COLORAO DE GRAM

MTODO DE COLORAO DE GRAM

1) Interpretao
O mecanismo da colorao de Gram se refere composio da parede celular,
sendo que as Gram-positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicano e
cido teicico, e as Gram-negativas, uma fina camada de peptideoglicano, sobre a
qual se encontra uma camada composta por lipoprotenas, fosfolipdeos, protenas e
lipopolissacardeos. Durante o processo de colorao, o tratamento com lcool-
acetona extrai os lipdeos, da resultando uma porosidade ou permeabilidade
aumentada da parede celular das bactrias Gram-negativas.
Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CVI) pode ser retirado e as bactrias Gram-
negativas so descoradas. A parede celular das bactrias gram-positivas, em virtude
de sua composio diferente, torna-se desidratada durante o tratamento com lcool-
acetona, a porosidade diminui, a permeabilidade reduzida e o complexo CVI no
pode ser extrado.
Outra explicao baseia-se tambm em diferenas de permeabilidade entre os dois
grupos de bactrias. Nas Gram-positivas, o complexo CVI retido na parede aps
tratamento pelo lcool-acetona, o que causa, provavelmente, uma diminuio do
dimetro dos poros da camada de glicopeptdeo ou peptideoglicano da parede celular.
A parede das bactrias Gram-negativas permanece com porosidade suficientemente
grande, mesmo depois do tratamento com lcool acetona, possibilitando a extrao do
complexo CV-l.

3) Procedimentos:
a- Preparar esfregaos a partir de culturas puras de Escherichia coli, Staphylococcus
aureus e Serratia marcescens.
b- Corar os esfregaos pelo mtodo de colorao de Gram.
c- Observar ao microscpio ptico, sob imerso e identificar a morfologia
deste microrganismos e sua reao frente ao mtodo de Gram.

4) Preparo do esfregao:
a- Pegar uma lmina limpa no recipiente, secar e flambar rapidamente na chama do
bico de Bunsen;
b- Identificar o lado da lmina onde ser feito o esfregao;
c- Flambar a ala bacteriolgica deix-la esfriar e colocar na lmina uma gota
de soluo salina fisiolgica;
d- Flambar a agulha bacteriolgica, deixar esfriar prximo a chama, abrir a placa com
a cultura teste e tocar a colnia escolhida para retirada da amostra,
e- Esfregar o material com movimentos de rotao da ala bacteriolgica, para se
obter um esfregao de forma oval, bem fino e uniforme;
f- Deixar secar nas proximidades da chama;
g- Fixar o esfregao passando a lmina (lado oposto ao esfregao) 5 vezes na
chama do bico de Bunsen (rapidamente).

5) Mtodo de Colorao de Gram:
1) Cobrir toda a lmina com soluo cristal violeta (corante roxo), aguardar um
minuto;
2) Lavar rapidamente em gua destilada;
3) Cobrir a lmina com soluo de Iugol (mordente) por um minuto;
4) Lavar em gua destilada;
5), Inclinar a lmina e gotejar lcool-acetona ou lcool absoluto (cerca
de 15 segundos). Lavar a lmina rapidamente em gua corrente;
6) Cobrir com fucsina de gram e aguardar 30 segundos;
7) Lavar a lmina em gua destilada e secar (sem esfregar);
8) Colocar uma gota de leo de cedro sobre a lmina e observar em objetiva de
imerso (IOOX).

RESULTADO: bactrias Gram-positivas: roxo
bactrias Gram-negativas: rosa/vermelho


6) Observaes:
O descoramento para mais ou para menos resultante da incorreta diferenciao pelo
lcool-acetona.
A idade da cultura bacteriana tem Importncia fundamental na colorao de Gram. Em
culturas envelhecidas, clulas. Gram-positivas freqentemente se tomam Gram-negativas.
Se houver um questionamento acerca da Gram-positividade ou da Gram-negatividade da
cultura, uma colorao de Gram paralela aconselhvel. Para isto, deve-se usar culturas
bacterianas conhecidas como Gram-positivas, tal como Staphylococcus aureus e Gram-
negativas, tal como Escherichia coli, como controles.


7) Resumo
Solues em ordem de
aplicao
Reao do aspecto das
bactrias Gram-positivas
Reao do aspecto das
bactrias Gram-negativas
Cristal violeta Coradas em violeta Coradas em violeta
Soluo de Iugol
Formao do complexo CV-I no
interior da clula, que
permanece violeta
Formao do complexo CV-I no
interior da clula, que
permanece violeta
lcool-acetona
Desidratao da parede
celular, diminuio da
porosidade e da
permeabilidade; o
complexo CV-I no pode sair
da clula, que permanece
violeta
Extrao dos lipdeos da parede
celular, aumento da porosidade;
o complexo CV-I removido da
clula
Fucsina ou safranina
A clula no afetada,
permanece violeta
A clula adquire o corante,
tornando-se vermelha