60 Revista Biotecnologia Cincia e Desenvolvimento - Edio n 30 - janeiro/junho 2003

Pesquisa
Degradao Seletiva
de Protenas e suas
Implicaes no Cncer
Humberto Miguel Garay
Aluno de Doutorado do Programa de Farmacologia
do Instituto de Cincias Biomdicas - USP
Juliano Alves
Aluno de Doutorado do Programa de Farmacologia
do Instituto de Cincias Biomdicas - USP
Joo Marcelo Ochiucci
Aluno de Iniciao Cientfica do Depto. de
Farmacologia do Instituto de Cincias Biomdicas - USP
Jos Ernesto Belizrio
Professor Assistente do Depto. de Farmacologia
do Instituto de Cincias Biomdicas - USP
jebeliza@usp.br
Ilustraes cedidas pelos autores
Papel do sistema ubiquitina-proteasoma e enzimas caspases
As protenas so responsveis
pela forma e pela funo das clulas.
Elas so sintetizadas e destrudas por
mecanismos distintos em resposta a
uma diversidade de sinais externos e
internos, que incluem a secreo de
hormnios e a restrio alimentar. A
degradao de protenas determina o
incio ou o trmino de eventos bio-
qumicos que controlam a prolifera-
o, a diferenciao e a morte celular
por apoptose. Por esse motivo, o
aumento de suscetibilidade ou de
resistncia degradao pode levar
ao ganho ou perda de atividade
biolgica de protenas, influencian-
do diretamente nos processos que
elas esto envolvidas. Os cientistas j
identificaram dezenas de protenas
que se tornaram oncognicas (isto :
provocaram a transformao celular)
aps sofrerem modificaes em se-
qncias, domnios e regies que
controlam a sua estabilidade ou des-
truio. Elucidar os mecanismos
moleculares pelos quais as protenas
aumentam sua suscetibilidade ou sua
resistncia degradao o grande
desafio da biologia contempornea
ps-genoma. As pesquisas nessa rea
tm por objetivo no apenas enten-
der como as protenas so destrudas,
mas quando falhas nesse processo
do origem a clulas imortais, isto ,
ao cncer. Neste artigo sero revisa-
dos, primeiramente, os recentes avan-
os na elucidao das bases bioqu-
micas e genticas que so envolvidas
na transformao de uma clula nor-
mal em clula tumoral. Em seguida,
sero revisadas as recentes desco-
bertas sobre os mecanismos bioqu-
micos de reconhecimento e de de-
gradao de protenas intracelulares
pela via ubiquitina-proteasoma e a
importncia dos aminocidos prolina,
cido glutmico, serina e treonina
(regio PEST) como sinais para de-
gradao rpida de certas protenas.
Finalmente, ser discutida a utiliza-
o de bancos de dados de genoma
humano e de proteoma - em constru-
o, e como os programas de compu-
tador para armazenamento, manipu-
lao e minerao de seqncia de
genes provenientes de amostras de
tecido tumoral, podero ajudar os
cientistas, principalmente os bioin-
formatas, na descoberta de novos
oncogenes e mtodos de preveno
e tratamento do cncer.
1. Biologia da Clula
Tumoral
Nas ltimas dcadas, com a in-
troduo de novas tecnologias de
seqenciamento do DNA, expresso
e anlise computacional de genes, foi
possvel que se vislumbrassem vrias
pistas que podero levar a um me-
lhor entendimento da biologia da
clula tumoral. O cncer considera-
do uma doena gentica - isto , ele
pode ser transmitido para uma clula
normal atravs da transferncia de
genes tumorais ou oncogenes (Hahn
& Weinberg, 2002). Oncogenes so
cpias de genes normais que sofre-
ram mutaes, e dessa forma, quan-
do transcritos, provocam a sntese de
protenas que apresentam perda ou
ganho de funo biolgica. Mutaes
so causadas por modificaes nas
bases de DNA, em particular, nas
posies O6 e N7 da guanina. A
carcinognese um processo que
pode ser dividido em trs fases: inici-
ao, promoo e progresso, e pode
durar de 1 a 30 anos. Durante esse
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tempo, ocorre um acmulo de muta-
es no genoma celular, em especial,
em genes que garantem a ordem dos
eventos do ciclo celular e a mitose,
ou executam reparo de eventuais
erros na replicao do DNA, ou ain-
da, que promovem e mantm o esta-
do de diferenciao celular (Hanaham
& Weinberg, 2000, Hahn & Weinberg,
2002).
Na maioria dos casos, os
oncogenes capazes de induzir a trans-
formao celular funcionam aos pa-
res, e seus produtos so fatores de
crescimento, receptores da mem-
brana plasmtica, fatores de trans-
crio e enzimas quinases de vias de
sinalizao intracelular implicadas
no controle positivo ou negativo do
ciclo celular (Hanaham & Weinberg,
2000, Evan & Vousden, 2001). Em
geral, as mutaes encontradas em
oncogenes alteram os nucleotdeos,
os quais codificam os aminocidos
de importncia crtica para sua ati-
vao ou o arranjo tridimensional
da sua estrutura molecular. A defor-
mao de elementos estruturais im-
pede que a protena estabelea
interaes protena-protena e pro-
tena-DNA e, conseqentemente,
exera adequadamente a sua funo
biolgica. Por exemplo, formas
mutantes da protena RAS permane-
cem constantemente ativadas devi-
do substituio de um aminocido
indispensvel na interao RAS-GAP.
GAP uma protena que estimula a
hidrlise de GTP, uma molcula que
ativa RAS. A estimulao contnua
da cascata de enzimas serina-
treonina-quinases: Raf-MEK-ERK-
MAPK, induzida pela forma mutante
de RAS, faz com que os eventos
bioqumicos de controle positivo do
ciclo celular tornem-se constantes e
a proliferao celular ininterrupta
(Hahn & Weinberg, 2002).
Por outro lado, as delees de
xons em genes, ou ainda, o seu
silenciamento (metilao das bases
nitrogenadas), so ocorrncias co-
muns em genes que codificam os
fatores supressores de tumor que
atuam no controle negativo do ciclo
celular. Nesse caso, a desregulao
de crescimento e diviso celular
acontece porque a clula deixa de
checar os erros e as falhas que pro-
vocariam bloqueio no ciclo celular,
reparo no DNA e induo de morte
celular por apoptose. O exemplo
mais estudado o gene que codifica
o fator supressor de tumores chama-
do p53, cuja funo principal a
transcrio de genes de reparo e da
apoptose (Hanahan & Weinberg,
2000, Evan & Vousden, 2001).
Recentemente houve uma ex-
ploso de trabalhos que mostraram
vias alternativas de estimulao da
proliferao celular e induo de cn-
cer. Os novos oncogenes identifica-
dos tm papel no reparo do DNA,
apoptose, reconhecimento clula-c-
lula, mecanismo de adeso clula-
matriz extracelular, angiognese,
metstase e degradao de prote-
nas. O que chamou maior ateno
dos investigadores foi a descoberta
que para a tranformao de clulas
humanas necessrio ativao de
telomerase, o que causa a sua
imortalilzao, e a inativao das vias
do p53 e RB (Hahn & Weinberg,
2002).
2. O Ciclo Celular
O crescimento e a diviso celu-
lar de clulas somticas dependem
de uma srie complexa de reaes
bioqumicas que ocorrem em um
perodo de 24 a 48 horas, denomina-
do ciclo celular. O ciclo celular com-
preende os processos de duplicao
do DNA e diviso nuclear (mitose), e
dele resulta a produo de uma nova
clula. Para iniciar um ciclo, a clula
em repouso (fase Go) precisa ser
estimulada por fatores de crescimen-
to (exemplos, PDGF, EGF, insulina),
hormnios esterides e citocinas pro-
duzidas por elas mesmas ou clulas
ao seu redor. Esses fatores ligam-se
aos seus receptores de membrana,
deflagrando uma srie de reaes
qumicas que causam, em ltima ins-
tncia, a ativao de fatores de trans-
crio (exemplos: c-myc, c-jun, c-
fos), os quais promovem a sntese de
RNA, mensageiros de dezenas de
enzimas que promovem a sntese do
cido deoxiribonuclico (DNA), tais
como diidrofolato redutase, DNA
polimerases e topoisomerases. Essa
cascata de eventos qumicos e morfo-
lgicos ocorre de uma maneira orde-
nada e sucessiva, fazendo com que a
clula avance da fase Go para as
fases G1-S-G2 e para a mitose
(Malumbres & Barbacid, 2001).
A execuo das reaes e dos
eventos de cada fase do ciclo celular
mediada por dezenas de fatores,
cuja sntese e destruio ocorrem em
momentos determinados. Os princi-
pais so os seguintes: ciclinas A, B e
D, enzimas quinases dependentes de
ciclinas: CDK-1, 2, 4 e 6, fosfatases:
cdc-25 A, B e C, protenas inibidoras
de CDKs: p21, p27, p57, p16, p18, e
fatores de transcrio: c-myc, E2F, Rb
e p53. Os complexos formados por
CDK/ciclina/inibidor de CDK so ina-
tivos e a sua ativao requer elimina-
o, por degradao, do inibidor de
CDK associado a ele (por exemplo:
p21, p27), um evento que ocorre
durante as transies de fases. A
ativao dos complexos CDK-4/
ciclina D, CDK-4/ciclina-6, CDK-2/
ciclina A, CDK-2/ciclina E aumenta a
atividade quinase dessas enzimas e
provoca a fosforilao progressiva de
RB. Isto causa a dissociao do com-
plexo E2F/RB, permitindo que E2F
inicie a transcrio de genes da fase
S. Mais tarde, a ativao do complexo
CDK-1/ciclina B promove a fosforila-
o de vrias protenas nucleares, a
condensao dos cromossomas, a
formao do fuso e o incio da mitose.
A atividade enzimtica do complexo
cessa aps a degradao da ciclina B,
e esse evento marca o fim do ciclo
celular (Malumbres & Barbacid, 2001).
(Figura 1)
As reaes e eventos do ciclo
celular so interrompidos em mo-
mentos especficos nas transies das
fases Go/G1 (ponto de restrio R1),
fases G1/S e G2/mitose. Durante es-
ses perodos crticos denominados
pontos de checagem, a clula deci-
de se inicia o ciclo (ponto de restri-
o R1) ou se avana para a fase
seguinte, continuando o processo de
proliferao, ou se sai do ciclo, inici-
ando o processo de diferenciao
celular, se estiver passando pela
mitose, ou ainda, entra em apoptose.
Esse mecanismo de checagem
dependente de reaes em cascatas
mediada por enzimas quinases e
fosfatases. Os exemplos mais estuda-
dos de vias de checagem e de reparo
so: a via ATM, a via Chk1/Chk2 e a
via cdc-25/14-3-3. Em resposta
ativao de uma dessas vias, so
sintetizadas as enzimas que fazem
reparo, recombinao, juno ou per-
mutao de nucleotdeos e que esto
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envolvidas nos processos de reco-
nhecimento e de correo de erros e
falhas no DNA em sntese. So exem-
plos importantes a GADD45, poli-
(ADP-ribose) polimerase (PARP),
MSH2 e MLH1. Na maioria das vezes,
a ativao das vias de checagem
iniciada pelo fator supressor de tu-
mores p53, que atua na transcrio
de dezenas de genes, inclundo o
gene da protena p21. A p21 bloqueia
o ciclo celular e inibe a atividade de
enzimas CDKs, que so responsveis
pelo controle positivo do ciclo celu-
lar. O bloqueio do ciclo celular
transiente e precisamente regulado
(Malumbres & Barbacid, 2001,
Hoeijmakers, 2001, Hahn & Weinberg,
2002).
Estudos recentes mostraram que
a degradao de vrias protenas re-
guladoras do ciclo celular, em espe-
cial as protenas p21, p27, ciclinas A
e B, Rb, E2F, MDM2 e p53, mediada
pelo sistema ubiquitina-proteasoma,
caso a deciso seja a proliferao
celular; e pela famlia caspase de
enzimas proteases, caso a deciso
seja a apoptose. Como era lgico
pressupor, esse mecanismo de
regulao mostrou tambm que pode
ser alterado em clulas neoplsicas
para impedir a deflagrao dos sinais
que ativam a apoptose. Vrios exem-
plos sero apresentados nesse texto
em favor dessa hiptese.
3. A morte celular por
apoptose
A morte celular programada ou
apoptose um processo fisiolgico
de morte celular pelos quais as clu-
las que perderam suas funes ou
apresentam defeitos so eliminadas
do organismo. Durante a embriog-
nese, a morte por apoptose de clu-
las embrionrias precursoras es-
sencial para o acabamento final de
rgos e membros. Alm disso, a
apoptose atua na seleo e depleo
de clones de clulas do sistema
imunolgico e de clulas em exces-
so, deixando em perfeito equilbrio
as populaes de clulas dos tecidos
durante a vida adulta dos mamferos
(Earnshaw et al., 1999). Desta forma,
esto implicadas em muitas doenas
aberraes genticas que alteram o
processo da apoptose, incluindo-se
a o cncer, as doenas auto-imunes,
doenas cardiovasculares e neuro-
degenerativas.
Vrios oncogenes que causam,
em clulas malignas, desregulao
no seu ciclo celular atuam ora esti-
mulando, ora inibindo a apoptose,
dependendo do estgio de desenvol-
vimento do tumor (Evan & Vousden,
2001). Mutaes oncognicas, que
levam ao aumento da expresso dos
genes c-myc, E2F, E1A (protena viral)
e Ras, ou perda da expresso do
gene Rb, desencadeiam a apoptose.
Mas esse fenmeno no aparente
em populaes de clulas malignas
porque elas contm mutaes que
inativam os oncogenes p53 e MDM2,
ou mutaes que aumentem a ex-
presso de genes Bcl-2, ou ainda,
mutaes que acarretem a produo
excessiva dos fatores de crescimen-
to: IGF-1, PDGF, NGF e IL-3. A liga-
o desses fatores de crescimento
aos seus receptores provoca a ativa-
o da cascata de enzimas, quinases,
entre elas, a fosfoinositol-3-quinase
(IP3), Ras, Raf e a protena serina-
treonina quinase B/Akt, como tam-
bm a do fator de transcrio NF-kB.
Esses fatores atuam em reaes ou
vias de sobrevivncia e resistncia
apoptose (Evan & Vousden, 2001).
Em vrios estudos ficou eviden-
ciado que as clulas, quando enfren-
tam situaes fisiolgicas e patolgi-
cas adversas, tais como, infeco por
microorganismos, estresse oxidativo
e outras formas moderadas de inj-
ria, somente permanecem vivas se os
efeitos pr-apoptticos gerados nes-
sas situaes forem contrabalancea-
dos pelos efeitos anti-apoptticos,
mediados pelas vias de sobrevivn-
cia. Esse mecanismo de sinalizao
dual exerce um papel chave no con-
trole da proliferao e morte celular
(Evan & Littlewood, 1998). Assim,
para o processo de proliferao ter
sucesso, preciso que a clula ative
as duas vias de sinalizao: a de
sobrevivncia, que atua suprimindo
a maquinaria da apoptose, e a de
proliferao, que desencadeia o cres-
cimento celular. Esta intercomunica-
Figura 1 - Esquema representativo mostrando as interaes entre as protenas das vias
de sinalizao de controle positivo e negativo do ciclo celular. Notar no esquema que
durante as transies (pontos de checagem) das fases Go, G1, S, G2 e Mitose, a ativao
destas protenas reguladoras dependente da fosforilao/defosforilao mediada por
enzimas quinases e fosfatases, enquanto a inativao mediada pelo sistema
proteasoma que degradada seletivamente protenas marcadas com ubiquitina.
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o entre ciclo celular e a apoptose
sem dvida o fator determinante nas
variaes de sensibilidade apopto-
se entre as clulas tumorais. Este
suposto sistema regulador tem servi-
do como base estrutural para unir a
gentica e a terapia do cncer.
A apoptose caracterizada por
eventos morfolgicos e bioqumicos
que ocorrem de uma forma ordenada
na clula em degenerao. Esses even-
tos so regulados por genes preser-
vados em vrios organismos, inclu-
das leveduras, parasitas, plantas e
insetos. Mais de 200 genes j foram
identificados e classificados com base
em domnios especficos, como exem-
plos: DED, DD e CARD (Aravind &
Koonin, 2001). Essas seqncias con-
servadas de aminocidos esto rela-
cionadas com a funo especfica
que a protena exerce no processo,
como, por exemplo: ligante, recep-
tor, adaptador, inibidor, protease,
quinase, etc. Os estudos de cristalo-
grafia, ressonncia magntica nucle-
ar e difrao de raios X tm mostrado
em detalhe como os complexos pa-
dres de interao entre essas prote-
nas, atravs de seus diferentes dom-
nios, atuam nas vias de sinalizao
positiva e negativa da apoptose (Fesik,
2000).
A apoptose desencadeada por
duas vias principais. Na primeira via,
o sinal vem do lado externo e por isso
denominada via extrnseca. Na se-
gunda, o sinal vem de dentro da
clula, e por isso denominada via
intrnseca. A via extrnseca iniciada
atravs da ativao de receptores de
membrana, denominados receptores
de morte celular. A via intrnseca
iniciada pela liberao de fatores
mitocondriais. Em ambos os casos, o
resultado imediato a ativao de
enzimas proteases da famlia caspase
(Figura 2).
As caspases so expressas na
forma de pr-enzimas (ou zimgeno)
e podem ter uma massa molecular
entre 30-60 kDa. A clivagem desse
precursor ocorre pela ao de uma
caspase iniciadora, que cliva a prote-
na em duas regies especficas, para
gerar uma subunidade grande de 20
kDa (cadeia externa) e uma peque-
na de 10 kDa (cadeia interna). A
forma ativa da enzima possui duas
subunidades grandes e duas peque-
nas, i.e., um tetrmero
1

2
, en-
tre as quais formam-se os dois stios
ativos da enzima (Earnshaw et al.,
1999).
As caspases foram divididas em
trs grupos com base na funo que
elas exercem no processo. No grupo
I, esto includas as caspases pr-
inflamatrias: caspases -1, -4, -5 e -
13, envolvidas no processamento e
na gerao das citocinas IL-1 e IL-18.
No grupo II, as caspases iniciadoras:
-2, -8, -9 e -10, atuam na iniciao da
cascata de ativao das caspases exe-
cutoras -3, -6 e -7. Essas caspases
fazem parte do grupo III e so res-
ponsveis pela clivagem de dezenas
de protenas vitais ao metabolismo e
estrutura da clula (Earnshaw et al.,
1999).
As caspases tambm foram clas-
sificadas em relao especificidade
na clivagem de peptdeos sintticos
em testes in vitro (Thornberry et al.,
1997, Garcia-Calvo et al., 1998). Se-
gundo esses estudos, o grupo I
formado pelas caspases -1, -4 e -5,
que so as enzimas que tm prefe-
rncia pela seqncia WEHD. O
peptdeo DExD reconhecido pelas
caspases -3, -7 e -2, os principais
membros do grupo II. O grupo III
formado pelas caspases -6, -8 e -9,
enzimas que clivam preferencialmen-
te peptdeos que contenham a se-
qncia (LV)ExD. Hoje sabemos que
seqncias adjacentes ao stio de
caspases, tanto direita como es-
querda, tambm influenciam na
clivagem do substrato, como ser
discutido abaixo.
A ativao das caspases inicia-
doras -8, -2 e -10 inicia-se com a
Figura 2 - Esquema representativo das vias de sinalizao da apoptose e a ativao em
cascata das caspases iniciadoras (2, 8, 9, 10) e efetoras (3, 6, 7) que causam a degradao
de protenas intracelulares. A via extrnseca de ativao da apoptose ocorre com a
interao de citocinas aos seus receptores de membrana e conseqente ativao da
caspase-8, 2 ou 10. Na via intrnseca, os eventos qumicos e fsicos mediados pela
protenas da famlia BCL-2/BAX provoca a liberao do citocromo c, que provoca a
ativao da caspase-9. Na quadra da direita so apresentados os smbolos que
representam os principais domnios ou motifs das protenas envolvidas na apoptose.
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ligao das citocinas da famlia TNF,
Fas ou TRAIL aos seus receptores de
membrana, identificados pelas si-
glas: TNFR1, Fas, DR-3, DR-4 ou DR-
5 (Ashkenazi & Dixit, 1998). Esses
receptores contm, em sua estrutura
polipeptdica, o domnio DD (death
domain), que permite sua associa-
o s protenas adaptoras FADD e
TRADD, que tambm possuem do-
mnio DD. Esse complexo, por sua
vez, interage com a pr-caspase-8
atravs do domnio DED (death
effector domain), para juntos forma-
rem um complexo supramolecular
denominado apoptosoma. Dentro
desta estrutura multimrica, ocorre
a aproximao e a oligomerizao
de molculas de pr-caspase-8, as
quais promovem sua clivagem e ati-
vao. Uma vez ativa, a caspase-8
inicia a cascata de ativao das pr-
caspases executoras; caspases -3, -6
e -7.
A ativao de caspases pela via
intrnseca requer a liberao do
citocromo c armazenado nas mito-
cndrias (Adams & Cory, 2001). A
sada de citocromo c dependente
de uma srie de eventos eltricos e
qumicos, sendo os mais estudados:
a queda do potencial de transio de
permeabilidade inica, abertura de
megaporos e a ruptura pontual de
uma regio da membrana externa.
Esses eventos so modulados pela
interao de protenas inibidoras de
apoptose da famlia Bcl-2 (principais
membros: Bcl-2-W, Bcl-xl, MCL-1) e
por protenas indutoras de apoptose
da famlia Bax (principais membros:
Bad, Bid e Bak), capazes de interagir
com elementos estruturais da mem-
brana externa das mitocndrias,
como, por exemplo, as porinas que
so poros de transio de permeabi-
lidade para vrias molculas, inclu-
das a H
2
0 e Ca
2+
. Essa classificao
em indutoras ou supressoras tem
como base a presena do domnio
BH, que dividido em BH-1, -2, -3 e
-4. Esses domnios provocam a ho-
modimerizao de molculas simila-
res e a formao de poros que
permeiam a passagem do citocromo
c da mitocndria para o citosol. Por
outro lado, a formao de heterod-
meros do tipo Bcl-2/Bax evita a for-
mao dessa estrutura e, conseqen-
temente, a morte celular (Adams &
Cory, 2001).
No citoplasma, as molculas de
citocromo c interagem, via domnio
CARD, com os complexos formados
pel a pr-caspase-9 e Apaf-1
(apoptotic protease activating factor-
1). A unio dessas protenas forma
um apoptosoma de aproximadamente
700 kDa, permitindo a aproximao
e a oligomerizao de molculas de
pr-caspase-9 e sua auto-clivagem e
ativao. A caspase-9 livre pode
recrutar e ati var as caspases
executoras -3, -6 e -7 e as caspases
iniciadoras -8,-2 e -10.
Encontradas nos diversos com-
partimentos celulares, as caspases
executoras podem atuar sobre as pro-
tenas estruturais, protenas de sina-
lizao, fatores de transcrio e vri-
as enzimas envolvidas na sntese e
reparo do RNA e DNA. Na tabela I,
esto apresentadas algumas das de-
zenas de protenas-substrato de
caspases. Segundo uma reviso re-
cente, o nmero de protenas
substratos de caspases de aproxi-
madamente 280 protenas (Fischer et
al., 2003). A funo e os efeitos
causados clula aps a clivagem
foram tambm sumarizados no arti-
go. Em vrios casos, a clivagem resul-
ta na inativao das protenas, mas
h tambm outros casos em que a
protena clivada ativada. Um exem-
plo em que a clivagem resulta na
ativao o da ativao da prpria
caspase. Um outro exemplo o da
protena ICAD/DFF45 (Enari et al.,
1998), um inibidor da nuclease CAD
(caspase activated deoxyribonuclea-
se), a enzima responsvel pela frag-
mentao do DNA durante a apopto-
se. Em clulas no apoptticas, CAD
est presente como um complexo
inativo com ICAD (inhibitor of caspase
activated deoxyribonuclease). Aps
a induo da apoptose, ICAD
inativada pelas caspases -3 e -7, dei-
xando CAD livre para funcionar como
uma nuclease.
As caspases clivam vrias prote-
nas envolvidas na regulao do
citoesqueleto, incluindo gelsolina,
fodrina, Gas-2, protena quinase de
adeso focal (FAK), protena quinase
p21, isoformas da protena quinase C
e MEKK-1. A destruio da rede de
microtbulos provoca o arredonda-
mento e o deslocamento da clula do
tecido. Vrias alteraes tpicas na
morfologia do ncleo apopttico so
dependentes da ao da caspase-6, a
caspase que degrada as lminas A, B
e C do envoltrio nuclear. O rompi-
mento dessa estrutura parece facilitar
o acesso e degradao das fitas de
DNA na regio internucleosomal pela
nuclease CAD.
A clivagem de substratos de
caspases ocorre de uma maneira tem-
po- dependente e pode anteceder ou
proceder morte por apoptose. Con-
tudo, ainda no se sabe ao certo se a
clivagem de uma protena-chave po-
deria servir de catalisador do proces-
so, i.e., o processo no se desencade-
aria sem a sua degradao. Vrias
linhas de evidncias mostraram que
a apoptose de clulas que encontra-
ram defeitos ou erros na replicao
do DNA durante a proliferao
dependente da degradao da Rb,
fatores inibidores de CDK, p21 e p27
e da protena MDM2, um inibidor da
atividade de p53 (Levkau et al., 1998,
Belizrio et al., 1991, Belizrio et al.,
1999, Hiesh et al., 1999). Este postu-
lado foi confirmado em alguns estu-
dos com mutantes das protenas
MDM2 e Rb, nos quais os aminoci-
dos DEVD - o stio preferencial de
clivagem pela caspase-3 - foram subs-
titudos por aminocidos neutros.
Como era esperado, na ausncia de
degradao dessas protenas, as c-
lulas resistiram apoptose induzida
por vrios agentes fisiolgicos e far-
macolgicos (Tan et al., 1997, Fattman
et al., 2001). No h, entretanto,
evidncias de que uma presso sele-
tiva na populao de clulas malig-
nas de um tecido tumoral produza
clulas cujas protenas apresentem
mutaes em stios de clivagem de
enzimas caspases como um fenme-
no geral de resistncia apoptose.
4. O sistema ubiquitina-
proteasoma
O sistema ubiquitina-proteaso-
ma responsvel pela degradao
de protenas intracelulares, cuja or-
ganizao gentica e funcional est
preservada em certas bactrias, le-
veduras e organismos multicelula-
res. Na clula, a protelise essen-
cial no apenas para a eliminao
seletiva de protenas defeituosas,
como tambm de protenas que atu-
am como reguladores de processos
bioqumicos, tais como a prolifera-
Revista Biotecnologia Cincia e Desenvolvimento - Edio n 30 - janeiro/junho 2003 65
o, diferenciao, biognese de
organelas, resposta imunolgica e
inflamatria (Ciechanover, 1998,
Weissman, 1997, Goldberg et al.,
2001). Doenas genticas, neurode-
generativas e tumores malignos so
induzidos quando certos componen-
tes desse sistema de degradao
esto ausentes ou desregulados
(Ciechanover, 1998).
Diferentemente do processo de
degradao mediado por proteases
presentes nos lisossomas, a degrada-
o de protenas por esse sistema
requer a energia de ATP e envolve
dois passos distintos e sucessivos.
No primeiro passo, uma protena
chamada ubiquitina, de peso mole-
cular de 8.5 kDa, covalentemente
adicionada protena-alvo. No se-
gundo, a protena-alvo degradada
aps ser desenovelada e fragmenta-
da ao atravessar uma estrutura em
forma cilndrica oca denominada
proteasoma (Figura 3).
O proteasoma constitudo de
uma parte central que contm 4
unidades que formam um anel, sen-
do que cada anel formado por 7
cadeias e 7 cadeias distintas.
Essa estrutura pode ser representa-
da pela frmula
17

17

17

17
. O
coeficiente de sedimentao do
proteasoma igual a 20S. As subuni-
dades possuem atividade proteo-
ltica e, dessa forma, atuam direta-
mente na degradao de protenas.
Essas proteases tm especificidade
distintas; a primeira possui ativida-
de similar tripsina, a segunda simi-
lar quimiotripsina e a terceira,
similar glutamil peptidil hidrolases.
Durante a resposta imunolgica, o
sistema ubiquitina-proteasoma ati-
vado pelo interferon-. Essa citocina
induz a sntese de trs subunidade
, LMP2, LMP7 and MECL-1, que
favorecem a gerao de peptdeos
da classe I do sistema histocompati-
bilidade humana (MHS).
Nas extremidades inferior e su-
perior dessa estrutura de 20S, esto
acopladas duas estruturas regulado-
ras de massa molecular igual a 19S.
Essas unidades contm enzimas
ATPases, que promovem o desnove-
lamento das protenas que sofreram
a degradao. A unio dessas trs
estruturas 19S-20S-19S d origem a
um complexo supramolecular de co-
eficiente de sedimentao 26S e,
aproximadamente, 1500-2000 kDa
(Weissman, 1997, Ciechanover,
1998).
A conjugao da ubiquitina ao
substrato feita em um mecanismo
de trs etapas e requer a participa-
o de trs classes de enzimas deno-
minadas E1, E2 e E3. Primeiro, a
molcula de glicina da poro C-
terminal da ubiquitina forma uma
ligao tio-ster com o resduo de
cistena da enzima ativadora de ubi-
quitina E1. Essa reao requer a
hidrlise de ATP. At o momento,
apenas uma enzima E1 de 117 kDa
foi identificada no genoma humano.
Em seguida, a ubiquitina ativada
transferida para uma enzima conju-
gadora de ubiquitina ou E2, tambm
conhecidas por UBCs (ubiquitin-
conjugating enzymes). Mais de 25
genes de E2 esto presentes no
genoma humano. Em seguida, a E2
transfere a ubiquitina para uma
enzima ubiquitina ligase ou E3
(Ubiquitin-protein ligases). As E3
ligam-se ao substrato de uma manei-
ra especfica e promovem a transfe-
rncia da ubiquitina da E2 para o
grupamento -amino de uma lisina
na protena-susbtrato. Reaes su-
cessivas podem ocorrer, levando
formao de substrato com cadeias
lineares ou de mltiplas seqncias
de ubiquitina (Weissman, 1997,
Ciechanover, 1998).
A famlia de enzimas E3 ligases
a mais abundante na clula huma-
na; so mais de 600 genes preditos;
entretanto, at o momento, somen-
te cinco classes principais foram
descri t as (Ci echanover, 1998,
Joazeiro & Weissman 2000). Em
geral, as E3s so identificadas pela
presena dos domnios Ringer Finger
(RF), F-box e WD40, que atuam no
recrutamento e na apresentao de
protenas-substrato ao proteasoma
(Ciechanover, 1998, Vodermaier,
2001). Ao contrrio do que se pen-
sava, as E3 ligases podem reconhe-
cer mais de uma protena, inclusive
protenas no ubiquitinadas.
No primeiro grupo, esto as
enzimas da famlia E3/E3. Essas
E3 reconhecem protenas que con-
tenham na poro N-terminal um
aminocido bsico (exemplo: Arg,
Lys, Hi s) ou um ami noci do
hidrofbico volumoso (exemplo:
Phe, Leu, Trp, Tyr, Ile). Essa regra de
reconhecimento denominada N-
Figura 3 - Esquema representativo mostrando as etapas de ubiquitinao e reconhec-
imento de uma protena-substrato pelas enzimas E1, E2 e E3. As protenas ubiquitina-
das so degradadas ao passarem por dentro do proteasoma por enzimas proteolticas
especficas, gerando peptdeos entre 7-12 aminocidos.
66 Revista Biotecnologia Cincia e Desenvolvimento - Edio n 30 - janeiro/junho 2003
end rule ou regra do aminocido N-
terminal (Varshavky, 1992).
O segundo grupo de enzimas
E3 tem como membro principal a
protena E6-AP (E6 associated
oncoprotein), que foi identificada
em um complexo formado com a
protena E6 do papiloma vrus. O
complexo recruta e promove a de-
gradao da protena p53. A degra-
dao de p53 tambm promovida
pela E3 denominada MDM2 (ver
adiante). Essas protenas, embora
de tamanho variados, apresentam
um domnio comum na poro
carboxi-terminal denominado HECT
(homology to the E6-AP carboxyl
terminus). Um grande nmero de
protenas com o domnio HECT j
foi identificado.
O terceiro grupo de E3 ligases
atuam na degradao de protenas
envolvidas no controle da entrada e
sada da mitose. Alguns exemplos de
substratos dessas E3 ligases so as
ciclinas A e B, securina, cdc5, cdc6,
entre outras. A E3 mais estudada
nesse grupo o complexo denomi-
nado ciclosoma (C) ou APC (anaphase
promoting complex). O complexo
pode ter at 10 subunidades (exem-
plos: cdc16, 20, 26, 27, Apc4, 5, 6)
cuja sntese e degradao ocorre de
uma maneira dependente dos even-
tos do ciclo celular (Zacharia &
Nasmyth, 1999).
O grupo quatro tem como exem-
plo mais estudado o complexo Skp-
1-cullin-F-Box ou SCF (Pray et al.,
2002). A parte central do complexo
formado pelas protenas Cul1
(culina 1) e Roc1 (protena Ringer
finger) e Skp1. A Skp1 um dos
membros da famlia de protenas F-
Box. Essas protenas ligam-se espe-
cificamente s protenas-substratos
de E3 ligase. As E3 ligases da famlia
SCF atuam na degradao de com-
ponentes do ciclo celular que con-
trolam a transio G1/S. Entre eles
esto os inibidores de enzimas CDKs,
p21 e p27, e as ciclinas A e E. Em
geral, essas protenas so fosforiladas
pelos complexos CDK/ciclina antes
de serem reconhecidas pelas prote-
nas F-Box do complexo E3 (King et
al., 1996). Recentemente foi demons-
trado que o complexo SCF tambm
pode participar na ubiquitinao das
protenas -catenina e IkB (Winston
et al., 1999).
O quinto grupo de E3 possui
vrios membros cuja caracterstica
principal a presena do domno
Ring Finger (RF). O domnio RF,
definido como uma seqncia linear
de extenso e estrutura varivel,
que pode ser representada pela se-
guinte frmula: Cx2Cx(9-39)Cx(1-
3)Hx(2-3)C/Hx2Cx(4-48)Cx2C, onde
C corresponde aos resduos de
cistena e H aos resduos de histina,
e X a qualquer outro aminocido. A
principal propriedade qumica da
regio RF a captura de duas mol-
culas de zinco. No obstante, a mai-
oria das protenas com domnio RF
apresenta atividade E3 e auxilia na
transferncia de ubiquitina de uma
molcula E2 para a protena-
substrato (Joazeiro & Weissman,
2000; Freemont, 2000). Exemplos de
molculas E3 com domnio RF so as
protenas MDM2, BRCA e Siah-1.
Um outro exemplo de protena com
domnio RF e atividade E3 a prote-
na VHL, responsvel pela sndrome
von Hippel Lindau (pVHL). A pro-
tena VHL pode se associar s
elonginas B, C e culina2, dando
origem ao complexo VBC, que tem
as mesmas caractersticas dos com-
plexos APC e SCF.
Survivin, XIAP-1, IAP-1 e c-IAP-
2 fazem parte da famlia IAPs
(inhibitor-of-apoptosis), que atuam
como inibidores da ativao das
enzimas caspases, e que tambm
apresentam, na poro C-terminal, o
domnio RF (Deveraux & Reed, 1999).
Alm disso, essas protenas so iden-
tificadas por apresentarem, na poro
N-terminal, uma seqncia de amino-
cidos chamada de domnio BIR. O
domnio BIR representado pela ex-
presso: Cx2Cx6Wx3Dx5Hx6C. A pre-
sena de resduos de cistena e
histidina pressupe uma possvel
estrutura ligadora de zinco, mas no
se sabe ao certo se outras proprieda-
des do domnio BIR seriam respons-
veis pela inibio da atividade enzi-
mtica das caspases. Por outro lado,
est bem estabelecido que o domnio
RF tem papel no processo de
ubiquitinao de vrias caspases
(Huang et al., 2000; Joazeiro &
Weissman, 2000). A ubiquitinao
uma evidncia experimental que su-
gere a degradao de caspases via
ubquitina-proteasoma, mas isto ain-
da no foi amplamente estudado.
5. A degradao seletica de
protenas e suas
implicaes no cncer
A falha na ubiquitinao e con-
seqente ausncia de degradao
pelo sistema ubiquitina-proteasoma
pode modificar a atividade de pro-
oncogenes e facilitar o desenvolvi-
mento de tumores malignos. Muta-
es e delees que interferem na
degradao foram encontrados nos
seguintes pro-oncogenes: -catenina,
p53, c-Jun, E2F, ciclinas A, B, D e E e
p27 (Loda et al., 1997, Rubinfeld et
al., 1997, Gstaiger et al., 2001).
A protena -catenina um dos
componentes de uma via de sinaliza-
o que promove a ativao dos
fatores de transcrio LEF e TCF.
Esses fatores atuam na proliferao
de linfcitos T, e, em particular, na
induo da sntese dos genes da
ciclina D e c-myc. Foi verificado que
certas mutaes na -catenina au-
menta sua estabilidade e o tempo de
sinalizao de proliferao celular na
clula mutante. A estabilidade da
protena -catenina tambm modi-
ficada por mutaes encontradas em
um outro gene que participa dessa
via de sinalizao, o gene APC
(adenomatous polyposis coli). O APC
um fator supressor de tumores e
tem papel chave na induo de
polipose e adenoma do clon
instestinal (Fodde et al., 2001). Alm
disso, a mutao de -catenina tam-
bm interrompe a via de sinalizao
da proliferao mediada pela E-
caderina da membrana celular e das
protenas da matriz extracelular
(Rubinfeld et al., 1997).
Recentemente descobriu-se que
a agressidade de carcinoma do clon
retal, carcinoma da mama e carcino-
ma da prstata est associada ao au-
mento da degradao da p27, o inibidor
de CDKs que controla o ciclo celular
(Loda et al., 1997). O mecanismo pelo
qual isto acontece ainda no est bem
definido, mas estudos recentes mos-
traram que a protena Skp2, uma F-
box protena, envolvida no reconhe-
cimento da protena p27, parece ter
um papel chave na oncognese
(Gstaiger et al., 2001). GSTAIGER e
colaboradores mostraram que o gene
dessa protena superexpressado em
displasias da epiderme e no carcino-
ma epitelial da boca. Mais importante
Revista Biotecnologia Cincia e Desenvolvimento - Edio n 30 - janeiro/junho 2003 67
ainda, eles mostraram que fibroblastos
normais, que expressam os genes H-
Ras mutados, e o Skp2, adquiriram as
propriedades biolgicas de uma clu-
la tumoral nos testes in vitro e in vivo.
Quando essas clulas eram injetadas
em camundongos nude, observou-se
tambm a rpida formao de tumo-
res malignos (Gstaiger et al., 2001).
Em aproximadamente 90% dos
cnceres da cervix detectada a
expresso das protenas E6 e E7 de
papiloma vrus tipos 16 e 18 (Evan &
Voudsden, 2001). Como discutido,
as protenas E6 so homlogas a uma
classe de protenas E3, denominada
E6-AP, as quais atuam no recruta-
mento e ubiquitinao da p53. A
produo excessiva de protena E6
em clulas infectadas pelo papiloma
e a subseqente degradao de p53,
via ubiquitina-proteasoma, so even-
tos iniciais na transformao tumoral
mediada por esses vrus (Huibregtse
et al., 1995).
Vrias protenas E3, incluindo
MDM2, BRCA, Siah-1, Cb1 e PML,
foram envolvidas direta ou indireta-
mente na transformao celular
(Freemont, 2000). Foi observado que
uma mutao pontual no domnio RF
da BRCA1 uma protena envolvida
no reparo do DNA, predispe as mu-
lheres portadoras desta mutao ao
cncer de mama e de ovrio (Baer &
Ludwig, 2002). Outro exemplo a
protena VHL, responsvel pela
sndrome von Hippel Lindau. Muta-
es no gene da VHL bloqueiam sua
ao E3, responsvel pela inativao
do fator HIP (hipoxia inducing factor).
Com o aumento de estabilidade do
HIP, possvel o desenvolvimento de
certos tumores malignos em indivdu-
os portadores dessa sndrome (Tyers
& Jorgensen, 2000).
Survivina, uma E3 da famlia IAP
de inibidores de caspases, parece ter
um papel relevante na induo de
cncer. Foi observado que sua ex-
presso aumentada na transio
G2/M do ciclo celular quando ela se
liga aos fusos de microtbulos do
aparato mittico. Esta associao pre-
vine a apoptose induzida pelo taxol.
Sabe-se tambm que a superexpres-
so de IAP um marcador de prog-
nstico ruim de evoluo da doenas
em pacientes portadores de neuro-
blastoma, cnceres do colo uterino e
gstrico (Deveraux & Reed, 1998).
6. A regio PEST como um
sinal que promove a
degradao rpida de
protenas
Alm da ubiquitinao, a pre-
sena de certas regies e seqncias
na estrutura primria das protenas
pode funcionar como um sinal que
define o seu tempo de meia-vida
dentro da clula. Vrias seqncias
de aminocidos foram identificadas
como sinais proteolticos para a
degradao por enzimas lisosomais
(exemplo, catepsina), calpainas e sis-
tema ubiquitina-proteasoma (Dice,
1990, Rechsteiner & Rogers, 1996).
Correlacionando as taxas de de-
gradao de dezenas de protenas e
as suas seqncias de aminocidos,
ROGERS, WELLS e RECHSTEINER
(1986) mostraram que as protenas,
com um tempo mdio de degradao
inferior a 2 horas, apresentam um
grupo conservado de aminocidos.
Essa regio, que pode ter de 10 a 50
aminocidos, rica em prolina (P),
cido glutmico (E), serina (S) e
treonina (T), e flanqueada na extre-
midade N e C-terminal, por um
aminocido positivo, como a arginina,
lisina ou histidina. A regio PEST,
como foi chamada, tem um nmero e
a ordem de aminocidos varivel,
bem como a sua extenso (Figura 4).
Ela pode estar presente 5 vezes em
uma protena de 300 aminocidos.
Devido s caractersticas qumicas
desses aminocidos de carga negati-
va, a regio PEST aumenta a reteno
de molculas de H
2
0 e ons Ca
2+
(Rechsteiner & Rogers, 1996). Alm
disso, os aminocidos serina e
treonina das protenas contendo a
regio PEST so alvos de fosforilao
por vrias enzimas quinases. Como
as regies PEST nunca so seqnci-
as repetitivas e idnticas, acredita-se
que a estrutura secundria, em forma
de lao (loop), sirva como local de
ligao de outras protenas ou
enzimas, em particular, E3 ligases,
mas isto ainda no foi definido.
Aps essa descoberta, vrios
grupos mostraram que a deleo ou
a substituio de aminocidos da
regio PEST aumenta a estabilidade
da protena, isto , impede a sua
rpida degradao. Em geral, a
funo biolgica da protena sem o
PEST dramaticamente aumentada
(Rechsteiner & Rogers, 1996).
Figura 4 - Diagrama representativo de uma regio PEST. Nesta seqncia aleatria de
aminocidos esto intercalados os aminocidos designados pelos seus smbolos alfabti-
cos citados ou figuras representativas ( , + , ). As protenas MCL1, caspase-9 e IF116B
so exemplos de protenas que apresentam regies PEST com um ndice PEST indicado.
68 Revista Biotecnologia Cincia e Desenvolvimento - Edio n 30 - janeiro/junho 2003
A regio PEST est presente em
vrias protenas diretamente envol-
vidas na etiologia do cncer. Exem-
plos mais relevantes so MYC, RAS,
FOS, JUN, PTEN, p53, EIA, ciclinas A,
B, inibidores de CDKs, p21 e p27, -
catenina e NF-kB (Rechsteiner &
Rogers, 1996).
A PTEN um fator supressor de
tumores, cujo gene aparece deletado
ou mutado em gliomas e cnceres do
endomtrio. A protena PTEN atua
como enzima fosfatase e, sob sua
ao, o fosfolpideo PIP
3
(fosfoinosi-
tol-3-fosfato) desfosforilado, tornan-
do-se inativo. O PIP
3
atua na ativao
da enzima quinase B (PKB), mais
conhecida por Akt. A Akt exerce uma
funo anti-apopttica, promovendo
a fosforilao e inativao da caspase-
9 e BAD, um dos membros da famlia
BAX de protenas pr-apoptticas
(Cardone et al., 1998). Mutaes no
gene PTEN, que causam gliomas e
cncer do endomtrio, geralmente
ocorrem na regio PEST. A oncogne-
se, nesse caso, , em parte, produzida
pela produo excessiva de PIP3 (fos-
foinositol) e a ativao contnua da via
Akt de sobrevivncia celular. De fato,
estudos de mutaes stio-dirigidas
mostram que a ausncia da regio
PEST provoca a desestabilizao da
estrutura secundria da protena e
compromete sua atividade enzimtica
(Georgescu et al., 1999).
7. A regio PEST e o stio
de clivagem de enzimas
caspases
Atravs da consulta de vrios ban-
cos de dados do genoma humano
(exemplo: National Center For
Biotecnology Information, NCBI) e o
uso do programa PESTFind (Rechsteiner
& Rogers, 1996) e um programa similar
desenvolvido em nosso laboratrio re-
alizamos um estudo para identificar a
presena da regio PEST dentro do
stio de clivagem em uma amostragem
de protenas-substrato de enzimas
caspases. A motivao para este estu-
do veio de uma descoberta inicial feita
durante a anlise da presena de re-
gio PEST na famlia de enzimas
caspases. Nesse grupo particular de
protenas notou-se que o stio de
clivagem (exemplo; DEVD) encontra-
va-se dentro da regio PEST em 10 de
um total de 12 enzimas caspases ana-
lisadas. Desta forma, a hiptese que
o stio de reconhecimento de caspase
no seja de apenas 4 aminocidos, mas
uma regio estendida de 20 a 30 ami-
nocidos, i.e., a regio PEST.
Em seguida, foram analisadas
todas as protenas-substrato de
caspases descritas na literatura. Nes-
se grupo de 144 protenas, a presen-
a do stio de clivagem dentro da
regio de PEST foi detectada em 63%
(90/144) da amostragem de prote-
nas. No restante, 37% (54/144) das
protenas-substrato de caspases, o
stio de clivagem foi encontrado em
um local distante da regio PEST
(Tabela 1). Estas protenas foram
agrupadas em 8 categorias, de acor-
do com as funes que exercem em
diferentes processos biolgicos como
apoptose, ciclo celular, doenas neu-
rodegenerativas, ou localizao celu-
lar (Tabela 1). Algumas dessas prote-
nas foram identificadas no quadro.
Elas podem atuar como citocinas,
receptores de membrana, fatores de
T S E P o i g e r a d m e g a v i l c e d o i t s o o d n e t n o c s e s a p s a c e d s o t a r t s b u s - s a n e t o r p e d o a l e R - 1 a l e b a T
a i r o g e t a C
s o l p m e x E
e s a p s a c e d o i t S
T S E P o d o r t n e d
m i S o N l a t o T
o t e l e u q s e o t i c o d e s i a r u t u r t s E s a n e t o r P
, a n i t n e m i V , u a T , a n i t c e l P , a n i r d l o F , 2 - s a G , a n i m a l i f , a n i t c a , a n i n e t a c , a n i t a r e u q o t i c , a n i l o s l e G
a n i t p a b a R
4 1 5 9 1
s e r a e l c u N s a n e t o r P
3 5 1 p u N , a 2 P A L 1 - B T A S , e s a c i l e h A N R , A - F A S , 2 M D M , s P N R n H , a M u N , C , B , A s a n i m a L 6 4 3 1
A N D e d o m s i l o b a t e M o d s a n e t o r P
, 1 A C R B , 1 5 D A R , e s a c i l e h A N D , A N D - s c K P , 3 M C M , e s a r e m o s i o p o t A N D , 0 4 1 C F R , P R A P
s u n i c a
6 8 5 1
s e s a n i u Q s a n e t o r P
, 1 e e W , t k A , 1 f a R , 1 K K E M , K A F , n y F , 1 t s M , V I K M a C , e s a n i u q d e t a l e r - C K P , ) , , ( C K P
N Y F 8 5 P , e s a n i u q P I R , c r S
5 1 9 6 2
a c i n g o i r c s n a r t e s i a n i s e d o u d a r t a d s a n e t o r P
, 2 3 1 - P B E R S , B k - F N , 1 T A T S , 2 A L P c , A 2 P P , I D G - 4 D , 8 1 , 6 1 , 1 s a n i c u e l r e t n i - o r P
e d s e r o t a F , A a n i r u e n i c l a C , X A M , A 0 1 e A 5 , 6 E D P , 2 F R N , 2 - B r E , 1 - b C , - C L P , a n i t a t s a p l a c
M A I T , 1 - A T A G , 1 K C O R , A 2 - P A o i r c s n a r T
7 1 3 1 2 3
e s o t p o p A e r a l u l e C o l c i C o d s e r o d a l u g e R s a n e t o r P
, P A I h , P A I X , D A C I , D A B , x a B , d i B , P I L F , L x - l c B , A a n i l c i c , 4 d d e n , 7 2 C D C , B R p , 7 2 p , 1 2 p
F A R T , 4 1 , 3 1 , 0 1 , 9 , 8 , 7 , 6 , 5 , 4 , 3 , 2 , 1 s e s a p s a C , 0 9 P S H
0 2 9 9 2
s a v i t a r e n e g e d o r u e N s a n e o d m e s a d i v l o v n e s a n e t o r P
r o t p e c e R , F G D E L , P P A , a n i l i n e s l a C , 3 - a n i x a t a , 2 P L P A , 2 , 1 - a n i l i n e s e r P , 1 - a n i f o r t A , a n i t g n i t n u H
o i n g o r d n A
9 1 0 1
s a i r o g e t a c s a r t u O
1 - P S A R G , e s a P T A - o i c l C , 5 6 P S A R G , A P M A r o t p e c e r , e d a d i s o c i l G - O , 8 2 A P 3 5 9
s i a t o T 0 9 4 5 4 4 1
s n e g a t n e c r o P % 3 6 % 7 3 % 0 0 1
Revista Biotecnologia Cincia e Desenvolvimento - Edio n 30 - janeiro/junho 2003 69
transcrio, enzimas quinases, prote-
ases, protenas do citoesqueleto,
citoplasmticas, nucleares, e vrias
outras funes no especificadas.
A presena do stio de clivagem
de caspases dentro da regio PEST
deve ter uma finalidade biolgica que
ainda no se conhece. Uma hiptese
que essa regio determinaria a degra-
dao rpida da protena pela via ubi-
quitina-proteasoma. De fato, estudos
j mostraram que as IAP funcionam
como E3 ligases, promovendo a ubi-
quitinao de caspases (Huang et al.,
2000). Estudos em andamento no nos-
so laboratrio mostraram que a substi-
tuio de certos aminocidos (S199A,
T201A) da regio PEST da caspase-7
impedem a sua autoativao. poss-
vel, portanto, que a regio PEST funci-
one como um stio de regulao de
ativao de caspase. Possivelmente, o
PEST funcionaria como um elemento
estrutural de reconhecimento que in-
duz a ativao intra ou intermolecular
da proforma da enzima.
Em resumo, os dados apresenta-
dos nesse estudo revelaram vrias
pistas ou hipteses a serem confirma-
das atravs de trabalhos de bancada
que envolvem a mutao stio-dirigida
de genes e a produo de protenas
modificadas para realizao de ensai-
os funcionais. Acredita-se que esses
ensaios possam revelar fatos impor-
tantes sobre o potencial oncognico
das protenas que contenham regies
PEST ainda no reveladas em estudos
convencionais de investigao cient-
fica (Figura 5). Ressalte-se que existe
uma predio de que, pelo menos,
um tero das protenas codificadas
pelo genoma humano, isto , 10 mil
protenas de um universo de 30 mil
protenas possuam regies PEST
(Rechsteiner & Rogers, 1996).
8. Perspectivas
Os bancos de dados gerados por
seqenciamento de genes provenien-
tes de tecido normal e tumoral so
exelentes provedores de informaes
para os estudos que visem anlise de
possveis alteraes funcionais de pro-
tenas devido a defeitos nos mecanis-
mos que levam sua destruio. Esta
anlise tem sido facilitada pelo conhe-
cimento de stios, regies e seqncias
de reconhecimento de degradao de
protenas, bem como pela identifica-
o de dezenas de famlias de prote-
nas e enzimas envolvidas nos diferen-
tes processos de protelise via ubiqui-
tina-proteasoma e a protelise media-
da por enzimas caspases. A identifica-
o destas modificaes poderia aju-
dar a predizer falhas nas interaes
com os elementos da maquinaria de
degradao celular; desenvolver estra-
tgias de inibio ou de ativao dos
processos; e, finalmente, propor novas
alternativas profilticas e teraputicas.
Entender a origem e a progres-
so do cncer atravs da anlise de
seqncias, regies e domnios na
estrutura das protenas que servem
de sinalizao e reconhecimento para
sua degradao o grande desafio do
momento. Para vencer esse desafio
preciso ter a cooperao de vrios
grupos de cientistas especializados
em seqenciamento e clonagem de
genes, expresso de protenas re-
combinantes e, em especial, a coo-
perao de uma nova classe de pes-
quisador, o bioinformata, cuja princi-
pal ferramenta o computador. Cabe
a esse profissional a anlise de con-
juntos de dados em grande escala e a
formulao de hipteses que sero
executadas por seus colegas. Essa
forma inovadora de pesquisa deci-
siva para entender a biologia da clu-
la em toda a sua complexidade.
9. Referncias
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Figura 5. O esquema mostra possveis etapas na regulao da proliferao e morte celular
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degradao, pode levar a produo de protenas oncognicas. Uma condio especfica
que pode levar as estas disfunes a alterao por mutaes ou deleo de aminocidos
da regio PEST, um elemento chave para o reconhecimento e eliminao de protenas
oncognicas pelas enzimas caspases e sistema ubiquitina-proteasoma.
70 Revista Biotecnologia Cincia e Desenvolvimento - Edio n 30 - janeiro/junho 2003
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