Clula Procariota

Tincin de Gram y
Observacin microscpica
Trabajo
Prctico
N 2

Trabajo Prctico N 2
Clula procariota. Tincin de Gram y Observacin microscpica

Objetivos
- Adquirir destreza en la tcnica de tincin de Gram.
- Comprender las diferencias estructurales de la pared celular de las eubacterias y su
importancia en la clasificacin de Gram.
- Aprender el funcionamiento y manejo del microscopio ptico.

Introduccin
En las clulas procariotas (fig. 1) el material gentico no est
contenido dentro de un ncleo rodeado por una membrana,
sino que se encuentra libre como una molcula grande y
circular de ADN y est ubicado en una regin definida
llamada nucleoide. En el citoplasma se encuentran variadas
molculas y complejos moleculares, como los ribosomas,
que desempean una funcin clave en la unin de los
aminocidos durante la sntesis proteica. La membrana
celular de los procariotas esta rodeada por una pared celular
externa que es elaborada por la propia clula. Esta pared
generalmente es rgida y da a la clula su forma
caracterstica. Dado que la mayora de las bacterias son
hipertnicas en relacin con su ambiente, estallaran si no
tuviesen pared.
La pared celular de las eubacterias tiene una composicin
particular (fig. 2), la misma est formada por peptidoglicano,
un polmero complejo de aminoazcares tambin llamado murena debido al cido murmico,
compuesto presente slo en la pared celular. Las paredes celulares de las eubacterias se presentan
en dos configuraciones diferentes que se distinguen fcilmente por su capacidad para combinarse
firmemente con ciertos colorantes. El microbilogo dans Hans Christian Gram descubri que al
tratar un preparado microscpico sucesivamente con un colorante violeta, un fijador, un lavado con
alcohol y un colorante de contraste rosa o rojo, algunas bacterias aparecan violetas y otras
rosadas. Las clulas que retienen el primer colorante y se tien de violeta se denominan Gram
positivas (+). Aquellas de aspecto rosado, que se tien del segundo colorantes, son Gram negativas
(-).
Esta tcnica de tincin se denomina Tincin de Gram. El fundamento de la tcnica se basa en las
diferencias entre las paredes celulares. La pared celular de las bacterias Gram (+) posee una
gruesa capa de peptidoglicano. Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las Gram (-) es
delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior, la cual es permeable
a solventes orgnicos (ej. alcohol/acetona). La clave es el peptidoglicano o murena, ambos tipos de
bacterias se tien de manera distinta debido a estas diferencias constitutivas de su pared.
La capa de peptidoglicano que poseen las bacterias Gram (-) es demasiado delgada como para
poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este
complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Por el contrario, las Gram (+), al
poseer una pared celular con mayor proporcin de peptidoglicanos, son menos susceptibles a la
decoloracin con el solvente orgnico, adems este acta deshidratando y cerrando los poros,
impidiendo la salida del complejo cristal violeta/yodo manteniendo as la coloracin azul-violcea.
Figura 1. Diagrama de clulas procariotas
de E. coli. El material gentico se
encuentra en la zona mas clara,
constituyendo el nucleoide. Los pequeos
granos densos del citoplasma son los
ribosomas
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La tcnica de tincin de Gram esta relacionada en general, con el espesor de la pared, el tamao
de los poros y las propiedades de permeabilidad de la envoltura celular. Es una metodologa
general ampliamente usada en la clasificacin bacteriana y constituye uno de los procedimientos
iniciales para lograr la identificacin de bacterias en principio desconocidas.
La clasificacin de Gram refleja una diferencia fundamental en la arquitectura de la pared celular de
las eubacterias y esta estructura est relacionada con los patrones de susceptibilidad a antibiticos
y otras sustancias. Su aplicacin prctica es innegable sobre todo en el trabajo microscpico de
rutina, las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, espirilos, negativos y
positivos) se basan precisamente en la tincin de Gram.
Los microorganismos pueden ser observados directamente usando un microscopio. Segn la
finalidad, se pueden observar vivos sin teir (movilidad o reaccin frente a elementos qumicos) o
fijados y teidos (detalles de forma, estructuras o agrupacin).
El microscopio, de micro- (pequeo) y scopio (observar), es un instrumento que permite observar
objetos que son demasiado pequeos para ser vistos a simple vista. Existen varios tipos (desde el
primero que se invent), el microscopio ptico, simple, compuesto, electrnico, de fluorescencia, de
contraste de fase, etc.
El microscopio ptico comn (fig. 3) est conformado por tres sistemas:
- MECANICO: constituido por una serie de piezas en las que van instaladas las lentes, que permiten
el movimiento para el enfoque.
- Soporte: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
- Platina: Lugar donde se deposita la preparacin.
- Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o binocular.
- Revlver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos.
- Tornillos de enfoque: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico que consigue el
enfoque correcto.

Figura 2. Esquema de paredes celulares de bacterias a) Gram positivas y b) Gram negativas. En las Gram (+) la pared
celular consta de una capa de peptidoglicano de 10 a 80 nm mientras que en las Gram (-) la pared consta de una capa
de peptidoglicano de 2 a 3 nm de espesor, el periplasma y una membrana externa de 7 a 8 nm de espesor con
lipoprotenas y lipopolisacaridos de estrucutura similar a la membrana celular
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- PTICO: comprende un conjunto de lentes, dispuestas de tal manera que producen el aumento de
las imgenes que se observan a travs de ellas.
- Ocular: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo.
- Objetivo: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta.
- DE ILUMINACIN: comprende las partes del microscopio que reflejan, transmiten y regulan la
cantidad de luz necesaria para efectuar la observacin a travs del microscopio.
- Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin.
- Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
- Fuente lumnica: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.



















Seguridad en el laboratorio de microbiologa
Pelo recogido. Indumentaria adecuada. Empleo de guantes y anteojos.
Lvese las manos.
Rotule adecuadamente los tubos, reactivos y soluciones antes de comenzar.
Desinfecte la superficie de trabajo.
Precaucin con la posicin del mechero.
No coma ni beba en el laboratorio
Evite el contacto de la mano con boca y ojos.
Evite el uso de dispositivos electrnicos.
Coloque los tubos de cultivos en gradillas.
Disponga en contenedores adecuados los materiales contaminados para su esterilizacin.
Si hay derrames sobre la piel de cultivo o qumicos, lvese inmediatamente; en los ojos lvelos
durante 5 minutos. Avise al docente responsable
Si hay algn derrame de bacterias viables, cubra con una toalla de papel embebida
generosamente en alguna sustancia desinfectante (etanol 70% o hipoclorito de sodio 5000 ppm)
durante 20 minutos antes de limpiar.
Conozca las localizaciones del kit de primeros auxilios, del extintor y de la ruta de emergencia
ante incendios del edificio.
Figura 3. Partes de un microscopio ptico
Ajuste de brillo
Tornillo Micromtrico
Tornillo Macromtrico
Tornillos de desplazamiento de platina
Brazo
Objetivos
Cabezal
Oculares
Revlver
Platina
Fuente de luz
Interruptor de encendido
Condensador
Base
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Materiales y reactivos
1. Reactivos de la tincin de Gram:
Solucin de cristal violeta:
Solucin A: cristal violeta 2 g y alcohol etlico 96% 20 mL.
Solucin B: oxalato de amonio 0,8 g y agua destilada 80 mL.
Mezclar las soluciones Ay B. Dejar reposar por un da. Filtrar antes de utilizar.
Solucin de Lugol:
Ioduro de potasio 2 g, agua destilada 300 mL, Iodo 1g.
Preparacin: moler el iodo con un mortero, adicionarlo agitando a la solucin de ioduro de
potasio. Almacenar en una botella oscura.
Solucin de Safranina:
Safranina 2,5 g, alcohol etlico 10 mL y agua destilada 100 mL.
Alcohol etlico 96%.
2. Piseta de agua destilada.
3. Portaobjetos, rotuladores y ansa ojal.
4. Broches de madera.
5. Gradillas.
6. Papel secante
7. Toallas de papel.
8. Guantes y anteojos.
9. Recipientes para desechables.
10. Soluciones de desinfeccin.
11. Puente (Varillas de vidrio conectadas con tubos de goma)
12. Contenedores para enjuagues del procedimiento.
13. Cultivos puros y mixto de Staphylococcus aureus y Escherichia coli.
14. Microscopio y aceite de inmersin
15. Mechero

Actividades
Se entregaran por grupo 3 cultivos ciegos (dos en medio lquido y uno en medio slido) rotulados
como 1, 2, y 3 para que, mediante tincin de Gram, determine el microrganismo correspondiente.
Los cultivos corresponen a:
- Cultivo puro de Staphylococcus aureus
- Cultivo puro de Escherichia coli
- Cocultivo de Staphylococcus aureus y Escherichia coli
1.- Realice con cada cultivo un extendido (frotis), tincin de Gram y observacin microscpica.
2.- Describa cada cultivo de acuerdo a forma, tamao relativo, agrupacin celular, color de tincin,
clasificacin de Gram.
3.- Esquematice para cada cultivo lo observado a 1000x y explique en breves palabras si not
diferencias al observar con los diferentes objetivos y cuales fueron.
4.- Determine a que microrganismo corresponde cada muestra y justifique.
5.- Elabore un informe de no ms de 3 hojas, describiendo las actividades realizadas y los
resultados obtenidos. Analice las causas que condujeron a obtener los resultados (esperados o no)
considerando los mtodos aplicados y el fundamento de los mismos. Recuerde que no todos los
grupos tienen las mismas muestras. El informe deber ser entregado 24 hs antes del prximo
trabajo prctico para realizar una breve discusin en clase.
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Procedimientos
Preparacin del extendido o frotis
El frotis se prepara esparciendo el espcimen en una fina capa sobre un portaobjetos limpio.
1. Escriba el nombre de la muestra o microrganismo en un costado del portaobjetos
Frotis de cultivo en medio slido
2. Con el ansa coloque una gota de agua
destilada en un portaobjetos
3. Con el ansa estril transfiera una pequea
cantidad de cultivo de la superficie del agar a
la gota sobre el portaobjetos. Esparza la
mezcla con movimientos circulares.
Frotis de cultivo en medio lquido
2. Con el ansa estril transfiera una
gota de cultivo al centro de un
portaobjetos
3. Esparza la gota en una fina capa
4. Esterilice el ansa antes de dejarla sobre la mesada
5. Deje secar el frotis boca arriba
6. Fije el frotis pasando el portaobjetos 3 veces sobre la llama del mechero con el extendido
hacia arriba. Sostenga el porta objetos con pinza de madera para evitar quemaduras.

3 4 5

6





Tincin de Gram
1. Coloque el frotis rotulado y fijado sobre un puente en una bandeja de tincin.
2. Cubra el frotis con Solucin de cristal violeta durante 20 segundos. Esta penetra la pared
celular.
3. Lave el portaobjetos con agua destilada para eliminar el exceso de Solucin de cristal
violeta. Al lavar no dirija el agua sobre el extendido, sino virtala por un costado y djela
correr sobre el frotis.
4. Cubra el frotis con Solucin de Lugol durante 1 minuto. Este mordiente, forma un complejo
con el cristal violeta.
5. Enjuague con agua para remover el exceso de Solucin de Lugol.
6. Sostenga el portaobjetos a 45 y decolore con etanol/acetona (agente decolorante) gota a
gota, hasta que no salga ms color.
7. Inmediatamente enjuague el frotis con agua para remover el agente decolorante.
8. Cubra el frotis con Solucin de Safranina (colorante de contraste) durante 1 minuto.
9. Enjuague el portaobjetos con agua para remover el exceso de Solucin de Safranina.
10. Seque con papel absorbente o deje secar al aire
11. Examine el extendido teido con el objetivo de 100x y aceite de inmersin
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Uso efectivo y cuidado responsable del microscopio
Debido a que el microscopio ptico es un instrumento esencial y costoso en el laboratorio de
microbiologa, es primordial que cada estudiante haga un uso apropiado del mismo y tome los
cuidados necesarios para mantenerlo en ptimo funcionamiento. Las siguientes instrucciones son
una gua para mantener el microscopio limpio y en condiciones de trabajo.
12. Use ambas manos para cargar el microscopio (una mano agarrando el brazo y la otra
sosteniendo la base).
13. Coloque el microscopio en la mesada lejos del borde. Ajuste la altura de su asiento de
manera tal que puede observar a travs de los oculares cmodamente.
14. Limpie las lentes de objetivos y oculares nicamente con papel para lentes.
15. Al introducir o sacar del tomacorrientes, sostenga el enchufe por la cabeza y no por el cable.
16. Encienda el microscopio y ajuste lentamente la intensidad de la luz.
17. Eleve el condensador a su altura mxima.
18. Coloque y ajuste el portaobjetos en la platina, siempre con el preparado a observar hacia
arriba.
19. Ajuste los oculares a la distancia interpupilar de sus ojos, de manera tal que vea una sola
imagen.
20. Gire el revolver para posicionar el objetivo de 10x sobre el portaobjetos.
21. Gire los tornillos de desplazamiento de la platina para ubicar la muestra del portaobjetos
sobre la luz. Familiarcese con el desplazamiento de la platina, recuerde que uno de los
tornillos proporciona un desplazamiento de lado a lado y el otro de adelante hacia atrs.
22. Mientras mira el microscopio de costado suba la platina con el tornillo macromtrico
acercando la platina al objetivo lo mximo posible. Familiarcese con el movimiento de
ascenso y descenso producido por el giro del tornillo macromtrico. Recuerde que direccin
de giro aumenta la distancia entre la platina y el objetivo y viceversa.
23. Ajuste la intensidad de la luz moviendo la pestaa del diafragma hasta que la imagen tenga
el mejor contraste contra el fondo.
24. Gire lentamente el tornillo micromtrico para enfocar bien y alcanzar una mejor definicin de
la imagen. Haga esto con su ojo izquierdo cerrado. Luego con el ojo izquierdo abierto y el
derecho cerrado, ajuste el foco con el anillo de enfoque del ocular izquierdo.
25. Una vez finalizadas las observaciones a 10x, gire el revolver para posicionar el objetivo de
40x sobre el preparado. Debido al sistema ptico del microscopio, la muestra se encontrar
casi enfocada, usted slo necesitar ajustar la definicin de la imagen con el tronillo
micromtrico. Probablemente tambin sea necesario aumentar la intensidad de la luz.
26. Use la lente de inmersin de 100x para observar preparados con diferentes tinciones. Aleje
levemente la platina con el tornillo macromtrico y mueva el revolver de manera tal que el
preparado quede entre los objetivos de 100x y 40x. Coloque una gota de aceite de inmersin
sobre el rea que desea observar en el portaobjetos. Abra del todo el diafragma.
27. Mueva el revolver y posicione el objetivo de 100x sobre el portaobjetos, colocndolo sobre el
aceite de inmersin. Gire lentamente el tornillo micromtrico hasta obtener una imagen
ntida. Siempre aleje el objetivo de la platina para evitar daar la lente.
28. Al finalizar las observaciones, aleje al mximo la platina del objetivo y gire el revolver a
medias, dejando el preparado entre el objetivo de 100x y el de menor aumento. Limpie la
lente del objetivo de 100x con papel para lentes y retire el portaobjetos.
29. Apague el microscopio, desenchfelo sin tirar del cable y enrolle el cable en la base.
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30. Gire el revolver y coloque el objetivo de menor aumento en posicin de observacin. Gire el
tornillo macromtrico para acercar lo mximo posible platina y objetivo.

Bibliografa
1- Curtis H., Barnes N.S. Biologa. Sexta edicin en espaol. Ed. Medica Panamericana 2000
2- Lammert J. M. Techniques in Microbiology. A Student Handbook. Ed. Pearson-Benjamin Cummings.
2007
3- Madigan M. T., Martinko J.M., Parker J. Brock. Biologa de los Microorganismos. PrenticeHall



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Cuestionario Trabajo Prctico N 2
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1. Indique verdadero o falso

Las clulas procariotas se
diferencian de las clulas
eucariotas por

Luego de la tincin de Gram, las clulas
Gram positivas:

La pared celular de las bacterias
Gram positivas esta constituida
por

Que tienen pared
celular no celulsica

Exhiben una coloracin rosada
producto del contraste de la
safranina

Una sola capa de
peptidoglicano

Que tienen ncleo
Exhiben una coloracin azul a
violeta producto del lavado de la
safranina y la posterior adicin de
cristal violeta

Varias capas finas de
peptidoglicano intercaladas
con membranas
lipoproteicas

Que tienen nucleoide
Exhiben una coloracin azul violeta
producto del complejo safranina-
cristal violeta formado luego del
lavado con alcohol/acetona

Una capa fina de
peptidoglicano y una
membrana externa de
lipoprotenas

2. Ordene las siguientes etapas de la tincin de Gram

Decoloracin con alcohol/acetona
Lavado del mordiente
Cubrir el frotis con colorante de contraste
Secado del preparado
Cubrir el frotis con Violeta Cristal

3. Rotule 10 partes del microscopio