Optimizacin de medios y condiciones de cultivo para la produccin de quitinasa por el

recientemente aislado : Aeromonas sp.

Resumen:
Cincuenta cepas de diferentes microorganismos con la habilidad de degradar quitina fueron aislados
durante un programa de investigacin. Una de las mas potentes cepas aisladas (cepa jk1) fue
identificada como Aeromona sp y fue depositada en un cultivo de coleccin tipo persa (ptcc 1691). La
identificacin fue llevada a cabo usando propiedades morfolgicas y bioqumicas junto con un
anlisis de secuencia parcial de arn. Esta cepa fue capaz de producir altos niveles de quitinasa
extracelular en un medio conteniendo quitina como nica fuente de carbn. Los efectos de la
composicin del medio y los parmetros fsicos en la produccin de quitinasa por este organismo
fueron estudiados. Se encontr que el medio optimo contenia quitina coloidal 0.75%, sulfato de
amonio 0.15%cloruro de magnesio 7.5mM y triton x-100 0.2%.La mas alta producciond e enzima por
aeromona sp se obtuvo con un pH de 8, a 30 |C y despus de 48 horas de cultivo. Con respecto a la
alta produccin de quitinasa por esta cepa en un medio simple y con un tiempo relativamente corto,
esta cepa podra serun candidato elegible para la produccin de quitinasa a una escala industrial y
amerita una mayo investigacin de su estructura y caractersticas.
INTRODUCCIN:
La Quitina, que es el segundo biopolmero ms abundante en el planeta es un polmero lineal
insoluble -1 y N-acetil 1--D- glucosamina (Shahidi y abuzaytoun, 2005)
Est ampliamente distribuido en la naturaleza un componente estructural de los crustceos,
protozoos hongos e insectos. Quitinasas como las glicosil Hidrolasas que catalizan la degradacin
de la quitina. Estas enzimas tienen una amplia gama de aplicaciones biotecnolgicas Tales como la
preparacin de productos farmacuticamente importantes y N-acety1-D-glucosamina (Kuk et al; 2005
pichyangkura et al, 2002; sorbotten et al, 2005), el aislamiento de protoplastos a partir de hongos y
levaduras (dahiya et al, 2005) la preparacin de protena celular simple (Vyas y Deshpande, 1991), el
control de hongos patgenos (Mathivanan et al 1998) y tratamiento de residuos de quitina (Wang y
Hwang, 2001).
Quitinasas estn presentes en un amplio rango de organismos incluyendo virus, bacterias, hongos,
insectos, plantas superiores y animales y juega importantes roles fisiolgicos y ecolgicos( cody)
las quitinasas son constituyentes de varias especies de bacterias, algunos de los generos mas
conocidos son Aeromonas, Serratia, Vibrio, Streptomyces y Bacillus(cody..)Las bacterias producen
quitinasas principalmente para degradar quitina y utilizarla como fuente de energa. En adicion,
algunas quitinasas de bacterias quitinoliticas son agentes potenciales para el control biolgico de
enfermedades de plantas causadas por varios hongos fitopatogenicos (chernin et al 1997, Downing
and tomphon ,2000)
El presente estudio describe los resultados de nuestro programa de investigacin para el aislamiento
de microorganismos productores de altos nivels de quitinasa de fuentes ambientales.
MATERIALES Y METODOS
Este estudio se llev a cabo en 2005-2007 por Tehern y Mashhad Universidades de Ciencias
Mdicas, Ministerio de Salud y Educacin Mdica, en Irn.
La deteccin y el aislamiento en placas de agar quitina: Varias muestras de residuos de quitina
(por ejemplo, el camarn y el cangrejo de residuos shell), el suelo, los residuos industriales mariscos,
piscinas de produccin de camarn y el medio marino se recogieron aspticamente de diferentes
lugares del Irn. Proyeccin de los microorganismos quitinolticas se realiz en placas de soluciones
de muestra de varias muestras en la placa de agar quitina.
Medio de agar quitina placa preparacin se prepar mezclando 5 g de quitina coloidal como nica
fuente de carbono y 18 g de agar en medio sinttico M9 y el pH final se ajust a 6,5 0,2. Las placas
de quitina / agar se incubaron a 30 C y se examinaron para la formacin de zonas claras alrededor
de las colonias de hasta 10 das. El tamao de las zonas claras y tamao de colonia eran ambos
medidos y las colonias se transfirieron a tubos inclinados de agar quitina para estudios posteriores.
La seleccin primaria de la produccin de quitinasa: aquellas cepas que mostraron una relacin
de tamao de la zona / colonia mayor claro en la placa de ensayo en un tiempo ms corto se
seleccionaron y se inocul en medio lquido quitina. Los medios de fermentacin se incubaron en un
agitador incubador orbital a 30 C y 150 rpm. Las muestras de los cultivos microbianos se tomaron
cada 24 horas hasta 120 horas y se mantuvieron a -4 C para su posterior anlisis para la actividad
de las quitinasas.
Estudios taxonmicos: Caractersticas morfolgicas, fisiolgicas y bioqumicas de los
microorganismos quitinolticas fueron estudiados de acuerdo con el Manual Bergey's de
Bacteriologa Sistemtica.
Para identificar las bacterias a nivel del gen, se realiz la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)
para amplificar un gen parcial de 16S rRNA de las bacterias. Aislamiento de ADN genmico, la
amplificacin por PCR y secuenciacin de producto de PCR para el anlisis de 16S rRNA se llevaron
a cabo de acuerdo con Sambrook (1986) y Marchesi (1998). Una bsqueda de similitud de la
secuencia de nucletidos de rRNA 16 del aislado ensayo se llev a cabo utilizando una bsqueda
BLAST en el NCBI.
Preparacin de quitina coloidal: Quitina coloidal era de quitina purificada de acuerdo con el
mtodo de Roberts y Selitrennikoff (1988) con algunas modificaciones que se describen como sigue:
se aadieron 5 g de polvo de quitina lentamente en 90 ml de HCl concentrado con agitacin vigorosa
durante 2 h. La mezcla se aadi a 500 ml de etanol al 95% enfriado con hielo con agitacin
vigorosa durante 30 min y se mantuvo durante la noche a 25 C y despus se almacen a - 20 C
hasta su uso. Cuando en la necesidad el precipitado se recogi por centrifugacin y se lav con
tampn de fosfato sdico 0,1 M (pH 7) hasta que la quitina coloidal se volvi natural (pH 7) y se
utiliza para otras aplicaciones.


Ensayo de quitinasa: quitinasa actividad se ensay con quitina coloidal como sustrato. Solucin de
enzima (0,3 ml) se aadi a 0,3 ml de solucin de sustrato, que contena 1% de quitina coloidal en
un tampn de fosfato de sodio (100 mM, pH 8,0). La mezcla se incub a 37 C durante 45 min. El
azcar reductor liberado se midi por el mtodo DNSA (Miller, 1959) a 540 nm usando N-acetil-D-
glucosamina (GlcNAc) como estndar. Una unidad de actividad quitinasa se defini como la cantidad
de produccin de 1 mol de GlcNAc por hora bajo las condiciones de ensayo especificadas enzima.
Optimizacin de las condiciones de cultivo: Las condiciones de cultivo ptimas para la
produccin de quitinasa por Aeromonas sp. JK1 se llevaron a cabo manteniendo todo el constante
fbrica excepto el que se estudi. Los parmetros estudiados incluyen: (a) diferentes fuentes de
carbono y nitrgeno con sus diversas concentraciones (b) Efecto de agentes tensioactivos (c) efecto
de diversos iones metlicos (d) la temperatura de incubacin (e) pH inicial del medio y (f) perodo de
tiempo de fermentacin. Para cada parmetro de optimizacin, dos conjuntos de experimentos
independientes se realizaron y se reportan los valores medios.
Produccin de enzimas: El cultivo de la cepa para la produccin de quitinasa se llev a cabo en
medio lquido 25 ml en matraces de 100 ml durante 48 horas a 30 C en un agitador rotatorio (150
rpm).
Despus del crecimiento, el caldo de cultivo se centrifug a 8000 rpm durante 10 min y el
sobrenadante se utiliz para el ensayo de quitinasa. El crecimiento celular se midi por absorbancia
a 600 nm.

RESULTADOS:
Aislamiento del microorganismo: En un experimento de cribado primario, 200 colonias fueron
aisladas de 60 muestras diferentes, siendo capaz de usar un medio de agar que contiene quitina
coloidal. Cincuenta cepas del cual las colonias formaron zonas grandes y claras en el menor tiempo
se purificaron y se analiz la actividad quitinasa con mtodo DNSA despus del crecimiento en
medio lquido quitina. La mayora de las cepas ensayadas exhibieron (como uno de los
microorganismos con mayor capacidad de produccin de quitinasa) y se us para estudios
posteriores.
Identificacin de la cepa aislada: la cepa aislada JK1 se someti a anlisis taxonmico basado en
Manual de Bacteriologa Sistemtica de Bergey e identificado como una bacteria que pertenece al
gnero Aeromonas. El organismo fue Gram-negativa, con forma de barra, no espora y catalasa -
positiva (tabla 1). Adems el anlisis de la secuencia parcial del gen que codifica el ARNr 16S
confirm el aislado como Aeromonas sp. relacionada ms cercana a la Aeromonas sp. U351
reportado por Skrodenyte- Arbaciauskiene et.al. (2006). De acuerdo con estos resultados, esta
bacteria se identific como miembro de Aeromonas sp. La identificacin del microorganismo aislado
fue confirmada por The Persiansa Type Culture Collection (PTCC), Tehran, Irn, como Aeromonas
sp. y depositado como PTCC 1691. La secuencia 16S sRNA parcial de aislamiento se encuantra en
la base de datos GenBank bajo el nmero de acceso DQ985606.
Optimizacin de las condiciones de cultivo: El crecimiento se lleva a cabo en un medio sinttico
mnimo (M9) y complementado gradualmente con los diversos ingredientes que se investigaron. Los
parmetros optimizados anteriormente fuerons incorporado en experimentos posteriores.
Las fuentes de carbono: Los efectos de las diversas fuentes de carbono (5 g L
-1
), como diferentes
monosacridos, disacridos y polisacridos se probaron en presencia y ausencia de quitina en la
produccin de quitinasa.
En el matraz de control no se aadi la fuente de carbono, excepto quitina. Se encontr que la
quitina era la mejor fuente de carbono para la produccin de quitinasa. La adicin de quitina aument
la produccin de quitinasa despus de 24 horas. Se observ el pico mximo de actividad cerca 72h,
despus de que la quitinasa disminuy lentamente. Las fuentes de carbono en la presencia de 5 gL
-1

quitina no causaron ningn aumento de la produccin de quitinasa en comparacin con el control.
Para optimizar la concentracin de quitina (como la fuente principal de carbono), se utilizaron
diferentes concentraciones (1,25 a 30 gL
-1
) en el medio de produccin y la mxima produccin de
quitinasa por Aeromonas sp. JK1 se encontr en un medio con 7,5 gL-1 quitina (Fig. 1).
Tabla1: Caracterstica morfolgica, fisiolgica y bioqumica de JK1





Las fuentes de nitrgeno: Para seleccionar la mejor fuente de nitrgeno, el medio quitina se
complement con diferentes fuentes de nitrgeno inorgnico (0.5 g L
-1
) y orgnico (1 g L
-1
). Entre las
diversas fuentes de nitrgeno en el medio basal, sulfato de amonio y peptona fueron los aditivos ms
eficaces resultantes en el incremento de la produccin de la enzima (. Fig 2). Sin embargo, en el
caso de extracto de carne, polvo de soja, gelatina, nitrato de amonio, fosfato de amonio y acetato de
amonio, la produccin de quitinasa fue reprimida de 15 a 60%. El sulfato de amonio y peptona dieron
aumento de casi 15% en la productividad quitinasa. El sulfato de amonio fue elegido como la fuente
de nitrgeno ms simple y ms barata para la preparacin de la prxima medios de comunicacin.
Para evaluar el efecto de sulfato de amonio, se aadieron diferentes concentraciones de medio de
produccin (0,25 a 3 g L
-1
). La produccin de quitinasa mxima por Aeromonas sp. JDK se encontr
en los medios con 1.5 (g L
-1
) no fueron llamativas las variaciones en la cantidad de enzima producida
(Fig. 3).


Figura 1. Efecto de diferentes concentraciones de quitina sobre la
produccin de quitinasa por Aeromonas sp. JK1
Figura 2. Efectos de las fuentes de nitrgeno inorgnicas y orgnicas en quitinasa por
Aeromonas sp. JK1. Medio de control contena cloruro de amonio en lugar de fuentes de
nitrgeno










Efecto de agentes tensioactivos: Para investigar el efecto de diversos agentes tensioactivos sobre
la produccin de quitinasa, el medio se suplement con 0,1% (v / v) de Triton X-100, Tween 80,
Tween 65 y Tween 20 Los resultados mostraron que Triton X-100 tuvo el mejor efecto sobre la
produccin de quitinasa (fig. 4). La adicin de Tween 80 dio lugar a un ligero aumento en la
produccin de quitinasa, mientras que se encontr otros tensioactivos para inhibir la produccin de
quitinasa. Otros estudios demostraron que la produccin mxima quitinasa por Aeromonas sp. JKI se
logr en medios con 0,2% (v / v) de Triton X-100.











Efecto de diversos iones metlicos: El efecto de diversos iones metlicos en la produccin de
quitinasa por Aeromonas sp. JKI fue investigado suplementando el medio con 5 mM de los
respectivos cationes. Los resultados mostraron que la produccin de quitinasa fue la ms afectada
por la adicin de Mg
2+
y Mn
2+
, donde la produccin de la enzima era de aproximadamente 60 y 54%
Figura 3. Efectos de diferentes concentraciones de sulfato de amonio en la
produccin de quitinasa por Aeromonas sp. JK1.
Figura 4. Efectos de detergentes no inicos sobre la produccin de quitinasa por
Aeromonas sp. JK1.
mayor que la de control, respectivamente (Fig. 5). La adicin de Ca
2+
y Cs
+
dio como resultado un
ligero aumento en la produccin de quitinasa, mientras que se encontraron otros iones para inhibir la
produccin de la enzima de 20 a 100%. Cuando se estudi an ms el efecto de la concentracin de
Mg
2+
, se encontr que la concentracin ptima de MgCl
2
para la produccin de quitinasa por
Aeromonas sp. JKI fue de 7,5 Mm.


pH y temperatura: El pH ptimo y la temperatura para la produccin de quitinasa se determinaron
en el medio ptimo variando el pH de la temperatura del medio y la incubacin. Los resultados
indicaron que la actividad quitinasa extracelular comenz a pH 5 y alcanz su nivel mximo a pH 8
(Fig.6).













Aunque, Aeromonas sp. JKI era muy sensible a pH cido y la produccin de la enzima a pH cido
fue muy bajo, la capacidad de Aeromonas sp. JKI para producir quitinasa en una amplia gama de
pH, especialmente en pH alcalino, era relativamente alta. La produccin de quitinasa a pH 6 y 10 fue
de 60% y 80% del pH optimizado. Aeromonas sp. JKI dio mayor rendimiento de quitinasa a 30C. El
rendimiento aislado de quitinasa a esta temperatura era ms de dos veces mayor que a 37 C y
18% ms de 25 C (datos no mostrados).



Figura 5. Efectos de los diferentes metlicos iones sobre la produccin de
quitinasa por Aeromonas sp. JK1.
Figura 6. Efectos del pH sobre la produccin de quitinasa por Aeromonas sp.
JK1. El pH del medio se ajust antes de la produccin de cultivo


Crecimiento celular y produccin de quitinasa: La produccin de quitinasa extracelular se
monitoriz durante el crecimiento de Aeromonas sp. KJI (. Fig 7). El organismo inici la produccin
de la enzima a las 12 h de incubacin y produjo el mximo de enzima a 48 h y alcanz su fase
estacionaria de crecimiento despus de 48 h. Este resultado indic que la produccin de quitinasa
comenz desde el principio de la fase logartmica y aument linealmente con el crecimiento de hasta
48 h.






















Figura 7. La produccin total de quitinasa y el crecimiento celular por
Aeromonas sp. JK1.
DISCUSION

La produccin microbiana de quitinasa ha capturado la atencin mundial de los entornos industriales y
cientficos, no slo debido a su amplio espectro de aplicaciones de mtodo. En este estudio de un
microorganismo productor de quitinasa, se aisl de los residuos de cscaras de gambas, muestra recogida del
rea local de Poonel, provincia de Gilan en el norte de Irn. Estudios taxonmicos mostraron que la cepa JK1
perteneca al gnero Aeromonas.
Aeromonas sp. Se ha reportado y estudiado (Chang et al, 2004;.. Guo et al, 2004;. Huang et al, 1996;. Kojima
et al, 2005). Adems de otras especies de Aeromonas reportados en la literatura, se han aislado localmente
Aeromonas sp. JK1, encontrado por tener un buen potencial quitinoltico, como se desprende de su
crecimiento y la hidrlisis de la quitina en agar coloidal. La relacin de la zona de la hidrlisis de la quitina con
el dimetro de la colonia fue alta, lo que indica una mejor capacidad de difusin de las enzimas quitinolticas.
El estudio de los diversos factores que influyen en la produccin de quitinasa por Aeromonas sp. JK1 revel
que la quitina era el mejor momento para la adicin de quitina, para la induccin de la produccin de quitinasa
era en el momento de inicio del cultivo (datos no mostrados). Estos resultados indicaron que la quitinasa es
una enzima inducible. La misma observacin se inform para Aeromonas schubertii (Guo et al., 2004),
Microbispora sp., (Nawani et al., 2002), losoxydans xy Alcaligenes (Vaidya et al., 2001) y Aspergillus
fumigatus NCPF 2140 (Escott et al., 1998). De acuerdo con los resultados obtenidos la adicin de glucosa al
medio de produccin de quitinasa reprimi la quitina y los mismos resultados fue reportado por Miyashita et al.
(1991). En contraste, un efecto de mejora de la glucosa sobre la produccin de quitinasa se observ por
Bhushan (1998) cuando se utiliz glucosa con quitina en medio de produccin.

En cuanto a los efectos de diversas fuentes de nitrgeno, los resultados mostraron que el sulfato de amonio
(0,15% w / v) fue la fuente de nitrgeno ms favorable para la produccin de quitinasa, mientras que otras
sales de amonio tuvieron un efecto represivo. Los resultados del presente estudio son compatibles con los
informes anteriores (Rattanakit et al., 2002) donde entre el nitrgeno, fuentes agregaron al medio basal sulfato
de amonio, esto fue ms eficaz en el aumento de la cantidad de producciones de quitinasa por Aspergillus sp.
SI - 13 mientras que peptona, extracto de levadura y urea tuvo un efecto represivo. Con el uso de la
composicin optima del cultivo, los efectos del pH, temperatura y tiempo de cultivos en las producciones de
quitinasa tambin se investig que la produccin inicial de quitinasa mxima alcanz un pH 8 a 30 C. Se
est de acuerdo con el productor de quitinasa Aeromonas sp. GJ - 18 segn lo informado por Kuk et al. (2005)
con la mxima produccin de quitinasa a 30 C. El pH del medio de fermentacin aument progresivamente
durante desde el valor inicial hasta el pH ptimo 8 (datos no mostrados), probablemente debido a la
catabolismo de NAG liberado por la hidrlisis de quitina (forraje et al, 1985;.. Wan et al, 1979). Adems, el
efecto del tiempo de cultivo en la produccin de quitinasa se investig mediante el control de la actividad
enzimtica cada 24 h hasta 5 das. El tiempo de incubacin a alcanzar producciones mximas de quitinasa se
redujo de 72 h en el medio inicial a 48 h, en un conjunto de datos mejorados (ptima) medianas (no se
muestra). Wang y Hwang (2001) informaron de la produccin de quitinasa de Bacillus cereus, B. alvei y B.
sphaericus estaban ms alto en 2 das mientras Sandhya et al. (2005) informaron de mxima produccin
desde quitinasa por Trichoderma harzianum en 72h.
Con respecto a presentar los resultados y la comparacin con nuestro mejor saber cornisa sobre otros
productores de quitinasa, este aislamiento tiene capacidad para la produccin de quitinasa a una escala
industrial. Este microorganismo puede ser til para el tratamiento de residuos quitinosos y tambin para la
produccin de diferentes productos de quitina hidrolizada para el nivel de diversas aplicaciones y
caractersticas estructurales de la enzima quitinasa este aislado en el futuro.