaccharidiques des extraits sont prsents Tableau
29. Les extraits issus dholocelluloses sont trs riches en xylanes avec des teneurs comprises
entre 74 et 81%, valeurs sensiblement identiques celles que lon obtient galement aprs
extraction alcaline de rsidus dlignifis par le chlorite de sodium. Avec de 40 53% de
xylanes, lextraction aqueuse sur des sciures conduit une moins bonne slectivit. Une telle
diffrence de comportement ne peut pas tre explique uniquement par leffet du solvant qui,
est leau dans les deux cas.

Tableau 29 : Compositions monosaccharidiques des extraits aprs extraction aqueuse
Catalyseur
Substrat de la
dlignification
avant extraction
Rha Fuc Ara Xyl Man Glc Gal GalA GlcA
4-O-
Me
GlcA
Xylane
H
2
TPPS
Holocellulose 3,0 0,2 1,5 67,3 4,5 2,3 3,9 5,7 0,7 10,8 78,1
Sciures dpectines 5,5 0,9 12,9 35,6 9,4 6,8 10,0 13,2 1,6 4,0 39,6
AlPcS
Holocellulose 2,4 0,2 1,6 76,0 4,6 1,9 4,0 3,7 0,4 5,3 81,3
Sciures dpectines 3,2 0,3 6,5 48,0 12,4 9,9 7,3 7,0 1,0 4,5 52,5
ZnPcS
Holocellulose 2,3 0,1 1,5 70,0 6,3 3,4 2,9 4,8 0,8 7,8 77,8
Sciures dpectines 2,8 0,4 5,7 49,0 14,4 11,9 5,7 5,4 0,8 4,0 53,0
NiPcS
Holocellulose 2,4 0,0 1,6 65,9 8,8 3,5 3,0 5,8 0,6 8,4 74,3
Sciures dpectines 3,3 0,4 7,9 44,7 17,5 10,4 5,6 6,5 0,7 3,1 47,8
Rose de Bengale
Holocellulose 2,4 0,2 1,7 71,0 5,4 2,4 3,0 3,6 0,6 9,7 80,7
Sciures dpectines 3,0 0,4 6,8 44,5 14,3 7,2 7,1 11,7 0,8 4,3 48,8


Les rsidus aprs dlignification et extraction des xylanes ont galement subi une
analyse chromatographique (Tableau 30).











124

Tableau 30 : Compositions monosaccharidiques des rsidus aprs extraction aqueuse des xylanes

Catalyseur
Substrat de la
dlignification
avant extraction
Rha Fuc Ara Xyl Man Glc Gal GalA GlcA
4-O -
Me
GlcA
Xylane
H
2
TPPS
Holocellulose 2,0 0,4 0,5 72,0 3,6 5,5 2,7 3,0 0,4 9,7 81,7
Sciures dpectines 2,8 0,2 1,3 68,1 2,5 3,2 4,4 7,3 1,4 8,9 77,0
AlPcS
Holocellulose 1,7 0,2 0,5 72,3 3,6 7,5 2,1 2,2 0.,4 9,6 81,9
Sciures dpectines 2,7 0,1 1,7 70,5 3,0 2,8 3,5 6,3 1,0 8,4 78,9
ZnPcS
Holocellulose 2,1 0,2 0,7 70,3 3,3 7,2 2,9 3,1 0,5 9,7 80,0
Sciures dpectines 2,7 0,2 1,6 68,9 2,6 3,4 4,2 6,3 1,0 9,3 78,2
NiPcS
Holocellulose 2,2 0,2 0,6 70,4 2,8 6,8 3,1 3,2 0,5 10,4 80,8
Sciures dpectines 2,5 0,3 1,4 68,8 2,8 2,7 3,1 6,5 1,4 10,7 79,5
Rose de Bengale
Holocellulose 2,5 0,4 0,7 70,2 3,6 5,9 3,1 3,7 0,4 9,5 79,7
Sciures dpectines 2,8 0,3 1,2 68,3 3,4 3,0 3,9 6,2 0,8 10,2 78,5

Avec des teneurs denviron 80% en xylanes, les rsidus obtenus prsentent des
quantits rsiduelles en xylanes importantes ce qui est expliqu par les faibles valeurs de
rendements dextraction enregistres.

IV.2.3. Bilan de la dlignification photochimique
La dlignification photochimique est une mthode de dlignification originale, non
polluante puisquelle se ralise en conditions aqueuses et ne ncessite, en dehors des
photosensibilisateurs, que de la lumire. Nanmoins, les rsultats obtenus tant qualitatifs que
quantitatifs (rendement optimal 6%) sont modestes non seulement par comparaison avec la
mthode alcaline de rfrence mais aussi avec le systme oxydant phtalocyanine ou
porphyrine/H
2
O
2
. Ce constat est dautant plus vrai lorsque les sciures dpectines sont
utilises comme substrat. Cela nous permet de dire que les espces radicalaires comme HO


sont plus oxydantes que loxygne singulet libr au cours de la photooxydation. Dautre part,
tout comme la mthode enzymatique, ce processus ne semble pas particulirement adapt
des matriaux aussi lignifis que les sciures de bois.

IV.3. Bilan gnral
Dans le cadre de ce travail, plusieurs solvants dextraction des xylanes et trois mthodes
de dlignification ont t slectionns et compars aux procds classiquement utiliss.
Sagissant dextraire des hmicelluloses, le traitement alcalin par la potasse reste
incontestablement le plus efficace tant sous langle quantitatif - les rendements dextraction

125

atteignent gnralement plus de 20% de la masse - que qualitatif - cet agent dextraction
prsente une bonne slectivit pour les xylanes qui reprsentent plus de 90% de la
composition molaire des extraits bruts recueillis. Un tel rsultat est associer aux proprits
chimiques des solutions alcalines qui sont en mesure notamment de rompre les liaisons de
type ester, qui stabilisent la relation entre les hmicelluloses et les lignines. Avec des
rendements dextraction denviron 10% massique et une bonne slectivit, le DMSO apparat
lui aussi trs spcifique des xylanes. En revanche, leau ne permet pas dextraire
quantitativement les xylanes trop ancrs lintrieur de la paroi cellulaire. La variabilit du
mode de chauffage - classique ou micro-ondes - tout comme la mise en uvre de
prtraitements par les ultrasons ne conduit aucune amlioration significative.

Il convenait alors de recourir une dlignification pralable des sciures pour parvenir
extraire les xylanes dans leau. Cest la raison pour laquelle nous avons test dautres
mthodes de dlignification que celle - considre comme classique - qui recourt
lutilisation du chlorite de sodium. Si le procd enzymatique qui na produit que des rsultats
modestes sest avr dcevant, la mthode photochimique, originale dans son approche, a
conduit lobtention de quelques rsultats encourageants. Il conviendra dans une dmarche
ultrieure de complter cette approche par des essais doptimisation qui devront intgrer le
suivi de lvolution de la structure des glucuronoxylanes extraits. Pour conclure, la
dlignification thermique par des macrocycles de fer et de manganse en prsence de
peroxyde dhydrogne semble la plus aboutie des mthodes alternatives prospectes dans
cette tude. Intressante sous langle quantitatif et qualitatif - les xylanes sont extraits avec
des rendements de lordre de 12% et une slectivit de 80% molaire - cette stratgie, ainsi
quen tmoigne nos rsultats, conduit nanmoins une volution de la structure des
glucuronoxylanes extraits ce qui soppose aux prrequis gnralement retenus par
lexprimentateur dsireux dextraire quantitativement les molcules dintrt sous leur forme
native. Un tel phnomne, savoir lapparition de fonctions aldhydiques rputes trs
ractives peut conduire la fonctionnalisation des extraits polysaccharidiques et doit pouvoir
permettre aux glycochimistes de dvelopper de nouvelles stratgies de valorisation des
glucides en utilisant leau comme unique solvant.

126



127















Troisime partie : Quelques proprits oncologiques de
xylanes de chtaignier (Castanea sativa)


128



129

Limportance de certaines classes de polysaccharides est actuellement r-value et,
comme nous lavons prcis dans lintroduction bibliographique, de nombreuses applications
sont aujourdhui proposes y compris lchelle industrielle pour les polysaccharides de
la famille des xylanes. Aprs avoir dvelopp plusieurs stratgies dobtention
dhmicelluloses avec dlignification pralable, nous nous proposons de prsenter les
proprits oncologiques de xylanes extraits de chtaignier. A cette fin, nous avons isol deux
fractions hmicellulosiques de sciures de feuillus. Ces proprits sont compares avec celles
dhmiceluloses dargan dont une fraction est dpourvue dacides uroniques. Une telle
stratgie doit nous permettre dapprhender le rle des fonctions carboxyle du point de vue de
lactivit anticancreuse. Ces fonctions sont souvent corrles des proprits biologiques
bien que cette caractristique ne soit pas un dterminant absolu.
232
Une tude prliminaire
consacre aux proprits biologiques de glucuronoxylanes de chtaignier en oncologie
cellulaire et molculaire
206
a t initie au Laboratoire en collaboration avec le Professeur
Kraemer (Laboratoire dOncologie Molculaire et Cellulaire de lUniversit de Paris XIII) ;
ils ont effectivement montr des activits cytotoxiques remarquables vis vis de cellules
cancreuses. Nous nous sommes attachs prciser cette relation structure - activit avec pour
objectif de comprendre le dterminisme molculaire de la variabilit des proprits
biologiques des xylanes sur les cellules cancreuses A431 issues dun piderme vulvaire.

130


131

Chapitre I. Extraction, purification et caractrisation
chimique de xylanes de bois de chtaignier et de
pricarpe dargan
I.1. Extraction alcaline des xylanes de chtaignier et
dargan
I.1.1. Extraction de xylanes de chtaignier
Le protocole exprimental utilis (Figure 74) pour l'extraction squentielle et slective
des polysaccharides paritaux des sciures de bois est celui propos dans notre laboratoire par
Moine
2
et a dj t prsent au paragraphe I.1. Pour le protocole II, un prtraitement la
potasse dilue a t ajout lextraction classique la potasse 4,3 M. Celui-ci, en induisant
le gonflement de la paroi cellulaire, peut favoriser lextractabilit des polysaccharides
prsents dans cette paroi.












132



Figure 74 : Protocole dextraction des xylanes de chtaignier MGX C
1
et MGX C
2


I.1.2. Extraction de xylanes dargan
Pour lextraction des xylanes dargan, le protocole utilis (Figure 75) est adapt de
Habibi et coll.,
42
et les premires tapes (extraction au Soxhlet, extraction des pectines et
dlignification) sont identiques au III.1.1.a.




85% EtOH 80 C pendant 7 h (x 2)
E
1
C R
1
C

1% oxalate dammonium pH 5 85 C pendant 2 h
E
2
C R
2
C

NaClO
2
acide actique 80 C pendant 1h (x 2)
R
3
C E
3
C
Protocole II Protocole I

Extraction KOH 4,3M avec NaBH
4

25 C pendant 24 h

Imprgnation KOH 0,43M 25 C
pendant 1 h
R
4a
C E
4
C R
5
C

Extraction KOH 4,3M avec NaBH
4

25 C pendant 24 h
R
4b
C
MGX C
1

MGX C
2

Sciures (500m) issues de Castanea sativa (R
cb
)

133



Pricarpe issu de Argania spinosa (R
pb
)

Figure 75 : Protocole dextraction des xylanes dargan MGX A et HX

I.2. Caractrisations chimiques
I.2.1. Composition centsimale
Les rendements massiques dextraction ont t dtermins par dosages des oses totaux
en spectroscopie UV-Visible. Les valeurs obtenues pour les deux extraits de chtaignier et
pour les deux extraits dargan ont t regroupes dans le Tableau 31.
85% EtOH 80 C pendant 7 h
E
1
A R
1
A

Extraction H
2
O 100 C pendant 2 h
E
2
A R
2
A

NaClO
2
acide actique 80 C pendant 1 h (x 2)
R
3
A E
3
A

Extraction KOH 4,3M avec NaBH
4
25 C pendant 24 h
R
4
A E
4
A
Centrifugation
HX

Fraction soluble dans leau
Fraction insoluble dans leau
MGX A
EtOH (4V)

134

Les xylanes ont t isols selon les procdures dcrites Figure 74 et Figure 75 avec des
rendements massiques allant de 12% (MGX C
2
) 19% (MGX C
1
et MGX A).

Tableau 31 : Rendements massiques dextraction en xylanes
Xylanes
Rendements d'extraction
(% m/m)
MGX C
1
19,2
MGX C
2
12,3
MGX A 19,2
HX 18,1

I.2.2. Analyse Chromatographique en Phase Gazeuse
Lanalyse de la composition monosaccharidique des extraits bruts de sciures et des
rsidus dextraction a t ralise par chromatographie en phase gazeuse des drivs
mthylglycosides trimthylsilyls. Les rsultats prsents dans le Tableau 32 et le Tableau 33
sont les compositions monosaccharidiques respectivement des extraits et rsidus issus du
chtaignier et du pricarpe dargan. Le suivi de la composition des rsidus ne montre pas
dvolution notable de la quantit en xylose lors des trois premires tapes (extractions des
tannins et sucres circulants, pectines, et enfin lignines). Le rsidu final obtenu aprs extraction
alcaline rvle un trs fort appauvrissement en xylose, preuve quils ont t extraits puisque le
pourcentage passe de plus de 90% moins de 30%.

Tableau 32 : Compositions monosaccharidiques des diffrents extraits et rsidus pour le chtaignier
Composition monosaccharidique molaire (%)
Rha Fuc Ara Xyl Man Glc Gal GalA GlcA
4-O-Me
GlcA
Rc
b
2,7 0,0 1,7 69,0 4,0 4,0 4,2 6,3 0,9 7,2
R
2
C 3,3 0,0 1,8 65,8 3,5 4,3 6,8 8,1 1,2 5,2
R
3
C 2,3 0,0 1,2 66,6 3,6 4,0 3,8 5,3 1,2 12,1
R
4a
C 1,8 0,0 0,7 58,2 8,2 14,4 3,4 1,2 0,8 11,4
R
4b
C 0,9 0,0 0,6 7,6 12,5 71,2 3,6 1,5 1,0 1,2
R
5
C 1,6 0,0 0,8 9,7 11,7 65,8 4,2 4,1 0,7 1,4
MGX C
1
1,8 0,0 0,8 76,3 0,9 1,0 2,0 2,1 0,6 14,6
MGX C
2
1,8 0,0 0,7 81,8 0,7 0,8 0,7 2,3 1,4 9,9

La fraction insoluble issue du pricarpe dargan, (Tableau 33) avec prs de 99%
molaire de xylose prsente la composition typique dun homoxylane (HX). Avec des
pourcentages molaires en xylose et en 4-O-MeGlcA allant de 76 86% et 13 14,6%

135

respectivement, les extraits KOH de pricarpe dargan (MGX A) et de sciures de chtaignier
(MGX C
1
et C
2
) sont caractristiques de polysaccharides de type 4-O-mthylglucuronoxylane.

Tableau 33 : Compositions monosaccharidiques des diffrents extraits et rsidus pour largan

Composition monosaccharidique molaire (%)
Rha Fuc Ara Xyl Man Glc Gal GalA GlcA
4-O-Me
GlcA
R
pb
1,4 0,1 1,1 90,3 0,1 2,8 1,0 1,1 0,2 1,8
R
1
A 1,5 0,0 1,0 94,0 1,0 0,8 0,7 1,0 0,0 0,0
R
3
A 1,3 0,0 0,6 92,0 0,1 1,3 0,8 1,0 0,2 2,8
R
4
A 0,0 0,0 0,0 27,9 0,0 72,1 0,0 0,0 0,0 0,0
HX 0,7 0,0 0,0 98,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,7
MGX A 0,9 0,0 0,0 85,8 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 13,3
On peut galement noter que contrairement aux extraits de chtaignier, la
contamination par les autres monosaccharides (rhamnose, glucose) est quasi inexistante
pour ceux dargan.
I.2.3. Distribution en masse
Une autre caractristique des xylanes est leur taille ainsi que la distribution en masse.
Le degr de polymrisation, obtenu en faisant le rapport entre les quantits de oses totaux et
dextrmits rductrices estimes partir de dosages colorimtriques spcifiques et
correspond au nombre dunits monosaccharidiques qui constituent le polymre. Les DP des
MGX de chtaignier est infrieurs ceux dargan (Figure 76). Les valeurs obtenues pour le
DP, gales au moins 180, sont la caractristique de polymres.


Figure 76 : Degrs de polymrisation des diffrents xylanes extraits
200
182
340
360
0
50
100
150
200
250
300
350
400
MGX
Chtaignier C1
MGX
Chtaignier C2
MGX Argan HX Argan

136


La polydispersit massique des extraits a par la suite t tudi par HPLC sur colonnes
dexclusion strique. Les pics dlution obtenus, relativement troits, indiquent une
composition homogne pour chaque extrait (Figure 77).

Figure 77 : Superposition des profils dlution obtenus par analyse HPLC des MGXs et du HX. V
0
: Volume
mort.


I.2.4. Etude de la distribution des acides uroniques
Ebringerov et al.,
165
ont suggr que la varit structurale des xylanes peut affecter
leurs proprits biologiques. Une telle variabilit structurale peut trouver son origine dans le
degr de polymrisation, la composition monosaccharidique (et spcialement le rapport
xylose/4-O-MeGlcA) mais galement la distribution rgulire ou alatoire des acides
uroniques le long de la chane de xylose. Cette dernire considration reflte la structure
macromolculaire des chanes qui peut affecter les interactions intramolculaires des
molcules de xylanes en solution, en crant notamment des rseaux ou des interactions avec
des biopolymres la surface des cellules des lymphocytes T par exemple.
165
Ceci nous a
donc men tudier la distribution des units MeGlcA dans les MGX C
1
, MGX C
2
et MGX A
par analyses de spectromtrie de masse MALDI aprs leur dgradation par autohydrolyse.
Lautohydrolyse des polysaccharides, c'est--dire leur hydrolyse par leurs propres fonctions
acides, est une mthode douce, slective et facile mettre en uvre. Par simple chauffage
ltuve et sous leffet de lacidit apporte par les fonctions carboxyliques protones aprs
0

5 10 15 20
0

1,5
2
MGX C2 1 mg/mL
MGX A 1 mg/mL
HX 5 mg/mL
Time (min)
4
3
2
1
MGX C1 1 mg/mL
V0
R
I
D

1
0,5

137

passage sur une rsine, le polymre est hydrolys. Les rendements dautohydrolyse dpendent
de la concentration en acides alors que les mcanismes chimiques dpendent de la distribution
de ces acides et leur habilit interagir avec les liaisons glycosidiques. Les fragments ainsi
obtenus sont reprsentatifs de la structure du polymre de dpart. Appliqus aux xylanes
dargan et de chtaignier, lautohydrolyse conduit leur dgradation en des oligosaccharides
forms par de lacide 4-O-mthylglucuronique (GA) et des rsidus xylose (X) dont les masses
molculaires sont observes en spectromtrie de masse MALDI et notes X
n
, X
n
GA, ou
X
n
GA
2
(n = 1 14) (Figure 78). Dans cette figure, les masses sont reprsentes sous formes
de btonnets o la hauteur des diffrentes espces correspond labondance relative de la
masse de chaque ion. Les profils de masses des glucurono-xylooligosaccharides obtenus
partir de MGX C
2
et MGX A sont presque similaires : une distribution gaussienne, centre sur
les DP 5 7 est observe. Deux sries majeures doligosaccharides sont observes dans les
deux cas, correspondant aux formes non-substitue (X
n
) et mono-substitue (X
n
GA). La
prsence de nombreuses masses correspondant une disusbstitution (X
n
GA
2
) rvle une
distribution irrgulire des acides uroniques, dj suggre par Jacob et al
233
. Dans le cas du
xylane de chtaignier MGX C
1
, les oligosaccharides les plus significatifs sont plus petits avec
X
1
, X
2
, X
3
XGA et X
2
GA les espces les plus abondantes. La srie disusbstitue (XGA
2
), peu
prsente, suggre dans ce cas une distribution plus rgulire des acides uroniques le long de la
chane de xylose.






Figure 78 : Distribution des acides uroniques des xylanes de chtaignier et dargan aprs autohydrolyse et
analyses

Nous nous sommes par la suite intress
analyses MALDI des MGX
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
1 2 3 4 5 6 7 8
A
b
o
n
d
a
n
c
e

R
e
l
a
t
i
v
e

%
n
MGX C
0
1
2
3
4
5
6
7
1 2 3 4 5 6 7 8
A
b
o
n
d
a
n
c
e

r
e
l
a
t
i
v
e

%
n
MGX C
0
1
2
3
4
5
6
7
1 2 3 4 5 6 7 8
A
b
o
n
d
a
n
c
e

r
e
l
a
t
i
v
e

%
n
MGX A
138


: Distribution des acides uroniques des xylanes de chtaignier et dargan aprs autohydrolyse et
analyses par spectromtrie de masse MALDI.
Nous nous sommes par la suite intresss la diffrence de structure dduite par les
analyses MALDI des MGX C
1
et

MGX C
2
obtenus aprs autohydrolyse de sciures de
8 9 10 11 12 13 14
n
MGX C
1
9 10 11 12 13 14
MGX C
2
9 10 11 12 13 14
A
.
Xn
XnGA
XnGA2


: Distribution des acides uroniques des xylanes de chtaignier et dargan aprs autohydrolyse et
la diffrence de structure dduite par les
obtenus aprs autohydrolyse de sciures de

139

chtaignier, respectivement non-imprgne et imprgnes. De telles diffrences peuvent tre
expliques par les mthodes dextraction utilises. Comme le suggrent Dahlman et al.,
234
les
molcules de xylanes sont distribues des couches les plus internes aux plus externes des
ptes papier de feuillus et dont les caractristiques structurales (masse molaire, teneur en
acides uroniques) diffrent selon leur localisation mais aussi selon le processus dextraction
utilis (cuisson, blanchiment, dlignification). A partir de nos rsultats, il peut tre suppos
que ltape dimprgnation favorise lextraction dune seconde classe de MGX avec une
distribution irrgulire des units de 4-O-MeGlcA intimement associs la paroi cellulaire
vgtale au travers de liaisons ester avec des composs phnoliques rsiduels.
235


I.2.5. Analyse structurale (RMN)
Les extraits polysaccharidiques ont galement t caractriss par RMN du proton
partir de leur forme native. Les spectres ont t enregistrs dans leau lourde (D
2
O) sauf pour
lhomoxylane dargan insoluble dans leau et dont le spectre a t enregistr dans le DMSO-
d6.
Les spectres RMN
1
H des glucuronoxylanes (MGX C
1
, C
2
et A) (Tableau 34) font
apparatre des signaux intenses correspondant aux protons des units xylose de la chane
principale non substitus, ainsi que des signaux moins intenses attribus aux units dacide
uronique et aux units xylose qui les portent en position 2. Lintensit de ces signaux dpend
du taux de substitution par lacide uronique. Les doublets attribus aux protons anomriques
des units xylose, substitues (4,5 ppm) ou non (4,6 ppm), sont associs une constante de
couplage denviron 7 Hz, caractristique dune liaison osidique de type . La constante de
couplage du doublet correspondant aux protons anomriques de lacide uronique, 5,3 ppm,
est quant elle de lordre de 2 Hz, ce qui caractrise une liaison osidique de type . Il est par
ailleurs possible dobserver sur les diffrents spectres
1
H des xylanes, un singulet fin vers 3,5
ppm, qui est associer lexistence de groupements mthyle ports, compte-tenu de
lintgration, par lacide uronique. Cette dernire remarque confirme la prsence de lacide 4-
O-mthylglucuronique. Celui-ci est fix en position 2 du xylose, ce qui se traduit par un
dblindage plus important du H
2
par rapport aux units xylose non substitues.





140


Tableau 34 : Dplacements chimiques (ppm) en RMN
1
H pour les glucuronoxylanes de chtaignier et dargan


(14)--D-Xylp (14)--D-Xylp-2-O-(4-O-Me-GlcpA) 4-O-Me--D-GlcpA

position
1
H
1
H
1
H

(ppm) (J Hz) (ppm) (J Hz) (ppm) (J Hz)
MGX C
1
1
4,48 d (7,5) 4,63 d (7,2) 5,29 d (2,0)
2 3,29 t (8,2) 3,44 m 3,60 m
3 3,55 t (9,0) 3,62 m 3,76 m
4 3,79 m 3,81 m 3,22 t (9,7)
5ax 4,10 dd (4,5 ; 11,5) 4,15 m
4,33 d (10,1)
5eq 3,38 t (11,0) 3,42 m
6 - - -
O-CH3
- - 3,46 s
MGX C
2
1
4,51 d (7,5) 4,66 d (7,0) 5,31 d (2,5)
2
3,32 t (8,4) 3,57 m 3,61 m
3 3,59 t (9,0) 3,68 m 3,77 m
4
3,79 m 3,82 m 3,26 t (9,7)
5ax 4,14 dd (4,4 ; 11,5) 4,15 m
4,36 d (10,0)
5eq
3,41 t (11,0) 3,46 m
6 - - -
O-CH3
- - 3,50 s
MGX A 1
4,51 d (7,1) 4,66 d (6,4) 5,32 d (1,6)
2 3,31 t (8,1) 3,57 m 3,61 m
3 3,61 t (8,9) 3,67 m 3,77 m
4 3,80 m 3,82 m 3,26 t (9,6)
5ax 4,14 dd (4,6 ; 11,0) 4,15 m
4,36 d (9,9)
5eq 3,41 t (11,0) 3,47 m
6 - - -
O-CH3
- - 3,50 s
a
Ax = axial, eq = equatorial,
3
JH,H en Hz
Pour les glucuronoxylanes, dont un spectre RMN type est reprsent Figure 79, la RMN
confirme les teneurs en MeGlcA donnes par la CPG (Tableau 36). Le ratio xyl/MeGlcA est
calcul en faisant le rapport entre lintgration des pics correspondant aux protons
anomriques du xylose non substitu et substitu par du MeGlcA (en vert sur la figure) et
lintgration du pic correspondant au proton anomrique du MeGlcA (en rouge sur la figure).

141


Figure 79 : Spectre RMN
1
H dun 4-O-mthylglucuronoxylane dans le D
2
O avec attribution des signaux

Le spectre RMN du proton de lextrait HX prsente 6 signaux des 4,28 (H-1), 3,05 (H-
2), 3,30 (H-3), 3,50 (H-4), 3,17 (H-5 q) et 3,88 (H-5 ax) (Tableau 35) correspondant aux
rsidus 14 -D-Xyl et est conforme aux donnes publies par Habibi et Vignon
42
pour la
structure dun homoxylane.
Tableau 35 : Dplacements chimiques (ppm) en RMN
1
H pour lhomoxylane dargan



(14)--D-Xylp

position
1
H

(ppm)
1
4,27
2
3,05
3 3,30
4 3,50
5ax
3,88
5eq
3,17
a
Ax = axial, eq = equatorial,
3
JH,H en Hz.


142

I.2.6. Conclusion sur les caractrisations chimiques
Les caractristiques chimiques et structurales tablies pour les xylanes sont rsumes
dans le tableau ci-dessous :
Tableau 36 : Caractristiques chimiques des diffrents xylanes extraits
Ratio Xyl/MeGlcA (
1
H NMR) Distribution des acides DP
Glucuronoxylane de chtaignier extrait
avec imprgnation (MGX C
1
)
5,9/1 Rgulire 200
Glucuronoxylane de chtaignier extrait
sans imprgnation (MGX C
2
)
6,1/1 Alatoire 182
Glucuronoxylane d'argan (MGX A) 4,8/1 Alatoire 340
Homoxylane d'argan (HX) / / 360


























143

Chapitre II. Evaluation des proprits biologiques des
extraits en oncologie cellulaire et molculaire
Une valuation biologique de ces xylanes extraits vis--vis de cellules cancreuses
t ralise au Laboratoire dOncologie Cellulaire et Molculaire de lUniversit Paris XII
sous la direction du Professeur Michel Kraemer.
La ligne tumorale A431 dun carcinome pidermode vulvaire humain se caractrise
par un grand nombre de rcepteurs lEGF (Epidermal Growth Factor). Ce facteur de
croissance pidermique est une hormone protique qui lors de sa fixation sur ses rcepteurs
provoque une activit mitotique, c'est--dire, une division cellulaire trs rapide au sein des
tissus pithliaux vulvaires. Par ailleurs, les cellules de cette ligne scrtent une quantit
importante de VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor = Facteur de Croissance de
lEndothlium Vasculaire), protine qui est mise par la tumeur primitive pour assurer sa
vascularisation partir de vaisseaux sanguins dj existants. Ce phnomne de vascularisation
appel angiogense permet certaines cellules cancreuses de la tumeur primitive de migrer
via le flux sanguin vers dautres organes. Ces cellules cancreuses vont alors envahir un
nouvel organe et former une nouvelle tumeur appele mtastase. La ligne tumorale A431
reprsente donc un bon modle pour valuer leffet biologique de molcules de synthse, ou,
comme cest le cas dans ce travail, de substances naturelles.
Nous avons test leffet de ces xylanes sur la prolifration, la migration et linvasion
des cellules tumorales. La dgradation de la matrice extracellulaire par des protases ayant un
rle essentiel dans linvasion et la dissmination dune tumeur, nous avons galement tudi
les effets des xylanes sur lexpression des mtalloprotases.

II.1. Effets sur la prolifration des cellules A431
Ltude des effets des xylanes sur la multiplication des cellules tumorales A431 a t
ralise en traitant ces cellules pendant 72 heures avec des doses croissantes de produit. Des
concentrations comprises entre 0,7 M 50 M ont t utilises afin de dterminer la
concentration induisant 50 % dinhibition (IC
50
). Lhomoxylane dargan ne prsente quune
faible activit cytotoxique (19%) et uniquement pour des concentrations leves. Le
glucuronoxylane dargan MGX A ne prsente aucun effet dose et ninhibe que faiblement la
prolifration cellulaire (29%). Le xylane de chtaignier extrait avec prtraitement (MGX C
2
)
inhibe la prolifration des cellules A431 de faon dose dpendante avec une inhibition de la


prolifration cellulaire de 45% pour une concentration de
chtaignier non imprgn (MGX
Figure 80 : Corrlation de

Compte tenu des rsultats prliminaires, nous avons choisi de poursuivre
biologiques avec les xylanes MGX C
linvasion des cellules tumorales A431.

II.2. Effets sur la migration des cellules A 431
Ltude de la migration des cellules tumorales A431 seffectue dans des chamb
culture appeles chambres de Boyden. Celles
membrane poreuse et sont placs dans une plaque de 24 puits (
exprimentale). Pour la migration, la membrane poreuse est recouverte de fibronectine et les
cellules A431 sont dposes sur cette membrane puis incubes pendant 24 heures. La
prsence dune substance stimulante comme le Srum
infrieure de la chambre de Boyden conduit les cellules A431 migrer traver
la surface infrieure de la membrane. On ajoute alors
dans leau. Aprs 24 heures, les
dnombres au microscope.
En absence de xylane, la migration est totale (100 % de migration). Par contre elle
diminue significativement de 68 % et de 99 % en prsence respectivement de 5 M et
M de MGX C
1
(Figure 81).
prsence de 50 M et de 55 % en prsence de 100 M de polysa

0
10
20
30
40
50
60
MGX C1 MGX C2
Inhibition de la prolifration des cellules A 431
144
prolifration cellulaire de 45% pour une concentration de 50 M (45%).
(MGX C
1
) atteint lIC
50
pour une concentration de 50
de la cytotoxicit des xylanes sur la prolifration des cellules A 431
Compte tenu des rsultats prliminaires, nous avons choisi de poursuivre
biologiques avec les xylanes MGX C
1
et C
2
en tudiant leur effet sur la migration et
linvasion des cellules tumorales A431.
Effets sur la migration des cellules A 431
Ltude de la migration des cellules tumorales A431 seffectue dans des chamb
culture appeles chambres de Boyden. Celles-ci sont composes dinserts constitus dune
membrane poreuse et sont placs dans une plaque de 24 puits (Figure
xprimentale). Pour la migration, la membrane poreuse est recouverte de fibronectine et les
cellules A431 sont dposes sur cette membrane puis incubes pendant 24 heures. La
prsence dune substance stimulante comme le Srum de veau ftal (SVF) dans la partie
rieure de la chambre de Boyden conduit les cellules A431 migrer traver
rieure de la membrane. On ajoute alors le xylane une certaine concentration
eures, les cellules ayant migr travers la membrane sont colores puis
En absence de xylane, la migration est totale (100 % de migration). Par contre elle
diminue significativement de 68 % et de 99 % en prsence respectivement de 5 M et
Dans le cas du MGX C
2
, la migration est rduite de 50 % en
prsence de 50 M et de 55 % en prsence de 100 M de polysaccharide.
MGX C2 MGX A HX
Inhibition de la prolifration des cellules A 431
0,7 M
50 M
. Seul le xylane de
pour une concentration de 50 M.

cytotoxicit des xylanes sur la prolifration des cellules A 431
Compte tenu des rsultats prliminaires, nous avons choisi de poursuivre les tests
en tudiant leur effet sur la migration et
Ltude de la migration des cellules tumorales A431 seffectue dans des chambres de
ci sont composes dinserts constitus dune
Figure 84 de la partie
xprimentale). Pour la migration, la membrane poreuse est recouverte de fibronectine et les
cellules A431 sont dposes sur cette membrane puis incubes pendant 24 heures. La
ftal (SVF) dans la partie
rieure de la chambre de Boyden conduit les cellules A431 migrer travers les pores vers
une certaine concentration
travers la membrane sont colores puis
En absence de xylane, la migration est totale (100 % de migration). Par contre elle
diminue significativement de 68 % et de 99 % en prsence respectivement de 5 M et de 50
, la migration est rduite de 50 % en
0,7 M
50 M

145


Figure 81 : Effets du MGX C
1
sur la migration des cellules A 431. Agrandissement: x 200.

II.3. Effets sur linvasion des cellules A 431
Aprs les tests de migration, nous avons procd des tests dinvasion. Dans ce cas, la
membrane est recouverte de matrigel, qui mime la matrice extracellulaire. La prsence de
srum de veau ftal dans la partie infrieure de la chambre de Boyden conduit les cellules
tumorales A431 digrer le matrigel et traverser la membrane poreuse vers la surface
infrieure de celle-ci. Ce test permet de dterminer si les xylanes inhibent les cellules
tumorales A431 les empchant ainsi de digrer la matrice. En absence de xylane, linvasion
est de 100 %, les cellules cancreuses ont digr le matrigel et travers la membrane poreuse.
En prsence de MGX C
1
, les capacits dinvasion des cellules tumorales A431 ne sont pas
affectes par des concentrations en MGX C
1
de 5 M et abaisses de 55% pour des
concentrations de 50 M (Figure 82). De meilleurs rsultats sont obtenus dans le cas de MGX
C
2
. Linvasion diminue de 72 % en prsence de 5 et de 50 M de polysaccharide.


Figure 82 : Effets du MGX C
1
sur linvasion des cellules A 431. Agrandissement: x 200.

Control
MGX C
1
50 M MGX C
1
5 M
Control MGX C
1
50M MGX C
1
5M

146

II.4. Effets sur lexpression des mtalloprotases
La migration des cellules a lieu durant langiognse et exige une dgradation de la
matrice cellulaire par les protases telles que la matrice mtalloprotase (MMP). Une tude
permettant de dterminer quelle mtalloprotase dgrade la matrice a consist raliser une
zymographie sur les deux composs les plus intressants. Nous avons utilis comme tmoins
la promtalloprotase 9, la mtalloprotase 9 et la promtalloprotase 2.
Dans le cas du MGX C
1
, lanalyse quantitative indique quen prsence de 12,5 M de
polysaccharide, la concentration des ProMMP9, MMP9 et ProMMP2 scrtes nest pas
significative aprs 24 ou 48 heures de traitement. Aprs 72 heures, lexpression des MMP9
est totalement abolie, tandis que lexpression des ProMMP9 et des ProMMP2 diminue de 50
et 56%, respectivement (Figure 83).
Dans le cas du MGX C
2
, on observe quaprs 72 heures de traitement avec 12,5 M de
polysaccharide, lexpression des MMP9 et ProMMP2 diminue respectivement de 10 % et
39%. Lexpression des ProMMP2 nest pas affecte mme aprs 72 heures.


Figure 83 : Effets du MGX C
1
sur la scrtion par les cellules A 431 des ProMMP9, MMP9 et ProMMP2. Les
milieux de culture non traits (lignes 1, 3, et 5) ou les cultures cellulaires traites avec 12.5 M MGX C
1
(lignes
2, 4, et 6) sont collects aprs 24 h, 48 h et 72 h dincubation. Ligne (1), cellules non traites pendant 24h; Ligne
(2), cellules traites pendant 24 h; Ligne (3), cellules non traites pendant 48 h; Ligne (4), cellules traites
pendant 48 h; Ligne (5), cellules non traites pendant 72 h; Ligne (6), cellules traites pendant 72 h.












147

Lensemble des donnes concernant les proprits biologiques est regroup dans le
tableau suivant :

Tableau 37 : Effets des xylanes de chtaignier et dargan sur la proliferation, la migration et linvasion des
cellules A431 et sur lexpression des MMP9, ProMMP2 et des ProMMP9
Xylane
Inhibition de la
prolifration (%)
Inhibition de la
migration (%)
Inhibition de linvasion
(%)
Zymographie 12,5 M
0.7 M 50 M 5 M 50 M 5 M 50 M
Inhibition
des MMP9
(%)
Inhibition
des
ProMMP2
(%)
Inhibition
des
ProMMP9
(%)
MGX C
1
351 512 682 992 0 552 100 56 50
MGX C
2
182 453 504 552 726 726 10 39 0
MGX A 291 291 nd
a
nd nd nd nd nd nd
HX 0 192 nd nd nd nd nd nd nd
a
nd: non dtermin.
II.5. Corrlation entre les effets biologiques et la structure
des molcules
Lactivit biologique des polysaccharides est souvent corrle avec leur acidit, mme
si cette caractristique nest pas absolument dterminante. Dun autre cot, une structure plus
complexe (liaisons glycosidiques principales, degr de branchement et de ramification, DP)
semble avoir une influence positive sur leurs capacits dclencher leur activit biologique.
La comparaison des rponses biologiques obtenues pour le HX neutre et les MGX acides
rvlent une relation intressante entre le DP, le rapport Xyl/MeGA, la distribution des
MeGA le long du squelette de xylose et les proprits cytotoxiques envers les cellules A431.
Le HX de pricarpe dargan caractris par un DP fort et labsence de substituants MeGA, est
dpourvu dactivit cytotoxique envers les cellules A431. Cest aussi le cas pour sa forme
acide (MGX A). Ainsi, la prsence de MeGA ne peut tre considr comme un facteur
dterminant. Le cas des MGX C
1
et MGX C
2
extraits de sciures de chtaignier est trs
intressant. Avec de DP et des ratios Xyl/MeGA similaires, ces extraits ne prsentent pas le
mme niveau dactivit cytotoxique. LIC
50
nest obtenu que dans le cas du MGX C
1
non
imprgn de sciures de chtaignier. Ce dernier est le seul prsenter une distribution rgulire
de ses acides uroniques le long de la chane de xylose de la molcule. Les compositions
monosaccharidiques obtenues pour le MGX A de pricarpe dargan et le MGX C
2
imprgn
de sciures de chtaignier ainsi que leur distribution des MeGA sur le squelette de xylose de la
molcule sont presque similaires. Nanmoins, le MGX A, alors quil montre une activit
cytotoxique envers les cellules A 431 plus faible, est aussi caractris par une valeur de DP

148

plus leve. Dans ce cas, les valeurs de DP fortes semblent avoir une influence ngative sur
leur activit biologique.
A partir des donnes obtenues dans cette tude, il est possible daffirmer que la
distribution des acides uroniques mais aussi le degr de polymrisation sont des facteurs
structuraux cls pour lactivit biologique des xylanes sur les cellules A431. Le degr de
polymrisation peut influencer la structure tridimensionnelle des xylanes et plus
particulirement leur organisation hlicodale. Il est maintenant accept que non seulement la
structure primaire mais aussi la structure tridimensionnelle de la molcule entrent en jeu dans
lexpression des proprits biologiques. Afin de comprendre cette relation structure-fonction,
nous avons initi une tude sur la structure tridimensionnelle, dans laquelle les xylanes
apparaissent comme des macromolcules trs organises, et ce de faon hlicodale.
13
Ltude
des effets de DP levs ainsi que la variabilit du taux de substitution en MeGA sur la
conformation hlicodale des xylanes constituent les prochaines tapes qui nous permettrons
de mieux comprendre les proprits biologiques des glucuronoxylanes de bois de chtaignier.



149




















CONCLUSION GENERALE

150
























151

La fraction polysaccharidique non cellulosique des sciures de bois, co-produit abondant de
la filire forestire, peut-elle tre mobilise et dans quelle(s) condition(s) ? La question porte
la fois sur l'organisation structurale des parois secondaires des cellules vgtales et sur les
mthodologies physique, chimique et biologique - compatibles avec la notion de Chimie verte
- qui peuvent tre mises en uvre afin d'en extraire slectivement les constituants natifs. Dans
notre cas, il s'agissait de dvelopper de nouvelles approches d'extraction du 4-O-
mthylglucuronoxylane (MGX). Cette hmicellulose est typique de la famille des xylanes et
trs rpandue dans les bois durs issus de feuillus tel le chtaignier utilis ici comme modle.
L'organisation tridimensionnelle de la paroi cellulaire vgtale repose sur des interactions
molculaires multiples tant par le nombre que par la nature des liaisons chimiques. Le taux de
lignification lev des parois secondaires - quantitativement majoritaire dans le bois -
s'oppose par ailleurs l'extractabilit des hmicelluloses dans l'eau et impose donc la mise en
uvre d'une dlignification pralable des sciures.
Dans une premire partie, plusieurs stratgies de dlignification ont t dveloppes,
adaptes et testes sur les sciures de chtaignier. Parmi les mthodologies existantes,
l'approche enzymatique qui recourt l'utilisation des laccases, si elle apparat comme
conceptuellement trs attrayante, s'est avre techniquement dcevante. Utilises dans l'eau,
des concentrations trs faibles, les enzymes sont pourtant capables de catalyser un grand
nombre de ractions chimiques. Toutefois, s'agissant d'une raction en phase htrogne, une
telle stratgie se heurte la complexit des sciures qui est le substrat lignocellulosique de la
raction. En revanche, la dlignification chimique dveloppe partir des phtalocyanines ou
les porphyrines de fer en milieu peroxyd est particulirement attractive. Similaire
l'approche enzymatique du point de vue de la chimie ractionnelle, cette approche n'en
supporte pas les mmes limites. Nos rsultats dmontrent qu'elle est parfaitement adapte
des substrats lignocellulosiques bruts telles que les sciures de bois.
Sur le plan des perspectives, et en utilisant l'approche du plan d'exprience, cette
mthodologie doit pouvoir bnficier d'essais d'optimisation qui feront varier la nature des
catalyseurs tout comme les quantits d'eau oxygne introduites dans le milieu ractionnel.
Dans un autre registre d'ide, l'apparition de fonctions aldhydiques rputes trs ractives au
cours de raction de dlignification conduit la fonctionnalisation des glucuronoxylanes
recueillis par la suite dans l'eau. Un tel rsultat doit pouvoir profiter au dveloppement de
nouvelles stratgies de valorisation chimique des polysaccharides - en phase homogne ou
htrogne - en utilisant l'eau comme unique solvant de la raction.

152

La deuxime partie de ce travail est consacre aux proprits biologiques des
glucuronoxylanes de chtaignier et plus prcisment leurs proprits cytotoxiques envers la
ligne de carcinome pidermode vulvaire humain (cellule A431). Nous avons ainsi
caractris les liens troits qui existent entre la structure chimique des xylanes et leurs
proprits biologiques. Si l'acidit de la molcule apparat comme un prrequis indispensable
l'expression de ces proprits, nos rsultats rvlent que la distribution de l'acide 4-O-
mthylglucuronique le long de la chane principale tout comme le degr de polymrisation de
la molcule apparaissent comme des dterminants supplmentaires. Dpendantes de la
structure de la molcule, les proprits sont par ailleurs et probablement intimement lies sa
conformation et donc sa capacit interagir avec les systmes biologiques. Un tel constat
oriente les perspectives de poursuite de cette tude vers l'tablissement de l'architecture
tridimensionnelle du 4-O-mthylglucuronoxylane de chtaignier par des approches de
modlisation molculaire. Des donnes sont dj disponibles mais doivent tre compltes
tout d'abord par l'tude de l'impact de la distribution de l'acide 4-O-mthylglucuronique sur
l'organisation tridimensionnelle du glucuronoxylane puis en direction de l'identification du
plus petit motif glucidique actif.
Pour conclure, l'tude prsente dans ce mmoire, en constituant une illustration aboutie,
affirme la complmentarit qui existe entre la structure des phytopolysaccharides et
l'expression de leurs proprits sur un systme biologique dtermin. Situ l'interface des
disciplines chimiques et biologiques propres aux activits du Laboratoire de Chimie des
Substances Naturelles, ce travail s'inscrit par ailleurs dans une dmarche de valorisation non
alimentaire des co-produits agricole et forestier. Il peut constituer la base de travaux ultrieurs
acadmiques et/ou finaliss consacrs aux stratgies co-compatibles de dlignification de la
matire lignocellulosique.

153





















Quatrime partie : Partie Exprimentale




















154




155


Chapitre I.
I.1. Ractifs et solvants

Lorigine des ractifs et des solvants utiliss est prsente dans le tableau suivant et il
convient de prciser quils sont utiliss sans purification supplmentaire :
Ractifs CAS [Reg. Num.] Puret Fournisseur
Actate de manganse [638-38-0] 98% VWR
Actate de sodium [127-09-3] 99% Acros
Acide actique [64-19-7] 99-100 % Acros
Acide chlorhydrique [7647-01-1] 37% Fisher Labosi
Acide formique [64-18-6] 99-100% VWR
Acide gallique [5995-86-8] 98% Aldrich
Acide glucuronique [6556-12-3] 97+% Fluka
Acide 4-sulfophtalique [89-08-7] 50% Acros
Acide sulfurique [7664-93-9] 95-98 % VWR
Ammoniaque [1336-21-6] 28% VWR
Anhydride actique [108-24-7] 99% Aldrich
BSTFA [25561-30-2] 98% Alltech
Butanol [71-36-3] 99,5% Acros
Chlorite de sodium [7758-19-2] 80% Acros
Chloroforme [67-66-3] 99,95% SDS
Chlorure dactyle [75-36-5] 98% Acros
Chlorure d'aluminium [7446-70-0] 99% VWR
Chlorure d'ammonium [12125-02-9] p.a Acros
Chlorure de fer [13478-10-9] 98% Alfa Aesar
Chlorure de nickel [7791-20-0] 98% Sigma
Chlorure de zinc [7646-85-7] 98% Acros
D
2
O [7789-20-8] 100% SDS
Dioxanne [123-91-1] 100% SDS
DMSO [67-68-5] 99,8% Acros
Ethanol [64-17-5] 99,99% Carlos Erba
Ethylne diamine [107-15-3] 99% Acros
Heptane [142-82-5] 99% Sigma
Hydrognophosphate de
potassium
[7778-77-0] 99% Sigma
Hydrognophosphate de sodium [10039-32-4] 98% VWR
HOBt [2592-95-2] 95% Aldrich
Hydroxyde de potassium [1310-58-3] p.a Acros
Hydroxyde de sodium [1310-73-2] p.a Acros
Iodure de potassium [7681-11-0] 99% Acros
Laccase [80498-15-3] 1,1U/mg Fluka
MeOH [67-56-1] 99,8% Acros


156

Mso-innositol [87-89-8] 98% Acros
MHDP [580-51-8] 90% Aldrich
Molybdate d'ammonium [12054-85-2] p.a Sigma
NaBH
4
[16940-66-2] 98% Acros
NaOH [1310-73-2] p.a. Acros
NH
4
PF
6
[16941-11-0] 99,5% Alfa Aesar
Oxalate d'ammonium [6009-70-7] 98% VWR
PABAH [5351-23-5] 97% Fluka
Proxyde d'hydrogne [7722-84-1] 35% Acros
Phnol [108-95-2] 99% Acros
Pyridine [110-86-1] 99,8% Aldrich
Rose de Bangale [632-69-9] 90,0% Sigma
Sulfate de fer [7782-63-0] p.a Acros
Sulfate de manganse [10034-96-5] p.a VWR
Ttraborate de sodium [1303-96-4] 99% Sigma
THF [109-99-9] 99,5% Carlos Erba
Ure [57-13-6] 99% Acros
Xylose [58-86-6] 99% Sigma

Chapitre II.
II.1. Analyse chimique
II.1.1. Analyses spectroscopiques
II. 1. 1. a. Infrarouge
Les spectres infrarouge ont t raliss l'aide d'un spectromtre Perkin Elmer
Spectrum 1310 transforme de Fourier, pilot par ordinateur pour une gamme de frquences
comprises entre 400 et 4 000 cm
-1
. Les chantillons sont dposs sur pastilles de KBr. Les
nombres d'ondes sont exprims en cm
-1
.

II. 1. 1. b. RMN
Les spectres de RMN ont t raliss au service commun de RMN de luniversit de
Limoges sur un appareil Bruker DPX-400 une frquence de 400,13 MHz pour le proton et
de 100,62 MHz pour le carbone 13. Les dplacements chimiques sont exprims en ppm ; le
tetramthylsilane tant pris comme rfrence interne ( = 0 ppm). Les constantes de
couplages J sont exprimes en Hz. Les abrviations retenues sont : s (singulet), sl. (singulet
largi), d (doublet), dd (double doublet), t (triplet), dt (double triplet), tap (triplet apparent),
dtap (double triplet apparent), ddd (double double doublet), m (multiplet).




157

II. 1. 1. c. Ultravi olet-Visible
Les densits optiques des dosages colorimtriques sont mesures sur un
spectrophotomtre UV-visible double faisceau Shimadzu UV-1700 series. Elles sont
effectues dans des cellules en polystyrne (PS) de 1 cm de trajet optique. Les spectres des
phtalocyanines et des porphyrines synthtises ont t raliss sur un spectrophotomtre UV-
visible Perkin Elmer Lamba 25 dans des cellules de quartz de 1 cm de trajet optique une
concentration voisine de 10
-5
-10
-6
M dans leau. Les longueurs donde correspondantes aux
absorbances maximales sont exprimes en nm et les coefficients dabsorption molaire , en
mol
-1
.L.cm
-1
.

II. 1. 1. d. Spectromtrie de masse MALDI-TOF
Les spectres de masse MALDI-TOF des oligosaccharides ont t raliss la
plateforme de spectromtrie de masse de lINRA de Nantes (UR 1268 BIA). Les chantillons
hydrolyss ont t dissous dans leau une concentration de 0,1 mg.L
-1
. Les mesures ont t
ralises sur un spectromtre MALDI-LR (Waters, Manchester, UK) dont le laser met dans
lUV 337 nm (frquence 5 HZ) pour dessorber et ioniser un mlange de matrice/chantillon
co-cristallis sur une surface mtallique. La matrice utilise est lacide 2,5-
dihydroxybenzoique (DHB), dissoute 5 mg.mL
-1
dans 0,1% de TFA.
Les spectres de masse MALDI-TOF des porphyrines et des phtalocyanines ont t effectus
au Laboratoire de Chimie Structurale Organique et Biologique de lUniversit de Paris VI par
le Dr. Sandra Alves par dsorption laser avec un spectromtre temps de vol Voyager Elite.

II.1.2. Chromatographie

II. 1. 2. a. Chromatographi e sur couche mince
Des plaques de silice Kieselgel 60F
254
de 0,2 mm d'paisseur (Merck) ont t
employes pour la chromatographie sur couche mince en phase normale. Dans le cas des
oligosaccharides, une double migration est ralise dans le systme de solvants ternaire
(butanol, acide actique, eau ; 2/1/1). Aprs vaporation de l'luant, les plaques sont
pulvrises par une solution dorcinol sulfurique (0,1 % dorcinol dans de lacide sulfurique
20 %). Elles sont enfin places 10 minutes l'tuve 100C pour tre rvles.


158

II. 1. 2. b. Chromatographi e en phase gazeuse
Un systme Perichrom PR-2100 a t utilis pour l'analyse des mthylglycosides
trimthylsilyls. Il est quip dune colonne capillaire CP-SIL-5CB (Chrompack ; L = 50 m,

int
= 0,32 mm ; phase : dimthylpolysiloxane) et dun dtecteur ionisation de flamme
(FID). Le gaz vecteur est lazote sous pression de 75 kPa. La temprature de linjecteur et du
dtecteur est fixe 260C. Le chromatographe est pilot par ordinateur et les
chromatogrammes traits par le logiciel Winilab v.3 de Perichrom.

II. 1. 2. c. Chromatographi e basse pression sur Bi ogel P
2

Les sparations par chromatographie dexclusion strique sur colonne en basse
pression, ont t ralises sur colonnes de Biogel P
2
. Les colonnes sont quilibres dans le
systme dlution. Llution se fait grce une pompe pristatique dont le dbit est fix 10
mL.h
-1
et les diffrentes fractions sont recueillies laide dun collecteur (Redifrac ;
Pharmacia-Biotech.).

II. 1. 2. d. Chromatographi e li quide haut e pression (HPLC)
Les profils HPLC des masses molculaires sont obtenus laide dun systme HPLC
(Dionex P-680), quip de deux colonnes dexclusion strique PL-aquagel-OH mixed 8 m
(Polymers Laboratories-300*7,5mm). Lquilibrage se fait dans leau ultrapure (Millipore)
un dbit de 1 mL.min
-1
. Ce systme est complt par un dtecteur indice de rfraction
Shodex (RI-101).
Chapitre III.
III.1. Extraction des xylanes
A. Xylanes de sciures de chtaignier
III.1.1. Prparation de lholocellulose
III. 1. 1. a. Mat ri el biol ogique
Les sciures utilises pour nos exprimentations sont des sciures de chtaignier,
arbre appartenant la catgorie des bois durs. Elles nous ont t fournies par ltablissement
Mazires de la Chapelle Montbrandeix (87). Ces sciures ont t sches ltuve ventile
durant trois jours la temprature de 50C. Elles ont par la suite t broyes puis tamises (
200 et 500 m) afin de faciliter lextractabilit des hmicelluloses quelles renferment.



159


III. 1. 1. b. Ext raction lthanol
Cette premire tape permet dliminer les sucres circulants et les tannins solubles.
Lextraction a t ralise partir de 45 g de sciures de chtaignier pralablement tamises
500 m dans 900 mL dthanol 80% 80C pendant 7 h. Le rsidu obtenu (R
Sox)
est alors
refroidi temprature ambiante avant dtre mis scher une nuit ltuve ventile 40C.

III. 1. 1. c. Ext raction des pecti nes
R
Sox
est dpectinis dans 1,6 L doxalate dammonium 1% 80C pendant 2 h. La
solution est refroidie temprature ambiante avant dtre filtre sur verre fritt de porosit 3.
Le rsidu R
D D p p
est, quant lui, rinc leau distille.

III. 1. 1. d. Dl ignif ication chi mique par l e chl orit e de sodi um
De faon extraire les hmicelluloses plus facilement, la dlignification de R
Dp
est
essentielle. Elle est ralise partir de R
D D p p
plac dans 1,6 L dune solution acide de chlorite
de sodium (0,47 g/g de sciures brutes + 0,2 mL lacide actique glacial par g de sciures
brutes). La solution est porte 80C pendant 1h, refroidie temprature ambiante et filtre
sur verre fritt de porosit 3. Le rsidu est rinc leau distille jusqu neutralisation du
filtrat. Pour une meilleure dlignification et donc une plus grande puret de lholocellulose
(R
Holo
), le protocole est renouvel.

III. 1. 1. e. Dl ignif ication enzymatique par l e systme
laccase/ HOBt/ O
2

Cette tape est ralise sur 2 g de sciures ou dholocellulose et places dans 100 mL
dune solution tampon dactate de sodium 50 mM ajuste pH 5,5 (par de lacide actique
glacial dilu), en prsence de la laccase et du mdiateur HOBt 2 % (40 mg). La raction se
droule sous atmosphre de dioxygne sous agitation magntique, et des temps (1 4 h) et
des tempratures (25C 45C) variables. A la fin de la raction, lenzyme est inactive par
chauffage 100C pendant quelques dizaines de secondes et la solution est filtre.


160

III. 1. 1. f. Dl ignif ication par des phtalocyanines et des porphyri nes
sulfones et mtalles par l e f er ou le manganse
Dans 25 mL deau distille sont placs 250 mg de sciures dpectines ou
dholocellulose auxquels on ajoute la phtalocyanine ou la porphyrine (dont la quantit varie
entre 4,8 mol et 10,6 mol) ainsi que 1 mL dH
2
O
2
35% par tranche de 24 h de raction.
La raction est place sous agitation magntique pendant des temps variables (de 1 100 h) et
des tempratures variables (20 et 40C). A la fin de la raction, la solution est filtre ; le
rsidu est ensuite rinc leau distill puis lyophilis.

III. 1. 1. g. Dl ignif ication phot ochimi que en mili eu oxygn
Dans 25 mL deau distille sont placs 250 mg de sciures dpectines ou
dholocellulose auxquels on ajoute 14 mg de photosensibilisateur (qui peuvent tre la TPPS,
le Rose de Bengale ou des phtalocyanines sulfones de zinc, aluminium ou nickel). La
raction est place sous agitation magntique et sous irradiation lumineuse de deux ampoules
de 100 watts pendant 8 jours temprature ambiante. A la fin de la raction, la solution est
filtre, le rsidu est ensuite rinc leau distill puis lyophilis.

III.1.2. Extraction des xylanes
III. 1. 2. a. Ext raction al cal ine
Un gramme dholocellulose est ajout 50 mL dune solution de KOH 4,3 M 3
mg.mL
-1
de NaBH
4
(agent rducteur). Lenceinte dextraction est sature largon pour
prvenir tout risque de dgradation du produit, puis place sous agitation magntique
temprature ambiante pendant 24 h. A la fin de la raction, la solution est filtre et le rsidu
est rinc leau distille puis lyophilis. Le pH du filtrat est ajust 5,5 par ajout dacide
actique glacial. Il est ensuite plac en dialyse 48h dans une membrane Spectrapor dont le
seuil de coupure est compris entre 6000 et 8000 Da. Aprs concentration, les hmicelluloses
sont prcipites par 3 volumes dthanol puis centrifuges pendant 20 minutes 1860 g (2000
rpm). Le surnageant thanolique est limin et le culot est repris dans de leau distille.

III. 1. 2. b. Ext raction aqueuse des xylanes
Lextraction se fait toujours dans de leau distille et raison de 1g de matire pour 50
mL de solvant. La raction a lieu reflux (100C) sous agitation magntique pendant une

161

heure. Aprs refroidissement de la solution, celle-ci est filtre sur papier filtre et le rsidu est
lyophilis.
III. 1. 2. c. Ext raction des xylanes aux micro-ondes
Toutes les extractions on t ralises dans un microndes de laboratoire (Milestone,
modle microSynth) une puissance de 200 W et durant 10 minutes la temprature
slectionne.
Choi x du solvant
Dans un bicol, on ajoute 50 mL de solvant (eau distille, DMSO ou DMA selon les
cas) 1 g dholocellulose. Le ballon est surmont dun rfrigrant et plac dans lenceinte du
four micro-ondes. La consigne de temprature est de 100C pour leau, 165C pour le DMA
et 189C pour le DMSO. Aprs irradiation, la solution est filtre sur papier filtre et le rsidu
rinc abondamment leau distille. Pour les extractions qui se sont faites dans les solvants
organiques, 50 mL deau distille sont ajouts au filtrat avant que celui-ci ne soit plac deux
jours en dialyse dans des membranes dont le seuil de coupure se situe entre 6000 et 8000 Da.

Prtrait ements ultrasons
Les traitements ultrasons se font laide dune sonde ultrasons Sonifier Cell
Disruptor B-30 durant des temps variables et selon un fonctionnement discontinu 25, 50, 75
ou 100% de la puissance maximale et une frquence de 20 kHz.

B. Xylanes de pricarpe dargan
III.1.3. Extraction des xylanes partir de pricarpe dargan
III. 1. 3. a. Mat ri el biol ogique
Les pricarpes dargan nous ont t fournis par la socit EFAS de Ait Amira au
Maroc. Ils ont t broys puis tamiss de faon obtenir une fine poudre blanche.

III. 1. 3. b. Ext raction lthanol
Cette premire tape permet dliminer les sucres circulants et les tannins solubles.
Lextraction a t ralise partir de 25 g de poudre de pricarpes dargan dans 900 mL

162

dthanol 80% 80C pendant 7 h. Le rsidu obtenu (R
Sox)
est alors refroidi temprature
ambiante avant dtre mis scher une nuit ltuve 40C.

III. 1. 3. c. Ext raction des pecti nes
Le mode opratoire est le mme que celui dcrit dans III.1.1.c.

III. 1. 3. d. Dl ignif ication chi mique par l e chl orit e de sodi um
Le mode opratoire est le mme que celui dcrit dans III.1.1.d.

III.1.4. Extraction alcaline des xylanes
Deux grammes dholocellulose de pricarpe dargan sont ajouts 100 mL dune
solution de KOH 4,3 M 3 mg.mL
-1
de NaBH
4
(agent rducteur). Lenceinte dextraction est
sature largon pour prvenir tout risque de dgradation du produit, puis place sous
agitation magntique temprature ambiante pendant 24h. A la fin de la raction, la
suspension est filtre et le rsidu est rinc leau distille puis lyophilis. Le pH du filtrat est
port 5,5 par ajout dacide actique glacial. Il est ensuite plac en dialyse 48h dans une
membrane Spectrapor dont le seuil de coupure est compris entre 6000 et 8000 Da. A la fin de
la dialyse, la solution est centrifuge de faon sparer la fraction insoluble (contenant
lhomoxylane) de la fraction soluble (qui contient le 4-O-mthylglucuronoxylane). Aprs
concentration de cette dernire fraction, les hmicelluloses de la fraction soluble sont
prcipites par 3 volumes dthanol puis centrifuges pendant 20 minutes 1860 g (2000
rpm). Le surnageant thanolique est limin et le culot est repris dans de leau distille.

III.2. Caractrisations chimique des xylanes
III.2.1. Etude de la composition centsimale
III. 2. 1. a. Dosage des oses
Lapprciation de la quantit en oses neutres et en acides uroniques prsents dans les
polysaccharides repose sur 2 dosages complmentaires :
- le dosage des oses totaux par la mthode de Dubois et al.,
120
,
- le dosage des acides uroniques par la mthode de Blumenkrantz et Asboe-Hansen
121
.

163

Dosage des oses totaux
Les solutions de polysaccharides doser, de concentrations comprises entre 5 et
100 g.mL
-1
ainsi que des solutions de xylose et dacide glucuronique constitutives de la
gamme talon sont prpares simultanment. A 200 L des solutions doser ou de gamme
talon, on ajoute 200 L dune solution aqueuse de phnol 5 %. Le mlange est
homognis au vortex et 1mL dacide sulfurique concentr est rapidement introduit la
pipette dans le milieu ractionnel. Aprs homognisation au vortex, le mlange est port au
bain-marie 100C durant 5 minutes. Les tubes sont refroidis dans un bain de glace et placs
30 minutes lobscurit. Les densits optiques sont par la suite mesures 492 nm sur un
spectrophotomtre UV-visible.

Principe du dosage des oses neutres par la mthode de Dubois et al.,
120






















Dosage des acides uroniques
Les solutions de polysaccharides doser sont prpares simultanment avec une
gamme talon compose de solutions dacide glucuronique 25, 50 et 100 g.mL
-1
et de
xylose 50, 100, 200 g.mL
-1
. A 200 L des solutions doser, on ajoute 1,2 mL dune
solution de ttraborate de sodium 0,0125 M dans de lacide sulfurique concentr. Le
mlange est homognis au vortex puis refroidi dans de la glace. Les tubes sont ensuite
ports 100C au bain-marie durant 5 minutes. Les tubes sont refroidis dans un bain de glace
100C
Phnol
Chromophore qui absorbe
492 nm
O
OH
OH
OH
H
2
SO
4
Dshydratation
OH
O CH
O
O
C
O
H
CHO
OH H
H HO
OH
CH
2
OH
H
OH
H
2
O

164

puis on ajoute 20 L dune solution de MHDP (mta-hydroxydiphnyle) 0,15 % dans
NaOH 0,5 %. Les contenus des tubes sont homogniss au vortex, une coloration rose
apparat. Les densits optiques sont par la suite mesures 520 nm.

Les concentrations relatives en oses neutres et en acides uroniques des solutions
polysaccharidique sont obtenues en utilisant la mthode de calcul dcrite par Montreuil et
Spik
136
qui permet dliminer les interfrences des acides uroniques dans le dosage des oses
neutres et rciproquement.
Principe du dosage des acides uroniques par la mthode de Blumenkrantz et Asboe-Hansen
121





Dosage des oses rduct eurs
Les solutions de polysaccharides doser sont prpares simultanment avec une gamme
talon compose de solutions de xylose 10, 25 et 50 g.mL
-1
. A 333 L de solution doser,
on ajoute 1000 L dune solution de PAHBAH (acide hydrazide para-hydroxybenzoque)
5 % dans HCl 0,5 M, frachement dilu au 1/5 par NaOH 0,5 M. Le mlange est homognis
au vortex et port 100C au bain-marie durant 5 minutes, puis refroidi. La lecture des
densits optiques est ralise 410 nm.

H
2
SO
4
100C
O
HOOC
OH
MHDP
Chromophore qui absorbe
520 nm
O
Dshydratation
O
CHO
OH H
H HO
OH H
OH H
COOH
O
OH
OH
OH
COOH
OH
CH
2
OH
O
CH
2
OH

165


Principe du dosage des oses rducteurs par la mthode de Lever
124







III.2.2. Dosage des hydroxyles phnoliques totaux
La teneur en groupements hydroxyles phnoliques totaux est dtermine par la
mthode au ractif de Folin-Ciocalteu propose par Pereira
222
et modifie par Pilo-Veloso et
al.,
236
. Cette mthode repose sur une raction doxydo-rduction indpendante du degr de
polymrisation des composs phnoliques. Ainsi, elle implique tous les composs sans
diffrenciation entre lacide gallique, les monomres, les dimres et les composs phnoliques
les plus grands. Le ractif de Folin-Ciocalteu est un ractif form de phosphomolybdate et de
HO C
O
H
N NH
2
Hydrazide d'acide parahydroxybenzoque (PAHBAH)
H
2
O
CH
H HO
OH H
H HO
N
H
N C
O
HO
CH
2
OH
NaOH
Anions colors en jaune absorbant 410nm
CH
H HO
OH H
H HO
N N C
O
HO
CH
2
OH
O
OH
HO
HO
OH
xylose

166

phosphotungstate. Ces derniers sont rduits par raction avec les composs phnoliques sous
leffet de la chaleur en milieu alcalin pour former un produit bleu. La concentration de ce
driv color est dtermine par spectrophotomtrie une longueur donde de 760 nm. Des
solutions dacide gallique de concentrations croissantes sont utilises comme talon.
Un millilitre dextrait brut aprs dlignification enzymatique est mlang 2,5 mL de
ractif de Folin-Ciocalteu dilu 10 fois par de leau ultra-pure. Le mlange est aussitt
additionn de 2 mL dun solution de bicarbonate de sodium 75 g.L
-1
puis plac au bain-
marie 50C pendant 5 minutes avant dtre plac dans un bain deau froide. Les mesures
dabsorbance sont effectues au spectromtre UV-visible (Shimadzu) 760 nm. Les
concentrations en hydroxyles phnoliques sont estimes par rfrence une droite talon
dacide gallique de concentrations comprises entre 20 et 100 mg.L
-1
. Les rsultats sont
exprims en quivalents massiques dacide gallique.

III.2.3. Dosage du peroxyde dhydrogne rsiduel
Un prlvement dun volume V de 1 mL du mlange ractionnel est introduit dans un
bcher de 100 mL et mlang 25 mL dune solution de tampon phosphate KH
2
PO
4
-
Na
2
HPO
4
500 mM (pH 7). On y ajoute une spatule dempois damidon et 5 mL dune solution
diodure de potassium (0,4 M) fraichement prpare. Liode libr est titr avec une solution
de tiosulfate de sodium (0,01 M) place dans une burette gradue. Les quilibres mis en jeu
dans ce dosage sont :
H
2
O
2
+ 2 I
-
+ 2 H
3
O
+
I
2
+ 4 H
2
O (1)
2 S
2
O
3
2-
+ I
2
2 I
-
+ S
4
O
6
2-
(2)

La quantit de peroxyde dhydrogne rsiduelle (n
H2O2
) contenu dans le mlange ractionnel
se calcule, daprs les quilibres (1) et (2) par la formule :
n
H2O2
= x V
q
x 0,01 x V
tot
/V
avec V
q
, le volume de thiosulfate de sodium vers jusqu la dcoloration de la solution et
V
tot
le volume total de la solution doser.

III.2.4. Dosage des fonctions acides carboxyliques
Un prlvement dune masse de 20 mg dchantillon est mis en solution dans 50 mL
deau distille auxquels est ajout 1 mL de soude 0,1 M. Lexcs de soude est dos par HCl

167

0,02 M en utilisant une lectrode de verre et un pHmtre. Un blanc est ralis partir du
polysaccharide non oxyd. Le nombre de moles de fonctions carboxyliques cres est calcul
selon la formule suivante :
n
COOH(chantillon)
= ( V
q

(blanc)
V
q

(chantillon)
)* [HCl]

III.2.5. Dosage des fonctions aldhydes (raction de Cannizarro)
Un prlvement dune masse de 50 mg dchantillon est mis en solution dans 10 mL
de soude 0,1 M. Le mlange est chauff 70C pendant 10 minutes sous agitation
magntique. Lexcs de soude est alors titr en retour par HCl 0,02 M en utilisant une
lectrode de verre et un pHmtre. Un blanc est ralis partir du polysaccharide non oxyd.
Le nombre de moles de fonctions carboxyliques cres est calcul selon la formule suivante :
n
CHO(chantillon)
= 2*(( V
q

(blanc)
V
q

(chantillon)
)* [HCl] - n
COOH(chantillon)
)

III.2.6. Etude de la composition monosaccharidique par CPG
Le principe de cette mthode repose sur lobtention de mthylglycosides
trimthylsilyls par mthanolyse suivie dune pertrimthylsilylation des monosaccharides
librs.
III. 2. 6. a. Prparation des dri vs met hylgl ycosi des trimt hyl sil yls
Les monosaccharides neutres et les acides uroniques sont identifis et analyss sous
forme de mthylglycosides O-trimthylsilyls selon la mthode de Kamerling et al.,
128

modifie par Montreuil et al.,
136
. Deux cents cinq cents microgrammes de polysaccharides,
auxquels on ajoute un tmoin interne, le mso-inositol (MI), raison de 50% de la quantit de
polysaccharide, sont traits. Cette analyse, qui a t adapte lanalyse de poudres dorigine
vgtale par Marga et al.,
237
, a t galement utilise pour ltude de la composition
monosaccharidique des sciures brutes et des rsidus dextraction.
Mt hanol yse
Les monosaccharides sont librs sous forme de mthylglycosides par ajout de 1 mL
dune solution de chlorure dactyle 1 M dans du mthanol anhydre (Instant methanolic HCl ;
Alltech Rf. 18053) sur 200 g dun chantillon polysaccharidique anhydre contenant 20 g
dun talon interne, le mso-inositol (MI). La mthanolyse est stoppe aprs 24 h de raction

168

80C par vaporation du mthanol chlorhydrique sous un flux dazote. La phase
mthanolique est dlipide par trois lavages successifs lheptane (3 x 1 mL). Elle est
nouveau vapore sous flux dazote.
Trimthylsil yl ation
Les mthylglycosides sont trimthylsilyls pendant 2 h temprature ambiante par
200 L dun mlange V/V pyridine/BSTFA (N,O-bis-trimthylsilyl-trifluoroactamide) 1 %
de trimthylchlorosilane (TMCS) avant de pouvoir tre injects en CPG.

III. 2. 6. b. Anal yse des dri vs TMS en CPG
Les mthylglycosides trimthylsilyls sont ensuite identifis et doss par CPG sur un
chromatographe Perichrom PR-2100 en comparaison avec des chantillons tmoins.
L'lvation de la temprature du four est programme de 130 210C raison de 2C.min
-1
,
avec un palier de 5 min 190C, puis de 210 260C raison de 5C.min
-1
. Les rsultats sont
exprims en pourcentage molaire aprs correction des aires des pics.

III.2.7. Evaluation du taux dactylation et dacide 4-O-
mthylglucuronique
Le calcul de ces pourcentages a t effectu par utilisation de la RMN
1
H. Les spectres
de RMN ont t raliss sur un appareil Bruker DPX-400 une frquence de 400,13 MHz au
Service commun de RMN de lUniversit de Limoges. Les dplacements chimiques sont
exprims en ppm ; le tetramthylsilane tant pris comme rfrence interne ( = 0 ppm). Les
spectres sont enregistrs dans leau deutrie. Les pourcentages ont t calculs selon la
mthode dcrite au paragraphe I.3.1.c (Prepire Partie) pour les diffrents xylanes tests.

III.3. Autohydrolyse des xylanes
Cette mthode de fragmentation a t utilise pour diffrents glucuronoxylanes de
chtaignier et dargan.
III.3.1. Protocole
Le protocole utilis a t adapt de Cescutti et al.,
238
pour l'analyse d'un polysaccharide
acide. Une solution aqueuse de polysaccharide 1 mg.mL
-1
est convertie en sa forme acide

169

par passage sur rsine Amberlite IR-120 (H
+
). Cette solution est alors place l'tuve 100C
durant des temps variables dpendants de la rsistance du polysaccharide lhydrolyse. Aprs
refroidissement, la fraction polymrique pas ou peu hydrolyse est prcipite par 3 volumes
dthanol absolu et limine par filtration. Lhydrolysat constitu doligosaccharides est
concentr par vaporation sous vide.

III.3.2. Sparation des oligosaccharides
Les produits d'hydrolyse ont t spars par chromatographie d'change d'ions sur une
colonne de rsine basique Dowex 12 sous forme Cl
-
(mesh 200-400 ; Fluka ; colonne : 1
cm 50 cm). Un gradient dlution linaire de formiate dammonium de 0,05 M 0,5 M a t
appliqu pour sparer les oligosaccharides selon leur charge. La purification des fractions
homognes se poursuit ensuite sur une colonne de Biogel P-2 (100-1800 Da ; Biorad ;
colonne : 2,5 cm 70 cm) quilibre dans leau sous un dbit de 10 mL.h
-1
. Les fractions
oligosaccharidiques sont recueillies en sortie de colonne laide dun collecteur (Redifrac ;
Pharmacia-Biotech.) et contrles par CCM (luant : butanol, acide actique, eau ; 2/1/1)
aprs rvlation par pulvrisation dune solution dH
2
SO
4
20 % 0,1 % dorcinol et passage
ltuve 100C.
III.3.3. Purification des oligosaccharides
Lhydrolysat ainsi obtenu est dpos sur colonne de BioGel P-2 (100-1800 Da ; Biorad ;
colonne : 2,5 cm 70 cm) et P-4 (800-4000 Da ; Biorad ; colonne : 2,5 cm 70 cm). Les
oligosaccharides sont lus avec de leau distille sous un dbit de 10 mL.h
-1
et collects.





170

Chapitre IV.
IV.1. Synthses
IV.1.1. Sel de sodium de lacide sulfophtalique
NaO
3
S
OH
O
O
OH

De la soude (15 g, 0.375 mol) est dissoute dans un minimum deau. Cette solution est
ajoute avec prcaution lacide sulfophtalique (80 mL, 0,21 mol). Le pH de la solution est
suivi et lon sarrte la premire quivalence (pH=1,3). Leau est ensuite vapore et le
produit est alors prcipit par de lthanol. La solution est filtre sur Bchner et le prcipit
est sch ltuve 40C pendant une nuit. Le rendement est de 95% et le produit est utilis
sans autre purification supplmentaire.




171

IV.1.2. 4,4,4,4-ttrasulfonylphtalocyanine de fer (FePcS)
N
HO
3
S
N
N
N
N
N
N
N
HO
3
S
SO
3
H
SO
3
H
Fe



Dans un ballon de lacide sulfophtalique (64 mmol, 17,2 g), de lure (386 mmol, 23,2
g), du chlorure dammonium (35 mmol, 1,87 mg), du sulfate de fer (12 mmol, 3,34 g) en
prsence de molybdate dammonium (0,2 mmol, 247 mg). Toutes les poudres sont broyes au
mortier, mlanges et dposes dans une boite de Ptri en verre, elle-mme place sur plaque
chauffante 200C pendant 2 h. Le produit de la raction est caractris et dos par lUV-
visible (
max
en nm / en mol.L
-1
: 328 / 55700 ; 630 / 65000)
227
. Le rendement molaire
obtenu est de 76%,











172


IV.1.3. 4,4,4,4-ttrasulfonylphtalocyanine de manganse
(MnPcS)
N
HO
3
S
N
N
N
N
N
N
N
HO
3
S
SO
3
H
SO
3
H
Mn

Dans un ballon de lacide sulfophtalique (6,4 mmol, 1,72 g), de lure (3,8 mmol, 2,32
g), du chlorure dammonium (3,5 mmol, 187 mg), du sulfate de manganse (1,2 mmol, 210
mg) en prsence de molybdate dammonium (0,2 mmol, 27 mg). Toutes les poudres sont
broyes au mortier, mlanges et dposes dans une boite de Ptri, en verre elle-mme place
sur plaque chauffante 200C pendant 2 h. Le produit de la raction est caractris et dos
par lUV-visible (
max
en nm / en mol.L
-1
: 506 / 7943 ; 640 / 26915 ; 714 / 51286)
228
. Le
rendement (molaire) est de 16 %.
SM (MALDI) : m/z 886,91 [M+H]
+










173

IV.1.4. 4,4,4,4-ttrasulfonylphtalocyanine daluminium
(AlPcS)

N
HO
3
S
N
N
N
N
N
N
N
HO
3
S
SO
3
H
SO
3
H
Al

Dans un ballon de lacide sulfophtalique (6,4 mmol, 1,72 g), de lure (3,8 mmol, 2,32
g), du chlorure dammonium (3,5 mmol, 187 mg), du chlorure daluminium (1,2 mmol, 290
mg) en prsence de molybdate dammonium (0,2 mmol, 27 mg). Toutes les poudres sont
broyes au mortier, mlanges et dposes dans une boite de Ptri en verre, elle-mme place
sur plaque chauffante 200C pendant 2 h. Le produit de la raction est caractris et dos
par lUV-visible (
max
en nm / en mol.L
-1
: 681/3870 ; 614/794). Le rendement molaire est
de 55 %.
SM (MALDI) : en cours
RMN
1
H : (400 MHz, DMSO d
6
, 25C), 7-8 ppm, protons aromatiques



174

IV.1.5. 4,4,4,4-ttrasulfonylphtalocyanine de zinc (ZnPcS)
N
HO
3
S
N
N
N
N
N
N
N
HO
3
S
SO
3
H
SO
3
H
Zn

Dans un ballon de lacide sulfophtalique (6,4 mmol, 1,72 g), de lure (3,8 mmol, 2,32
g), du chlorure dammonium (3,5 mmol, 187 mg), du chlorure de zinc (1,2 mmol, 290 mg) en
prsence de molybdate dammonium (0,2 mmol, 27 mg). Toutes les poudres sont broyes au
mortier, mlanges et dposes dans une boite de Ptri en verre, elle-mme place sur plaque
chauffante 200C pendant 2 h. Le produit de la raction est caractris et dos par lUV-
visible (
max
en nm / en mol.L
-1
: 677/683 ; 636/496). Le rendement molaire est de 71%.
SM (MALDI) : en cours
RMN
1
H : (400 MHz, DMSO d
6
, 25C), 7-8 ppm, protons aromatiques


175

IV.1.6. 4,4,4,4-ttrasulfonylphtalocyanine de nickel (NiPcS)
N
HO
3
S
N
N
N
N
N
N
N
HO
3
S
SO
3
H
SO
3
H
Ni

Dans un ballon de lacide sulfophtalique (6,4 mmol, 1,72 g), de lure (3,8 mmol, 2,32
g), du chlorure dammonium (3,5 mmol, 187 mg), du chlorure de nickel (1,2 mmol, 280 mg)
en prsence de molybdate dammonium (0,2 mmol, 27 mg). Toutes les poudres sont broyes
au mortier, mlanges et dposes dans une boite de Ptri en verre, place sur plaque
chauffante 200C pendant 2 h. Le produit de la raction est caractris et dos par lUV-
visible (
max
en nm / en mol.L
-1
: 661/13792 ; 628/15895). Le rendement molaire est de
42%.
SM (MALDI) : en cours
RMN
1
H : (400 MHz, DMSO d
6
, 25C), 7-8 ppm, protons aromatiques


176

IV.1.7. 5,10,15,20-ttra(4-sulfonatophenyl)porphyrine (H
2
TPPS)
N
N H
N NH
SO
3
H
SO
3
H
HO
3
S
SO
3
H

Dans un ballon de 100 mL, on place 710 mg (1,15 mmol) de ttraphnylporphyrine
(H
2
TTP) (pralablement purifie sur colonne) en prsence de 30 mL dH
2
SO
4
95% (0,16
mol), 80C. Aprs 20 h de raction, la solution est place dans un bain de glace et avec
prcaution, la ttraphnylporphyrine sulfone est verse dans 100 mL deau distille. La
neutralisation se fait par de la soude puis par une solution sature de Na
2
CO
3
jusqu ce que la
porphyrine qui tait verte devienne violette. La solution est alors vapore sous pression
rduite. La H
2
TPPS est ensuite dissoute dans du mthanol ; les sels prcipitent froid et sont
limins par filtration. Plusieurs lavages sont ainsi raliss avant lvaporation du mthanol
sous pression rduite. La H
2
TPPS est reprise dans de leau et place dans des membranes de
dialyse (dont le seuil de coupure est de 1000 Da) pendant 48 h. Aprs vaporation de leau, la
H
2
TPPS est obtenue sous la forme dune poudre violette avec un rendement de 87%.
R
f
= 0,54 (CHCl
3
/MeOH/H
2
O 60/35/5)
RMN
1
H : (400 MHz, DMSO d
6
, 25C) en ppm (J en Hz), -2,93 (s, 2H, NH pyrrole), 8,06
(d, J=7,9 HZ, 8H, H-m-ArSO
3
H), 8,19 (d, J=7,9 Hz, 8H, H-p-ArSO
3
H), 8,86 (s, 8H, H
pyrrole).
SM (MALDI) : m/z 935,24 [M+H]
+
UV-Visible
max
en nm / en mol.L
-1
dans leau: 413 (413242), 515 (5479), 552 (5809), 580
(5030), 633(2608)

177

IV.1.8. 5, 10, 15,20-ttra(4-sulfonatophnyl)porphyrine de fer
(FeTPPS)
N
N
N N
SO
3
H
SO
3
H
HO
3
S
SO
3
H
Fe

Dans un ballon 200 mg de H
2
TPPS (0,19 mmol, 1 q.) sont dissouts dans 100 mL
deau distille auxquels on ajoute 387 mg de FeCl
2
,4H
2
O (1,9 mmol, 10 q.) dans un ballon
de 250 mL. La raction est porte 80 C pendant 28 h. Aprs refroidissement du milieu
ractionnel, le surplus de fer est prcipit par du mthanol froid. La solution est ensuite
centrifuge 15 minutes 3000 rpm pour sparer les sels. La solution porphyrinique est alors
vapore sous vide puis reprise dans de leau distille avant dtre place en dialyse 48 h dans
des membranes de seuil de coupure fix 1000 Da. La solution purifie est alors elle aussi
vapore sec et lon obtient une poudre marron avec un rendement de 43%.

R
f
= 0,5 (CHCl
3
/MeOH/H
2
O 60/35/5)
SM (MALDI) : en cours

UV-Visible
max
en nm / en mol.L
-1
dans leau: 392/68187 ; 528/8407 ; 580/4727




178

IV.1.9. 5, 10, 15, 20-ttra(4-sulfonatophnyl)porphyrine de
manganse (MnTPPS)
N
N
N N
SO
3
H
SO
3
H
HO
3
S
SO
3
H
Mn

Dans un ballon 200 mg de H
2
TPPS (0,19 mmol, 1 q.) sont dissouts dans 100 mL
deau distille auxquels on ajoute 335 mg dactate de manganse (1,9 mmol, 10 q.) dans un
ballon de 250 mL. La raction est porte 85 C pendant 16 h. Aprs refroidissement de la
raction, le surplus de fer est prcipit par du mthanol froid. La solution est ensuite
centrifuge 15 minutes 3000 rpm pour sparer les sels. La solution porphyrinique est alors
vapore sous vide puis reprise dans de leau distille avant dtre mise en dialyse 48 h dans
des membranes de seuil de coupure fix 1000 Da. La solution ainsi purifie est enfin
vapore sec ce qui permet dobtenir une poudre marron avec un rendement de 52%.

R
f
= 0,56 (CHCl
3
/MeOH/H
2
O 60/35/5)
SM (MALDI) : m/z 988,00 [M+H]
+

UV-Visible
max
en nm / en mol.L
-1
dans leau: 466/ 123625 ; 562/15170 ; 596/10522



179

Chapitre V.
V.1. Evaluation des proprits biologiques de cytotoxicit
des extraits
Les tests de cytotoxicit ont t raliss au Laboratoire dOncologie Cellulaire et
Molculaire (EA 3410) de lUniversit de Paris XIII avec la collabration du professeur
Michel Kraemer et lassistance technique de Mme Odile Sainte Catherine.
V.1.1. Efficacit des xylanes en oncologie cellulaire et molculaire
V. 1. 1. a. Ligne cell ulaire
Les tudes ont t menes sur des cellules de la ligne tumorale A431 provenant de
lATCC (American Type Collection Culture). Cette ligne dun carcinome pidermode
vulvaire humain se caractrise par une morphologie de cellules pithliales et un grand
nombre de rcepteurs lEGF
239
. Par ailleurs, ces cellules scrtent une quantit importante
de VEGF (facteur de croissance endothlial vasculaire), favorisant langiognse
(L'angiogense est un mcanisme de novascularisation prenant naissance partir d'un rseau
capillaire prexistant. Elle est particulirement importante et indispensable en particulier pour
la croissance des tumeurs, le dveloppement des mtastases).
240


V. 1. 1. b. Entreti en cell ulaire
La ligne cellulaire est cultive dans un milieu de culture DMEM (4500 mg.mL
-1
de
glucose, pyruvate de sodium et glutaMAX), enrichi de 10 % de srum de veau ftal (SVF)
dcomplment et contenant un mlange dantibiotiques (50 UI.mL
-1
de pniciline, 50 g.mL
-
1
de streptomycine) (Invitrogen). Les cellules sont ensemences dans des tubes Falcon T75
raison de 5.10
5
10
6
cellules.10 mL
-1
de milieu de culture et maintenues en culture dans un
incubateur 37C et 5% de CO
2
en atmosphre humide. A confluence, les cellules sont
rinces avec une solution saline de phosphate tamponne (PBS : Gibco) puis dtaches par
une solution de trypsine-EDTA (0,0025% de trypsine, 0,01% dEDTA ; Invitrogen) et
reensemences au 1/10
me
de la confluence dans de nouvelles boites de culture. Chaque
trypsination correspond un passage numrot.



180

V.1.2. Etude de la viabilit cellulaire
V. 1. 2. a. Tests MTT
Leffet des diffrents composs sur la viabilit cellulaire a t tudi grce un test
MTT (bromure de 3-(4,5-dimthylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylttrazolium ; Sigma-Aldrich)).
241

V. 1. 2. b. Etude des eff ets de doses et du t emps
Les cellules sont ensemences dans des plaques de 96 puits (Falcon) raison de 5.10
3

cellules.100 L
-1
dans du milieu complet (10% de SVF). Aprs 24 h de culture, le milieu est
elimin et remplac par du milieu 2% de SVF contenant des concentrations croissantes de
produits. Aprs 72 h de traitement, les cellules sont rinces au PBS puis incubes avec 100 L
de MTT (0,2 mg.mL
-1
de PBS pendant 4h 37C et 5% de CO
2
. Le MTT rduit en bleu de
formazan, est solubilis par laddition de 100 L de DMSO (dimthylsulfoxide ; Sigma-
Aldrich) dans chaque puits. La densit optique (DO) est mesure 595 nm grce un lecteur
de plaque Labsystem Multiskan MS. Le pourcentage de viabilit cellulaire (%V) est
dtermin selon la formule suivante :

%V = [DO
cellules traites
/Moy (DO
cellules non traites
)]x100

V. 1. 2. c. Etude de la migrati on et de l invasion cel lulaire
Leffet des xylanes a t tudi sur la migration et linvasion des cellules A431 a t
tudi. Pour cela, nous avons utilis des chambres de culture (ou chambre de migration)
appeles chambres de Boyden (Becton Dickinson). Ces chambres sont composes dinserts
constitus dune membrane poreuse (membrane de 0,3 cm
2
, pores de 8 m), placs dans des
plaques de 24 puits (plaques companions ; Falcon ; Becton Dickinson).

Prparation des inserts pour la migrati on
Pour ltude de la migration cellulaire, lintrieur des inserts (dposs dans les puits de la
plaque compagnon) est recouvert de 100 L de fibronectine ( 100 g.mL
-1
dans du PBS) par
inserts. Aprs une nuit 4 C, lexcs de fibronectine est limin, les membranes sont rinces
2 fois au PBS puis satures 1 heure avec 1% de BSA (albumine bovine ; Sigma-Aldrich). Le
milieu avec 1% BSA est finalement limin.

181


Prparation des inserts pour li nvasi on
Pour ltude de linvasion cellulaire, lintrieur des inserts (dposs dans les puits de la
plaque companion) est recouvert par 100 L de Matrigel 10 mg.mL
-1
PBS (Becton
Dickinson). La plaque de culture est alors place dans lincubateur 37 C pendant 3 heures,
puis sous une hotte flux laminaire (12 24 heures) pour permettre la polymrisation du
Matrigel. Les inserts sont stocks 4 C puis rhydrats 24 heures avant lexprience avec
500 l de milieu.

Prparation des cell ules pour l a migration
Les cellules A431 sont ensemences dans des tubes Falcon T25 raison de 1.7.10
6
-2.10
6
cellules.5 mL
-1
par T25 dans du milieu de culture 10 % de SVF. Aprs 24 h, les cellules sont
rinces au PBS puis traites par des solutions 50 ou 100 M des xylanes (dilution dans du
milieu 10% de SVF) pendant 24 h. Des cellules, servant de tmoins, ne sont pas traites
(milieu 10 % SVF). Aprs les traitements par les diffrents lots de xylanes, les cellules sont
rinces au PBS, dtaches la trypsine, puis comptes. Elles sont alors dilues dans du milieu
dpourvu de srum mais additionn de 0,1 % de BSA.

Prparation des cell ules pour l i nvasion
Les cellules ne sont pas pr-traites mais sont places simultanment au contact de
solutions 50 ou 100 M de xylanes dans les inserts.

Migration cellulaire
Les cellules pr-traites et non traites (tmoins) sont dposes dans les inserts recouverts
de fibronectine raison de 10.10
4
cellules.500 L-1 par insert dans du milieu 0,1 % de BSA.
Du milieu 10 % de SVF est plac comme chmoattractant dans les puits de la plaque
companion (500 L par puits), afin de permettre la formation dun gradient chimiotactique de
part et dautre de la membrane poreuse (Figure). Aprs 24 h de migration dans lincubateur
37 C, le surnageant est limin et les inserts sont rincs au PBS sur chaque face. Les cellules
nayant pas migr au travers des pores (face interne des inserts) sont limines par grattage

182

avec un coton-tige, celles qui ont migr sur la fibronectine (face externe des inserts) sont
fixes pendant 10 minutes au mthanol, puis colores au crystal violet. Les cellules sont
comptes au microscope (Zeiss Axiophot). Lensemble des cellules est dnombr
(grossissement X200) et les pourcentages de migration sont dtermins en comparant le
nombre de cellules pr-traites qui ont migr (N
traites
) au nombre de cellules non traites qui
ont migr (N
non traites
). Ainsi :

%Migration = (N
traites
/N
non traites
)x100



Figure 84 : Principe de la migration et de linvasion cellulaires en chambre de Boyden

V. 1. 2. d. Invasi on cellulaire
Les cellules non traites sont dposes dans les inserts recouverts par le Matrigel
raison de 10.10
4
cellules.500 L
-1
par insert dans du milieu 0,1 % de BSA contenant
diffrentes concentrations de xylanes de chtaignier et dargan et dhomoxylanes dargan.
Comme prcdemment, du milieu 10 % de SVF est plac dans les puits de la plaque
companion (500 L par puits). Aprs 24 h dinvasion dans lincubateur 37 C, les inserts
sont rcuprs et les cellules ayant travers le Matrigel sont laves, fixes, colores et
comptes comme dcrit pour ltude de la migration. Des pourcentages dinvasion cellulaire
sont calculs de la mme manire que les pourcentages de migration.

100 L Fibronectine (100
g/ml) pendant 24 h 4 C)
Insert
CellulesA 431 (30 000 dans
250 l de milieu avec 0.1 % BSA)
Plaque companion (24 puits)
Membrane PET 8 m
500 l milieu
10 % SVF
3 Rinages PBS
Blocage 1 % BSA
dans 1 H
- incubation 20 h 37 C
- grattage des inserts au
coton tige
- Fixation 5 minutes
paraformald hyde 4 %
- Rin age l eau
- Coloration

l Hemalun
pendant 5 minutes

183

V. 1. 2. e. Zymographi e
Principe
Lactivit glatinolytique des mtalloprotases 2 et 9 contenues dans les surnageants de
culture ainsi que celle de leurs formes zymognes est tudie par zymographie. Il sagit dune
lectrophorse SDS-PAGE effectue en conditons non rductrices. Le substrat de la protase
tudie (glatine) est copolymris avec lacrylamide.

Les cellules sont ensemences dans des plaques de 6 puits (Falcon) raison de 50.10
4

cellules.2 mL
-1
dans du milieu complet (10 % de SVF). Lexprience comporte des temps de
traitement des cellules de 24 h, 48 h et 72 h. Aprs 24 h de culture, le milieu est enlev et
remplac par du milieu sans SVF pour les cellules non traites, et 0,015 mM des diffrents
lots de xylanes pour les cellules traites pour la premire plaque. Les autres plaques sont
maintenues avec 10 % de SVF pour 24 h et 48 h supplmentaires. Les surnageants des
cellules A431 (sans srum) sont rcolts toutes les 24 heures de traitement. Les surnageants
sont concentrs avec des centricons 1000g pendant 1 h30 (Millipore) puis dilus dans un
tampon dchantillon non rducteur SDS 4X, 30 minutes temprature ambiante avant le
dpt sur un gel de polyacrylamide 10 % co-polymriss avec 1 mg.mL
-1
de glatine
(Glatine type B ; Sigma-Aldrich) ; substrat prfrentiel des MMP-2 et MMP-9.
Llectrophorse dbute 60 V pendant 20 minutes puis se poursuit 160 V 4 C. Aprs
migration, le SDS est limin par des lavages successifs dans une solution de Triton sous
agitation temprature ambiante pour permettre la renaturation des protines, puis leau
distille. Les gels sont incubs dans un tampon de digestion (50 mM Tris-HCl pH 7,4 ; 0,2M
NaCl ; 5 mM CaCl
2
; 0,05 % Brij 35) contenant les lments ncessaires lactivit
enzymatique des MMPs durant 19 heures 37 C. Le gel est enfin color pendant 1 heure
dans une solution 30 % de mthanol, 10 % dacide actique et 0,5 % de Bleu de Coomassie
R.250 puis dcolor dans des bains 30 % de mthanol, 10 % dacide actique. Les
glatinases sont rvles par une bande claire sur un fond bleu, correspondant la protolyse
locale de la glatine dans le gel.

Sur chacun des zymogrammes raliss, une fraction de surnageant issue de la culture
de la ligne HT 1080 (Fibrosarcome humain, ATCC) et scrtant les pro-MMP2 et pro-
MMP9 en quantit importante est dpose en parallle des chantillons analyss. La
quantification des plages de lyse est effectue par analyse semi-automatique. La surface

184

(m
2
), ainsi que la densit grise des plages de lyse sont mesures pour chaque dpt effectu,
les activits pro-MMP2 sont alors exprimes en teinte gris.m
-2
. Les activits ainsi mesures
sont ramenes au nombre de cellule dtermines dans chaque puits dont sont issus les
chantillons analyss (dosage de protines). De faon pouvoir normaliser lensemble des
valeurs obtenues et effectuer une comparaison des activits mesures partir des diffrents
gels, la valeur dactivit mesure pour la plage de lyse correspondant lactivit pro-MMP2
scrte par HT 1080 est prise pour rfrence et chacune des valeurs lui est compare.

185

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES


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2. Moine C., Extraction, caractrisation structurale et valorisation d'une famille
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Mines, St Etienne, 2004, 202 p.

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202



203












Annexes

204



205


Annexe 1

Mthode de calcul de la concentration en oses neutres et en acides uroniques


En raison de linterfrence des acides uroniques dans le dosage des oses neutres, il est
ncessaire de corriger les calculs par la mthode tablie par Montreuil et Spick
122
. A laide
des solutions doses neutres (Xyl) et dacides uroniques (GlcA) tmoins, on dtermine la
pente de chaque droite talon :

Dosage au phnol : pente= pour le Xyl
Pente= pour le GlcA
Dosage au MHDP : pente= pour le Xyl
Pente= pour le GlcA


A partir de ces pentes et en fonction des densits optiques (D.O) obtenues selon les
dosages, les concentrations en acides uroniques (AU) et en oses neutres (ON) sont
dtermines grce aux formules suivantes :

D.O
phnol
= [ON] + [AU]
D.O
MHDP
= [ON] + [AU]

On a alors :

[ON] = [D.O
phnol
[AU]]/
[AU] = [D.O
MHDP
D.O
phnol
] / [( ) / ]









206

Annexe 2



Mthode de calcul de la quantit dacide actique pour le dosage par le kit enzymatique
(Boehringer Mannheim/R-Test Combination 148 261)















207


















Conduite de Projet de recherche. Un nouveau chapitre de la
thse


208





209

Cadre gnral et enjeux de la thse

Prsentation succincte du sujet de thse

Titre : Extraction et valorisation biologique de polysaccharides de
chtaignier

Lors de mon travail de thse, je me suis consacre dans un premier temps, extraire
des polysaccharides cest dire des molcules de la famille des sucres partir de bois de
chtaignier en recourant des mthodes de chimie verte dextraction (solvants moins
agressifs, non chlors, prtraitements physiques). Les molcules ont ensuite t
caractrises chimiquement (dosages colorimtriques, chromatographie haute et basse
pression, en phase gaz, RMN, spectromtrie de masse) afin dvaluer lincidence des
traitements mis en place sur la structure des ces molcules. Enfin, ces molcules, des xylanes
dans mon cas, ont t testes en oncologie molculaire et cellulaire sur des cellules
cancreuses afin den dterminer lactivit. Une tude structure/activit a galement t
mene afin de comprendre ltroite corrlation qui lie la structure chimique dune molcule
son activit sur un systme biologique donn.

Contexte de la thse
Lindustrie du bois trs prsente notamment dans le Limousin gnre de nombreux co-
produits qui ne sont pas toujours valoriss et qui pourtant sont riches en molcules
essentiellement polysaccharidiques dont la particularit est dtre inpuisables puisque
renouvelables. Il sagissait ici de proposer de nouvelles voies dextraction de ces molcules
haute valeur ajoute. Pour cela des protocoles recourant aux enzymes ont t dvelopps ainsi
que lutilisation de catalyseurs pralablement synthtiss. Par ailleurs, nous avons eu recours
des techniques dextraction physiques comme les micro-ondes ou les ultrasons et limit
lutilisation de solvants. Outre un intrt acadmique li ltude de leffet des divers
traitements sur la structure des polysaccharides, ce sujet, en proposant de nouvelles pistes de
valorisation biologique des glucuronoxylanes de bois, prsente aussi un intrt appliqu qui
pourra tre directement transpos aux entreprises rgionales du secteur de la cosmtique et de
la pharmacie.


210

Le Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles est une unit pluridisciplinaire
spcialise, entre autres, dans la chimie des glucides. Un premier axe de recherche concerne la
synthse de molcules vise thrapeutique, telles que les porphyrines utilises en tant que
photosensibilisateurs en photothrapie dynamique des cancers, et des analogues de
nuclosides, des molcules dveloppes en tant quantiviraux, anticancreux et antibiotiques.
Ce laboratoire s'intresse galement aux voies de valorisation des fractions cellulosiques et
hmicellulosiques de co-produits agricoles et forestiers. Mon sujet de thse est lun des
premiers faire la jonction entre ces deux thmatiques. En effet il sagit bien de valoriser la
fraction hmicellulosique (essentiellement compose de xylanes) de sciures de bois de
chtaignier mais pour extraire ces molcules une tape pralable de dgradation des lignines,
macromolcules qui assurent la rigidit du bois, est ncessaire. Lors de cette tape nous avons
introduit des catalyseurs tels les phtalocyanines ou les porphyrines synthtises bnficiant
ainsi de lexprience du LCSN dans ce domaine. De tels protocoles nont notre
connaissance pas t reproduit sur une matrice vgtale complexe telle que la sciure de bois.

Au cours de ce travail de thse, de nombreuses comptences scientifiques et savoir-
faire ont t mis ma disposition, tels les protocoles dextraction de polysaccharides vgtaux
et les mthodes danalyses de ces molcules notamment en chromatographie en phase gaz.
Jai ainsi bnfici de lexprience et du travail des chercheurs et des doctorants du
laboratoire en terme de glycobiologie et de chimie des glucides sur lesquels je me suis
appuye pour mener et faire avancer mon projet de thse.

Mon intrt sest port sur les polysaccharides vgtaux car ce sont des molcules de
structures trs diversifies, renouvelables et prsentant de nombreuses perspectives en termes
dapplications et de proprits biologiques. De plus ce sont des molcules davenir et peuvent
devenir de relles alternatives des produits issus de lindustrie ptrolire. Cette thse
sinscrit logiquement la fois dans la suite de mon DEA qui portait sur de nouvelles
mthodologies dextraction de xylanes mais aussi dans le projet qua le LCSN depuis
quelques annes dj de valoriser les co-produits issus de la filire bois. Ce travail portait au
dpart sur lextraction de xylanes alternatives la mthode alcaline. Mais face certaines
difficults, nous avons recentr nos recherches sur de nouvelles mthodes de dlignification,
les lignines tant des macromolcules intimement lies aux xylanes et qui empchent leur
extraction.


211

Gestion, volution et cot du projet
Prparation et cadrage du projet
Tout projet qui se cre ncessite en amont une prparation mais galement une
valuation des risques afin de limiter les checs. Dans le cadre de ma thse, la prparation a
consist en la recherche dun financement qui sest matrialis sous la forme dune bourse
rgionale. Des premires expriences ralises lors du stage de master recherche ont permis
de voir ce qui pourraient fonctionner et ainsi de donner un premier cadre la thse. Les
nombreuses discussions avec mes encadrants le Docteur Vincent Gloaguen et le Professeur
Pierre Krausz mais aussi avec les autres membres du laboratoire ont permis dvaluer les
risques mais galement denvisager une stratgie visant limiter ces derniers au maximum.

Conduite du projet
Ce projet de thse sest droul entre octobre 2006 et juillet 2009 au sein du
Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles (LCSN, EA 1069) de lUniversit de
Limoges. Des points davancement rguliers avec mes encadrants ont eu lieu sans priodicit
dfinie tandis que des runions de laboratoire furent programmes au cours desquels les
diffrents doctorants et stagiaires exposent leurs travaux, permettant ainsi une discussion
constructive avec tous les autres acteurs du LCSN. Dans la premire phase de mon travail, jai
extrait et caractris structuralement des polysaccharides de diffrentes essences selon des
mthodologies bien identifies au laboratoire, ce qui ma permis dacqurir ds le dbut de la
thse les bases de lextraction de biomolcules. Par la suite, une collaboration avec le
Professeur Kraemer et Mme Sainte-Catherine du laboratoire dOncologie Molculaire et
Cellulaire de luniversit de Paris XIII, a permis dtudier lactivit cytotoxique de ces
molcules sur des systmes biologiques. En parallle de nouvelles mthodologies dextraction
des polysaccharides impliquant des traitements physiques ont t exprimentes sans succs
avec pour objectif de limiter le recours des solvants polluants. Nous nous sommes alors
rorients vers ltablissement de nouveaux protocoles de dlignification, tape pralable
lextraction de nos polysaccharides dintrt. Dans un premier temps, je me suis appuye sur
ses connaissances en termes de biochimie pour dvelopper un protocole enzymatique,
protocole qui a ncessit la mise en place dun plan dexpriences afin doptimiser les
paramtres de raction. Les rsultats ntant pas la hauteur de nos esprances, jai poursuivi
ce travail par la synthse de composs tels les phtalocyanines et les porphyrines mimant
lactivit des enzymes prcdemment utilises mais moins sensibles la temprature et au

212

pH. Pour cela, je me suis appuye sur la solide exprience du Dr Vincent Sol pour la synthse
de ces molcules, utilises pour ltape de dlignification des sciures, quelle soit chimique ou
photochimique. Enfin, dans une dernire partie de ma thse, je me suis intresse aux
proprits antioxydantes des xylanes extraits selon les mthodologies innovantes dtailles
auparavant. Nayant pas toujours, les comptences, les savoir-faire et le matriel adquat
certaines spcialits, tels les tests biologiques in vitro ou lanalyse en masse des produits, ce
travail de thse a bnfici de collaborations avec diffrents partenaires rsumes dans le
tableau ci-dessous :

Laboratoire Participation
Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles (LCSN)
UPRES EA 1069, Limoges
Laboratoire d'accueil
Laboratoire d'Oncologie Molculaire et Cellulaire
EA 3410, Paris XIII
Tests biologiques in vitro sur une ligne cancreuse
RIO plateforme "Biopolymres-Intractions-Biologie
Structurale UR 1268, INRA de Nantes
Spectres de masse MALDI des oligosaccharides
Laboratoire de Chimie Structurale Organique et Biologique
CNRS UMR 7613, Paris VI
Spectres de masse des phtalocyanines et des porphyrines

Evaluation et prise en charge du cot du projet
Une valuation du cot de la thse a t faite en tenant compte des moyens en
personnel, (selon leurs catgories et en y incluant les charges sociales), en matriel achet
quil soit du consommable ou du matriel dinvestissement, les ventuelles prestations
extrieures et les cots dinfrastructure lis notamment au fonctionnement ou aux btiments
(Tableau). Pour tout cela, le cot de ma thse est estim prs de 100 000 euros, 70% tant
absorbs dans les ressources humaines. Le deuxime poste de dpense est lensemble des
consommables (solvants, produits) suivi de prs par les infrastructures et le gros matriel.
Lorigine des ressources provient de la rgion et du fond social europen pour ma bourse en
particulier mais aussi pour certains contrats de recherche obtenus par le laboratoire. Le
ministre de la Recherche, en payant les enseignants-chercheurs du laboratoire mais aussi par
des contrats est lautre principal contributeur pour la charge financire de ma thse. La
ralisation de ce travail destimation des cots et des charges ma permis de raliser quil
ntait pas si ais de prendre en compte tous les cots que ncessite un projet et que parmi ces
charges, les salaires sont ceux les plus importants.

213

Dtails
Nombre
d'units
Cot
unitaire
moyen
Quote-part
utilisation
Total
Ressources humaines Salaire brut Charges
Doctorant anne 1 1165 0 12 1165 1 13980
Doctorant anne 2 1254 0 12 1254 1 15048
Doctorant anne 3 (charges = 30% du salaire
brut)
1658,25 500 12 2158,25 1 25899
Encadrant 1 (charges = 40% du salaire brut) 3300 1320 36 166320 1/20 8316
Prime Encadrement 3360 3 3360 1/3 1120
Encadrant 2 (charges = 40% du salaire brut) 5200 2080 36 262080 1/50 5242
Prime Encadrement 6350 3 6350 1/8 794
Sous traitantes 500
Sous-total ressources humaines 70900
Consommables
Fournitures exprimentale
Dont verrerie 570
Dont solvants 370
Dont produits 6500
Dont bouteilles de gaz 700
Autres fournitures exprimentales 1600
Fournitures de bureau 30
Sous-total ressources consommables 9770
Infrastructures (entretien, loyer des locaux,
lectricit, eau , chauffage, secrtariat)
8800
Matriel (amortissements)
Matriel d'exprimentation 5500
Ordinateur de bureau et logiciel 1550
Sous-total ressources matriel 7050
Dplacements
Congrs en France 350
Congrs l'tranger 550
Sous-total ressources dplacements 900
Formation
1re anne 170
2me anne 110
3me anne 300
Sous-total ressources formation 580
Documentation et communication
Affranchissements, internet, tlphone 50
Communication impressions 150
Documentation (priodiques, livres) 30
Sous-total ressources Documentation et
communication
230
Total 98230


214

Comptences et savoir-faire

Au cours de ma thse, jai dvelopp de nombreuses expertises scientifiques lies mon
sujet de thse notamment sur lextraction, la valorisation et la modification de
polysaccharides. En termes de comptences techniques, la maitrise des techniques danalyses
des glucides, qui recourent la HPLC, la RMN, la spectromtrie de masse, l'IR, les dosages
colorimtriques et iodomtriques. Cependant ces techniques danalyse ne sont pas propres
mon domaine et peuvent tre valorises dans dautres contextes. En termes pratique, en plus
des techniques dextraction de biomolcules de plantes, je possde galement des bases de
synthse organique, mon sujet de thse tant pluridisciplinaire, au croisement de la chimie
organique, la biochimie et la biologie vgtale. Jai ainsi acquis des connaissances thoriques
et pratiques en phytochimie et en enzymologie, connaissances que je navais pas eu loccasion
dacqurir au cours de mon cursus universitaire.

Jai galement acquis une exprience pdagogique, sous la forme de vacations en
troisime anne de thse. Jai ainsi non seulement encadr des travaux pratiques pour des
tudiants de licence mais jai mis au point certains de ces TP avec laide dune technicienne.
Ce travail, ncessitant beaucoup de temps et de crativit a t trs formateur. Auprs des
tudiants, jai du apprendre expliquer et rexpliquer diffremment ainsi qu adapter ma
communication et parfois vulgariser pour mieux faire passer les informations. Ce fut
galement le cas lorsque jai eu encadrer des tudiants de Licence et de Master. Jai
particip la dfinition de leur sujet et de leurs objectifs atteindre, leur suivi jusqu la
soutenance et la correction de leur mmoire. Pour cela, des comptences pdagogiques ainsi
quune certaine autorit furent ncessaires.

Le projet de thse ma permis de dvelopper une certaine aisance loral que je
navais pas prcdemment. En effet dans la recherche la communication est trs importante et
au cours de leur thse, les doctorants sont amens prsenter leurs travaux oralement mais
aussi sous formes de posters lors de congrs nationaux ou internationaux comme cela fut mon
cas. Il peut sagir aussi darticles, alors rdigs en anglais, qui paraissent dans des revues
internationales. Un bon niveau danglais, des capacits de synthse et/ou vulgarisation et de
linguistiques sont alors requises lors de ces exercices.

En ce qui concerne le ct administratif, jai appris comment fonctionnait un
laboratoire, jai acquis aussi des connaissances dans la gestion des stocks qui ncessite de

215

lanticipation et de la concertation avec les autres membres du laboratoire au sujet des besoins
de chacun en consommables notamment. Pour linvestissement dans du gros matriel, jai
tablir des devis en faisant les meilleurs compromis entre le cot et les performances
souhaits pour les appareils voulus. Lors de problmes de dlais de livraison avec les
fournisseurs, il a fallu les contacter et ngocier avec eux, faisant appel des qualits de
diplomatie.

Dans le cadre de ma thse, jai eu travailler en quipe soit avec des personnes
extrieures au laboratoire ce qui ma permis de me crer un rseau professionnel (cf tableau
prsentant les diverses collaborations), soit avec des personnes du laboratoire. De plus, la
plupart des appareils dexprimentation sont uniques et le nombre de hottes est quant lui
limite mais plusieurs personnes en ont besoin et lutilisent pour leurs travaux. Pour que le
laboratoire fonctionne correctement, un minimum dorganisation est requis do la cration de
plannings o chacun sinscrit en fonction de ses besoins. Ainsi, jai parfois du faire preuve de
conciliation et de ngociation, soit pour cder un de mes crneaux soit pour en obtenir un de
quelquun dautre. Ayant de bonnes qualits relationnelles, jai pu sans problme mintgrer
au laboratoire.

Une autre comptence acquise pendant cette thse est la gestion du temps trs
importante lors du droulement de tout projet. Les premiers mois ont consist faire de la
bibliographie mais trs vite les exprimentations ont du commencer pour ne pas prendre de
retard. Tout au long du projet de thse, des objectifs de rsultats atteindre ont t chelonns
et pour cela jai du mimposer parfois un planning bien prcis. Le dfi le plus difficile tant de
rendre la thse dans les temps et que nous nous tions donns afin de pouvoir soutenir la thse
mi-juillet, ce qui a exig de ma part une grande capacit de travail et une adaptabilit de mes
horaires en fonction du travail effectuer.

Les formations dispenses par lcole doctorale ont permis dlargir mon champ de
comptences non scientifiques. Ainsi le module INECO ma permis de mieux me
familiariser avec le monde de lentreprise en comprenant son mode de fonctionnement et ses
mcanismes. La formation premiers secours ma permis dacqurir les gestes qui sauvent
lors de situations bien prcises et ma permis de minitier la prvention.
Dun point de vue plus personnel, jai pu au cours de ces trois annes dvelopper mes
autres qualits en plus de celles dj dtailles prcdemment, notamment de rigueur avec la
volont dutiliser un plan dexpriences qui permet de dfinir les paramtres qui ont le plus

216

dinfluence sur la raction pour les optimiser. Mes qualits de persvrance ont t mises
lpreuve pour surmonter les premires difficults et les checs rencontrs au cours de ce
projet. Mon autonomie ma permis de grer ma thse comme je le souhaitais en explorant des
domaines comme lenzymologie ou la synthse de porphyrines en tant que catalyseur. Dans le
cadre de ma thse, il ma fallu aussi runir des capacits danalyse pour interprter les
rsultats obtenus qui ntaient pas toujours ceux attendus. Enfin, lors de la rdaction du
mmoire, jai fait preuve de synthse et dorganisation pour pouvoir tablir un plan cohrent
qui puisse faciliter le travail des futurs rapporteurs. Ce doctorat ma permis aussi dacqurir
une certaine maturit, du professionnalisme et une meilleure confiance en moi et en mes
qualits.

Rsultats, impacts de la thse

Les recherches effectues au cours des ces trois annes de doctorat ont permis de
rendre compte de la complexit de la paroi cellulaire vgtale et des nombreux difficults
engendres. Moyennant quelques optimisations et amliorations lun des protocoles mis en
place au cours de ce travail pourrait tre expriment plus grande chelle. Les modifications
structurales des molcules extraites dcoulant de lutilisation de ces protocoles ouvrent
galement dautres voies de valorisation des co-produits de la filire bois. Enfin, les
proprits biologiques dcouvertes sur ces polysaccharides nous permettent denvisager des
applications plus long-terme en pharmacologie ou dans lindustrie cosmtique.

Concernant mes perspectives davenir, mon premier souhait serait de partir
ltranger afin deffectuer un stage post-doctoral, quil soit dailleurs sur les polysaccharides
ou sur une toute autre thmatique, me permettant dans ce cas prcis dlargir mon domaine de
comptence et dexpertise scientifique. Lors de ma thse, la vie dans un laboratoire ainsi que
la gestion dun projet de recherche en quipe mont confort dans mon choix de poursuivre
une carrire dans la recherche scientifique, quelle soit publique ou prive.




RESUME
Extraction, caractrisation chimique et valorisation biologique de glucuronoxylanes de
bois de chtaignier-Dveloppement de nouveaux procds de dlignification.

Les sciures de bois de chtaignier sont naturellement riches en polysaccharides dintrt
industriel parmi lesquels les xylanes. Lobtention de telles molcules ncessite cependant la
mise en uvre de traitements chimiques agressifs qui freinent leur valorisation grande
chelle. Dans un contexte de Chimie verte, diffrentes stratgies de dlignification chimique
et biochimique de sciure de bois de chtaignier et dextraction dans, et par leau, de xylanes
ont t dveloppes. La dlignification enzymatique par les laccases s'est avre dcevante
contrairement celle dveloppe partir de molcules ttrapyrroliques tels que les
phtalocyanines ou les porphyrines de fer en milieu peroxyd dont nos rsultats dmontrent
lintrt de la mise en uvre. La structure, ainsi que les proprits biologiques en oncologie
molculaire et cellulaire du 4-O-mthylglucuronoxylane de chtaignier ont par la suite t
caractrises, nous permettant de prciser une relation structure-activit.

Mots-cls : xylanes, hmicelluloses, extraction, structure, valorisation, lignines, enzymes,
phtalocyanine, porphyrine, proprits biologiques


SUMMARY
Extraction, chemical characterization and biological valorization of glucuronoxylans
from chestnut wood -Development of new delignification processes.

Chestnut sawdust is rich in polysaccharides of industrial interest, including xylans.
Experimental procedures for the extraction of these molecules usually make use of aggressive
chemical treatments that hamper their large scale valorization. In a context of Green
Chemistry, several chemical and biochemical delignification processes of chestnut sawdust
have been developed, followed by water-extraction of xylans. Enzymatic delignification by
laccases was found disappointing contrary to protocols taking advantage of radical reactions
generated by phthalocyanine or iron porphyrin in presence of hydrogen peroxide.
Characterization of the chemical structure along with studies of antitumoural properties led us
to find a structure-activity relationship for a 4-O-methylglucuronoxylan from chestnut tree.

Keywords: xylans, hemicelluloses, extraction, structure, valorization, lignins, enzymes,
phthalocyanine, porphyrin, biological properties